JPH0226955B2 - - Google Patents
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- JPH0226955B2 JPH0226955B2 JP55154706A JP15470680A JPH0226955B2 JP H0226955 B2 JPH0226955 B2 JP H0226955B2 JP 55154706 A JP55154706 A JP 55154706A JP 15470680 A JP15470680 A JP 15470680A JP H0226955 B2 JPH0226955 B2 JP H0226955B2
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- JP
- Japan
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- tryptophan
- coli
- trp
- host
- psc101
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/22—Tryptophan; Tyrosine; Phenylalanine; 3,4-Dihydroxyphenylalanine
- C12P13/227—Tryptophan
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- Genetics & Genomics (AREA)
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- Engineering & Computer Science (AREA)
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Description
本発明は、アントラニル酸合成酵素（以下Ａ
Saseという）に対するトリプトフアンによるフ
イードバツク阻害が解除されたトリプトフアンオ
ペロンをもつプラスミドを有し、該プラスミドを
遺伝子操作によつて組換えたトリプトフアン生産
性の高い大腸菌の製法に関する。 従来、微生物特に生産性の高い人工変異株を用
いて発酵法によりアミノ酸等が製造されているこ
とは周知のとおりである。しかし、アミノ酸のう
ちトリプトフアンについては、従来の発酵法は生
産性が低く工業的製法はまだ確立されていない。
他方、近時遺伝子工学の発達により、高等動植物
の遺伝子を大腸菌に移入して有用な物質、例えば
インシユリンや生長ホルモン等を発酵技法により
製造することが行われるようになつた。 本発明者らは、遺伝子操作により大腸菌を形質
転換してトリプトフアン合成活性を与えられたト
リプトフアン高生産性の大腸菌を製造することに
成功した。 本発明は下記のとおりである。 (1) 野生型のトリプトフアンオペロンをもつ組換
えプラスミドを宿主大腸菌に移入し、しかる後
この大腸菌を変異処理し、この際宿主大腸菌が
トリプトフアンレプレツサー及びトリプトフア
ナーゼの欠損したものであるときは後記の形質
転換を行わずそのまま、また、宿主大腸菌がそ
うしたものでないときは前記変異処理した大腸
菌から変異型のプラスミドを取出しこれをトリ
プトフアンレプレツサー及びトリプトフアナー
ゼの欠損した別の宿主大腸菌に移入することに
より形質転換を行い、かくしてアントラニル酸
合成酵素に対するトリプトフアンによるフイー
ドバツク阻害が解除されたトリプトフアンオペ
ロンをもつ組換えプラスミドを有し、かつ、ト
リプトフアンレプレツサー及びトリプトフアナ
ーゼの欠損した大腸菌を造成することを特徴と
するトリプトフアン生産性の高い大腸菌の製
法。 (2) 宿主大腸菌が染色体trpE遺伝子の欠失した
大腸菌である特許請求の範囲第１項記載の製
法。 (3) プラスミドがpSC101由来のものである特許
請求の範囲第１項記載の製法。 本発明において変異処理した大腸菌が保持する
ところのトリプトフアンによるＡ Saseに対す
るフイードバツク阻害が解除されたプラスミドに
ついて説明する。 トリプトフアン合成系の最初の酵素であるＡ
Saseはトリプトフアンによるフイードバツク阻
害を受けるが、トリプトフアンのアナログであ
る、例えば５−メチルトリプトフアンに耐性の株
のなかにはＡ Saseに対するトリプトフアンに
よるフイードバツク阻害が解除されたものが含ま
れている。そこで後述するように大腸菌株
Escherichia coli Ｗ 3110 trpAE1（pSC101−
trp）すなわち、トリプトフアンオペロンを有す
るプラスミド包含の株を変異手段により変異処理
し、そのうち５−メチルトリプトフアン耐性菌に
ついてトリプトフアンによりＡ Sase活性が阻
害されない株を選択する。これらのものから抽出
されたプラスミド（例えばpSC101−trp・I15）
は、トリプトフアンによるフイードバツク阻害が
解除されたトリプトフアンオペロンをもつてい
る。本発明で用いられるトリプトフアンオペロン
を有するプラスミド例えばpSC101−trpは、
Genetics第１巻141〜152頁（1977）に記載された
方法により、又はこれを改善した方法により得る
ことができる。 本発明により製造された大腸菌は、前記のプラ
スミドを移入して形質転換を行つた大腸菌であつ
て、トリプトフアンによるフイードバツク阻害が
解除されていると同時に、トリプトフアンレプレ
ツサーが欠損しトリプトフアナーゼも欠損したも
のである。 本発明により製造された大腸菌は、これを栄養
培地、特にアントラニル酸添加培地に、必要によ
りテトラサイクリン系抗生物質を添加して、培養
すると、培養液からそれ自体公知の採取方法によ
つてＬ−トリプトフアンを高い生産性で採取する
ことができる。この場合における培養及び採取の
方法は、通常の発酵法の場合と同様である。 以下に、本発明について詳述する。 本発明における宿主大腸菌としては、例えば下
記の菌株が使用される。 (1) Escherichia coli Ｗ 3110 trp AE1〔AE1〕 (2) Escherichia coli Ｗ 3110 trp AE1 trp
Ram 27〔Ram〕 (3) Escherichia coli Ｗ 3110 trp AE1 trp Ｒ
tna Ａ〔Tna〕 上記Escherichia coli（以下E.coliという）
W3110は、λ非溶原性（λ-）で性因子Ｆをもた
ない（F-）株であつて、このものはλ溶原性、
性因子ＦをもつE.coli Ｋ−12株に由来する
ATCC27325株である。すなわち、本発明では、
E.coli K12株由来の大腸菌であれば全て宿主菌と
なることができ、さらにトリプトフアン製造を目
的とする場合には、これらの菌にトリプトフアン
オペロンの欠失変異（trp AE1）、トリプトフア
ンレプレツサー欠損変異（trp Ｒ）及びトリプト
フアナーゼ欠損変異（trp Ａ）性を付与された大
腸菌が好適に用いられる。 次に、上記３種の菌株について宿主大腸菌とし
て所持すべき特性を述べる。 trp AE1（トリプトフアンオペロンの欠失変異） 大腸菌のトリプトフアンオペロンは染色体上で
ton Ｂ遺伝子と隣接しているが、ton Ｂはフアー
ジT1が大腸菌に吸着する際に必要なものである
から、ton Ｂに変異が起るとフアージT1は吸着
できない。したがつて、大腸菌はton Ｂに変異が
起ることによつてT1フアージに耐性（T1 r）とな
る。 紫外線（UV）照射して得られたT1フアージ耐
性変異株（T1 r）についてトリプトフアン要求性
を検定するとT1 r、Trp-となつた株の大部分は染
色体上のton Ｂからトリプトフアンオペロンにか
けてのDNA断片が一部又は全部欠失したもので
あつた。これらの変異処理及び確認方法について
は、例えばGenetics第49巻267〜278頁（1964）に
詳しく記述されている。 trp Ram27、trp Ｒ（トリプトフアンレプレツサ
ー変異） トリプトフアンレプレツサーの変異株は、トリ
プトフアンのアナログ（例えば、５−メチルトリ
プトフアン、６−メチルトリプトフアン等）に対
する耐性で１次選択を行う。このアナログ耐性株
には (1) レプレツシヨン（repression）が解除された
もの (2) フイードバツク インヒビジヨン
（feedback inhibition）が解除されたもの (3) 膜構造の変化により、アナログを細胞内に取
り込めないもの 等が考えられる。そこでアナログ耐性株をトリプ
トフアンを含む培地（野生株ではレプレツシヨン
のためトリプトフアン合成系酵素は、ほとんど生
産されない条件）で培養しても、トリプトフアン
合成系酵素が構成的に生産されていれば、レプレ
ツシヨンが解除されていることになる。レプレツ
サーの欠損か、オペレーター変異によるものかに
ついては、フアージPIKc（大腸菌の普遍形質導入
フアージ）による形質導入でこのアナログ耐性の
形質がthr（threonine要求性）遺伝子と連鎖して
いるか、trp（tryptophan要求性）遺伝子と連鎖し
ているかを調べ、thrと連鎖していればレプレツ
サー変異が生起していることが確認でき本発明に
用いることができる。 なお、trp Ram27は、トリプトフアンレプレ
ツサー欠損のナンセンス変異、trp Ｒは、同ミス
センス変異である。詳しくは、J.Mol.Biol.第44
巻185〜193頁（1969）、Genetics第52巻1303〜
1316頁（1965）等を参照されたい。 tna Ａ（トリプトフアナーゼ欠損変異） 野生の大腸菌は、トリプトフアン分解酵素（ト
リプトフアナーゼ）活性をもつため単一炭素源と
して、トリプトフアンを利用して増殖することが
できる（トリプトフアン→インドール＋ピルビン
酸＋NH3）が、トリプトフアナーゼ欠損株は、
トリプトフアンを単一炭素源としては増殖できな
い。この生理を利用してトリプトフアナーゼ欠損
株を分離することができる。例えば、UV照射、
Ｎ−メチル−N′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニ
ジン（NTG）又は、エチル−メタン−スルフオ
ネート（EMS）などで変異処理し、グルコース
を炭素源とする最少寒天培地上でコロニーを形成
させる。これをトリプトフアンを単一炭素源とす
る最少寒天培地上にレプリカして炭素源がグルコ
ースのときには増殖するが、トリプトフアンのと
きには増殖できない株を選択する。トリプトフア
ナーゼ活性がないことは、Ｌ−ブロスで培養した
培養液にインドール試薬〔トリプトフアン合成酵
素（Ｔ Sase）活性測定に用いるものと同一；
インドールに対する呈色反応〕を加え、インドー
ルに特異的な赤色が生じないことで確認する。例
えば、J.Bacteriology 第89巻 680〜686頁
（1965）を参照されたい。 E.coli W3110 trpAE1 trpR tnaA株の取得は、
上述の方法を組み合せることによつて可能である
が、具体的には次の手順で実施できる。 (1) E.coli W3110 cysB株にtrpR変異をつける。 (2) E.coli W3110 trpAE1株からのPIKc溶菌液
でcysB trpR株を形質導入してW3110trpAE1
trpR株を得る。 (3) (2)にtnaA変異を加える。 以下において、プラスミド例えばpSC101−
trp・I5又はpSC101−trp・I15により形質添加し
て得られた株のトリプトフアン合成酵素（Ｔ
Sase）及びアントラニル酸合成酵素（Ａ Sase）
の活性を第１表に、トリプトフアンによるＡ
Sase活性の阻害率を第２表に、並びに、トリプ
トフアンの生産性を第３表に示す。
Saseという）に対するトリプトフアンによるフ
イードバツク阻害が解除されたトリプトフアンオ
ペロンをもつプラスミドを有し、該プラスミドを
遺伝子操作によつて組換えたトリプトフアン生産
性の高い大腸菌の製法に関する。 従来、微生物特に生産性の高い人工変異株を用
いて発酵法によりアミノ酸等が製造されているこ
とは周知のとおりである。しかし、アミノ酸のう
ちトリプトフアンについては、従来の発酵法は生
産性が低く工業的製法はまだ確立されていない。
他方、近時遺伝子工学の発達により、高等動植物
の遺伝子を大腸菌に移入して有用な物質、例えば
インシユリンや生長ホルモン等を発酵技法により
製造することが行われるようになつた。 本発明者らは、遺伝子操作により大腸菌を形質
転換してトリプトフアン合成活性を与えられたト
リプトフアン高生産性の大腸菌を製造することに
成功した。 本発明は下記のとおりである。 (1) 野生型のトリプトフアンオペロンをもつ組換
えプラスミドを宿主大腸菌に移入し、しかる後
この大腸菌を変異処理し、この際宿主大腸菌が
トリプトフアンレプレツサー及びトリプトフア
ナーゼの欠損したものであるときは後記の形質
転換を行わずそのまま、また、宿主大腸菌がそ
うしたものでないときは前記変異処理した大腸
菌から変異型のプラスミドを取出しこれをトリ
プトフアンレプレツサー及びトリプトフアナー
ゼの欠損した別の宿主大腸菌に移入することに
より形質転換を行い、かくしてアントラニル酸
合成酵素に対するトリプトフアンによるフイー
ドバツク阻害が解除されたトリプトフアンオペ
ロンをもつ組換えプラスミドを有し、かつ、ト
リプトフアンレプレツサー及びトリプトフアナ
ーゼの欠損した大腸菌を造成することを特徴と
するトリプトフアン生産性の高い大腸菌の製
法。 (2) 宿主大腸菌が染色体trpE遺伝子の欠失した
大腸菌である特許請求の範囲第１項記載の製
法。 (3) プラスミドがpSC101由来のものである特許
請求の範囲第１項記載の製法。 本発明において変異処理した大腸菌が保持する
ところのトリプトフアンによるＡ Saseに対す
るフイードバツク阻害が解除されたプラスミドに
ついて説明する。 トリプトフアン合成系の最初の酵素であるＡ
Saseはトリプトフアンによるフイードバツク阻
害を受けるが、トリプトフアンのアナログであ
る、例えば５−メチルトリプトフアンに耐性の株
のなかにはＡ Saseに対するトリプトフアンに
よるフイードバツク阻害が解除されたものが含ま
れている。そこで後述するように大腸菌株
Escherichia coli Ｗ 3110 trpAE1（pSC101−
trp）すなわち、トリプトフアンオペロンを有す
るプラスミド包含の株を変異手段により変異処理
し、そのうち５−メチルトリプトフアン耐性菌に
ついてトリプトフアンによりＡ Sase活性が阻
害されない株を選択する。これらのものから抽出
されたプラスミド（例えばpSC101−trp・I15）
は、トリプトフアンによるフイードバツク阻害が
解除されたトリプトフアンオペロンをもつてい
る。本発明で用いられるトリプトフアンオペロン
を有するプラスミド例えばpSC101−trpは、
Genetics第１巻141〜152頁（1977）に記載された
方法により、又はこれを改善した方法により得る
ことができる。 本発明により製造された大腸菌は、前記のプラ
スミドを移入して形質転換を行つた大腸菌であつ
て、トリプトフアンによるフイードバツク阻害が
解除されていると同時に、トリプトフアンレプレ
ツサーが欠損しトリプトフアナーゼも欠損したも
のである。 本発明により製造された大腸菌は、これを栄養
培地、特にアントラニル酸添加培地に、必要によ
りテトラサイクリン系抗生物質を添加して、培養
すると、培養液からそれ自体公知の採取方法によ
つてＬ−トリプトフアンを高い生産性で採取する
ことができる。この場合における培養及び採取の
方法は、通常の発酵法の場合と同様である。 以下に、本発明について詳述する。 本発明における宿主大腸菌としては、例えば下
記の菌株が使用される。 (1) Escherichia coli Ｗ 3110 trp AE1〔AE1〕 (2) Escherichia coli Ｗ 3110 trp AE1 trp
Ram 27〔Ram〕 (3) Escherichia coli Ｗ 3110 trp AE1 trp Ｒ
tna Ａ〔Tna〕 上記Escherichia coli（以下E.coliという）
W3110は、λ非溶原性（λ-）で性因子Ｆをもた
ない（F-）株であつて、このものはλ溶原性、
性因子ＦをもつE.coli Ｋ−12株に由来する
ATCC27325株である。すなわち、本発明では、
E.coli K12株由来の大腸菌であれば全て宿主菌と
なることができ、さらにトリプトフアン製造を目
的とする場合には、これらの菌にトリプトフアン
オペロンの欠失変異（trp AE1）、トリプトフア
ンレプレツサー欠損変異（trp Ｒ）及びトリプト
フアナーゼ欠損変異（trp Ａ）性を付与された大
腸菌が好適に用いられる。 次に、上記３種の菌株について宿主大腸菌とし
て所持すべき特性を述べる。 trp AE1（トリプトフアンオペロンの欠失変異） 大腸菌のトリプトフアンオペロンは染色体上で
ton Ｂ遺伝子と隣接しているが、ton Ｂはフアー
ジT1が大腸菌に吸着する際に必要なものである
から、ton Ｂに変異が起るとフアージT1は吸着
できない。したがつて、大腸菌はton Ｂに変異が
起ることによつてT1フアージに耐性（T1 r）とな
る。 紫外線（UV）照射して得られたT1フアージ耐
性変異株（T1 r）についてトリプトフアン要求性
を検定するとT1 r、Trp-となつた株の大部分は染
色体上のton Ｂからトリプトフアンオペロンにか
けてのDNA断片が一部又は全部欠失したもので
あつた。これらの変異処理及び確認方法について
は、例えばGenetics第49巻267〜278頁（1964）に
詳しく記述されている。 trp Ram27、trp Ｒ（トリプトフアンレプレツサ
ー変異） トリプトフアンレプレツサーの変異株は、トリ
プトフアンのアナログ（例えば、５−メチルトリ
プトフアン、６−メチルトリプトフアン等）に対
する耐性で１次選択を行う。このアナログ耐性株
には (1) レプレツシヨン（repression）が解除された
もの (2) フイードバツク インヒビジヨン
（feedback inhibition）が解除されたもの (3) 膜構造の変化により、アナログを細胞内に取
り込めないもの 等が考えられる。そこでアナログ耐性株をトリプ
トフアンを含む培地（野生株ではレプレツシヨン
のためトリプトフアン合成系酵素は、ほとんど生
産されない条件）で培養しても、トリプトフアン
合成系酵素が構成的に生産されていれば、レプレ
ツシヨンが解除されていることになる。レプレツ
サーの欠損か、オペレーター変異によるものかに
ついては、フアージPIKc（大腸菌の普遍形質導入
フアージ）による形質導入でこのアナログ耐性の
形質がthr（threonine要求性）遺伝子と連鎖して
いるか、trp（tryptophan要求性）遺伝子と連鎖し
ているかを調べ、thrと連鎖していればレプレツ
サー変異が生起していることが確認でき本発明に
用いることができる。 なお、trp Ram27は、トリプトフアンレプレ
ツサー欠損のナンセンス変異、trp Ｒは、同ミス
センス変異である。詳しくは、J.Mol.Biol.第44
巻185〜193頁（1969）、Genetics第52巻1303〜
1316頁（1965）等を参照されたい。 tna Ａ（トリプトフアナーゼ欠損変異） 野生の大腸菌は、トリプトフアン分解酵素（ト
リプトフアナーゼ）活性をもつため単一炭素源と
して、トリプトフアンを利用して増殖することが
できる（トリプトフアン→インドール＋ピルビン
酸＋NH3）が、トリプトフアナーゼ欠損株は、
トリプトフアンを単一炭素源としては増殖できな
い。この生理を利用してトリプトフアナーゼ欠損
株を分離することができる。例えば、UV照射、
Ｎ−メチル−N′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニ
ジン（NTG）又は、エチル−メタン−スルフオ
ネート（EMS）などで変異処理し、グルコース
を炭素源とする最少寒天培地上でコロニーを形成
させる。これをトリプトフアンを単一炭素源とす
る最少寒天培地上にレプリカして炭素源がグルコ
ースのときには増殖するが、トリプトフアンのと
きには増殖できない株を選択する。トリプトフア
ナーゼ活性がないことは、Ｌ−ブロスで培養した
培養液にインドール試薬〔トリプトフアン合成酵
素（Ｔ Sase）活性測定に用いるものと同一；
インドールに対する呈色反応〕を加え、インドー
ルに特異的な赤色が生じないことで確認する。例
えば、J.Bacteriology 第89巻 680〜686頁
（1965）を参照されたい。 E.coli W3110 trpAE1 trpR tnaA株の取得は、
上述の方法を組み合せることによつて可能である
が、具体的には次の手順で実施できる。 (1) E.coli W3110 cysB株にtrpR変異をつける。 (2) E.coli W3110 trpAE1株からのPIKc溶菌液
でcysB trpR株を形質導入してW3110trpAE1
trpR株を得る。 (3) (2)にtnaA変異を加える。 以下において、プラスミド例えばpSC101−
trp・I5又はpSC101−trp・I15により形質添加し
て得られた株のトリプトフアン合成酵素（Ｔ
Sase）及びアントラニル酸合成酵素（Ａ Sase）
の活性を第１表に、トリプトフアンによるＡ
Sase活性の阻害率を第２表に、並びに、トリプ
トフアンの生産性を第３表に示す。
【表】
第１表において、活性単位はユニツト／mg蛋白
質である。結果は後述する培地−Ａで培養した菌
体破砕液（粗酵素液）について活性を測定したも
ので、Ａ Saseについては、トリプトフアンを
加えない場合（−Trp）とトリプトフアンを0.2
ｍＭ加えた場合（＋Trp）について測定したもの
である。 Ｔ Sase活性、Ａ Sase活性は、トリプトフ
アンレプレツサー欠損株であるRam株やTna株
ではAE1株より大きい。Ａ Saseはいずれもト
リプトフアンによる阻害をうけていない。
質である。結果は後述する培地−Ａで培養した菌
体破砕液（粗酵素液）について活性を測定したも
ので、Ａ Saseについては、トリプトフアンを
加えない場合（−Trp）とトリプトフアンを0.2
ｍＭ加えた場合（＋Trp）について測定したもの
である。 Ｔ Sase活性、Ａ Sase活性は、トリプトフ
アンレプレツサー欠損株であるRam株やTna株
ではAE1株より大きい。Ａ Saseはいずれもト
リプトフアンによる阻害をうけていない。
【表】
第２表によれば、pSC101−trp・I5又はpSC101
−trp・I15により形質転換されたAE1株について
Ａ Sase活性を50％阻害するトリプトフアン濃
度を求めたものであるが、pSC101−trp・I5と
pSC101−trp・I15の間にトリプトフアンによる
Ａ Sase活性阻害に関し有意差は見られず、本
発明におけるプラスミドの普遍性が窺える。 本発明において形質転換した大腸菌、例えば
Tna（pSC101−trp・I15）株は、トリプトフアン
による阻害が解除され、かつトリプトフアンレプ
レツサー及びトリプトフアナーゼが欠損したもの
であり、かかる条件を満足した菌株によつて、は
じめてトリプトフアンの高濃度蓄積が達成される
のである。このことは次の第３表から明らかであ
る。
−trp・I15により形質転換されたAE1株について
Ａ Sase活性を50％阻害するトリプトフアン濃
度を求めたものであるが、pSC101−trp・I5と
pSC101−trp・I15の間にトリプトフアンによる
Ａ Sase活性阻害に関し有意差は見られず、本
発明におけるプラスミドの普遍性が窺える。 本発明において形質転換した大腸菌、例えば
Tna（pSC101−trp・I15）株は、トリプトフアン
による阻害が解除され、かつトリプトフアンレプ
レツサー及びトリプトフアナーゼが欠損したもの
であり、かかる条件を満足した菌株によつて、は
じめてトリプトフアンの高濃度蓄積が達成される
のである。このことは次の第３表から明らかであ
る。
【表】
トリプトフアンの高濃度蓄積には、トリプトフ
アンによる抑制並びに阻害の解除が必須であり、
また、トリプトフアナーゼの欠損も必要である。
Tna（pSC101−trp・I15）の生産性は、大腸菌に
おいて染色体性の二重変異株（repression-、
inhibition-）で示された値〔180μｇ／ml：醗工
誌 第43巻 302〜306頁（1965）〕よりも大きく、
プラスミドによる遺伝子増幅効果が最終生産物の
生成量にまで反映した結果と思われる。 なお、上記Escherichia coli W3110 trpAE1
trpR tnaA（pSC101−trp・I15）は、アメリカン
タイプ カルチヤーコレクシヨン
（AMERICAN TYPE CULTURE
COLLECTION）に昭和55年（1980年）10月28日
付にて寄託され寄託番号（ATCC31743）を得て
いる。 大腸菌を培養するための培地としては、炭素
源、窒素源、無機物等を含む栄養培地、並びに、
使用微生物を製造する際に付与した耐性薬剤及
び／又はアントラニル酸を追加含有する培地が挙
げられる。合成培地又は天然培地のいずれも使用
可能である。培地に使用される炭素源及び窒素源
は、使用菌の利用可能なものならばいずれの種類
を用いてもよい。 炭素源としては、グルコース、グリセロール、
フラクトース、シユクロース、マルトース、マン
ノース、澱粉、澱粉加水分解液、糖蜜などの炭水
化物が使用できる。 窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウ
ム、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、燐酸
アンモニウム、酢酸アンモニウムなどの無機若し
くは有機のアンモニウム塩類又は、肉エキス、酵
母エキス、コーン・ステイープ・リカー、カゼイ
ン加水分解物、脱脂大豆粕、その消化物などの天
然有機窒素源が使用可能である。天然有機窒素源
の多くのものは、窒素源であるとともに炭素源に
もなり得る。 さらに、無機物として、燐酸第一水素カリウ
ム、燐酸第二水素カリウム、硫酸マグネシウム、
塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、塩化カルシウム、
塩化亜鉛、硫酸銅、塩化マンガン、塩化コバル
ト、モリブデン酸アンモン、ホウ酸などを必要に
応じて使用するとよい。 大腸菌に抗菌薬剤耐性性が付与されている場合
は、該当する抗菌剤を培地に添加することによつ
て汚染菌の混入を防ぐことができる。また、トリ
プトフアンの前駆体たるアントラニル酸の添加も
トリプトフアンの増収に好都合である。 培養は、振盪培養又は通気撹拌深部培養などの
好気的条件下で行う。培養温度は通常20〜50℃の
範囲である。培養中の培地のPHは中性附近に維持
することが望ましく、培養期間は通常１〜３日間
である。 生成蓄積したトリプトフアンを採取する方法
は、イオン交換樹脂を用いる等のそれ自体公知の
方法で行うことができる。 次に、本発明を実施例によつて説明するが、本
発明はこれにより限定されるものではない。 製造例 （野生型のトリプトフアンオペロンをもつ組換
えプラスミド） 大腸菌の薬剤耐性プラスミドの１種である
pSC101（テトラサイクリン耐性：Tcr、染色体当
りのコピー数５〜10）をベクターとし大腸菌のト
リプトフアンオペロン供与体として特殊形質導入
フアージtrp EA60−３を用いる。 (1) 制限酵素EcoRI処理 λtrp EA60−3DNA（約0.1μｇ）とpSC101プ
ラスミドDNA（約1.9μｇ）とを下記の反応液中
で37℃１時間反応させる。その後65℃で５分間
加熱してEcoRIを失活させて反応を停止させ
る。 EcoRI反応液（全量50μ） トリス−HCL PH7.4 90ｍＭ MgCl2 10ｍＭ DNA 2μｇ EcoRI ２ユニツト 上記のEcoRIは市販品（Miles Laboratories
Inc.、Bethesda Research Laboratories Inc.
など）を用いる。 (2) T4−DNAリガーゼ処理 T4−DNAリガーゼ処理は、上記EcoRI反応
液に下記の試薬を加え全量を100μとして４
℃、18時間で行う。上記のリガーゼは市販品を
用いる。 試 薬 50ｍＭ MgCl 10μ 100ｍＭ ジチオエリトリトール 10μ 0.5ｍＭ アデノシントリホスフエト（ATP）
10μ 水 20μ T4−DNAリガーゼ 0.2ユニツト (3) 大腸菌の形質転換 E.coli C600rk-、mk-、Trp-株を20mlのＬ
−ブロス（ポリペプトン10ｇ／、イースト抽
出物５ｇ／、NaCl5ｇ／、PH７）中で
OD660が0.4になるまで37℃で培養し、集菌後
100ｍＭのMgCl220mlで洗浄し、100ｍＭの
CaCl210mlで懸濁し氷浴中で20分間静置する。
遠心分離で再び集菌し100ｍＭのCaCl21mlに再
懸濁し、この細胞懸濁液200μとT4−DNAリ
ガーゼ反応液100μとを氷浴中で混合して30
分間静置する。次に、この混合液を42℃で２分
間処理し、再び氷浴中で20分間静置する。Ｌ−
ブロス2.7mlを加えて37℃で２時間培養した後、
テトラサイクリン（Tc）10μｇ／mlを含む下記
組成の培地Ａ（寒天を1.5％含む）の上に広げ
て、Tcr、Trp+の形質転換株を選択する。 上記E.coliC600に関し、記号rkは細菌が自身
のDNA分子（DNA上の塩基が特異的にメチル
化されているもの）と外部のDNA分子（自身
のものとメチル化の部位が異なるもの）とを認
識して外部DNAを制限する機能（restriction）
をいい、記号mkは一旦細胞内に導入された
DNAを自己に特異的なDNA分子に修飾する機
能（modification）をいう。rk-、mk-とは、
これらの機能が欠損していることを示す。 培地−Ａ（Vogel and Bonner最小寒天培地、
PH７） K2HPO4 10ｇ／ NaNH4HPO4・4H2O 3.5ｇ／ MgSO4・7H2O 0.2ｇ／ クエン酸・H2O ２ｇ／ グルコース 2.5ｇ／ カザミノ酸 0.5ｇ／ (4) pSC101−trpプラスミドDNAの抽出 Tcr、Trp+形質転換株を100mlのＬ−ブロス
中でOD660が0.8になるまで37℃で培養し、集菌
後、１mlのトリス・シユクロース〔トリス・
HCl PH８（50ｍＭ）、シユクロース（25％、
wt／Vol）〕に懸濁する。氷浴中で0.2mlのリゾ
チーム（５mg／ml）を加え５分間静置後、0.4
mlのNa2EDTA（250ｍＭ、PH８）を加え５分間
静置する。次に、5MのNaCl0.5mlと10％
（wt／Vol）のソジウムドデシルサルフエート
（SDS）0.2mlを連続して加え、撹拌後氷浴中で
１晩静置する。４℃で30分間遠心分離
（30000xg）して得られた上清液を50ｍＭの
Na2EDTA（PH８）で５mgにメスアップし、4.7
ｇのCsClと1.8mgのエチジウムブロマイド
（ethidium bromide）を加えて密度を1.57ｇ／
mlに調整する。このサンプルを平衡密度勾配超
遠心（日立製作所製RP65ローター、3800rpm
40hr）にかける。遠心後、プラスミドDNAを
含む分画を取り出しエチジウムブロマイドをブ
タノールで抽出し、TEバツフアー（Tris.
HCl10ｍＭ、Na2EDTA0.1ｍＭ、PH８）に対
して透析する。 上記の平衡密度勾配超遠心の原理は次のとお
りである。 プラスミドDNA（環状分子）と染色体DNA
（線状分子：細胞内では環状分子だが分子量が
大きいため、抽出過程で線状分子となる）では
分子形態が異なる。色素エチジウムブロマイド
はDNAの塩基間に入り込むが、線状分子の方
により多く入り込むので、結果的にプラスミド
DNAと染色体DNAとの間に密度差が生じる。
この密度差を利用してプラスミドDNAを分離
する。 上記方法で抽出されたpSC101−trpは分子量が
約16.5×106ダルトンである。制限酵素EcoRIで
処理後、アガロースゲル電気泳動にかけると２本
のDNAバンドが認められる。大分子量（泳動度、
小）のものがトリプトフアンオペロンを含む
DNA断片で10.8×106ダルトン、小分子量（泳動
度、大）のものが、ベクターとして用いた
pSC101で5.7×106ダルトンである。 実施例 １ Trpによるフイードバツク阻害の解除されたト
リプトフアンオペロンをもつプラスミドを有する
大腸菌の製造を次のようにして行つた。 (1) ５−メチルトリプトフアン（5MT）耐性株
の分離 トリプトフアンのアナログである5MTは、
トリプトフアンと同様にトリプトフアンオペロ
ンからのメツセンジヤRAM（mRAM）への転
写を抑制し、アントラニル酸合成酵素（Ａ
Sase）活性をフイードバツク阻害する。通常
の野生株は5MT存在下では増殖できないが、
トリプトフアンレプレツサーの変異などにより
抑制がかからなくなつたり、あるいはＡ
Saseが変異を受けて阻害をうけなくなれば、
最低限のトリプトフアンを合成して生育可能
（5MTr）となる。 さて、前記pSC101−trpDNAでE.coli
W3110trpAE1（染色体上のトリプトフアンオペ
ロンが全て欠失したTrp-、〔AE1〕）株を形質
転換し、Tcr、Trp+の形質転換株AE1（pSC101
−trp）を得た。このAE1（pSC101−trp）株を
NTG（200μｇ／ml）で処理し、5MT（200μｇ／
ml）を含む寒天培地−Ａ（培地−Ａに15ｇ／
の寒天を含む）上に約106細胞（cells）広げて
37℃で１晩培養した。この方法により約70株の
5MTr株を独立に分離した。 (2) フイードバツク阻害が解除された株の分離 70株の5MTr株をそれぞれ100mlの培地−Ａ
で37℃、16時間培養し集菌後、菌体を0.9％の
NaClで洗浄し、５mlの100ｍＭトリス・HCl
（PH7.8）で懸濁した。20秒３回の超音波処理
（ultrasonic generator、model4280、Kaijo
Denki CO.、10KHz）で菌体を破砕し、
18000rpm30分間（Sorval SS−34rotor）遠心
分離して上清を粗酵素液とした。 この粗酵素液についてＡ Sase活性を測定
し、反応液中に0.2ｍＭのトリプトフアンが存
在してもＡ Sase活性が阻害をうけないかど
うかを検討した。その結果、I5、I15の２株の
Ａ Sase活性は0.2ｍＭのトリプトフアンによ
る阻害を全く受けずフイードバツク阻害耐性で
あつた。 次に、宿主菌としてトリプトフアンレプレツ
サー及びトリプトフアナーゼが欠損した大腸菌
を用い上記と同様にして、さらに高濃度の５−
MTに対する耐性菌を分離することにより一層
有効な大腸菌を分離した。 (3) フイードバツク阻害の解除されたトリプトフ
アンオペロンをもつプラスミドの調製 I5、I15の各株から、前述のpSC101−trpの製
造例におけると同様の方法によりプラスミド
pSC101−trp・I5及びpSC101−trp・I15を得
た。pSC101−trp・I5、pSC101−trp・
I15DNAをそれぞれEcoRIで処理して、アガロ
ースゲル電気泳動にかけると、pSC101−trpと
同じく、10.8×106ダルトンと5.7×106ダルトン
の２本のバンドが認められた。 変異型プラスミドによる大腸菌の形質転換 上記で得られたプラスミドを上記製造例で記
載したと同様な方法によりE.coli W3110
trpAE1 trpR TnaA（トリプトフアンオペロン
欠失、トリプトフアンレプレツサー欠損、トリ
プトフアナーゼ欠損〔Tna〕に移入し形質転換
を行つた。得られた菌は、アントラニル酸合成
酵素に対するトリプトフアンによるフイードバ
ツク阻害が解除されたトリプトフアンオペロン
をもつ組換えプラスミドを有し、かつ、トリプ
トフアンレプレツサー及びトリプトフアナーゼ
の欠損した大腸菌であつた。 前記のpSC101−trp・I5、又はpSC101−
trp・I15プラスミドにより、AE1株、E.coli
W3110 trpAE1 trpRam27（トリプトフアンオ
ペロン欠失、トリプトフアンレプレツサー欠損
〔Ram〕）、E.coli W3110 trpAE1 trpR tnaA
（トリプトフアンオペロン欠失、トリプトフア
ンレプレツサー欠損、トリプトフアナーゼ欠損
〔Tna〕）をそれぞれ形質転換した。選択して得
られたTcr、Trp+のpSC101−trp・I5又は
pSC101−trp・I15保持株について、前述の方
法で粗酵素液を調製し、Ａ Sase活性を測定
したところ、いずれの場合も、Ａ Sase活性
はトリプトフアンによる阻害を受けなかつた。
したがつてフイードバツク阻害耐性の形質は
pSC101−trp・I5、又はpSC101−trp・I15プラ
スミドDNA上にあるトリプトフアンオペロン
が変異を受けていることに起因するものであ
る。 製造例 （トリプトフアン） プラスミドpSC101−trp・I15によりTna株を
形質転換して得た株Tna（pSC101−trp・I15）
を、まず前培養としてサトラサイクリン20μｇ／
mlを含む下記組成のＬ−ブロスに寒天保存培地か
ら一白金耳植菌して37℃、９〜15時間培養した。
次に下記組成の培地−B100ml（500ml容フラス
コ）に前記前培養液0.5ml（0.5％植菌）を植菌し
37℃で本培養を行つた。 2N NaOHにより３〜５時間ごとにPHを７に調
整した。48時間培養後、トリプトフアンの蓄積量
をキサンチドロール（Xanthydrol）法により定
量したところ、360μｇ／mlであつた。 Ｌ−ブロス バクトトリプトン 10ｇ イースト抽出物 ５ｇ NaCl ５ｇ／ PH７ 培地−Ｂ KH2PO4 ３ｇ K2HPO4 ７ｇ NH4Cl ３ｇ MgSO4・7H2O 0.2ｇ／ PH７ グルコース ３％ カザミノ酸 0.1％ 製造例 （トリプトフアン） 前記の培地−ＢにTna（pSC101−trp・I15）を
植菌して下表に示すとおりアントラニル酸及びカ
ザミノ酸を添加して培養した。2N NaOHで48時
間までPH７に調整した。下表に示すトリプトフア
ン蓄積量が得られた。 アントラニル酸は500mg／では約24時間、800
mg／では約48時間で完全に消費される。アント
ラニル酸の濃度が高くなると菌の増殖は悪くな
り、1000mg／では63時間、1500mg／では63時
間以上の培養が必要である。消費されたアントラ
ニル酸はほぼ完全にトリプトフアンに変化する。
アンによる抑制並びに阻害の解除が必須であり、
また、トリプトフアナーゼの欠損も必要である。
Tna（pSC101−trp・I15）の生産性は、大腸菌に
おいて染色体性の二重変異株（repression-、
inhibition-）で示された値〔180μｇ／ml：醗工
誌 第43巻 302〜306頁（1965）〕よりも大きく、
プラスミドによる遺伝子増幅効果が最終生産物の
生成量にまで反映した結果と思われる。 なお、上記Escherichia coli W3110 trpAE1
trpR tnaA（pSC101−trp・I15）は、アメリカン
タイプ カルチヤーコレクシヨン
（AMERICAN TYPE CULTURE
COLLECTION）に昭和55年（1980年）10月28日
付にて寄託され寄託番号（ATCC31743）を得て
いる。 大腸菌を培養するための培地としては、炭素
源、窒素源、無機物等を含む栄養培地、並びに、
使用微生物を製造する際に付与した耐性薬剤及
び／又はアントラニル酸を追加含有する培地が挙
げられる。合成培地又は天然培地のいずれも使用
可能である。培地に使用される炭素源及び窒素源
は、使用菌の利用可能なものならばいずれの種類
を用いてもよい。 炭素源としては、グルコース、グリセロール、
フラクトース、シユクロース、マルトース、マン
ノース、澱粉、澱粉加水分解液、糖蜜などの炭水
化物が使用できる。 窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウ
ム、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、燐酸
アンモニウム、酢酸アンモニウムなどの無機若し
くは有機のアンモニウム塩類又は、肉エキス、酵
母エキス、コーン・ステイープ・リカー、カゼイ
ン加水分解物、脱脂大豆粕、その消化物などの天
然有機窒素源が使用可能である。天然有機窒素源
の多くのものは、窒素源であるとともに炭素源に
もなり得る。 さらに、無機物として、燐酸第一水素カリウ
ム、燐酸第二水素カリウム、硫酸マグネシウム、
塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、塩化カルシウム、
塩化亜鉛、硫酸銅、塩化マンガン、塩化コバル
ト、モリブデン酸アンモン、ホウ酸などを必要に
応じて使用するとよい。 大腸菌に抗菌薬剤耐性性が付与されている場合
は、該当する抗菌剤を培地に添加することによつ
て汚染菌の混入を防ぐことができる。また、トリ
プトフアンの前駆体たるアントラニル酸の添加も
トリプトフアンの増収に好都合である。 培養は、振盪培養又は通気撹拌深部培養などの
好気的条件下で行う。培養温度は通常20〜50℃の
範囲である。培養中の培地のPHは中性附近に維持
することが望ましく、培養期間は通常１〜３日間
である。 生成蓄積したトリプトフアンを採取する方法
は、イオン交換樹脂を用いる等のそれ自体公知の
方法で行うことができる。 次に、本発明を実施例によつて説明するが、本
発明はこれにより限定されるものではない。 製造例 （野生型のトリプトフアンオペロンをもつ組換
えプラスミド） 大腸菌の薬剤耐性プラスミドの１種である
pSC101（テトラサイクリン耐性：Tcr、染色体当
りのコピー数５〜10）をベクターとし大腸菌のト
リプトフアンオペロン供与体として特殊形質導入
フアージtrp EA60−３を用いる。 (1) 制限酵素EcoRI処理 λtrp EA60−3DNA（約0.1μｇ）とpSC101プ
ラスミドDNA（約1.9μｇ）とを下記の反応液中
で37℃１時間反応させる。その後65℃で５分間
加熱してEcoRIを失活させて反応を停止させ
る。 EcoRI反応液（全量50μ） トリス−HCL PH7.4 90ｍＭ MgCl2 10ｍＭ DNA 2μｇ EcoRI ２ユニツト 上記のEcoRIは市販品（Miles Laboratories
Inc.、Bethesda Research Laboratories Inc.
など）を用いる。 (2) T4−DNAリガーゼ処理 T4−DNAリガーゼ処理は、上記EcoRI反応
液に下記の試薬を加え全量を100μとして４
℃、18時間で行う。上記のリガーゼは市販品を
用いる。 試 薬 50ｍＭ MgCl 10μ 100ｍＭ ジチオエリトリトール 10μ 0.5ｍＭ アデノシントリホスフエト（ATP）
10μ 水 20μ T4−DNAリガーゼ 0.2ユニツト (3) 大腸菌の形質転換 E.coli C600rk-、mk-、Trp-株を20mlのＬ
−ブロス（ポリペプトン10ｇ／、イースト抽
出物５ｇ／、NaCl5ｇ／、PH７）中で
OD660が0.4になるまで37℃で培養し、集菌後
100ｍＭのMgCl220mlで洗浄し、100ｍＭの
CaCl210mlで懸濁し氷浴中で20分間静置する。
遠心分離で再び集菌し100ｍＭのCaCl21mlに再
懸濁し、この細胞懸濁液200μとT4−DNAリ
ガーゼ反応液100μとを氷浴中で混合して30
分間静置する。次に、この混合液を42℃で２分
間処理し、再び氷浴中で20分間静置する。Ｌ−
ブロス2.7mlを加えて37℃で２時間培養した後、
テトラサイクリン（Tc）10μｇ／mlを含む下記
組成の培地Ａ（寒天を1.5％含む）の上に広げ
て、Tcr、Trp+の形質転換株を選択する。 上記E.coliC600に関し、記号rkは細菌が自身
のDNA分子（DNA上の塩基が特異的にメチル
化されているもの）と外部のDNA分子（自身
のものとメチル化の部位が異なるもの）とを認
識して外部DNAを制限する機能（restriction）
をいい、記号mkは一旦細胞内に導入された
DNAを自己に特異的なDNA分子に修飾する機
能（modification）をいう。rk-、mk-とは、
これらの機能が欠損していることを示す。 培地−Ａ（Vogel and Bonner最小寒天培地、
PH７） K2HPO4 10ｇ／ NaNH4HPO4・4H2O 3.5ｇ／ MgSO4・7H2O 0.2ｇ／ クエン酸・H2O ２ｇ／ グルコース 2.5ｇ／ カザミノ酸 0.5ｇ／ (4) pSC101−trpプラスミドDNAの抽出 Tcr、Trp+形質転換株を100mlのＬ−ブロス
中でOD660が0.8になるまで37℃で培養し、集菌
後、１mlのトリス・シユクロース〔トリス・
HCl PH８（50ｍＭ）、シユクロース（25％、
wt／Vol）〕に懸濁する。氷浴中で0.2mlのリゾ
チーム（５mg／ml）を加え５分間静置後、0.4
mlのNa2EDTA（250ｍＭ、PH８）を加え５分間
静置する。次に、5MのNaCl0.5mlと10％
（wt／Vol）のソジウムドデシルサルフエート
（SDS）0.2mlを連続して加え、撹拌後氷浴中で
１晩静置する。４℃で30分間遠心分離
（30000xg）して得られた上清液を50ｍＭの
Na2EDTA（PH８）で５mgにメスアップし、4.7
ｇのCsClと1.8mgのエチジウムブロマイド
（ethidium bromide）を加えて密度を1.57ｇ／
mlに調整する。このサンプルを平衡密度勾配超
遠心（日立製作所製RP65ローター、3800rpm
40hr）にかける。遠心後、プラスミドDNAを
含む分画を取り出しエチジウムブロマイドをブ
タノールで抽出し、TEバツフアー（Tris.
HCl10ｍＭ、Na2EDTA0.1ｍＭ、PH８）に対
して透析する。 上記の平衡密度勾配超遠心の原理は次のとお
りである。 プラスミドDNA（環状分子）と染色体DNA
（線状分子：細胞内では環状分子だが分子量が
大きいため、抽出過程で線状分子となる）では
分子形態が異なる。色素エチジウムブロマイド
はDNAの塩基間に入り込むが、線状分子の方
により多く入り込むので、結果的にプラスミド
DNAと染色体DNAとの間に密度差が生じる。
この密度差を利用してプラスミドDNAを分離
する。 上記方法で抽出されたpSC101−trpは分子量が
約16.5×106ダルトンである。制限酵素EcoRIで
処理後、アガロースゲル電気泳動にかけると２本
のDNAバンドが認められる。大分子量（泳動度、
小）のものがトリプトフアンオペロンを含む
DNA断片で10.8×106ダルトン、小分子量（泳動
度、大）のものが、ベクターとして用いた
pSC101で5.7×106ダルトンである。 実施例 １ Trpによるフイードバツク阻害の解除されたト
リプトフアンオペロンをもつプラスミドを有する
大腸菌の製造を次のようにして行つた。 (1) ５−メチルトリプトフアン（5MT）耐性株
の分離 トリプトフアンのアナログである5MTは、
トリプトフアンと同様にトリプトフアンオペロ
ンからのメツセンジヤRAM（mRAM）への転
写を抑制し、アントラニル酸合成酵素（Ａ
Sase）活性をフイードバツク阻害する。通常
の野生株は5MT存在下では増殖できないが、
トリプトフアンレプレツサーの変異などにより
抑制がかからなくなつたり、あるいはＡ
Saseが変異を受けて阻害をうけなくなれば、
最低限のトリプトフアンを合成して生育可能
（5MTr）となる。 さて、前記pSC101−trpDNAでE.coli
W3110trpAE1（染色体上のトリプトフアンオペ
ロンが全て欠失したTrp-、〔AE1〕）株を形質
転換し、Tcr、Trp+の形質転換株AE1（pSC101
−trp）を得た。このAE1（pSC101−trp）株を
NTG（200μｇ／ml）で処理し、5MT（200μｇ／
ml）を含む寒天培地−Ａ（培地−Ａに15ｇ／
の寒天を含む）上に約106細胞（cells）広げて
37℃で１晩培養した。この方法により約70株の
5MTr株を独立に分離した。 (2) フイードバツク阻害が解除された株の分離 70株の5MTr株をそれぞれ100mlの培地−Ａ
で37℃、16時間培養し集菌後、菌体を0.9％の
NaClで洗浄し、５mlの100ｍＭトリス・HCl
（PH7.8）で懸濁した。20秒３回の超音波処理
（ultrasonic generator、model4280、Kaijo
Denki CO.、10KHz）で菌体を破砕し、
18000rpm30分間（Sorval SS−34rotor）遠心
分離して上清を粗酵素液とした。 この粗酵素液についてＡ Sase活性を測定
し、反応液中に0.2ｍＭのトリプトフアンが存
在してもＡ Sase活性が阻害をうけないかど
うかを検討した。その結果、I5、I15の２株の
Ａ Sase活性は0.2ｍＭのトリプトフアンによ
る阻害を全く受けずフイードバツク阻害耐性で
あつた。 次に、宿主菌としてトリプトフアンレプレツ
サー及びトリプトフアナーゼが欠損した大腸菌
を用い上記と同様にして、さらに高濃度の５−
MTに対する耐性菌を分離することにより一層
有効な大腸菌を分離した。 (3) フイードバツク阻害の解除されたトリプトフ
アンオペロンをもつプラスミドの調製 I5、I15の各株から、前述のpSC101−trpの製
造例におけると同様の方法によりプラスミド
pSC101−trp・I5及びpSC101−trp・I15を得
た。pSC101−trp・I5、pSC101−trp・
I15DNAをそれぞれEcoRIで処理して、アガロ
ースゲル電気泳動にかけると、pSC101−trpと
同じく、10.8×106ダルトンと5.7×106ダルトン
の２本のバンドが認められた。 変異型プラスミドによる大腸菌の形質転換 上記で得られたプラスミドを上記製造例で記
載したと同様な方法によりE.coli W3110
trpAE1 trpR TnaA（トリプトフアンオペロン
欠失、トリプトフアンレプレツサー欠損、トリ
プトフアナーゼ欠損〔Tna〕に移入し形質転換
を行つた。得られた菌は、アントラニル酸合成
酵素に対するトリプトフアンによるフイードバ
ツク阻害が解除されたトリプトフアンオペロン
をもつ組換えプラスミドを有し、かつ、トリプ
トフアンレプレツサー及びトリプトフアナーゼ
の欠損した大腸菌であつた。 前記のpSC101−trp・I5、又はpSC101−
trp・I15プラスミドにより、AE1株、E.coli
W3110 trpAE1 trpRam27（トリプトフアンオ
ペロン欠失、トリプトフアンレプレツサー欠損
〔Ram〕）、E.coli W3110 trpAE1 trpR tnaA
（トリプトフアンオペロン欠失、トリプトフア
ンレプレツサー欠損、トリプトフアナーゼ欠損
〔Tna〕）をそれぞれ形質転換した。選択して得
られたTcr、Trp+のpSC101−trp・I5又は
pSC101−trp・I15保持株について、前述の方
法で粗酵素液を調製し、Ａ Sase活性を測定
したところ、いずれの場合も、Ａ Sase活性
はトリプトフアンによる阻害を受けなかつた。
したがつてフイードバツク阻害耐性の形質は
pSC101−trp・I5、又はpSC101−trp・I15プラ
スミドDNA上にあるトリプトフアンオペロン
が変異を受けていることに起因するものであ
る。 製造例 （トリプトフアン） プラスミドpSC101−trp・I15によりTna株を
形質転換して得た株Tna（pSC101−trp・I15）
を、まず前培養としてサトラサイクリン20μｇ／
mlを含む下記組成のＬ−ブロスに寒天保存培地か
ら一白金耳植菌して37℃、９〜15時間培養した。
次に下記組成の培地−B100ml（500ml容フラス
コ）に前記前培養液0.5ml（0.5％植菌）を植菌し
37℃で本培養を行つた。 2N NaOHにより３〜５時間ごとにPHを７に調
整した。48時間培養後、トリプトフアンの蓄積量
をキサンチドロール（Xanthydrol）法により定
量したところ、360μｇ／mlであつた。 Ｌ−ブロス バクトトリプトン 10ｇ イースト抽出物 ５ｇ NaCl ５ｇ／ PH７ 培地−Ｂ KH2PO4 ３ｇ K2HPO4 ７ｇ NH4Cl ３ｇ MgSO4・7H2O 0.2ｇ／ PH７ グルコース ３％ カザミノ酸 0.1％ 製造例 （トリプトフアン） 前記の培地−ＢにTna（pSC101−trp・I15）を
植菌して下表に示すとおりアントラニル酸及びカ
ザミノ酸を添加して培養した。2N NaOHで48時
間までPH７に調整した。下表に示すトリプトフア
ン蓄積量が得られた。 アントラニル酸は500mg／では約24時間、800
mg／では約48時間で完全に消費される。アント
ラニル酸の濃度が高くなると菌の増殖は悪くな
り、1000mg／では63時間、1500mg／では63時
間以上の培養が必要である。消費されたアントラ
ニル酸はほぼ完全にトリプトフアンに変化する。
【表】
製造例
（トリプトフアン）
テトラサイクリンを20μｇ／ml含むＬ−ブロス
で、Tna（pSC101−trp・I15）株を37℃で９〜15
時間前培養した。この前培液100mlを、1.5の培
地−Ｃを含むジヤーフアーメンター（丸菱理科装
置研究所MD−250型、２容量）に植菌し37℃
で培養した。撹拌は500rpm、通気は1v.v.m.で行
い14％NH4OHにてPHを７に制御した。基質のア
ントラニル酸は培養８時間目から50mg／／hrの
速度で追加した。キサンチドロール28時間培養
後、トリプトフアンの蓄積量をキサンチドロール
法により定量したところ、5.6ｇ／であつた。 培地−Ｃ KH2PO4 ３ｇ／ K2HPO4 ７ｇ／ NH4Cl ３ｇ／ MgSO4・7H2O 0.2ｇ／ FeSO4・7H2O 0.01ｇ／ アントラニル酸 0.5ｇ／ グルコース 50ｇ／ カザミノ酸 10ｇ／ テトラサイクリン 0.01ｇ／ PH７ かくして得られる培養液１を遠沈し、菌体を
除去し、遠沈上清をクロマト用活性炭900mlを充
填した塔に流しトリプトフアンを吸着させる。水
洗後トリプトフアンを0.7％アンモニアを含む50
％エタノール溶液で溶出し、溶出液を減圧下に濃
縮しアンモニアとエタノールを除去する。 得られるトリプトフアン水溶液PH4.5に調整し、
これをあらかじめダウエツクス50×８、Na型樹
脂（ダウケミカル社製）を0.1MPH3.4のクエン酸
緩衝液で緩衝化したカラム（10×40cm）に通す。 ついで0.1MPH5.0のクエン酸緩衝液4.5を流し
た後、0.2％アンモニアを含む50％メタノール溶
液でトリプトフアンを溶出する。この溶出液を減
圧下に濃縮乾固しトリプトフアンの結晶性を粗粉
末を得る。これを少量の50％熱エタノール水に溶
解し少量の活性炭で脱色し冷却後トリプトフアン
の白色鱗片状結晶3.5ｇを得た。 以上からわかるように、本発明では遺伝子操作
により形質転換した大腸菌を用いることにより従
来の変異株を用いる場合に比し短時間で効率よく
トリプトフアンが得られ、しかも、さらにコピー
数の多いプラスミドと組換えたり、また耐性をよ
り向上させることなどにより採来一層の効率化を
期待することができる。
で、Tna（pSC101−trp・I15）株を37℃で９〜15
時間前培養した。この前培液100mlを、1.5の培
地−Ｃを含むジヤーフアーメンター（丸菱理科装
置研究所MD−250型、２容量）に植菌し37℃
で培養した。撹拌は500rpm、通気は1v.v.m.で行
い14％NH4OHにてPHを７に制御した。基質のア
ントラニル酸は培養８時間目から50mg／／hrの
速度で追加した。キサンチドロール28時間培養
後、トリプトフアンの蓄積量をキサンチドロール
法により定量したところ、5.6ｇ／であつた。 培地−Ｃ KH2PO4 ３ｇ／ K2HPO4 ７ｇ／ NH4Cl ３ｇ／ MgSO4・7H2O 0.2ｇ／ FeSO4・7H2O 0.01ｇ／ アントラニル酸 0.5ｇ／ グルコース 50ｇ／ カザミノ酸 10ｇ／ テトラサイクリン 0.01ｇ／ PH７ かくして得られる培養液１を遠沈し、菌体を
除去し、遠沈上清をクロマト用活性炭900mlを充
填した塔に流しトリプトフアンを吸着させる。水
洗後トリプトフアンを0.7％アンモニアを含む50
％エタノール溶液で溶出し、溶出液を減圧下に濃
縮しアンモニアとエタノールを除去する。 得られるトリプトフアン水溶液PH4.5に調整し、
これをあらかじめダウエツクス50×８、Na型樹
脂（ダウケミカル社製）を0.1MPH3.4のクエン酸
緩衝液で緩衝化したカラム（10×40cm）に通す。 ついで0.1MPH5.0のクエン酸緩衝液4.5を流し
た後、0.2％アンモニアを含む50％メタノール溶
液でトリプトフアンを溶出する。この溶出液を減
圧下に濃縮乾固しトリプトフアンの結晶性を粗粉
末を得る。これを少量の50％熱エタノール水に溶
解し少量の活性炭で脱色し冷却後トリプトフアン
の白色鱗片状結晶3.5ｇを得た。 以上からわかるように、本発明では遺伝子操作
により形質転換した大腸菌を用いることにより従
来の変異株を用いる場合に比し短時間で効率よく
トリプトフアンが得られ、しかも、さらにコピー
数の多いプラスミドと組換えたり、また耐性をよ
り向上させることなどにより採来一層の効率化を
期待することができる。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 野生型のトリプトフアンオペロンをもつ組換
えプラスミドを宿主大腸菌に移入し、しかる後こ
の大腸菌を変異処理し、この際宿主大腸菌がトリ
プトフアンレプレツサー及びトリプトフアナーゼ
の欠損したものであるときは後記の形質転換を行
わずそのまま、また、宿主大腸菌がそうしたもの
でないときは前記変異処理した大腸菌から変異型
のプラスミドを取出しこれをトリプトフアンレプ
レツサー及びトリプトフアナーゼの欠損した別の
宿主大腸菌に移入することにより形質転換を行
い、かくしてアントラニル酸合成酵素に対するト
リプトフアンによるフイードバツク阻害が解除さ
れたトリプトフアンオペロンをもつ組換えプラス
ミドを有し、かつ、トリプトフアンレプレツサー
及びトリプトフアナーゼの欠損した大腸菌を造成
することを特徴とするトリプトフアン生産性の高
い大腸菌の製法。 ２ 宿主大腸菌が染色体trpE遺伝子の欠失した
大腸菌である特許請求の範囲第１項記載の製法。 ３ プラスミドがpSC101由来のものである特許
請求の範囲第１項記載の製法。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP55154706A JPS5780398A (en) | 1980-11-05 | 1980-11-05 | Plasmid produced by genetic manipulation, coliform bacillus having the same and preparation of tryptophan with said bacillus |
| AU74644/81A AU549686B2 (en) | 1980-11-05 | 1981-08-26 | Plasmid constructed by gene manipulation strains of e.coli to produce tryptophan |
| CA000386858A CA1182409A (en) | 1980-11-05 | 1981-09-29 | Plasmids constructed by gene manipulation, strains of escherichia coli carrying them, and process of tryptophan production using said strains |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP55154706A JPS5780398A (en) | 1980-11-05 | 1980-11-05 | Plasmid produced by genetic manipulation, coliform bacillus having the same and preparation of tryptophan with said bacillus |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63085130A Division JPS63273488A (ja) | 1988-04-08 | 1988-04-08 | トリプトファンの製法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5780398A JPS5780398A (en) | 1982-05-19 |
| JPH0226955B2 true JPH0226955B2 (ja) | 1990-06-13 |
Family
ID=15590169
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP55154706A Granted JPS5780398A (en) | 1980-11-05 | 1980-11-05 | Plasmid produced by genetic manipulation, coliform bacillus having the same and preparation of tryptophan with said bacillus |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5780398A (ja) |
| AU (1) | AU549686B2 (ja) |
| CA (1) | CA1182409A (ja) |
Families Citing this family (21)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ZA811368B (en) * | 1980-03-24 | 1982-04-28 | Genentech Inc | Bacterial polypedtide expression employing tryptophan promoter-operator |
| JPH074257B2 (ja) * | 1983-06-17 | 1995-01-25 | 三菱油化株式会社 | 新規なプラスミド |
| JPS6043392A (ja) * | 1983-08-20 | 1985-03-07 | Showa Denko Kk | Ｌ−トリプトフアンの製造法 |
| EP0190921A3 (en) * | 1985-02-04 | 1988-01-13 | Engenics, Inc. | Method for the overproduction of amino acids |
| EP0293207A3 (en) * | 1987-05-29 | 1989-11-02 | The Standard Oil Company | Eschericia coli carrying recombinant plasmid for the production of tryptophan |
| JPH0722510B2 (ja) * | 1988-05-09 | 1995-03-15 | 三井東圧化学株式会社 | 耐熱性トリプトファンシンターゼをコードする遺伝子とその利用 |
| DE4232468A1 (de) | 1992-09-28 | 1994-03-31 | Consortium Elektrochem Ind | Mikroorganismen für die Produktion von Tryptophan und Verfahren zu ihrer Herstellung |
| US6118047A (en) | 1993-08-25 | 2000-09-12 | Dekalb Genetic Corporation | Anthranilate synthase gene and method of use thereof for conferring tryptophan overproduction |
| DE102005019040A1 (de) | 2005-04-23 | 2006-10-26 | Degussa Ag | Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung verbesserter Stämme der Familie Enterobacteriaceae |
| DE102007051024A1 (de) | 2007-03-05 | 2008-09-11 | Evonik Degussa Gmbh | Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von Stämmen der Familie Enterobacteriaceae |
| EP1975241A1 (de) | 2007-03-29 | 2008-10-01 | Evonik Degussa GmbH | Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von verbesserten Stämmen der Familie Enterobacteriaceae |
| DE102007044134A1 (de) | 2007-09-15 | 2009-03-19 | Evonik Degussa Gmbh | Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von verbesserten Stämmen der Familie Enterobacteriaceae |
| DE102007052270A1 (de) | 2007-11-02 | 2009-05-07 | Evonik Degussa Gmbh | Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von verbesserten Stämmen der Familie Enterobacteriaceae |
| EP2060636A1 (de) | 2007-11-14 | 2009-05-20 | Evonik Degussa GmbH | Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von verbesserten Stämmen der Familie Enterobacteriaceae |
| DE102008040352A1 (de) | 2008-07-11 | 2010-01-14 | Evonik Degussa Gmbh | Verfahren zur Herstellung von L-Tryptophan unter Verwendung von verbesserten Stämmen der Familie Enterobacteriaceae |
| DE102008044768A1 (de) | 2008-08-28 | 2010-03-04 | Evonik Degussa Gmbh | Verfahren zur Herstellung von organisch-chemischen Verbindungen unter Verwendung von verbesserten Stämmen der Familie Enterobacteriaceae |
| EP2628792A1 (de) | 2012-02-17 | 2013-08-21 | Evonik Industries AG | Zelle mit verringerter ppGppase-Aktivität |
| EP2762571A1 (de) | 2013-01-30 | 2014-08-06 | Evonik Industries AG | Mikroorganismus und Verfahren zur fermentativen Herstellung von Aminosäuren |
| ES2643442T3 (es) * | 2013-04-16 | 2017-11-22 | Cj Cheiljedang Corporation | Microorganismo que presenta productividad de L-triptófano y método para la producción del L-triptófano mediante la utilización del mismo |
| EP3385275B1 (de) | 2017-04-07 | 2019-10-23 | Evonik Degussa GmbH | Verfahren zur herstellung von aromatischen l-aminosäuren unter verwendung von verbesserten stämmen der familie enterobacteriaceae |
| US11053526B2 (en) | 2018-08-09 | 2021-07-06 | Evonik Operations Gmbh | Process for preparing L amino acids using improved strains of the enterobacteriaceae family |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4371614A (en) * | 1980-08-22 | 1983-02-01 | Ajinomoto Co., Inc. | E.Coli bacteria carrying recombinant plasmids and their use in the fermentative production of L-tryptophan |
-
1980
- 1980-11-05 JP JP55154706A patent/JPS5780398A/ja active Granted
-
1981
- 1981-08-26 AU AU74644/81A patent/AU549686B2/en not_active Withdrawn - After Issue
- 1981-09-29 CA CA000386858A patent/CA1182409A/en not_active Expired
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS5780398A (en) | 1982-05-19 |
| CA1182409A (en) | 1985-02-12 |
| AU7464481A (en) | 1982-05-13 |
| AU549686B2 (en) | 1986-02-06 |
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