JPS62187492A - プロタミン鉱酸塩の精製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 檄１上の利用分野 本発明はプロタミン鉱酸塩の精製方法に関する。

従来技術 プロタミンは分子ｆｆ１（約４０００〜約１００００）
の比較的小さい塩基性蛋白質であり、ニシン、サケ、マ
スなどの魚の精子中に核酸（ＤＮＡ）と結合した核蛋白
として存在する。

プロタミン塩類、特にその硫酸塩はヘパリンの血液凝固
を阻止する作用や、インシュリンの薬効を持続させる働
き、酵素を安定化する働きあるいは抗生物質を安定化す
る働き等が知られており、それらの性質をＰＩ用して各
種医薬品等に使用されている。

魚の白子より抽出、分離して得られたプロタミン鉱酸塩
の精製方法としては、例えば特公昭４９−２４２０９号
公報、特開昭５５−２６１２号公報あるいは特公昭５９
−３１５１９号公報等に開示されている。

特公昭４９−２４２０９号公報記載の技術は、魚の白子
の抽出液にトリクロル酢酸を添加してプロタミン以外の
不純物を不溶性物質として除去する精製方法である。該
方法は不溶性物質を除去する操作さらに溶解しているプ
ロタミン鉱酸塩を分離する操作が必要であり、非常に繁
雑な工程からなりたっている。また該方法で得られるプ
ロタミン鉱酸塩は純度が悪いために、さらに別の精製工
程が必要である。

また本方法には、プロタミン鉱酸塩の溶解度を利用して
精製することについてはなにも教示されていない。

特開昭５５−２６１２号公報および特公昭５９−３１５
１９号公報に記載の技術は、魚の白子より抽出、分離し
て得たプロタミン鉱酸塩の酸性希薄水溶液を吸着剤で処
理した後に、有機溶剤で分別沈澱させる精製方法である
。

該方法はプロタミン鉱酸塩以外の不純物を活性炭のよう
な吸着剤で除去するものであり、プロタミン鉱酸塩の溶
解度を利用して精製することについてはなにも教示され
ていない。

発明が解決しようとする問題点 本発明者らは硫酸プロタミンをより高純度、高収率で得
ろ精製方法を検討した結果、硫酸プロタミンおよび夾雑
蛋白は、無機塩の濃度か違う溶液に対して、溶解性を著
しく異にする゛ことを発見した。この新たな知見を利用
４゛ることにより前記のような問題点をすべて解消し、
純度の高いプロタミン硫酸塩を簡便にしかも効率良く得
ることができろ方法を完成するに至った。

問題点を解決するための７段 本発明は魚の白子より抽出、分離して得られたプロタミ
ン鉱酸塩を温水に溶解し、次に該温水に少量の硫酸塩を
添加し冷却することによりプロタミン鉱酸塩を析出させ
ることを特徴とするプロタミン鉱酸塩の精製方法に関す
る。

本発明に使用しうろプロタミン鉱酸塩は、公知の方法に
より魚、たとえばニシン、サケ、あるいはザバ等の白子
から抽出、分離して得られたプロタミン鉱酸塩ならいず
れでもよく、特に限定されるものではない。

本発明においてはプロタミン鉱酸塩として硫酸プロタミ
ンを使用することが好ましい。

温水に溶かすプロタミン鉱酸塩の濃度は濃厚な程良い。

温水は、溶解させるプロタミン鉱酸塩が溶解する温度で
あればよい。

本発明に使用できる硫酸塩は硫酸アンモニウムあるいは
硫酸ナトリウム等である。

硫酸塩はプロタミン鉱酸塩とともに温水に溶解してもよ
いし、プロタミン鉱酸塩を添加した後に添加してもよい
。

硫酸塩は温水１リツトルに対して０．０５〜０゜２モル
の量を添加する。０．０５モルより少ないかあるいは０
．２モルより多いと温水を冷却後プロタミン鉱酸塩を効
率良く析出させることができない。

温水は１０℃以下、好ましくは５℃以下に冷却する。１
０℃より高いとプロタミン鉱酸塩を効率良く析出させる
ことができない。

温水のｐＨは特に調整する必要はない。調整する場合は
、プロタミン鉱酸塩を添加後硫酸塩を添加する前にｐｏ
２〜７の範囲にすることが望ましい。

本発明に従い精製を行うことにより、白子を抽出、分離
する際プロタミン鉱酸塩の析出物に付着する塩、酸およ
び夾雑蛋白を除去できる。

本発明に従うと、魚の白子より抽出、分離した祖プロタ
ミン鉱酸塩を再結晶のごとき簡単な手段でかつ効率よく
精製することができる。

本発明は、プロタミン鉱酸塩の溶解性が溶液ｌＱに対し
て硫酸アンモニウムあるいは硫酸ナトリウム０．０５〜
０．２モル溶けた極めて低い濃度域の溶液中で最小にな
るという新たな知見に基づくものである。

表１に水温５℃、ｐＨ２，５の水溶液中における硫酸プ
ロクミンを例にとり、その溶解度（重量％）と硫酸塩濃
度の関係を表した。表中、濃度は溶液ｌＱに対して溶か
したモル数を表す。

表１ 表１より硫酸プロタミンの溶解度は塩の濃度が０．０５
〜０．２モルの範囲で最小になるのがわかる。

本発明を実施例を用いてさらに詳しく説明する。

実施例１ 抽出 冷凍した鮭の白子を解凍、水洗い、水切りを行い摩砕し
た。

摩砕した鮭の白子１００ｇを５％（ＩＮ）硫酸５００ｍ
１に添加し、室温（２４°Ｃ）で１時間攪拌した。

攪拌後、残渣を遠心分離により取り除き硫酸プロタミン
抽出液５５０ｍ１を得た。

黛１ 該抽出液に攪拌下、室／７＋＆２４℃で濃アンモニア水
３０ｍ１を添加し、ｐＨを３にコ、す整し、さらに硫酸
アンモニウム１２４ｇを少量ずつ添加し、夾雑蛋白を沈
澱させた。該夾惟蛋白沈澱物を遠心分離により取り除き
上澄み液６３０ｍ１を得た。

該上澄み液に攪拌下、室温２４℃で硫酸アンモニウム１
３０ｇを徐々に添加し硫酸プロタミンを塩析させた。塩
析した硫酸プロタミンを遠心分離により分離し、白色飴
状の硫酸プロタミンｌｏ。

４ｇを得た。

置型 さらに以上のようにして得られた白色飴状の硫酸プロタ
ミン１０．４ｇを１００ｍ１の温水（４０〜５０℃）に
溶解し、該溶液１リツトル当り０．０９モルの硫酸アン
モニウムの濃度とした。その後溶液を５℃に冷却しその
温度で２日間放置し硫酸プロタミンを析出さ仕た。

析出した硫酸プロタミンの上澄み液を傾瀉して取り除き
、透明油状の硫酸プロタミンを得た。それを凍結乾燥し
白色の硫酸プロタミン４，７６ｇを得た（収率４．７６
％）。

実施例２ 抽出工程 冷凍した鮭の白子を解凍、水洗い、水切りを行い摩砕し
た。

摩砕した鮭の白子ＩＫｇおよび２．３５モルの硫酸アン
モニウムを１０％（２Ｎ）硫酸２リツトルに添加し、３
０℃１時間攪拌した。攪拌後、残渣を遠心分離により取
り除き硫酸プロタミン抽出液２．５リツトルを得た。

抽出液中には硫酸プロタミンが５３．３ｇ（２，１３重
量％）（乾燥換算）含まれていた。

分離工程 抽出液２．５リツトルを５℃に冷却しその温度で１６時
間静置し、硫酸プロタミン析出物と上澄み液とに分離さ
せた。上澄み液は傾瀉して回収した。

硫酸プロタミン析出物は白色アメ状で、収量は１０２ｇ
であった。

回収した上澄み液は２．４３リツトルであった。

成分は硫酸７．２６％、硫酸アンモニウム１．７２モル
／リットル、夾雑蛋白１．６重量％、硫酸プロタミン０
．４重量％（９，７２ｇ）であった。

精製工程 分離工程で得られた硫酸プロタミン１０２ｇを８００ｍ
１の温水（４０〜５０’Ｃ）に溶解し、該溶液１リツト
ル当たり約０．１４モルの硫酸アンモニウムの濃度とし
た。その後溶液を５℃に冷却しその温度で一夜静置し硫
酸プロタミン析出物と上澄み液とに分離させた。

上澄み液を傾瀉して取り除き、透明油状の硫酸プロタミ
ンを得た。それを凍結乾燥し白色の硫酸プロタミン４３
．２ｇを得た（収率４．３２％）。

比較例１ 実施例１における板製工程を行わない以外は実施例１と
同様におこなった。得られた白色飴状の硫酸プロタミン
を凍結乾燥し、白色の硫酸プロタミンの粉末６．３０ｇ
（収率６．３０％）を得た。

比較例２ 実施例２における肋工程を行なわない以外は実施例２と
同様におこなった。得られた白色飴状の硫酸プロタミン
を凍結乾燥し、白色の硫酸プロタミンの粉末５３．２ｇ
（収率５，３２％）を得た。

実施例３ 実施例１，２および比較例１．２で得た硫酸プロタミン
を試料とし、その純度を測定した。

純度はクロマトグラフィー、吸光分析、硫酸プロタミン
を水に溶かした時の溶液の溶状および抗菌活性により検
討した。

クロマトグラフィーは高速液体クロマトグラフィーを使
用した。試１：１の純度は和光純薬工業製硫酸プロタミ
ン（鮭製）を標品とし、その純度を１．００として比較
しＨＰＬＣ純度として示した。またＨＰＬＣ純度と試料
の収率を掛けたものを標品換算収率として示した。ここ
で標品換算収率とは白子１００ｇから得られる硫酸プロ
タミンの量を標品程度の純度を有した硫酸プロタミン爪
に換算した場合の収率を言い、硫酸プロタミンの分離効
率比較の尺度と考えて良い。それらの結果を表２中に示
した。

ＨＰ　Ｌ　Ｃ純度を比較すると、本発明に従い得られた
硫酸プロタミンの純度は、比較例に比べ約１゜２倍ら良
いことがわかる。

抗菌活性は和光補薬工業製硫酸プロタミン（鮭製）を標
品に使用し、ペーパーディスク法において枯草菌（Ｂ、
　５ｕｂｔｉｌｉｓ　　Ｉ　ＡＭ　　１０６９株）に対
する抗菌活性を１．００として比較し抗菌力比活性とし
て示した。また抗菌力活性と試料の収率を掛けたものを
標品換算活性収率として示した。

標品換算活性収率とは白子１００ｇから得られる硫酸プ
ロタミンの量に対して同等の抗菌力を示すために必要と
する標品の量に換算した場合の収率を言い硫酸プロタミ
ンの分離効率比較の尺度と考えて良い。それらの結果を
表２中に示した。抗菌力比活性を比較ずろと本発明に従
い得られた硫酸プＣ！タミンは、比較例ものよりも約１
．２倍も良いごとがわかる。

表２ 吸光分析は、核酸にに起因する２６０ｍおよび夾雑蛋白
に起因する２８０ｎｍでの吸光度を測定した。

測定は試料の濃度０．１重量％の水溶液を温度２０℃で
行なった。その結果を表３中に示した。純粋な硫酸プロ
タミンは２２０ｒｕ＋＋以上の光に対しては吸収がない
。表３かられかるように本発明に従い得られた硫酸プロ
タミンは比較例により得られた硫酸プロタミンに比べ、
夾雑蛋白の量が非常に少ないことがわかる。

表３ 溶液状態の目視観察は、各試料の２％水溶液（２０℃）
で行なった。本発明および比較例に従い得られた硫酸プ
ロタミンともに完全に溶解し、不溶物の存在が認められ
なかった。

発明の効果 本発明に従うと魚の白子から得られた祖プロタミン鉱酸
塩を損失なく、しかも簡便な工程で、精製することがで
きる。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １、魚の白子より抽出、分離して得られたプロタミン鉱
   酸塩を温水に溶解し、次に該温水に少量の硫酸塩を添加
   し冷却することによりプロタミン鉱酸塩を析出させるこ
   とを特徴とするプロタミン鉱酸塩の精製方法。