JPH02264800A - プロタミンの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） この発明は、プロタミンの製造方法に関するものである
。さらに詳しくは、この発明は、魚類の白子から容易に
かつ高純度にプロタミンを抽出、精製することのできる
プロタミンの製造方法に関するものである。

（従来技術とその課題） プロタミンは、ニシンやサケ等の魚類やニワトリなどの
を推動物の成熟精子核中に存在している分子量４０００
〜８５００の塩基性蛋白質であり、近年、医薬品、ある
いは食品、化粧料、清掃用品等の抗菌剤として注目され
ている。

このプロタミンの工業的製造方法としては、−般に、魚
類の精巣（白子）を磨砕し、その磨砕物から鉱酸でプロ
タミンを抽出する方法が知られているが、通常この白子
に付着している血液や粘液、あるいは白子に含まれてい
る各種蛋白質が夾雑物として共に抽出されるため、従来
より、夾雑物を含有しない高純度のプロタミンを得るた
めの抽出方法あるいは鉱酸抽出液の精製方法が種々提案
されている。

たとえば、白子を磨砕することなくそのままの形状で直
接鉱酸により抽出する方法が提案されており、また、鉱
酸抽出液の精製方法としては、アルカリ剤の添加による
塩析法、縮合リン酸塩の添加による沈澱法、エタノール
等の有機溶媒による沈澱法、酵素を作用させる方法、プ
ロタミンを遊離化した後イオン交換や電気透析する方法
等が提案されている。

しかしながら、これらの方法によってもプロタミンを効
率よく抽出、精製することは困難であり、高純度のプロ
タミンを製造するためには相当の手間とコストをかけな
ければならなかった。たとえば、白子を磨砕することな
くプロタミンを抽出する場合でもヒストン等の塩基性不
純物蛋白質は同時に抽出され、それらがその後の精製行
程を妨害するので、高純度のプロタミンを得ることが困
難になっていた。

このため、プロタミンを簡便な方法で高純度に製造する
ことのできる新しいプロタミンの製造方法の開発が望ま
れていた。

この発明は、以上の通りの事情を踏まえてなされたもの
であり、従来法の欠点を改善し、魚類の白子からプロタ
ミンを簡便にかつ選択的に抽出することができ、抽出液
中にヒストン等の不純物蛋白質や血液、粘液成分等の夾
雑物が混入することがなく、また、プロタミンの鉱酸抽
出液を高純度に精製することもできる高品質プロタミン
のｌｌ！遣方法を提供することを目的としている。

（課題を解決するための手段） この発明は、上記の課題を解決するものとして、魚類の
白子を希鉱酸で洗浄処理し、その洗浄処理物からプロタ
ミンを抽出することを特徴とするプロタミンの製造方法
を提供する。

また、魚類の白子から鉱酸によりプロタミンを抽出し、
その鉱酸抽出液に酸可溶性カチオン系高分子凝集剤を添
加して夾雑物を除去し精製することを特徴とするプロタ
ミンの製造方法をも提供する。

さらにこの発明は、魚類の白子からプロタミンを抽出す
るプロタミンの製造方法において、上記の洗浄処理を施
し、さらに上記の精製を行うプロタミンの製造方法を提
供するものである。

この発明の製造方法は基本的にはいずれも魚類の白子か
らプロタミンを抽出するものであるが、上記の洗浄処理
を施す方法はプロタミンを選択的に抽出することを可能
とするものであり、希鉱酸を洗液として予め魚類の白子
を洗浄処理し、その後に鉱酸による抽出など任意の方法
でプロタミンを高純度で抽出することを可能とするもの
である。

この洗浄処理では、ヒストン等の不純物蛋白質、血液、
粘液成分などの夾雑物だけを選択的に希鉱酸中に抽出し
、白子から夾雑物を十分に洗い出す。

洗浄処理を施す白子としては、そこに付着あるいは含有
されている夾雑物が十分に洗浄除去されるように、磨砕
したものとするのが好ましい、なお、白子の種類として
は特に制限はなく、サケ、ニシン、ニジマス、マグロな
ど従来よりプロタミンの製造原料として使用されている
白子を広く使用することができる。

また、洗液とする希鉱酸としては、白子の種類にもよる
が、０．０５〜０．２Ｎ程度の希鉱酸を使用するのが好
ましい、もちろんこの濃度は限定的ではないが、０．０
５Ｎ未満の希鉱酸では夾雑物が抽出され難くなるので十
分な洗浄ができなくなり、一方０．２Ｎを超える希鉱酸
を使用すると夾雑物の他にプロタミンも抽出されてプロ
タミンの損失をきたし生産性が低下するので好ましくな
い。

希鉱酸の使用量は、白子の種類や量に応じて酸の総量（
酸の規定度Ｎ×酸の使用量オ）が十分なものとなるよう
に定めることが好ましく、一般には白子に対して１〜３
倍容量程度とするのが好適である。

また、洗浄処理はこのような希鉱酸を白子と混合攪拌し
、洗液を分離除去するだけで容易に行うことができるが
、この場合の混合攪拌時間（洗浄時間）は、白子の種類
、希鉱酸の規定度、使用量等に応じて高い洗浄効率を実
現できるように適宜室める０通常は数時間以内で十分な
洗浄処理を達成することができる。

以上のように、洗浄処理の条件は白子の種類、希鉱酸の
規定度および使用量、洗浄時間等の相互の関係が全体と
して好適なものとなるように設定することが好ましい、
このような条件としては、サケやニシン等の魚類の白子
の磨砕物に対して０．２Ｎの塩酸を１倍容量使用し、洗
浄時間を１時間とすることを例示することができる。

なお、夾雑物を抽出した洗液を洗浄後に白子から分離除
去する方法は、遠心分離や濾過等の常法によることがで
きる。

このように白子に洗浄処理を施した後は、その洗浄処理
物（すなわち洗浄処理した白子）から抽出によりプロタ
ミンを製造する。これによりヒストン等の不純物蛋白質
、血液、粘液成分等の夾雑物の含有量が著しく低減した
高純度のプロタミンの抽出液を得ることが可能となる。

なお、この場合の抽出方法については特に制限はな〈従
来の鉱酸による抽出方法を利用することができ、その際
の抽出条件としては、使用する鉱酸の規定度や量および
抽出時間をプロタミンの抽出効率を高められるように適
宜設定する。抽出条件は白子の種類にもよるが、たとえ
ばサケやニシン等の白子に対して１Ｎの鉱酸を２倍容ｉ
使用し、抽出時間を１時間とする。

また、抽出条件を設定するに際しては、抽出時間を必要
以上に長くしないようにし、通常数時間以内とする。　
　０．２Ｎ〜０．５Ｎ程度の希鉱酸を使用して抽出する
場合でも抽出に長時間をかけすぎるとかえって抽出量が
半減する。

抽出したプロタミンの抽出液は、必要によりさらに電気
透析等の常法により脱塩：ｄＩ４縮と乾燥で遊離型とす
ることができ、また従来の塩形成方法により、塩酸塩、
硫酸塩、硝酸塩等の所望の塩形前とすることができる。

以上のように、この発明の方法は洗浄処理を施すことに
より魚類の白子からプロタミンを選択的に高純度抽出で
きるようにするが、さらにプロタミンの鉱酸抽出液を特
定の精製方法で効率よく精製することにより高純度のプ
ロタミンを得られるようにもしている。

この精製方法は、鉱酸抽出液に酸可溶性カチオン系高分
子凝集剤を添加して夾雑物を分離除去することを特徴と
している。

この場合、酸可溶性カチオン系高分子凝集剤としては、
酸溶液に溶解してポリ陽イオンとなるものを広く使用で
きる。たとえばキトサン、ポリアミノアルキルメタクリ
レート、ポリエチレンイミン、ハロゲン化ポリジアリル
アンモニウム、アイオネン系凝集剤等を使用することが
できる。特に、キトサンは好適に使用することができる
。

これらの高分子凝集剤は常法の凝集分離法によって使用
することができる。たとえば、キトサンを用いる場合に
は、任意の鉱酸によるプロタミンの抽出液にキトサンを
添加して撹拌混合し、ＰＨを８〜１０程度に調整し、キ
トサンと共に夾雑物を沈澱させ、その沈澱物を遠心分離
等によって分離除去する。

このような鉱酸抽出の精製方法は、前述の洗浄処理をし
た白子から抽出したプロタミンの鉱酸抽出液に適用でき
る他、洗浄処理をしない従来のプロタミンの鉱酸抽出液
にも適用でき、いずれの鉱酸抽出液に対してもプロタミ
ンを高純度に精製することを可能とする。しかしながら
より高純度のプロタミンを製造するためには、洗浄処理
をした白子からの鉱酸抽出液に適用するのが好ましい。

すなわち、まず白子に前述の希鉱酸による洗浄処理を施
し、次にその洗浄処理物から鉱酸でプロタミンを抽出し
、そのプロタミンの鉱酸抽出液に対してこの精製方法を
適用する。

なお、この場合においても鉱酸によるプロタミンの抽出
方法自体は常法によることができる。また、この精製後
に遊離型、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩等の所望の塩形層と
することら常法によることができる。

以下、この発明を実施例に基づいて具体的に説明する。

実施例１ 白子の好適な洗浄条件を検討するなめに、プロタミン含
有量８％、５％、２．５％の３種類の白子に対して、そ
れぞれ次の（ｉ）〜（ｉｉｉ）の抽出処理を施し、それ
らの抽出液中の成分を電気泳動法により検出した。

（ｉ）ＩＮ塩酸、１倍容量による１時間の抽出処理。

（ｉｉ）　　０．２　Ｎ塩酸、１．５倍容量による１時
間の抽出処理。

（ｉｉｉ）　　０．２Ｎ塩酸、１．５倍容量による１時
間の抽出処理をした後、さらにその抽 出残渣にＩ　Ｎｍ酸、１倍容量による１時間の抽出処理
。

この結果、プロタミン含有量の異なるいずれの種類の白
子についても、（ｉ）の場合の抽出液にはプロタミンと
共にヒストン等の夾雑物が検出され、（ｉｉ）の場合の
抽出液にはプロタミンがほとんど検出されることなく相
当量のヒストンその他の夾雑物が検出され、また（ｉｔ
ｉ）の場合の抽出液にはヒストン等の夾雑物は検出され
ることなくプロタミンのみが検出された。

Ｈに対しての（ｉｉ）（ｉｉｉ）の対比から明らかなよ
うに、ヒストン等の夾雑物を含有しない高純度のプロタ
ミン抽出液を得るためには、１Ｎ塩酸で抽出処理をする
前に、０．２Ｎ塩酸で洗浄処理して夾雑物を抽出除去す
るのが有効であることが確認できた。

実施例２ 白子の好適な洗浄条件あるいは抽出条件を検討するため
に、次のように、白子の種類、抽出溶媒しとての塩酸の
規定度および使用量、抽出時間を変えて抽出処理を行い
、塩酸抽出液中に抽出されるプロタミンの回収率をＨＰ
　Ｌ　Ｃで測定し、また不純物蛋白質成分を電気泳動法
により検出した。

なおＨＰＬＣのスタンダードとしてはシグマ社製、ナカ
ライテスク製、和光補薬製のＳａｌｍｉｎｅ　５ｕｌ−
ｆａｔｅ、　５ａｌｌｉｎｅ　ｃｈｌｏｒｉｄｅ、　５
ａｌｎｉｎｅ　ｆｒｅｅ　ｂａｓｅ及びＣ１ｕｐｅｉｎ
ｅ　５ｕｌｆａｔｅを用いた。

（１）白　子・・・プロタミン含有量８％、５％、２．
５％の３種類 （１１）塩酸の規定度・・・０．２Ｎ、０．５Ｎ、１Ｎ
、２Ｎ （ｉｉｉ）塩酸の使用！（白子に対する容量比）・・・
１倍、２＠、５倍 （１ｖ）抽出時間・・・１時間、２時間、２０時間 ＨＰＬＣの測定結果をプロタミン含有量８％、５％およ
び２．５％の各々の白子について示したものが第１図（
ａ）　（ｂ）　（ｃ）である。

この結果、塩酸中に抽出されるプロタミンの回収率は白
子の種類に応じて異なるものの塩酸の規定度、使用量お
よび抽出時間に対してほぼ同様の挙動を示していた。す
なわち、いずれの白子においても、１Ｎと　２Ｎの塩酸
による場合にはプロタミンの回収率はほぼ等しく、０，
２Ｎの場合には著しく低下しており、特に０．２Ｎの塩
酸を１倍容量使用したものについては抽出液には全くプ
ロタミンが検出されなかった。

これにより白子の洗浄処理には０．２Ｎ以下の希鉱酸が
好適であり、また抽出処理には０．２Ｎより高い規定度
の鉱酸が好適であることがわかった。

また、０．５Ｎ以下の場合にはプロタミンの回収率が塩
酸の使用量に大きく依存するが、１Ｎ以上の場合には依
存性は小さくなるので、安定的な回収率を確保するため
の抽出処理としては１Ｎ程度以上の鉱酸を使用するのが
好ましいことがわかった。

抽出時間に関しては、第２図（ｂ）から明らかなように
、数時間程度ではプロタミンの回収率に大きな差異はな
いが、２０時間程度の長時間の処理を行うと、プロタミ
ンが加水分解するためか、回収率が著しく低下し、処理
条件としては好ましくないこともわかった。

実施例３ サクの白子（プロタミン含有Ｊ１７％）１に９を阜砕し
、０．２Ｎの塩酸１１を加えた後に攪拌して洗浄し１．
洗液を遠心分ｌｌ＠　（７０００Ｇ、　５分）により除
去した。

次に残渣に対して１Ｎの塩酸２オを加えて撹拌し、遠心
分離して上澄を採取し、中和してプロタミン抽出液を得
た。

このプロタミン抽出液の成分を分析したところ、固形分
７．４４％、プロタミン含有量２．８５％、ＮａＣｌ含
有量４．０１％であり、プロタミンの純度（プロタミン
含有量／（固形分−ＮａＣ！含有量））は８３．２％で
あった。

このプロタミン純度は後述する洗浄処理をしない比較例
に比べて著しく高純度であった。

実施例４ 実施例３と同様のサケの白子１に９に、希塩酸の洗浄を
行うことなく、１Ｎの塩酸２ｊを加えて攪拌し、遠心分
離して上澄を採取することによりプロタミンの抽出液を
得な。

このプロタミン抽出液にキトサン２．５ｇを添加し、ｐ
Ｈ９に調整して凝集沈澱させ、遠心分離して上澄を採取
し、さらに中和してプロタミン抽出液の精製物を得た。

この精製したプロタミン抽出液の成分を分析しなところ
、固形分７．１２％、プロタミン含有量２．７５％、Ｎ
ａＣＩ含有量４．１０％であり、プロタミンの純度は９
１％であった。

実施例５ 実施例３と同様にして、サケの白子１にＱを０．２Ｎの
塩酸１ｊにより洗浄し、次いで１Ｎの塩酸２Ｊによりプ
ロタミンを抽出し、遠心分離して上澄を採取した。

この上澄に、実施例４と同様にキトサン２．５ＫＱを添
加しｐＨを調整してプロタミン抽出液を精製した。

この精製したプロタミン抽出液の成分を分析したところ
、固形分６．９０％、プロタミン含有量２．６８％、Ｎ
ａＣｌ含有量４．０５％であり、プロタミンの純度は９
４％であった。このプロタミン純度は上記実施例３およ
び実施例４よりも高く、−層良好な品質であった。

比較例 実施例３と同様にして、サケの白子１にｇを摩砕し、１
Ｎの塩酸２ｊを加えて撹拌し、遠心分離して上澄を採取
し、中和してプロタミン抽出液を得た。

このプロタミン抽出液の成分を分析したところ、固形分
８．７７％、プロタミン含有量２．６５％、ＮａＣｌ含
有量３．７８％であり、プロタミンの純度は５３．１％
にすぎなかった。

洗浄処理や精製処理をしないこの比較例のプロタミン純
度は前述の実施例に比べて著しく劣っていた。

実施例６ 凍結保存していたサケの白子（プロタミン含有量７％）
１にｇを解凍し、摩砕後、皮を除去しな。

これに０．２Ｎの塩酸１Ｊを加えて１時間攪拌して洗浄
し、遠心分離（７０００Ｇ、５分）により洗液を除去し
なや 次に残渣に対して１Ｎの塩酸２ｊを加えて１時間撹拌し
、遠心分離して上澄を採取し、プロタミン抽出液を得た
。

このプロタミン抽出液１．５ｊに０．２Ｎの塩酸に溶解
した１％キトサン（共和油脂工業社製フローナック）１
５０ｍｊを添加し、ｐＨを８〜１０に調整して凝集沈澱
させ、遠心分離して上澄を採取し、プロタミン抽出液の
精製液１．７ｊｌを得た。

次にこの精製液を使用して、以下のように（１）硫酸プ
ロタミン、（１ｊ）塩酸プロタミン、（ｉｉｉ）遊離プ
ロタミンを調製し、それらの純度を測定した。

（ｉ）硫酸プロタミン 精製したプロタミン抽出液１ｊに１０％硫酸１００ｍｊ
とエタノール５ｊを添加し、５℃に冷却後遠心分離（７
０００Ｇ、５分）して残渣を採取し、さらに乾燥して硫
酸プロタミン３６ｇを得た。この硫酸プロタミンの純度
は９４％であった。

（ｉｉ）塩酸プロタミン 精製したプロタミン抽出液１ｊにエタ ノール５１を添加し、５℃に冷却後遠心分＠　（７００
（ＩＯ，５分ンして残渣を採取し、さらに乾燥して塩酸
プロタミン３５０を得た。

この塩酸プロタミンの純度は９３％であった。

（ｉｉｉ）遊離プロタミン 精製したプロタミン抽出液１１を ｐＨ１３に調整し、電気透析（旭硝子社製Ｄｕ−Ｏｂ型
、３０Ｖ、５ｈｒ　）によりほぼ電流が流れなくなるま
で脱塩透析し、さ らに濃縮、乾燥して遊離プロタミン ２７．５０を得た。この遊離プロタミンの純度は９５％
であった。

実施例７ 凍結保存していたサケの白子（プロタミン含有量４％）
１に９を使用し、０．２Ｎの塩酸を１．５ｊ使用した以
外は実施例６と同様にして、硫酸プロタミン、塩酸プロ
タミンおよび遊離プロタミンを製造した。

その結果、硫酸プロタミン１８ｇ、塩酸プロタミン１８
ｇおよび遊離プロタミン１５（ＩＩを得た。

実施例８ 凍結保存していたニシンの白子（プロタミン含有量４％
）ＩＫｇを実施例６と同様に処理してプロタミン抽出液
の精製液１．７ｊを得た。

次にこの精製液を陰イオン交換樹脂（住友化学社製Ｄｕ
ｏｌｉｔｅ　Ａ−１６２）で処理し、エタノール５１を
添加し、５℃に冷却後遠心分Ｍ（７０００Ｇ、５分）し
て残渣を採取した。この残渣を温水１００ｍ　Ｎで再溶
解し、エタノール１オを添加して沈澱物を得た。

これを乾燥して遊離プロタミン２Ｇ（Ｊを得た。この遊
離プロタミンの純度は９８％であり、極めて高純度であ
った。

（発明の効果） この発明の方法により、魚類の白子からプロタミンを簡
便にかつ選択的に抽出し、またプロタミン抽出液を高純
度に精製することが可能となる。

不純物をほとんど含有せず極めて高純度で医薬品にも有
用な高品質のプロタミンを製造することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図（ａ）（ｂ）（ｃ）は、各々、プロタミン含有量
８％、５％、および２．５％の白子からのプロタミンの
回収率を示した塩酸濃度の回収率との相関図である。 第１図 （ａ） 代理人　弁理士　西　澤　利　夫 塩酸濃度 第 図 第 （Ｃ） 図

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. （１）魚類の白子を希鉱酸で洗浄処理し、その洗浄処理
   物からプロタミンを抽出することを特徴とするプロタミ
   ンの製造方法。
2. （２）洗浄処理に、０．０５〜０．２Ｎの希鉱酸を使用
   する請求項（１）記載のプロタミンの製造方法。
3. （３）洗浄処理に、魚類の白子の１〜３倍容量の希鉱酸
   を使用する請求項（１）記載のプロタミンの製造方法。
4. （４）魚類の白子から鉱酸によりプロタミンを抽出し、
   その鉱酸抽出液に酸可溶性カチオン系高分子凝集剤を添
   加して夾雑物を除去し精製することを特徴とするプロタ
   ミンの製造方法。
5. （５）酸可溶性カチオン系高分子凝集剤としてキトサン
   を使用する請求項（４）記載のプロタミンの製造方法。
6. （６）魚類の白子に対して１Ｎの鉱酸を２倍容量使用し
   、抽出時間を１時間としてプロタミンを抽出する請求項
   （１）または（４）記載のプロタミンの製造方法。
7. （７）魚類の白子からプロタミンを抽出するプロタミン
   の製造方法において、請求項（１）記載の洗浄処理を施
   し、次いで請求項（４）記載の精製を行うプロタミンの
   製造方法。