JPH02265487A - ヒト第９因子または類似の蛋白質をコードするｄｎａ配列、発現ベクター、形質転換された細胞、第９因子の製造方法および得られた対応する生成物 - Google Patents
ヒト第９因子または類似の蛋白質をコードするｄｎａ配列、発現ベクター、形質転換された細胞、第９因子の製造方法および得られた対応する生成物Info
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- JPH02265487A JPH02265487A JP1293766A JP29376689A JPH02265487A JP H02265487 A JPH02265487 A JP H02265487A JP 1293766 A JP1293766 A JP 1293766A JP 29376689 A JP29376689 A JP 29376689A JP H02265487 A JPH02265487 A JP H02265487A
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- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
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- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12N9/644—Coagulation factor IXa (3.4.21.22)
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- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明は、ヒト第Ｘ因子または類似の蛋白質をコードす
る新規なりＮＡ配列に関する。該配列は、宿主細胞、特
にを椎動物細胞、とりわけ哺乳類細胞における発現に利
用できる、 従来技術 第Ｘ因子は、血液凝固に関与するビタミンに一依存性蛋
白質である。該因子は、チモーゲンの形態で合成され、
血中に分泌される前に、３種類の翻訳後修飾を受ける：
即ち、グルタミン酸のカルボキシグルタミン酸へのビタ
ミンに依存性変換、炭化水素鎖の付加およびアスパラギ
ン酸のβ−水酸化である。ヒトにおいては、肝臓が第Ｘ
因子の合成部位である。この蛋白質は、血液凝固サイク
ルに係わり、血友病Ｂ患者の治療に使用される。
る新規なりＮＡ配列に関する。該配列は、宿主細胞、特
にを椎動物細胞、とりわけ哺乳類細胞における発現に利
用できる、 従来技術 第Ｘ因子は、血液凝固に関与するビタミンに一依存性蛋
白質である。該因子は、チモーゲンの形態で合成され、
血中に分泌される前に、３種類の翻訳後修飾を受ける：
即ち、グルタミン酸のカルボキシグルタミン酸へのビタ
ミンに依存性変換、炭化水素鎖の付加およびアスパラギ
ン酸のβ−水酸化である。ヒトにおいては、肝臓が第Ｘ
因子の合成部位である。この蛋白質は、血液凝固サイク
ルに係わり、血友病Ｂ患者の治療に使用される。
現在市販されている唯一の第■因子源は、ヒト血漿であ
る。
る。
しかしながら、血漿抽出物から得られた第Ｘ因子製剤は
、発熱性である可能性があり、また、病原性因子または
ウィルス、特に肝炎ウィルスまたはＡＩＤＳベクター因
子で汚染されている危険性を伴う。
、発熱性である可能性があり、また、病原性因子または
ウィルス、特に肝炎ウィルスまたはＡＩＤＳベクター因
子で汚染されている危険性を伴う。
この理由により、ヒトまたは動物血漿からの抽出作業を
必要とすることなく、極めて純度の高い第Ｘ因子を製造
する方法を開発することが、特に有利である。
必要とすることなく、極めて純度の高い第Ｘ因子を製造
する方法を開発することが、特に有利である。
従って、過去数年間、組換えＤＮＡ技術を用いて、第Ｘ
因子を製造する試みがなされている。
因子を製造する試みがなされている。
特に、先願である欧州特許公開Ｅ Ｐ Ｏ，１６７，４
２０、Ｅ Ｐ Ｏ，１６２，７８２およびＥ Ｐ ０．
２５１．８７４において、本出願人は、宿主細胞に第■
因子生産能を与えるために、宿主細胞を形質転換させる
方法を開示している。
２０、Ｅ Ｐ Ｏ，１６２，７８２およびＥ Ｐ ０．
２５１．８７４において、本出願人は、宿主細胞に第■
因子生産能を与えるために、宿主細胞を形質転換させる
方法を開示している。
他のビタミンに依存性蛋白質の発現において既に得られ
ていた結果から予測できる知見と合致して、考慮できる
全ての宿主細胞の内でも、哺乳類の細胞が最も有益な結
果をもたらす。例えば、哺乳類細胞における第■因子ま
たは蛋白質Ｃの発現は好結果をもたらし、十分に活性な
蛋白質の生産を導いた（バーフナ−ケイ、 （Ｂｅｒ
ｋｎｅｒ Ｋ、）ら、コールド スプリング ハーバ−
（Ｃｏｌｄ ＳｐｒｌｎｇＨａｒｂｏｒ）、クオンティ
テイティブ バイオロジー（Ｑａｎｔｌｔａｔｉｖｅ
Ｂｌｏｌｏｇｙ）学会、Ｖｏｌ、ＬＩ、 １９８Ｂ）。
ていた結果から予測できる知見と合致して、考慮できる
全ての宿主細胞の内でも、哺乳類の細胞が最も有益な結
果をもたらす。例えば、哺乳類細胞における第■因子ま
たは蛋白質Ｃの発現は好結果をもたらし、十分に活性な
蛋白質の生産を導いた（バーフナ−ケイ、 （Ｂｅｒ
ｋｎｅｒ Ｋ、）ら、コールド スプリング ハーバ−
（Ｃｏｌｄ ＳｐｒｌｎｇＨａｒｂｏｒ）、クオンティ
テイティブ バイオロジー（Ｑａｎｔｌｔａｔｉｖｅ
Ｂｌｏｌｏｇｙ）学会、Ｖｏｌ、ＬＩ、 １９８Ｂ）。
しかしながら、第Ｘ因子の特異性および、余り高くない
費用で工業的開発を期待するに十分な収量で生産できか
つ活性である生成物を得ることの困難は、すぐに明らか
となった。
費用で工業的開発を期待するに十分な収量で生産できか
つ活性である生成物を得ることの困難は、すぐに明らか
となった。
最近の刊行物（リース デイ、ジエイ、ジー（Ｒｅｅｓ
Ｄ、Ｊ、Ｇ、） Ｅｍｂｏ Ｊ、、 １９８８． ｖ
ｏｌ、７．２０５３ ）には、イヌ腎（ＭＤＣＫ）細胞
から非常に活性な第Ｘ因子の生産が開示されているが、
発現レベルは極端に低く、０．２〜０．３μｇ／１０６
細胞／２４時間である。これらの低い発現レベルにおい
て、第Ｘ因子に活性を付与するのに必要なカルボキシル
化反応は飽和化しないことが観察され、このことは観察
された非常に大きな比活性を説明する。
Ｄ、Ｊ、Ｇ、） Ｅｍｂｏ Ｊ、、 １９８８． ｖ
ｏｌ、７．２０５３ ）には、イヌ腎（ＭＤＣＫ）細胞
から非常に活性な第Ｘ因子の生産が開示されているが、
発現レベルは極端に低く、０．２〜０．３μｇ／１０６
細胞／２４時間である。これらの低い発現レベルにおい
て、第Ｘ因子に活性を付与するのに必要なカルボキシル
化反応は飽和化しないことが観察され、このことは観察
された非常に大きな比活性を説明する。
また、第Ｘ因子ｃＤＮＡの一次翻訳生成物の構造は、周
知であり、３種のドメインに分割される：Ｎ末端には、
−次翻訳生成物が小胞体膜を通過する時に切り出される
２８個のアミノ酸のシグナル配列が存在する。次いで、
１２個のグルタミン酸のカルボキシル化を指示する１８
個のアミノ酸のプロシークエンス（ｐｒｏｓｅｑｕｃｎ
ｃｅ）が存在し、次に成熟第■因子をコードする配列が
存在する。最近の研究で、２種の要素が第Ｘ因子に生物
活性を与えるた妙に必須であることがわかった。２つの
要素とは、一つは、ビタミンに依存性カルボキシル化で
あり、もう一つは、第Ｘ因子が細胞外に分泌される時に
切り出されるプロシークエンスである。
知であり、３種のドメインに分割される：Ｎ末端には、
−次翻訳生成物が小胞体膜を通過する時に切り出される
２８個のアミノ酸のシグナル配列が存在する。次いで、
１２個のグルタミン酸のカルボキシル化を指示する１８
個のアミノ酸のプロシークエンス（ｐｒｏｓｅｑｕｃｎ
ｃｅ）が存在し、次に成熟第■因子をコードする配列が
存在する。最近の研究で、２種の要素が第Ｘ因子に生物
活性を与えるた妙に必須であることがわかった。２つの
要素とは、一つは、ビタミンに依存性カルボキシル化で
あり、もう一つは、第Ｘ因子が細胞外に分泌される時に
切り出されるプロシークエンスである。
発明の開示
従って、本発明の目的とするところは、肝臓細胞におけ
る第Ｘ因子の成熟メカニズムについての最近の科学的デ
ータの観点から、遺伝子工学で第Ｘ因子を製造する従来
の試みにおいて生じた問題点を解決することにある。特
に、本発明の目的は、工業的利用に適う程度の発現レベ
ルで、生物学的に活性であるヒト第Ｘ因子または類似の
蛋白質を製造する方法を提供することである。
る第Ｘ因子の成熟メカニズムについての最近の科学的デ
ータの観点から、遺伝子工学で第Ｘ因子を製造する従来
の試みにおいて生じた問題点を解決することにある。特
に、本発明の目的は、工業的利用に適う程度の発現レベ
ルで、生物学的に活性であるヒト第Ｘ因子または類似の
蛋白質を製造する方法を提供することである。
本発明は、ヒト第Ｘ因子または類似の蛋白質をコードす
るＤＮＡ配列に関する。該配列は、プロシークエンスを
コードする部分および成熟第Ｘ因子または類似の成熟蛋
白質をコードする部分の少なくとも２つの部分を有する
。プロシークエンスをコードする部分において、コドン
（−３）は、バリン、アルギニン、リジン、トレオニン
またはセリンをコードする。
るＤＮＡ配列に関する。該配列は、プロシークエンスを
コードする部分および成熟第Ｘ因子または類似の成熟蛋
白質をコードする部分の少なくとも２つの部分を有する
。プロシークエンスをコードする部分において、コドン
（−３）は、バリン、アルギニン、リジン、トレオニン
またはセリンをコードする。
以下の記載で、マイナスの番号をつけられたコドンは、
プロシークエンスに相当し、成熟第Ｘ因子のアミノ酸を
コードする第１コドンを特徴とする 特に、コドン（−３）の付近の好ましい構造は、下記の
アミノ酸配列に相当する： Ｘ −Ｌｙｓ −Ａｒｇ （−３＞ （−２） （−１）（式中、Ｘ
はバリン、アルギニン、リジン、トレオニンおよびセリ
ンから選ばれるアミノ酸である）一般的にいえば、本明
細書において、“ヒト第Ｘ因子に類似の蛋白質“とけ、
類似の構造を有し、インビボで同タイプの生物学的活性
を有する蛋白質を意味する。すなわち、例えば、第Ｘ因
子と同じ一次構造と、必要であれば、限定された数のア
ミノ酸について数個の修飾を持つ蛋白質、さもなくば第
Ｘ因子と同じ翻訳後修飾を必ずしも持たない蛋白質、或
いは非必須部分において欠失がある同タイプの蛋白質な
どである。
プロシークエンスに相当し、成熟第Ｘ因子のアミノ酸を
コードする第１コドンを特徴とする 特に、コドン（−３）の付近の好ましい構造は、下記の
アミノ酸配列に相当する： Ｘ −Ｌｙｓ −Ａｒｇ （−３＞ （−２） （−１）（式中、Ｘ
はバリン、アルギニン、リジン、トレオニンおよびセリ
ンから選ばれるアミノ酸である）一般的にいえば、本明
細書において、“ヒト第Ｘ因子に類似の蛋白質“とけ、
類似の構造を有し、インビボで同タイプの生物学的活性
を有する蛋白質を意味する。すなわち、例えば、第Ｘ因
子と同じ一次構造と、必要であれば、限定された数のア
ミノ酸について数個の修飾を持つ蛋白質、さもなくば第
Ｘ因子と同じ翻訳後修飾を必ずしも持たない蛋白質、或
いは非必須部分において欠失がある同タイプの蛋白質な
どである。
特に、本発明の対象は、ヒト第Ｘ因子または上記の類似
蛋白質をコードする新規なりＮＡ配列である。該配列は
、第１図に示す第Ｘ因子ｃ ＤＮＡのヌクレオチド配列
と比較する場合、対応するアミノ酸配列において、プロ
リン（−３）がプロシークエンス中のバリン、アルギニ
ン、リジン、トレオニンまたはセリンに変換されるよう
な少なくとも１個のヌクレオチドの変異を有する。
蛋白質をコードする新規なりＮＡ配列である。該配列は
、第１図に示す第Ｘ因子ｃ ＤＮＡのヌクレオチド配列
と比較する場合、対応するアミノ酸配列において、プロ
リン（−３）がプロシークエンス中のバリン、アルギニ
ン、リジン、トレオニンまたはセリンに変換されるよう
な少なくとも１個のヌクレオチドの変異を有する。
このＤＮＡ配列は、宿主細胞における第Ｘ因子または類
似蛋白質の発現に有用である。上述の理由により、好ま
しい宿主細胞は、を椎動物細胞、特に哺乳類細胞である
。
似蛋白質の発現に有用である。上述の理由により、好ま
しい宿主細胞は、を椎動物細胞、特に哺乳類細胞である
。
事実、第Ｘ因子ｃＤＮＡの一次翻訳生成物は上記したご
と（，３種のドメインを含有する。また、本発明のＤＮ
Ａ配列は、好ましくは、第Ｘ因子の発現を促進すること
ができるシグナル配列をコードする部分をも含む。しか
しながら、この部分が第Ｘ因子の天然シグナル配列に相
当することは必須ではない。また、この部分は、所望で
あれば、第■囚子、蛋白質Ｃなどのビタミンに依存性蛋
白質のシグナル配列と置換されていても良い。
と（，３種のドメインを含有する。また、本発明のＤＮ
Ａ配列は、好ましくは、第Ｘ因子の発現を促進すること
ができるシグナル配列をコードする部分をも含む。しか
しながら、この部分が第Ｘ因子の天然シグナル配列に相
当することは必須ではない。また、この部分は、所望で
あれば、第■囚子、蛋白質Ｃなどのビタミンに依存性蛋
白質のシグナル配列と置換されていても良い。
さらに詳しくは、本発明の配列は、ポジション（−３）
に、プロリンをコードするＣＣＡコドンの代わりに、バ
リンをコードするＧＴＧまたはＧＴＡコドンを有する。
に、プロリンをコードするＣＣＡコドンの代わりに、バ
リンをコードするＧＴＧまたはＧＴＡコドンを有する。
本発明の第２の対象は、新規な第Ｘ因子類縁物質および
これらの新規な類縁物質をコードする新規なりＮＡ配列
である。後者は、（Ａｌａ’）ＦＩＸ類縁物質（ＦＩＸ
は、天然または組換え第■囚子或いは上記類似蛋白質を
意味する）である。
これらの新規な類縁物質をコードする新規なりＮＡ配列
である。後者は、（Ａｌａ’）ＦＩＸ類縁物質（ＦＩＸ
は、天然または組換え第■囚子或いは上記類似蛋白質を
意味する）である。
同様に、本発明は、これらの新規な類縁物質をツー下す
るＤＮＡ配列（５′末端がアラニンをコードする）に関
する。特に、該配列は、第１図に示す第Ｘ因子ｃＤＮＡ
のヌクレオチド配列と比較する場合、対応するアミノ酸
配列において、チロシン（＋１）がアラニンに変換され
るような少なくとも１個のヌクレオチドの変異を有する
。
るＤＮＡ配列（５′末端がアラニンをコードする）に関
する。特に、該配列は、第１図に示す第Ｘ因子ｃＤＮＡ
のヌクレオチド配列と比較する場合、対応するアミノ酸
配列において、チロシン（＋１）がアラニンに変換され
るような少なくとも１個のヌクレオチドの変異を有する
。
さらに詳しくは、本発明の配列は、ポジション（＋１）
でチロシンをコードするＴＡＴコドンの代わりに、アラ
ニンをコードするコドンＧＣＣまたはＧＣＴを有する。
でチロシンをコードするＴＡＴコドンの代わりに、アラ
ニンをコードするコドンＧＣＣまたはＧＣＴを有する。
最後に、本発明の第３の対象は、コドン（＋１）がアラ
ニンをコードし、コドン（−３）がバリン、アルギニン
、リジン、トレオニンまたはセリンをコードする、ヒト
第Ｘ因子または類似蛋白質をコードするＤＮＡ配列であ
る。
ニンをコードし、コドン（−３）がバリン、アルギニン
、リジン、トレオニンまたはセリンをコードする、ヒト
第Ｘ因子または類似蛋白質をコードするＤＮＡ配列であ
る。
したがって、このＤＮＡ配列は、好ましくは、−Ｘ−Ｌ
ｙｓ−Ａｒｇ−Ａｌａ− （−３） （−２） （−１） （＋ｔ）（Ｘ
はバリン、アルギニン、リジン、トレオニンおよびセリ
ンから選ばれるアミノ酸である。）をコードする配列を
含有する。
ｙｓ−Ａｒｇ−Ａｌａ− （−３） （−２） （−１） （＋ｔ）（Ｘ
はバリン、アルギニン、リジン、トレオニンおよびセリ
ンから選ばれるアミノ酸である。）をコードする配列を
含有する。
特に、本発明の対象は、第１図に示すヌクレオチド配列
に比べて、対応するプロシークエンスにおいて、プロリ
ン（−３）がバリン、アルギニン、リジン、トレオニン
またはセリンに変換され、且つ成熟第Ｘ因子または成熟
した類似蛋白質をコードする配列において、チロシン（
＋１）がアラニンに変換されるような変異を有する、ヒ
ト第Ｘ因子または類似蛋白質をコードする新規なりＮＡ
配列にある。
に比べて、対応するプロシークエンスにおいて、プロリ
ン（−３）がバリン、アルギニン、リジン、トレオニン
またはセリンに変換され、且つ成熟第Ｘ因子または成熟
した類似蛋白質をコードする配列において、チロシン（
＋１）がアラニンに変換されるような変異を有する、ヒ
ト第Ｘ因子または類似蛋白質をコードする新規なりＮＡ
配列にある。
第Ｘ因子の遺伝子を担うクローンを製造する方法につい
ては、再度詳しくは述べない。既に述べた特許公開が参
考文献として挙げられ、その内容は、本明細書の一部を
なすものである。
ては、再度詳しくは述べない。既に述べた特許公開が参
考文献として挙げられ、その内容は、本明細書の一部を
なすものである。
また、本発明の対象は、宿主細胞において第Ｘ因子また
は類似蛋白質の発現のためのベクターである。該ベクタ
ーは、少なくとも、本発明のＤＮＡ配列および該細胞で
該配列を発現させるための要素を有する。
は類似蛋白質の発現のためのベクターである。該ベクタ
ーは、少なくとも、本発明のＤＮＡ配列および該細胞で
該配列を発現させるための要素を有する。
有用なベクターについては、ポックスウィルス族のウィ
ルス、特にワクシニアウィルスまたは牛皮ウィルス、或
いはプラスミドベクター、特に組み込みベクターを挙げ
ることができる。その他の代替可能なベクターについて
は、前述の特許出願、特に特許出願Ｅ ＰＯ，１６２，
７８２、Ｅ ＰＯ，２５１，８７４などに詳しく記載さ
れる。
ルス、特にワクシニアウィルスまたは牛皮ウィルス、或
いはプラスミドベクター、特に組み込みベクターを挙げ
ることができる。その他の代替可能なベクターについて
は、前述の特許出願、特に特許出願Ｅ ＰＯ，１６２，
７８２、Ｅ ＰＯ，２５１，８７４などに詳しく記載さ
れる。
使用するベクターに適合する限り、特に、用いるベクタ
ーがウィルスベクターかプラスミドベクターかに応じて
、宿主細胞は種々のタイプであってよい。哺乳類細胞、
特にＶＥＲＯ細胞、ＢＨＫ２１細胞等の肝臓細胞が特に
好適に使用される。
ーがウィルスベクターかプラスミドベクターかに応じて
、宿主細胞は種々のタイプであってよい。哺乳類細胞、
特にＶＥＲＯ細胞、ＢＨＫ２１細胞等の肝臓細胞が特に
好適に使用される。
ＣＨＯ細胞を感染させるためには、牛皮ウィルス由来の
ベクターを用いる。
ベクターを用いる。
成長のための適当な培地で、上記細胞を培養する。形質
転換または感染の後に、細胞または培地を回収して、第
Ｘ因子蛋白質またはその活性類縁物質を公知の蛋白質精
製方法により単離することができる。
転換または感染の後に、細胞または培地を回収して、第
Ｘ因子蛋白質またはその活性類縁物質を公知の蛋白質精
製方法により単離することができる。
はとんどの場合、ビタミンＫを含有する培地上で培養す
ることが重要である。ビタミンにの世は、細胞培養物に
よって異なり、好ましくは培地を飽和させる量であり、
例えば５〜５０μｇ／培地１１、通常１０μｇ／ｍｌの
オーダーである。
ることが重要である。ビタミンにの世は、細胞培養物に
よって異なり、好ましくは培地を飽和させる量であり、
例えば５〜５０μｇ／培地１１、通常１０μｇ／ｍｌの
オーダーである。
最後に、本発明は、上記の方法に従って得られる第Ｘ因
子に関する。特に、本発明は、チロシン（＋１）がアラ
ニンに変換されているヒト第Ｘ因子類縁物質に関する。
子に関する。特に、本発明は、チロシン（＋１）がアラ
ニンに変換されているヒト第Ｘ因子類縁物質に関する。
本発明の他の特徴および利点は、第１図および第２図で
説明されるように、下記で明らかにされる。
説明されるように、下記で明らかにされる。
実施例１：第Ｘ因子ｃＤＮＡの構築
第Ｘ因子ｃＤＮＡをＢａｍＨＩフラグメントの形態でプ
ラスミドｐＴＧ３８１にクローンした。
ラスミドｐＴＧ３８１にクローンした。
非コーディング５′末端をコザック則（Ｋｏｚａｋ ’
５ｒｕｌｅ）により良く従うようにさせるために、ｐ
ＴＧ３８１の構築が行われた。ｐ’ｒＧ３８１の構築は
、前述の特許公開Ｅ Ｐ −Ａ −０，２５１，８７４
に記載されている。ＢａｍＨＩフラグメントは、ポリリ
ンカーの制限部位が２０Ｂｇ Ｉ ＩＩ、ＰｓｔＩ、Ｈ
ｉｎｄｍ、Ｓｍａ ＩＳＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで
ある以外は、ファージＭ１３７Ｇ１３１（キーニー（Ｋ
ｉｅｎｙ）ら、１９８３、ジーン（Ｇｅｎｅ））と同一
のファージＭ１３ＴＧ１２７に再クローンされる。第Ｘ
因子ｃＤＮＡの５′末端がＳｍａＩ部位に隣接する新規
な構築物をＭ１３ＴＧ１９３８と称する。
５ｒｕｌｅ）により良く従うようにさせるために、ｐ
ＴＧ３８１の構築が行われた。ｐ’ｒＧ３８１の構築は
、前述の特許公開Ｅ Ｐ −Ａ −０，２５１，８７４
に記載されている。ＢａｍＨＩフラグメントは、ポリリ
ンカーの制限部位が２０Ｂｇ Ｉ ＩＩ、ＰｓｔＩ、Ｈ
ｉｎｄｍ、Ｓｍａ ＩＳＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで
ある以外は、ファージＭ１３７Ｇ１３１（キーニー（Ｋ
ｉｅｎｙ）ら、１９８３、ジーン（Ｇｅｎｅ））と同一
のファージＭ１３ＴＧ１２７に再クローンされる。第Ｘ
因子ｃＤＮＡの５′末端がＳｍａＩ部位に隣接する新規
な構築物をＭ１３ＴＧ１９３８と称する。
ファージＭ１３ＴＧ１９３８から一本鎖ＤＮＡを製造し
、公知の位置特異的突然変異誘発技術（シラー（Ｚｏｌ
ｌｅｒ）およびスミス（Ｓ＋ｎ１ｔｈ） ）に従って、
第■因子ｃＤＮＡ上で変異誘発を行う。
、公知の位置特異的突然変異誘発技術（シラー（Ｚｏｌ
ｌｅｒ）およびスミス（Ｓ＋ｎ１ｔｈ） ）に従って、
第■因子ｃＤＮＡ上で変異誘発を行う。
ａ）プロリン（−３）がバリンに変換されているアミノ
酸配列に相当するｃＤＮＡの構築。
酸配列に相当するｃＤＮＡの構築。
ＴＧ１７７１と称される合成オリゴヌクレオチド ５’
−ＡＴＡＣＴＣＣＴＣＡＣＣＣＧＡＴＴＣＡＧ−３’を
使用する。
−ＡＴＡＣＴＣＣＴＣＡＣＣＣＧＡＴＴＣＡＧ−３’を
使用する。
このオリゴヌクレオチドを一本鎖ＤＮＡフラグメントと
５０℃で３０分間迅速にハイブリダイズさせる。次いで
、デオキシヌクレオチドトリフオスフェートの存在下に
、ハイブリダイズさせた混合物をポリメラーゼクレノー
フラグメントで処理することにより、二本鎖分子を製造
する。形質転換の後、プローブとして放射性物質で標識
したオリゴヌクレオチドＴＧ１７７１を用いて、ハイブ
リダイゼーションにより、効果的に所望の変異を遂げた
分子を同定する。
５０℃で３０分間迅速にハイブリダイズさせる。次いで
、デオキシヌクレオチドトリフオスフェートの存在下に
、ハイブリダイズさせた混合物をポリメラーゼクレノー
フラグメントで処理することにより、二本鎖分子を製造
する。形質転換の後、プローブとして放射性物質で標識
したオリゴヌクレオチドＴＧ１７７１を用いて、ハイブ
リダイゼーションにより、効果的に所望の変異を遂げた
分子を同定する。
所望の変異を確認するために、新規な第■囚子ｃＤＮＡ
の５′末端のＤＮＡ配列を調べる。プロリンをコードす
るＣＣＡコドンは、バリンをコードするＧＴＧコドンに
よって置換されている。
の５′末端のＤＮＡ配列を調べる。プロリンをコードす
るＣＣＡコドンは、バリンをコードするＧＴＧコドンに
よって置換されている。
ｂ）チロシン（＋１）がアラニンに変換されているアミ
ノ酸配列に相当するｃＤＮＡの構築。
ノ酸配列に相当するｃＤＮＡの構築。
ＴＧ１７７０と称される合成オリゴヌクレオチド５’−
ＣＴＧＡＡＴＴＡＧＣＣＣＴＣＴＴＴＡＣＣＣＧＡＴＴ
Ｃ−３’を用いる。
ＣＴＧＡＡＴＴＡＧＣＣＣＴＣＴＴＴＡＣＣＣＧＡＴＴ
Ｃ−３’を用いる。
この場合、チロシンをコードするＴＡＴコドンは、アラ
ニンをコードするＧＣＣコドンにより置換されている。
ニンをコードするＧＣＣコドンにより置換されている。
条件は、ａ）に記載のものと同じである。
Ｃ）チロシン（＋１）がアラニンに変換され、且つプロ
リン（−３）がバリンに変換されているアミノ酸配列に
相当するｃＤＮＡの構築。
リン（−３）がバリンに変換されているアミノ酸配列に
相当するｃＤＮＡの構築。
ＴＧ１３２７と称される合成オリゴヌクレオチド５ ’
−ＣＴＧＡＡＴＴＡＧＣＣＣＴＣＴＴＡＣＣＣＧＡＴ
ＴＣ−３’ を用いる。
−ＣＴＧＡＡＴＴＡＧＣＣＣＴＣＴＴＡＣＣＣＧＡＴ
ＴＣ−３’ を用いる。
この場合、プロリン（−３）をコードするＣＣＡコドン
は、バリンをコードするＧＴＡコドンによって置換され
、チロシン（＋１）をコードするＴＡＴコドンは、アラ
ニンをコードするＧＣＴコドンにより置換されている。
は、バリンをコードするＧＴＡコドンによって置換され
、チロシン（＋１）をコードするＴＡＴコドンは、アラ
ニンをコードするＧＣＴコドンにより置換されている。
Ｌ記により得られた新規なｃＤＮＡを、制限酵素Ｂａｍ
ＨＩでＭ１３ベクターから切り出す。これらのフラグメ
ントをアガロースゲル電気泳動により単離し、ＢａｍＨ
Ｉで消化されたプラスミドベクターｐＴＧ１８６−ｐｏ
ｌｙに挿入する。ｐＴＧｌ ８６−ｐｏｎｙは、その構
築が前述の欧州特許公開Ｅ Ｐ ０．１６２゜７８２に
記載され、既に述べたファージＭ１３７Ｇ１３１のポリ
リンカーのＢｇ Ｉ ＩＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントを
更に含有するｐＴＧ１８６の誘導体である。
ＨＩでＭ１３ベクターから切り出す。これらのフラグメ
ントをアガロースゲル電気泳動により単離し、ＢａｍＨ
Ｉで消化されたプラスミドベクターｐＴＧ１８６−ｐｏ
ｌｙに挿入する。ｐＴＧｌ ８６−ｐｏｎｙは、その構
築が前述の欧州特許公開Ｅ Ｐ ０．１６２゜７８２に
記載され、既に述べたファージＭ１３７Ｇ１３１のポリ
リンカーのＢｇ Ｉ ＩＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントを
更に含有するｐＴＧ１８６の誘導体である。
得られた３種のプラスミドニ
ーＦＩＸ −３ｖａｔ／＋１ａｌａ （オリゴヌクレ
オチドＴＧ１３２７）に対応するｐＴＧ３５３３、−Ｆ
ＩＸ −３ｖａｔ （オリゴヌクレオチドＴＧ１７７
１）に対応するｐＴＧ３５３６、−ＦＩＸ ＋１ ａｌ
ａ （オリゴヌクレオチドＴＧ１７７０）に対応するｐ
ＴＧ３５３７ を、欧州特許公開Ｅ Ｐ ０．１６２，７８２に記載さ
れた条件下に、ワクシニアウィルスゲノムにそれぞれ挿
入する。
オチドＴＧ１３２７）に対応するｐＴＧ３５３３、−Ｆ
ＩＸ −３ｖａｔ （オリゴヌクレオチドＴＧ１７７
１）に対応するｐＴＧ３５３６、−ＦＩＸ ＋１ ａｌ
ａ （オリゴヌクレオチドＴＧ１７７０）に対応するｐ
ＴＧ３５３７ を、欧州特許公開Ｅ Ｐ ０．１６２，７８２に記載さ
れた条件下に、ワクシニアウィルスゲノムにそれぞれ挿
入する。
５−ブロモデオキシウリジンを用いて、第■因子をコー
ドする配列がワクシニアの７．５にプロモータの支配下
にある組換えワクシニアウィルスをＴＫ−表現型につい
てスクリーニングする。
ドする配列がワクシニアの７．５にプロモータの支配下
にある組換えワクシニアウィルスをＴＫ−表現型につい
てスクリーニングする。
５６°Ｃで３０分間加熱することにより不活性化された
牛胎児血清５％を補われたＭＥＭグラスゴー培地中で、
ビタミンＫＩＯμｇ／ｍｌの存在下に、細胞を培養する
。感染濃度１ｐｆｕで、組換えウィルスにより該細胞を
感染させる。細胞を培地だけで３回洗浄し、次いで、完
全培地と接触させる。
牛胎児血清５％を補われたＭＥＭグラスゴー培地中で、
ビタミンＫＩＯμｇ／ｍｌの存在下に、細胞を培養する
。感染濃度１ｐｆｕで、組換えウィルスにより該細胞を
感染させる。細胞を培地だけで３回洗浄し、次いで、完
全培地と接触させる。
２４時間後、培養土清み中の第■囚子の存在を２種の方
法で試験するニ ー第■因子抗原の量をＥＬ Ｉ ＳＡ試験（ダイアグノ
スチカ スタガ（Ｄａｌａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｓｔａｇ
ｏ）製）により算出する。
法で試験するニ ー第■因子抗原の量をＥＬ Ｉ ＳＡ試験（ダイアグノ
スチカ スタガ（Ｄａｌａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｓｔａｇ
ｏ）製）により算出する。
一抽出物（スタガ（Ｓｔａｇｏ）により市販されるキッ
ト）を加え、血友病患者の血漿の凝固時間を測定するこ
とにより、第■囚子の活性を計算する。
ト）を加え、血友病患者の血漿の凝固時間を測定するこ
とにより、第■囚子の活性を計算する。
結果を下記の表に示す。第■因子抗原の皿は、μｇ／試
料１１で表わされる。
料１１で表わされる。
活性は、比活性で表わす。このために、測定された活性
を正常人血漿の混合物を用いて得られた活性と比較する
。
を正常人血漿の混合物を用いて得られた活性と比較する
。
表に示される比較例は、その構築が欧州特許公開Ｅ Ｐ
−Ａ −０，１６２，７８２に開示された第■因子ｃ
ＤＮＡの発現のための組換えウィルスＶＶＴＧＣ■であ
る。
−Ａ −０，１６２，７８２に開示された第■因子ｃ
ＤＮＡの発現のための組換えウィルスＶＶＴＧＣ■であ
る。
特に組換えワクシニアウィルスＶＶＴＧ３５３３および
ＶＶＴＧ３５３７において、比較し得る発現レベルで強
い比活性がみられる。生産された第■因子の活性が実質
的に１００％であるので、ウィルスＶＶＴＧ３５３７が
特に有利である。対照は正常血漿であり、ＦＩＸ ５μ
ｇ ／ ｍ Ｉについて１００％活性である。
ＶＶＴＧ３５３７において、比較し得る発現レベルで強
い比活性がみられる。生産された第■因子の活性が実質
的に１００％であるので、ウィルスＶＶＴＧ３５３７が
特に有利である。対照は正常血漿であり、ＦＩＸ ５μ
ｇ ／ ｍ Ｉについて１００％活性である。
下記の菌株をパリのアンスティテユ バストウール（Ｉ
ｎｓｔｉｔｕｔ Ｐａ５ｔｅｕｒ）のコレクシオン ナ
シオナル ド キュルチュール ド ミクロオルガニス
ムス（Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄ
ｅ Ｃｕ１ｔｕｒｅｓｄａ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｍｉｓ
ｍｃｓ ）に１９８８年１１月８日に寄託した。
ｎｓｔｉｔｕｔ Ｐａ５ｔｅｕｒ）のコレクシオン ナ
シオナル ド キュルチュール ド ミクロオルガニス
ムス（Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄ
ｅ Ｃｕ１ｔｕｒｅｓｄａ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｍｉｓ
ｍｃｓ ）に１９８８年１１月８日に寄託した。
−Ｅ、ｃｏｌ ｉ ｐＴＧ３５３７ （寄託番号■−
Ｅ、ｃｏ Ｉ Ｌ ｐＴＧ３５３６ （寄託番号ｌ−
Ｅ、ｃｏ １ ｉ ｐＴＧ３５３３ （寄託番号ｌ一
番８１２）。
Ｅ、ｃｏ Ｉ Ｌ ｐＴＧ３５３６ （寄託番号ｌ−
Ｅ、ｃｏ １ ｉ ｐＴＧ３５３３ （寄託番号ｌ一
番８１２）。
第１表
組換えワクシニアウィルスで感染されたＢＨＫ２１細胞
で検出された第■因子の量 よび対応するアミノ酸配列を示す。
で検出された第■因子の量 よび対応するアミノ酸配列を示す。
第２図は、第１図に示すｃＤＮＡの一次翻訳生成物の種
々のドメイン構造の大要を示すものである。
々のドメイン構造の大要を示すものである。
（以 上）
組換えワタ
シニア
ウィルス
ＶＶＴＧＣＩＩ ２．５
ＶＶＴＧ３５３６ ２．０
ＶＶＴＧ３５３３ １．９
ＶＶＴＧ３５３７ ２．３
図面の簡単な説明
第１図は、ヒト第■因子のヌクレオチド配列お得られた
分子
天然ＦＩＸ
天然ＦＩＸ
（Ａｌａｌ）ＦＩＸ
（Ａｌａ’ ）ＦＩＸ
比活性（％）
ＦＩＸ活性
／ＦＩＸ Ａｇ
ＦＩＸ Ａｇ
（μｇ／ｌ）
補正の内容
第１図を別紙の通りとする（内容に変更なし）。
事件の表示
平成１年特許願第２９３７６６号
発明の名称
ヒト第Ｘ因子または類似の蛋白質をコードするＤＮＡ配
列、発現ベクター、形質転換された細胞、第Ｘ因子の製
造方法お（以 上） 事件との関係 特許出願人 トランスジーン ソシエテ アノニム
列、発現ベクター、形質転換された細胞、第Ｘ因子の製
造方法お（以 上） 事件との関係 特許出願人 トランスジーン ソシエテ アノニム
Claims (20)
- （１）プロシークエンスをコードする部分および成熟第
IX因子または類似の成熟蛋白質をコードする部分の少な
くとも２つの部分を有し、プロシークエンスをコードす
る部分において、コドン（−３）がバリン、アルギニン
、リジン、トレオニンまたはセリンをコードすることを
特徴とするヒト第IX因子または類似蛋白質をコードする
ＤＮＡ配列。 - （２）▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｘはバリン、アルギニン、リジン、トレオニン
およびセリンから選ばれるアミノ酸である）をコードす
る配列をポジション（−３）の付近に有する請求項１に
記載のＤＮＡ配列。 - （３）第１図に示す第IX因子ｃＤＮＡのヌクレオチド配
列と比較する場合、対応するアミノ酸配列において、プ
ロリン（−３）がプロシークエンス中のバリン、アルギ
ニン、リジン、トレオニンまたはセリンに変換されるよ
うな少なくとも１個のヌクレオチドの変異を有する配列
であることを特徴とするヒト第IX因子または類似の蛋白
質をコードする請求項１または２に記載のＤＮＡ配列。 - （４）プロリンをコードするＣＣＡコドンがバリンをコ
ードするＧＴＧコドンまたはＧＴＡコドンで置換されて
いる請求項３に記載のＤＮＡ配列。 - （５）アラニンをコードする５′末端を有する、成熟し
たヒト第IX因子または成熟した類似蛋白質をコードする
ＤＮＡ配列。 - （６）プロシークエンスをコードする部分および成熟第
IX因子または類似の成熟蛋白質をコードする部分の少な
くとも２つの部分を有し、第１図に示す第IX因子ｃＤＮ
Ａのヌクレオチド配列と比較する場合、対応するアミノ
酸配列において、チロシン（＋１）がアラニンに変換さ
れるような少なくとも１個のヌクレオチドの変異を有す
る配列であることを特徴とするヒト第IX因子または類似
の蛋白質をコードする請求項５に記載のＤＮＡ配列。 - （７）チロシンをコードするＴＡＴコドンがアラニンを
コードするコドンＧＣＣまたはＧＣＴにより置換されて
いる請求項５または６に記載のＤＮＡ配列。 - （８）コドン（＋１）がアラニンをコードし、コドン（
−３）がバリン、アルギニン、リジン、トレオニンまた
はセリンをコードすることを特徴とする、ヒト第IX因子
または類似の蛋白質をコードするＤＮＡ配列。 - （９）▲数式、化学式、表等があります▼ （Ｘはバリン、アルギニン、リジン、トレオニンおよび
セリンから選ばれるアミノ酸である。）をコードする配
列を有する請求項８に記載のＤＮＡ配列。 - （１０）第１図に示す第IX因子ｃＤＮＡのヌクレオチド
配列と比較する場合、対応するプロシークエンスにおい
て、プロリン（−３）がバリン、アルギニン、リジン、
トレオニンまたはセリンに変換され、且つ成熟第IX子ま
たは類似の成熟蛋白質をコードする配列において、チロ
シン（＋１）がアラニンに変換されるような変異を有す
る配列である請求項８または９に記載のＤＮＡ配列。 - （１１）第IX因子の天然シグナル配列（−４６から−１
８）をコードする部分をも有する請求項１乃至１０のい
ずれかに記載のＤＮＡ配列。 - （１２）ベクターが請求項１乃至１１のいずれかに記載
のＤＮＡ配列の少なくとも１種および宿主細胞において
該配列を発現させるための要素を有することを特徴とす
る、宿主細胞において第IX因子または類似の蛋白質を発
現するベクター。 - （１３）ヒト第IX因子または類似の蛋白質をコードする
ＤＮＡ配列が挿入されているポックスウィルス族のウィ
ルスゲノムからなる請求項１２に記載のベクター。 - （１４）ポックスウィルスがワクシニアウィルスおよび
牛痘ウィルスから選択される請求項１３に記載のベクタ
ー。 - （１５）組み込みプラスミドである請求項１３に記載の
ベクター。 - （１６）請求項１３または１４に記載のベクターで感染
されているか、或いは請求項１５に記載のベクターで形
質転換された宿主細胞。 - （１７）ＶＥＲＯ、ＢＨＫおよびＣＨＯ細胞並びにこれ
らのサブクラスから選ばれた哺乳類細胞の１種である請
求項１６に記載の細胞。 - （１８）請求項１６または１７に記載の細胞を培養して
、形成された第IX因子または類似の蛋白質を回収するこ
とを特徴とする活性ヒト第IX因子または類似の蛋白質を
製造する方法。 - （１９）細胞培養をビタミンＫを含有する培地で行う請
求項１８に記載の方法。 - （２０）（Ａｌａ＾１）ＦＩＸ （式中、ＦＩＸは天然または組換え第IX因子或いはその
類縁物質を示す）。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR8814635 | 1988-11-09 | ||
| FR8814635A FR2638643B1 (fr) | 1988-11-09 | 1988-11-09 | Sequence d'adn codant pour le facteur ix humain ou une proteine analogue, vecteur d'expression, cellules transformees, procede de preparation du facteur ix et produits obtenus correspondants |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02265487A true JPH02265487A (ja) | 1990-10-30 |
| JP2936201B2 JP2936201B2 (ja) | 1999-08-23 |
Family
ID=9371722
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1293766A Expired - Fee Related JP2936201B2 (ja) | 1988-11-09 | 1989-11-09 | ヒト第▲ｉｘ▼因子または類似の蛋白質をコードするｄｎａ配列、発現ベクター、形質転換された細胞、第▲ｉｘ▼因子の製造方法および得られた対応する生成物 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5521070A (ja) |
| EP (1) | EP0373012B1 (ja) |
| JP (1) | JP2936201B2 (ja) |
| AT (1) | ATE118041T1 (ja) |
| CA (1) | CA2002540C (ja) |
| DE (1) | DE68920980T2 (ja) |
| FR (1) | FR2638643B1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2011517951A (ja) * | 2008-04-16 | 2011-06-23 | バイエル・ヘルスケア・エルエルシー | 修飾された第ｉｘ因子ポリペプチドおよびそれらの使用 |
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|---|---|---|---|---|
| DE69101634T4 (de) * | 1990-01-26 | 1994-12-01 | Immuno Ag | Rekombinant hergestellte blutfaktoren, verfahren zur exprimierung besagter blutfaktoren sowie in besagtem prozess verwendeter rekombinanter vaccina-virus. |
| US6531298B2 (en) | 1997-07-21 | 2003-03-11 | The University Of North Carolina At Chapel Hill | Factor IX antihemophilic factor with increased clotting activity |
| US7399751B2 (en) * | 1999-11-04 | 2008-07-15 | Sertoli Technologies, Inc. | Production of a biological factor and creation of an immunologically privileged environment using genetically altered Sertoli cells |
| EE200200538A (et) * | 2000-03-22 | 2004-04-15 | Octagene Gmbh | Rekombinantsete verehüübimisfaktorite produtseerimine inimese rakuliinides |
| AU2001249389A1 (en) * | 2000-03-22 | 2001-10-03 | The Children's Hospital Of Philadelphia | Modified blood clotting factors and methods of use |
| WO2002040544A2 (en) | 2000-11-14 | 2002-05-23 | Board Of Regents, University Of Texas Systems | Mutant human factor ix with an increased resistance to inhibition by heparin |
| ES2411007T3 (es) | 2001-10-10 | 2013-07-04 | Novo Nordisk A/S | Remodelación y glicoconjugación de péptidos |
| ES2371913T3 (es) | 2003-01-22 | 2012-01-11 | Duke University | Constructos mejorados para expresar polipéptidos lisosomales. |
| PL1615945T3 (pl) | 2003-04-09 | 2012-03-30 | Ratiopharm Gmbh | Sposoby glikopegylacji i białka/peptydy wytwarzane tymi sposobami |
| CA2531022C (en) * | 2003-07-03 | 2014-09-09 | Jannette Dufour | Compositions containing sertoli cells and myoid cells and use thereof in cellular transplants |
| EP1707634A1 (en) | 2005-03-29 | 2006-10-04 | Octapharma AG | Method for isolation of recombinantly produced proteins |
| EP2975135A1 (en) | 2005-05-25 | 2016-01-20 | Novo Nordisk A/S | Glycopegylated factor IX |
| AU2006331501B2 (en) | 2005-12-21 | 2013-09-05 | Aptevo Biotherapeutics Llc | Method of producing biologically active vitamin K dependent proteins by recombinant methods |
| EP2423307A1 (en) | 2006-06-19 | 2012-02-29 | Catalyst Biosciences, Inc. | Modified coagulation factor IV polypeptides and use thereof for treatment |
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| EP2220230A2 (en) * | 2007-11-09 | 2010-08-25 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Modulation of factor 9 expression |
| WO2011053738A1 (en) | 2009-10-30 | 2011-05-05 | Inspiration Biopharmaceuticals, Inc. | Method of producing recombinant vitamin k dependent proteins |
| WO2011095604A1 (en) | 2010-02-04 | 2011-08-11 | Octapharma Biopharmaceuticals Gmbh | Half-life prolongation of proteins |
| US20120076779A1 (en) | 2010-09-17 | 2012-03-29 | Baxter Healthcare S.A. | STABILIZATION OF IMMUNOGLOBULINS AND OTHER PROTEINS THROUGH AQUEOUS FORMULATIONS WITH SODIUM CHLORIDE AT WEAK ACIDIC TO NEUTRAL ph |
| CA2892038C (en) | 2012-11-20 | 2021-12-28 | Darrel W. Stafford | Methods and compositions for modified factor ix proteins |
| WO2017070167A1 (en) | 2015-10-20 | 2017-04-27 | The University Of North Carolina At Chapel Hill | Methods and compositions for modified factor ix fusion proteins |
| AU2019360270B2 (en) | 2018-10-18 | 2025-08-07 | Intellia Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for expressing factor IX. |
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| AU8339187A (en) * | 1986-11-17 | 1988-06-16 | New England Medical Center Hospitals, Inc., The | Enhancing gamma-carboxylation of recombinant vitamin k-dependent proteins |
-
1988
- 1988-11-09 FR FR8814635A patent/FR2638643B1/fr not_active Expired - Fee Related
-
1989
- 1989-11-07 EP EP89403065A patent/EP0373012B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1989-11-07 DE DE68920980T patent/DE68920980T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1989-11-07 AT AT89403065T patent/ATE118041T1/de not_active IP Right Cessation
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- 1989-11-09 JP JP1293766A patent/JP2936201B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1994
- 1994-03-14 US US08/209,489 patent/US5521070A/en not_active Expired - Fee Related
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| DE68920980D1 (de) | 1995-03-16 |
| FR2638643A1 (fr) | 1990-05-11 |
| JP2936201B2 (ja) | 1999-08-23 |
| ATE118041T1 (de) | 1995-02-15 |
| DE68920980T2 (de) | 1995-07-06 |
| EP0373012B1 (fr) | 1995-02-01 |
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| CA2002540C (fr) | 2000-04-04 |
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