JPH02273186A - 鱗翅類害虫活性のＢ．ｔ．ＰＳ８１ＧＧと命々される新規バシラス・スリンギエンシス分離体と、鱗翅類活性毒素をコードした遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、Ｂ、ｔ、ＰＳ８１ＧＧと指定される新規なバ
シラス・スリンギエンシス分離体と、＆ｊｌ　１１目に
活性な毒素をコードした遺伝子に関する。

〔従来の技術〕

（１）微生物殺虫剤 最も広く使用される微生物殺虫剤は細菌バシラス争スリ
ンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｔ＋ｒｉｎ３ｉｅ
ｎｓｉｓ）に由来している。この細菌薬剤は、葉を食べ
る広範囲のいも虫や蚊の防除に使用される。バシラス・
スリンギエンシスは、感受性のある昆虫ホストに摂取さ
れると有毒なタンパク性パラ胞子や結晶をつくる０例え
ば、バシラス・スリンギエンシス・バラエテ４”カース
タキ（Ｂ、ｔｈｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ　ｖａｒ。

ｋｕｒｓｔａｋｉ）　ＨＤ−１は、デルタ毒素と呼ばれ
る結晶をつくるが、これは幾つかのｉａ翅目毘虫の幼虫
に有毒である。大ＩＩＩＮ（Ｅ、　ｃｏｌｉ）における
このＳ、ｔ。

結晶タンパク遺伝子のクローニング及び発現は、公表文
献［シュネフ番エッチφイー（Ｓｃｈｎｅｐｆ、　Ｈ，
Ｅ、）及びホワイトリー・エッチ・アール（Ｌ＋１ｈｉ
ｔｅｌｙ、　Ｈ。

Ｒ，）（１９８１年）！　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａ
ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ７８巻２８９３−２８９７
頁］中に記述されている。合衆国特許第４．４４８，８
８５号と第４．４Ｇ７，０３６号は、大１ｌｉＮでのＢ
、ｔ。

結晶タンパクの発Ｅｌを明らかにしている。

（２）　Ｍ翅目害虫 ビートアワヨトウ（ｂｅｅｔ　ａｒＩｙｖｏｒｍ、　Ｂ
ＡＷ、スボドブテラ争エクシグア　５ｐｏｄｏｐｔｅｒ
ａ　ｅｘｉｇｕａ）は、広範囲の畑作物と野菜作物を荒
し、広く分布するヤガである。これはアジアを起源とす
る経済的に重要な種であるが、現在は合衆国を含めた世
界各地に見られる。

ビートアワヨトウに荒される植物はビート、落花生、ア
ルファルファ、レタス、アスパラガス、トマト、じゃが
いも、トウモロコシ、タマネギ、エントウ、綿、かんき
つ類、アオイ科植物、及びある種の野草も含んでいる。

観葉植物や、カーネーションと菊のような草花作物にと
っても害虫である。幼虫はホスト植物の葉、茎、芽、ま
た時には根も食べる。ひどく荒されると、テーブルビー
トのような作物畑で全体的に葉が落ちるに至る。

雌はホスト植物の葉に約８０個の卵の塊りを産む。

これらの卵塊は雌の体からの毛や鱗で覆われている。平
均５００ないし６００個の卵が、４日から１０日の期間
に置かれる。幼虫は２日ないし５日でふ化し、葉を食べ
始める。若い幼虫は、植物の成長先端や発芽してくる芽
を食べるが、もっと成長した幼虫はえり好みが少なく、
大きくなった葉も同じように食べる。第５齢になるのに
約３週間かかり、この時点で成熟幼虫は地面に落ち、土
中でさなぎになる。ビートアワヨトウは暖かい地域では
、年に４世代を経る。

〔発明が解決しようとする課題〕

この昆虫種は、一般に種々の作物状況で防除が困難と考
えられている。レタスその他の畑作物でこの害虫を防除
するには、メトミル（ラネート）が−船釣に用いられる
。しかし、多量使用のこの化学薬品にさらされた集団で
、メトミル耐性が報告されている（ヨシダ及びバレラ［
１９８７年］）、その結果、この重要害虫に対して代替
え防除戦略を開発する必要がある。

ビートアワヨトウ防除にラネートのような広いスペクト
ルの材料を使用するもう一つの面は、第二の害虫発生で
ある。これは、所定の作物で他の害虫の天然防除剤に対
して見られる非選択的化学薬品の破壊的な影響である。

トマト、菊、その他の作物で、ハモグリムシ（１ｅａｆ
ａ＋１ｎｅｒ）が問題となる場合、ラネートを使用する
と、ハモグリムシの天敵集団をひどく抑制する。ハモグ
リムシへの寄生虫が除去されると、ハモグリムシが高水
準の集団となり、深刻な被害をもたらす。

ビートアワヨトウに良好な活性をもった新規なバシラス
・スリンギエンシス分離体の発見及び使用は、この鱗翅
目害虫の防除に明白な改善である。

〔課題を解決する手段〕

本発明は、鱗翅類害虫に対して活性のあるＢ．ｔ。

ＰＳ８１ＧＧと指定される新規なバシラスφスリンギエ
ンシス分離体に間する。これはビートアワヨトウに対し
て非常に活性がある。

また、本発明は、鱗翅類害虫に活性のあるＢ．ｔ。

ＰＳ８１０Ｇの変異種をも包含する。

また、このＩＩＴｆｆｌな分離体からの新規な毒素遺伝
子が明らかにされ、特許請求されている。この毒素遺伝
子はプラスミドベクターを経由して、適当なホストへ移
すことができる。

特定的には、本発明はＢ、ｔ、ＰＳ８１ＧＧと指定され
る新規なり、ｔ、分離体、その変異種、及び鱗翅目害虫
に対して活性のある１３３．１５６ダルトンのタンパク
をコードした新規なデルタ内毒素遺伝子を含めてなる。

ｖＬ１表は、新規な毒素をコードした口ＮＡを明らかに
している。第２表は新規な毒素のアミノ酸配列を明らか
にしている。第３表は第１．２表を合成したものである
。

本発明の新規な毒素遺伝子は、鱗翅類に対して活性のあ
るＰＳ８１ＧＧと指定される新規なり、スリンギエンシ
ス（Ｂ、ｔ、）分離体から得られた。

ＣＢ、ｔ、ＰＳ８１ＧＧの特性］ 集落形態−Ｂ、ｔ、に典型的な大集落で、表面はくすん
でいる。

増Ｍ期の細胞形態−Ｂ．ｔ．に典ヤ的。

鞭毛の血清型−３ａ３ｃ、カースタキ。

細胞内含有物−胞子形成細胞は両錘型結晶をつくり、こ
の結晶が部分的に小さめの立方形結晶を包んでいる。

プラスミド製剤−プラスミド製剤のアガロースゲルミス
泳動は、Ｂ、ｔ、ＰＳ８１ＧＧをＢ．ｔ．ｎｏ−＋及び
他のＢ、ｔ、分離体から区別している。

アルカリ可溶性タンパク−〇、ｔ、ＰＳ８１ＧＧは１３
０．０００ダルトンのタンパクと６０．０００ダルトン
のタンパクをもっている。

特異な毒素−−１３０，０００ダルトンの毒素は既に確
認されたどれとも違っている。

活性−Ｂ、ｔ、ＰＳ８１ＧＧは試験されたすべてのｗ４
ＶＢ目を殺虫し、ビートアワヨトウに対しては、Ｂ　、
　ｔ　、　ＨＤ−１の２倍の活性がある。

ビートアワヨトウ検定結果： Ｂ．ｔ、ＰＳ８１ＧＧ　ＬＣ５０＝　　４μｇ／ｎ＋１
Ｂ、ｔ、ＨＤ−Ｉ　ＬＣ５０＝　８μ８／１スボドブテ
ラ・エクシグア生物検定−−胞子及び結晶ペレットの希
釈物をつくり、合衆国ａ両省の昆虫餌（技術ブレティン
１５２Ｂ．合衆国属両省）と混合し、小さなプラスチッ
クトレーに注いだ。

新生スボドブテラ・エクシグア幼虫を粗混合物上に置き
、２５℃に保持する。死亡率を６日後に記録する。

Ｂ、スリンギエンシスＰＳ８１ＧＧ（ＮＲＲＬ訃！８４
２５）とその変異種は、標準的な既知培地と発酵手法を
用いて培養できる。発酵サイクルの終了時にまずＢ、ｔ
。

胞子と結晶をこの技術で［８１知の手段によって発酵ブ
ロスから分離することによって、細菌を取り入れること
ができる０回収されたＢ、ｔ、胞子及び結晶は、取り扱
いと特定目標害虫への施用を容易にするための表面活性
剤、分散剤、不活性担体、及び他の成分の添加により、
水和剤、濃厚液剤、粒剤又は他の処方剤に処方剤できる
。処方と施用手順はこの技術に周知であり、鱗翅目、例
えばいも生類に対して活性のあるＢ、スリンギエンシス
（ＨＤ−１）の市販菌株と一緒に使用されろ。Ｂ、ｔ、
ＰＳ８１ＧＧとその変異種は鱗翅目害虫の防除に使用で
きる。

本発明のＢ、ｔ、ＰＳ８１ＧＧと、毒素遺伝子を取り込
んだ大ｍ菌ホストである大腸菌ＮＲＲＬ　Ｂ−１８４２
８の二次培養基は、合衆国イリノイ州ビオリア、合衆国
農務省北部地域研究所の永久保存施設に、１９８８年ｌ
Ｏ月１９日に寄託された。呼出し番号は次のとおりであ
る。

［１，ｔ、ＰＳ８１ＧＧ　−ＮＲＲＬ　Ｂ−１８４２５
：１９８８年ｌＯ月１１日寄託。

大腸菌（＋３ＭＶＣ３８Ｂ）　−ＮＲＲＬ　Ｂ−１８４
２８；　　１９８８年１０月１９日寄託。

本培養基は、３７　＋：ＦＲ１，＋４及び３５１Ｊｓｃ
　１２２の下で米国特許商標庁長官に権原があると認め
られた者は、本特許出願に対応する米国出願の係属中に
、培養基を人手できることを保証されているという条件
により寄託された。また、該米国出願又はその子孫の対
応特許出願が提出されている米国以外の国々の特許法で
要求されるとおりに、寄託物は人手できる。しかし、寄
託物が人手できるからといって、行政行為によって付与
された特許権を損わしめて本発明の実施する権利を構成
するものではないことを理解すべきである。

更に、本培養基寄託物は、ブタペスト微生物寄託条約の
規定に従って保存され、一般の人々に入手可能とされる
。すなわち、寄託物の試料提供に対する最も最近の請求
後少なくとも５年間、かつどんな場合も、寄託期日から
少なくとも３０年間か、又は培養基を開示して発行され
る特許の権利行使可能な期間中、これらの寄託物は、生
育可能で汚染されていない状態に保つために必要なあら
ゆる配慮をもって保存される。要求を受けた受託施設が
、寄託物の状態のために試料を供給できない場合には、
寄託者は寄託物を補充する義務を認めるものである。本
培養基寄託物の一般への人手可能性に間するすべての制
限は、これらを開示した特許の付与に際して永久に取り
除かれる。

本発明の毒素遺伝子は、広範囲の微生物ホストへ導入で
きる。毒素遺伝子の発現は、直接又は間接に殺虫剤の細
胞内生産と保持をもたらす、ａ当なホスト、例えばシュ
ードモナスの場合、微生物は鱗翅目昆虫発生位置に施用
さ、れると、そこで増殖し、昆虫に摂取される。その結
果、望んでぃない昆虫を防除できる。その代わりに、毒
素遺伝子をもった微生物を、細胞内でつくられる毒素の
活性を長くするような条件下に処理できる０次に処理細
胞を目標害虫環境に施用できる。生ずる生成物はＲ，ｔ
、毒素の毒性を保持している。

Ｂ．ｔ．毒素遺伝子は適当なベクターを経て微生物ホス
トへ導入されて、このホストが生きている状態で環境へ
施用される場合に、あるホスト微生物を使用することが
必須である。微生物ホストは、一つ以上の重要作物の「
植物領域」（葉面、葉領域、根領域、及び／又は板表面
）を占有することが知られたものを選択する。これらの
微生物は、特定環境（作物及び他の昆虫生息地）中で野
性型微生物と順調に競合できるように選ばれ、ポリペプ
チド殺虫剤を発現させる遺伝子の安定な維持と発現を提
供し、頓ましくは殺虫剤に対して環境的劣化と不活性化
からの改良された保護を提供する。

広範囲の重要作物の葉面（植物の葉の表面）と根の領域
（植物の根の周囲の土壌）に生息する多数の微生物が知
られている。これらの微生物は細菌、藻類及びカビを包
含している。特に興味あるものは、細菌、例えばシュー
ドモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、エルウィニア（
Ｅｒｗｉｎｉａ）、セラティア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、
クレブシェラ（にＩｅｂｓｉｅｌ　ｔａ）、キサントモ
ナス（Ｘａｎｔｈｏ＋ｍｏｎａｓ）、ストレプトミセス
（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、リゾビウム（Ｒｈｉｚ
ｏｂｉｕｍ）、ロードシュードモナス（Ｒｈｏｄｏｐｓ
ｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、メチロフィリウス（Ｍｅｔｈｙ
ｌ。

ｐｈｉｌｉｕｓ）、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ）、アセトバクター（Ａｃｅｔｏｂａｃ
ｔｅｒ）、乳酸杆菌（Ｌａｃｔｏ−ｂａｃｉｌｌｕｓ）
、アースロバフタ−（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、ア
ゾトバクター（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）、リューコノ
ストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）及びアルカリゲネ
ス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　）属の細菌；菌類、特に
酵母、例えばサツカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃ
ｅｓ）、クリプトコツカス（Ｃｒ　ｙｐｔｏｃｏｃｃｕ
ｓ）、クルイベロミセス（ＫｌｕｙｖｅｒｏＩＩｌｙｃ
ｅｓ）、スポロボロミセス（Ｓｐｏｒｏｈｏｌｏｍｙｃ
ｅｓ）、ロードトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、及
びオーレオバシジウム（Ａ　ｕ　ｒｅｏｂａｓｉｄｉｕ
ｍ）属の微生物である。特に重要なものは、シュードモ
ナス争シリンガ’ｘ　（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｙ
ｒｉｎｇａｅ　）、シュードモナス・フルオレッセンス
、セラティア脅マルセスケンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｍ
ａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、アセトバクター・キシリヌム（
Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｘｙｌ　ｉｎｕｍ）、アグロ
バクテリウム令ツメファシェンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）−ロードシュード
モナス・スフェロイデス（Ｒｈｏ＋ｉｏｐｓｅｕｄｏｍ
ｏｎａｓ　５ｐｈｅｒｏｉｄｅｓ）、キサントモナス・
カンペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍ。

ｎａｓ　ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）、リゾビウム・メリオ
チ（Ｒｈｉｚｏｂ目１１ＩＩ…ｅｌｉｏｔｉ）、アルカ
リゲネス争エントロフス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　ｅ
ｎｔｒｏｐｈｕｓ）及びアゾトバクター拳ヴインランデ
ィ（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ　ｖｉｎｌａｎｄｉｉ）の
ような植物領域の細菌種；及びロードトルラ・ルブラ（
Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ　ｒｕｂｒａ）、Ｒ，グルチニ
ス（Ｒ，ｇｌｕｔｉｎｉｓ）、Ｒ，マリーナ（Ｒ，ｍａ
ｒｉｎａ）、Ｒ，オーランティアカ（Ｒ。

ａｕｒａｎＮａｃａ）、クリプトコツカス・アルビダス
（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ａｌｂｉｄｕｓ）、Ｃ，
ジフルエンス（Ｃ，ｄｉｆｆｌｕｅｎｓ）、Ｃ，ローレ
ンティ（Ｃ，ｌａｕｒｅｎｔｉｉ）、サツカロミセス・
ロゼイ（Ｓ、ｒｏｓｅｉ）、Ｓ、プレトリエンシス（Ｓ
、　ｐｒｅｔｏｒｉｅｎｓｉｓ）、Ｓ、セレビシェ（Ｓ
、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）＋スポロボロミセスー０ゼウ
ス（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ　ｒ。

ｓｅｕ　ｓ　）、Ｓ、オドルス（Ｓ、　ｏｄｏｒｕｓ）
、クルイベロミセス舎ヴエローナエ（Ｋｌｕｙｖｅｒｏ
ｍｙｃｅｓ　ｖｅｒｏｎａｅ）及びオーレオバシジウム
Ｉポルランス（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍｐｏ　ｌ　
ｌ　ＩＩ　ｌ　ａｎｓ）のような植物領域の酵母種であ
る。

特に重要なのは有色前微生物である。

遺伝子の安定な保持と発現を可能とするような条件下に
、毒素を発現させるＢ．ｔ、遺伝子を微生物ホストに導
入するには、さまざまな方法を利用できる。！Ｉ素遺伝
子発現用の転写翻訳調節イに号とその調節制御下の毒素
遺伝子、及び組込みを行なうためのホスト生物内の配列
と相同のＤＮＡ配列、また絹込みや安定な１呆持が起こ
るための、ホスト内で機能的な複製系などを含んだＤＮ
Ａ構造体を用意することができる。

転写開始信号はプロモータと転写開始出発位置を包含し
よう、ある場合には、毒素の調節的発Ｉｎを提供して、
毒素の発現が環境への放出後にのみ生ずるようにするの
が望ましいこともある。これはオペレータ、又はアクチ
ベータやエンハンサに結合する領域、によって達成でき
、これらは微生物の物理的又は化学的環境の変化によっ
て誘発てきる。例えば、温度感受性調節領域を使用する
と、生物は毒素を発現せずに実験室で生育でき、環境へ
枚用されると発現が始まる。他の手法は、実験室で毒素
の発現を抑制する特定的な栄養培地を使用し、一方環境
中での栄養培地は毒素発現を可能とするものを使用でき
る。転写開始には、リポソーム結合位置と開始コドンが
存在しよう。

メツセンジャーＲＮＡの安定性を強化する配列を使用す
ると共に、特に活性プロモータを使用してメツセンジャ
ーの発現を強化するために種々の操作を使用できる。開
始及び転写終結領域は停止コドン、終結領域、及び任意
にポリアデニル化信号を包含しよう。

転写の方向、すなわちコーディング又はセンス配列の５
′から３１への方向で、構造体は転写調節領域（これが
ある場合）とプロモータ（制御領域はプロモータの５′
又は３′のいずれかにある）、リボゾーム結合位置、開
始コドン、開始コドンと同調する開放読取り枠をもった
構造遺伝子、停止コドン、ポリアデニル化信号配列（使
用する場合）、及び終結領域を包含しよう。二本鎖とし
てのこの配列はそれ自体微生物ホストの形質転換に使用
できるが、胃通はマーカーを含めたＤＮＡ配列を伴うよ
うにし、この第二のＤＮＡ配列は、ホストへのＤＮＡ導
入中に青紫発現構造体に結合させることができる。

マーカーとは、変更又は形質転換されたホストの選定を
行なうための構造遺伝子のことである。

マーカーは通常、選択的利点を提供するもので、例えば
抗生物質や這金属への耐性などの殺生物耐性や、栄養素
要求ホストに原栄養性を与える相補性を提供する。変更
されたホストがｉｌ！定されるだけでなく、野外で競合
的であるように、相補性を使用するのが好ましい、構造
体の開発に、またホストの変更に、一つ以上のマーカー
を使用できる。

野外で池の野性型微生物に対する競合的利点を提供する
ことによって、生物を更に変更できる。例えば、金属キ
レート剤、例えばシデロフォア類の発現用遺伝子を、毒
素発ＩＱ用の構造遺伝子と一緒にホストへ導入できる。

この方法で、シデロフォアの強化された発現が毒素生産
ホストに競合的利点を提供するため、ホストは野性型微
生物と効果的に競合し、環境中で安定した生態的地位を
占めるようになる。

機能的な複製系が存在しない場合、構造体はホスト内の
配列と相同な、少なくとも５０塩基対（ｂ　ｐ）、好ま
しくは約１００　ｂｐ−及び通常的１，０００　ｂｐま
での配列を包含しよう、こうして合法的組換えの確率が
強化されるため、遺伝子はホストへ組込まれ、ホストに
よって安定に保持される。毒素遺伝子が相補性を提供す
る遺伝子並びに競合的利点を提供する遺伝子に近接して
いるのが望ましい、従って、毒素遺伝子が失われる場合
、生ずる生物は相補性遺伝子及び／又は競合的利点を提
供する遺伝子も失う可能性が強く、このため無傷の構造
体を保持している遺伝子と環境中で競合できなくなる。

細菌、バクテリオファージ、シアノバクテリア、藻類、
カビ等のような広範囲の微生物ホストから多数の転写調
節領域が人手できる。稽々の転写調節領域はｔｒｐ遺伝
子、ｌａｃ遺伝子、３ａｌ遺伝子、ラムダ左及び右プロ
モータ、Ｔａｃプロモータ、及びホスト中で機能的な場
合は毒素遺伝子と関連して天然に生ずるプロモータを包
含する。例として合衆国特許第４，３３２，８９８号、
第４，３４２，８３２号、及び第４．３５ｆｉ、２７０
号を参照のこと、終結領域は、普通は転写開始領域と関
連する終結領域か、又は異なる転写開始領域（二つの領
域がホスト内で適合的で機能的である限りにおいて）で
ありうる。

安定なエピゾーム保持又は絹込みを所望する場合は、ホ
スト中で機能的な１１製系をもったプラスミドが使用さ
れよう、複製系は染色体、ホストや別のホスト内に通常
存在するエピゾーム要素、又はホスト内で安定なウィル
スの複製系から誘導される。ｐＢＲ３２２、ｐＡＣＹＣ
１８４、Ｒ５Ｆ１０１０．、ｐＲＯＩＧ１４等（Ｄよう
な多数のプラスミドが人手できる。例として、オルソン
（Ｏｌｓｏｎ）ら、（璽９８２年）　ｊ、Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌ、　１５０巻６０６９頁、及びバグダサリアン（
８ａ８ｄａｓａｒｉａｎ）ら、（１９８１年）　Ｇｅｎ
ｅ　１６巻２３７頁、並びに合衆国特許第４゜３５０．
２７０号、第４．３（３２，８１７号、及び第４　、３
７１　、６２５号を参照のこと。

Ｂ．ｔ、遺伝子は開始領域の調節制御下にあるように、
転写翻訳開始領域と転写翻訳終結領域との間に導入でき
る。この構造体はプラスミドに含有され、プラスミドは
少なくとも一つの複製系を包含するが、一つ以上を包含
でき、その場合−つの複製系はプラスミドの開発中にク
ローニング用に使用され、第二の複製系は最終ホストで
の機能発揮に必要である。更に、すでに述べた一つ以上
のマーカーが存在できる。絹込みを望む場合は、プラス
ミドはホストゲノムと相同の配列を含むのが望ましい。

形質転１粂体は、通常、未変更生物や運搬生物が存在す
る時は、それらに対して所望生物を選定できるように、
慣用の方法に従）て選定手法を使用して単離できる０次
に形質転換体を殺虫活性のために試験できる。

殺虫剤含有細胞を処理して処理細胞を目標害虫環境に施
用する時に、細胞内毒素の活性を長くするのに適したホ
スト細胞は、原核生物か真核生物を包含するが、通常、
哺乳類のような高等生物に有毒な物質を生しない細胞に
限定される。しかし、毒素が不安定か、哺乳類ホストへ
の毒性の可能性を回避するのに十分な低い施用水準であ
る場合には、高等生物に有毒な物質をつくる生物も使用
できる。ホストとして、特に興味あるものは、原核生物
と、カビのような低級真核生物である。ゲノム陰性・陽
性双方の原核生物の例は、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒ
　１ｃｈｉａ）、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）、シ
ゲラ（Ｓｈｉｇｅｌ　ｌａ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏ
ｎｅｌｌａ）及びブロチウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）のよう
な腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ
）　：バシラス科（Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）　：リゾ
ビウム（ＲｈｉＺｏｈｉｕｎ＋）のようなりソビウム科
（Ｒｈｉｚｏ−ｂｉａｃｅａｅ）　；発光ｗＡ菌、ジモ
モナス（ＺｙｌｌＩｏ＊ｏｎａｓ）　＋セラティア（Ｓ
ｅｒｒａｔｉａ）、アエロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ
）、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）、デスルホビアリオ（Ｄ
ｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒＯ）、スピリルム（Ｓｐｉｒｉｌ
ｌｕｍ）のようならせん菌科；乳酸かん菌科；シュード
モナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）及びアセトバクター
（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）のようなシュードモナス科
ニアシトバクター科及びニトロバクター科を包含スル。

真核生物ニＣａｔ藻ｒＪｆ　類（Ｐｈｙｃｏｍｙｃｅｔ
ｅｓ　）と子のう菌ＩＩＩ　（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ
）のようなカビがあり、これはサツカロミセス（Ｓａｃ
ｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）とシゾサツカロミセス（Ｓｃｈ
ｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）のような酵母、ロ
ートトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、オーレオバシ
ジウム（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）、スポロボロミ
セス（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ）のような担子菌
類（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ）酵母を包含する。

生産目的のためにホスト細胞を選定する上で特に重要な
特性は、ｅ　、　ｔ、　、　ｉｊｔ伝子のホストへの導
入の容易さ、発現系の入手性、発現効率、ホスト中の殺
虫剤の安定性、及び補助的遺伝能力の存在を包含する。

殺虫剤ミクロカプセルとして使用するのに重要な特性は
厚い細胞壁、色素形成、及び細胞内パッケージング又は
封入体の形成のような殺虫剤保護性；葉親和性；対哺乳
類毒性の欠如；害虫に摂取させるための誘引力；毒素に
損害を与えない殺菌固定の容易さ等を包含する。他の考
慮としては、処方と取り扱いの容易さ、経済性、保存安
定性等がある。

特に重要なホスト生物は、ロードトルラ種、オーレオバ
シジウム種、サツカロミセス種、スポロボロミセス種の
ような酵母；シュードモナス種、エルウィニア種、及び
フラボバクテリウム種のような葉面に生息する生物；又
はエシェリキア、乳酸杆菌種、バシラス種等の池の生物
を包含する。

特定的な生物は、シュードモナス・アエルギノサ（１’
ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒＢｉｎｏｓａ）、シュー
ドモナス拳フルオレッセンス（Ｐ、ｆ　Ｉｕｏｒｅｓｃ
ｅｎｓ）、サツカロミセス−セレビシェ（Ｓａｃｃｈａ
ｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、バシラス壷
スリンギエンシス、大ＩＩ！菌、枯草ｒＪ（Ｂ。

５ｕｈＬｉｌｉｓ）等を包含する。

細胞は通常、ｗ！、ＩＩＫであって、処理時に胞子型よ
りも実質的に増殖型にあるが、ある場合には胞子も使用
できる。

微生物細胞、例えばＢ．ｔ、毒素遺伝子を含有する微生
物の処理は、毒素の性状に悪影響を及ぼさないか、又は
毒素を保護する細胞能力を消滅させない限り、化学的又
は物理的手段によるか、又は化学的及び物理的手段の鞘
合わせによる。化学的試薬の例はハロゲン化剤、特に原
子番号＋７−８０のハロゲンである。もっと特定的には
、ヨウ素を温和な条件下に、所望の結果を達成するのに
十分な時間に使用できる。池の適当な手法は、ホルムア
ルデヒドとグルタルアルデヒドのようなアルデヒド類：
塩化ゼフィランと塩化セチルピリジニウムのような抗感
染剤：イソプロビルアルコールとエタノールのようなア
ルコール類；プアン固定剤とヘリ−同定剤［７マソン（
Ｈ＋ｎｗａｓｏｎ）、グレッチェン・エル（Ｇｒｅｆ、
ｃｈｅｎ、　Ｌ、）　ｒ動物組織手法」ダブリュー・エ
ッチ◆フリーマン社、１９６７年、を＃照］のような種
々の組織学的固定剤等での処理二又はホスト動物に細胞
を投与する時に細胞中につくられる毒素の活性を保存し
、持続させるような物理的処理（加熱）と化学薬剤処理
との絹合わせを包含する。物理的手段の例は、ガンマ放
射線とＸ線のような短波長放射線、凍結、υＶ照射、凍
結乾燥等である。

一般に細胞は、環境条件に対する耐性を強化するような
、強化された構造安定性をもつであろう。

殺虫剤がプロ型の場合は、目標害虫病原体による殺虫剤
のプロ型から成熟型への加工を抑制しないように、不活
性化方法を選定すべきである。例えばホルムアルデヒド
はタンパクを架橋し、プロ型ポリペプチド殺虫剤の加工
を抑制できる。不活性化ないし殺菌方法は、毒素の少な
くとも実質部分の生物学的利用率又は生物活性を保持す
る。

Ｂ、ｔ、殺虫剤遺伝子を含有する細胞ホストは任意慣用
の栄養培地で生育できるが、ＤＮＡ構造体は選択的利点
を提供するため、′Ｓ胞の全指又は実質的全電がＢ．ｔ
．遺伝子を保持するように選択培地となる。次にこれら
の細胞を慣用方法に従って取り入れる。その代わりに、
細胞を取り入れる前に処理することもできる。

Ｂ、ｔ、ａ＠を種々の方法で処方できる。これらを無機
鉱物（フィロ珪酸塩、炭酸塩、硫酸塩、燐酸塩等）又は
植物材料（粉末トウモロコシ穂軸、もみ殻、クルミ殻等
）のような種々の不活性材料と混合することにより、水
和剤、粒剤又は粉剤として使用できる。処方剤は展粘着
助剤、安定剤、その他殺虫助剤、又は表面活性剤を包含
できる。液体処方剤は水性基盤又は非水性基盤のもので
、フォ−ム、ゲル、懸濁液、乳剤等として使用できる。

成分は流動剤、表面活性剤、乳化剤、分散剤又は重合体
を包含できる。

殺虫剤濃度は特定処方剤の性質、特に濃厚液か直接使用
されるかによって、広範囲にわたる、殺虫剤は少なくと
も＋ｉｔｘで存在し、１００＠量Ｘでありうる。乾燥処
方剤は約１−９５重量工の殺虫剤をもつが、液体処方剤
は一般に約１−６０１１：Ｘの固形分を液相中にもつで
あろう。処方剤は概してｌｌ１ｇ当たり約１０２ないし
約１０　’　ｌｌＡｌの細胞をもつであろう、これらの
処方剤はへクタール当たり約５０　Ｂ（液体又は乾燥）
ないしＩ　ｔ＋４以上の率で投与さ°れよう。

処方剤は鱗翅目害虫環境、例えば植物、土壌、又は水に
噴霧、散布、散水等によって施用できる。

ＰＳ８１ＧＧの変異種は、この技術で周知の手順によっ
てつくることができる０例えば、非胞子形成性変異種は
、ＰＳ８１ＧＧのエチルメタンスルホネー）　（ＥＭＳ
）変異誘発によフて得られる。変異種は、この技術で周
知の手順により、紫外光やニトロソグアニジンを使用し
てつくることができる。

以下は本発明実施の最善の１様を含めた手順を例示した
実施例である。これらの例は限定的に考えられてはなら
ない。他に注意がなければ、百分率はすべて重量、溶媒
混合物割合はすべて容量による。

実施ＰＩＩＩＬ量、、Ｐ５８１ＧＧ（ＮＲＲＬ　Ｂ−１
８４２５）の培養Ｂ、ｔ、ＰＳ８１ＧＧ（ＮＲＲＬ　Ｂ
−１８４２５）又はその変異種の二次培養基を使用して
次の培地、すなわちペプトン・ブドウ糖・塩培地に接種
した。

バクト・ペプトン　　　　７．５　ｇ／ｌブドウ糖　　
　　　　　　１．０　ｇ／ｌＫＨ２ＰＯ４３，４ｇ／ｌ に２）ＩＰＯ４４，３５ｇ／ 塩溶液　　　　　　　　　５．０　ｍｌ／ＣａＣｌ２溶
ｔ？！２　　　　　　　５．０ｍｌ／Ｉ塩溶液（１００
ｍｌ） ＭｇＳＯ４−？Ｈ２０２，４６８ ＭｎＳＯ４−Ｈ２Ｏ０，０４ｇ ＺｎＳＯ４−７Ｈ２００，２８ｇ ＦｅＳＯ４−７Ｈ２００，４０ｇ ＣａＣＩ２ＣａＣｌ２溶渣ｌ） ＣａＣＩ、−２８２０３，６６ｇ ｐＨ７，２ 塩溶液とＣａＣｌ２溶渣を濾過滅菌し、オートクレーブ
処理し調理したアロスに、接種時に添加する。

２００　ｒｐｎ＋で操作される回転振どう機で、フラス
コを３０℃、６４時間培養する。

上の手１１１Ｇは、この技術で周知の手＋ｍにより、大
発酵装置まで容易に規模拡大できる。

上の発酵で得られるＢ．ｔ．ｌＩｌ！子及びｌ又は結晶
は、この技術で周知の手１１１１により単離できる。し
ばしば用いられる手順は、取り入れた発酵液を分離手順
、例えば°遠心分離にかけることである。

実施例２Ｆ’＋規な毒素遺伝子のクローニングと大ｍ菌
への形質転換 Ｂ、スリンギエンシスＨＤ−１と新規なり、ｔ、ＰＳ８
１ＣＧの細胞を低光学密度（ＯＤｅｏｎ”ｌ　、０）に
生育させ、細胞を遠心分離によって回収し、全細胞ＤＮ
Ａを調製した。２０１庶糖と５０ｍｇ／ｍｌリゾチーム
を含有するＹＥＳ緩衝Ｍ（３０ｍＭ）リス−Ｃ１、Ｉ（
１ｍＭ　ＥＤＴＡ、　５０　ｍＭ　ＮａＣｌ、ｐｌ＝　
Ｂ．０）中で細胞をプロトプラスト化させた。

プロトプラストを４ｚの最終濃度までＳＯ５添加によっ
て溶菌化した。細胞材料を最終濃度１００　ｍＭの中性
塩化カリウム中、４℃で一夜沈殿させた。上澄み液をフ
ェノール／クロロホルム（１：１）で２回抽出した。Ｉ
ＩＮＡをエタノール中で沈殿させ、塩化セシウム勾配上
の等密度バンディングによって精製した。

ＰＳ８１ＣＧとＨＤ−１からの全細胞［ＩＮＡをＥｃｏ
ＲＩで消化させ、０．８ｚアガロースゲル−ＴＡＥ−１
１Ｊｔｉ化ゲル上の電気泳動によって分離した。ゲルの
サザンプロットを、ＮＲＲＬ　Ｂ・１８３３２のプラス
ミド１Ｍ１．１３０−７中に含まれる毒素遺伝子のＮ５
ｉｌからＮ５ｉｌまでの断片、及び’４．５　ｋｈクラ
ス■の毒素遺伝子［クロンスタッド（にｒｏｎｓｔａｄ
）及びホワイトリー（Ｗｈｉｔｅｌｙ）（１９８６年）
Ｇｅｎｅ　ｕｓＡ　４３巻２９−４０頁］のＮ５ｉｌか
らＮ５ｉｌまでの断片でプローブした。これらの二つの
断片を一緒にし、プローブとして用いた。結果は、Ｐ　
Ｓ　８１０Ｇのハイブリット化断片がＨＤ−１のそれと
異なることを示している。特定的には、ＰＳ８１ＧＧ中
の３．０　ｋｂのハイブリッド化バンドが、ＨＤ−１中
に見られる８００ｈｐ大きい３．８　ｋｂのハイブリッ
ド化バンドの代わりに検出された。

ＰＳＩ（ＩＧＧの全細胞ＤＮＡ　２００７１ｇをＥｃｏ
ＲＩで消化させ、分離用０．８χアガロース−ＴＡＥゲ
ル上の電気泳動によって分離した。ゲルの２．５　ｋｂ
から３．５　ｋｂの領域を切り出し、そこからのＤＮＡ
を電気溶離し、ＥＬＵＴＩＰＴ”−ｄ　（シュライヒャ
ー・エンドやシュニル社、ニューハンプシャー州キーン
）イオン交換カラムを用いて濃縮した。単離されたＥｃ
ｏＲＴ断片をＬＡＭＢＤＡＺＡＰ”ＥｃｏＲｌアーム（
ストラタジーン・クローニング・システムズ社、カリフ
ォルニア州うホヤ）こと再結合し、ＧＩＧＡＰＡＣにＧ
ＯＬＤ”抽出液を用いてパッケージ処理した。パッケー
ジ化した組換えファージを太ｌ１ｌＩ菌菌株ＢＢ４（ス
トラドジーン）と−緒にプレートに職くと、高プラーク
密度が得られた。

プラークを放射性標識付きプローブによる標準的核酸ハ
イブリッド化手順によって選定した。ハイブリッド化さ
れたプラークを精製し、低プラーク密度で再選定した。

生ずる精製ファージをＲ４０８Ｍ１３ヘルパーファージ
（ストラドジーン）と−緒に生育させ、紺換えＢ１．１
ＪＥＳＣＲＩＰＴ”　（ストラタジーン）プラスミドを
自動的に切り出し、パッケージ化した。自動化切り出し
法の一部として、「ファージミツド」をＸＬＩ−旧ｕｅ
大腸菌細胞（ストラドジーン〉に再感染させた。感染Ｘ
ＬＩ−Ｂｌ＋＋ｅ細胞をアンピシリン耐性について選定
し、所望のプラスミドを見つけるため、生ずるコロニー
を標準ミニブレツブ化手順によって分析した。プラスミ
ドｐＭ４，３１１は、約３．Ｏｋｂ　ＥｃｏＲＩ挿入物
を含有しており、ストラドジーン社のＴ７及びＴ３ブラ
イマー、プラス−絹の既存Ｂ．ｔ．内毒素オリブスクレ
オ子ドブライマーを用いて配列決定した。

ＰＳ８１ＧＧの全Ｍｌ　胞ＤＮＡをＡｌｕｌ叉はＲｓａ
　Ｉで部分的に消化させ、消化物を混合した。ＤＮＡ１
ｉ：ＥｃｏＲＩメチラーゼで変更し、ＥｃｏＲＩリンカ
−を末端に再結合し、過剰のリンカ−をＥｃｏＲＩ消化
によって除去した。　ＤＮＡを０．８！アガロース−Ｔ
ＡＥゲル上でサイズ分画し、電気ｍＭとＮＡＣ３５２カ
ラムクロマトグラフイ（ＢＲＬ）によって約４−８　ｋ
ｂの断片を回収した。ＥｃｏＲＩで切断したＬＡＭＢＤ
Ａ　ＺＡＰ”（ストラタジーン）への挿入物再結合後、
Ｄ　Ｎ　Ａをファージヘッドへパッケージした。放射性
標識付き合成オリゴヌクレオチトブローア（ＣＣＴＧＴ
ＣＧＧＴＴＴＴＴＣＧＧＧＧＣＣ）を使用する核酸フィ
ルターハイブリッド化によってライブラリーを選定した
。

ハイブリッド化の陽性のものをプラーク精製し、メーカ
ー（ストラタジーン）の指示のとおりに、ヘルパーファ
ージによって挿入［）ＨＡをファージ［ｌＮＡからｐＢ
ＬＩＪＥｓｃＲＩＰＴ”７ラスミＦ　＜７．　）　’ｙ
９シー：／＞上に切り出した。所望のプラスミド’　ｐ
ＭＹｃ３８８を制限地図化し、ｌ’１．ｔ、毒素コード
配列をＤＮＡ配列決定によって完全に特性化した。

穏準昆虫試験からのデータは、新規なり、ｔ、Ｐｓ８１
ＧＧが試験されたすべての鱗翅目に活性であることを示
している。

上のクローニング手Ｉｌｌは、他に注意がなければ標準
手順を使用して行なった。

プラスミドの調製とホスト生物の形質転換に使用される
種々の方法はこの技術で周知である。また、クローニン
グ−ビヒクルとしてのラムダバクテリオファージの使用
法、すなわちラムダＤＮＡの調製、生体外パッケージン
グ、及び組換えＤＮＡのトランスフェクションは、この
技術で周知である。

これらの手順はすべて、マニアチス・ティー（Ｍａｎｉ
ａｔｉｓ、　Ｔ、）、フリッシュ・イー・エフ（Ｆｒｉ
ｔｓｃｈ。

Ｅ、Ｆ、）及びサムブロックｅジエイ（Ｓａｍｂｒｏｏ
ｋ、　、１．）（１９８２年）、「分子クローニング：
実験マニュアル」（コールド・スプリング・ハーバ−研
究所、ニューヨーク州）に記述されている。このように
、微生物細胞からＤＮＡを抽出し、制限酵素での消化を
行ない、ＤＮＡ断片を電気泳動にかけ、プラスミドのテ
ーリングとアニーリングを行ない、ＤＮＡを挿入、再結
合し、細胞を形質転換し、プラスミドＤＮＡをｌｌＩ製
し、タンパクを電気泳動にかけ、Ｄ　Ｎ　Ａの配列を決
定するのは、遺伝子工学の当業者の技術範囲にある。

本明！Ｉ書で明らかにされているＩ’ｌ限酵素は、ベセ
スダ研究所（メリーランド州ゲイサーズバーグ）及びニ
ューイングランド・バイオラブ（マサチュ−セッッ州ビ
バリー〉から購入できる。酵素は、供給側から提供され
る指示に従って使用される。

Ｂ、ｔ、毒素遺伝子を含有するプラスミドｐＭ’／Ｃ３
８Ｂは、形質転換されたホスト微生物から周知の標準手
１１１ａを用いて除去できる。例えば大腸菌（ｐＭＹＣ
３８８）ＮＲＲＬ　Ｂ−１８４２８を透明溶菌液の等密
度勾配手順等にかけて、ＰＭＹＣ３８８を回収すること
ができる。

実施例３　毒素遺伝子のも賽物への挿入本明Ｉｇ書で明
らかにされている新規な殺虫剤毒素をコードした新規な
遺伝子は、アブロバフタ−舎ツメファシェンス（Ａｇｒ
ｏｌ＋ａｃｔｅｒ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）からのＴ
−プラスミドを使用して、植物細胞へ挿入できる。次に
稙物！ｌ胞を植物へ再生させる［ザンプリスキφビー（
Ｚａｓｂｒｙｓｋｉ、　Ｐ、）、ジョースφエッチ（Ｊ
ｏｏｓ、　Ｈ，）、ジエンテロ・シー（Ｇｅｎｔｅｌｌ
ｏ、　Ｃ，）、リーマシス、ジエイ（Ｌｅｅｍａｎｓ、
　Ｊ、）、パン・モンタギュー・エム（Ｖａｎ　Ｍｏｎ
ｔａｇｕｅ、　Ｍ、）、及びシェル・ジェイ（Ｓｃｈｅ
ｌｌ、　　Ｊ、）（１９８３年）Ｃｅｌｌ　３２巻＋０
３３−１０４３頁］、この点で、特に有用なベクターは
ｐＥＮＤ４にである［クリーφエッチ・ジエイ（にｌｅ
ｅ、　Ｈ，Ｊ、）、ヤノフスキー・エム・エフ（Ｙａｎ
ｏｆｓｋｙ、　Ｍ、Ｆ、）及びネスダー・イー拳ダブリ
：１−　（Ｎｅｓｔ、ｅｒ、　Ｅ、ｌｊ、）（１９８５
年）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　３巻ｆ１３７−６
４２頁］。このプラスミドは、植物細胞と細菌中で複製
でき、パラセンジャー遺伝子に対して複数のクローニン
グ位置をもっている。釣りえは毒素ｉｎ！　１云子はｐ
ＥＮ０４にのＢａｍ１ｌｌへ挿入され、大腸菌中で増鼎
し、適当な植物細胞へ形質転換される。

実施例４　　ｆ、ＦｔＢｌなＢ．スリンキニンシス遺伝
子のバクロウィルスへのクローニング 本発明の新規な遺伝子を、オートグラフ７・カリフオル
ニカ（ＡＩｌ↑、ｏｇｒａｐｌ＋ａ　ｃａｌｉｆｏｒｎ
ｉｃａ）核ポリへトロシスウィルス（ＡｃＮＰＶ）のよ
うなバクロウィルスへクローン化できる。ρｔｌｃ８の
ような市販のクローニングベクターにクローン化された
ＡｃＮＰＶケノムを含有するプラスミドを構築てきる。

ＡｃＮＰＶゲノムを変更し、ポリヘトリン遺伝子のコー
ド領域が除かれて、パラセンジャー遺伝子の特異なりロ
ーニング位蘭がポリヘトリンプロモータの真後ろに看か
れるようにする。このようなベクターの例はペノックら
［ペノック・ジーφデイ−（ＰｅｎｎＯＣｋｌＧ、Ｄ、
）、シューメーカー・シー（Ｓｈｏｅｍａｋｅｒ、　Ｃ
，）及びミラー・エル・ケイ（Ｍｉｌｌｅｒ、Ｌ、に、
）（１９８４年）Ｍｏｌ。

Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、４巻３９９−４０６頁］に記述さ
れたｐＧＰ−８６８７４、及びスミスら［スミス・ジー
・イー（Ｓｍｉｔｈ、Ｇ、Ｅ、）、サマーズ奉エム・デ
イ−（Ｓｕｍｍｅｒｓ、　Ｍ、Ｄ、）及びフレーザー・
エム・ジエイ（１９８３年）Ｍｏ１．　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉ
ｏｌ。

３巻２１５６４１６５頁］に記述されたｐ　Ａ　ｔ：　
３８０である６本発明の新規なタンパク毒素をコートシ
た遺伝子は、コート領域から）−、１＝及び下流の適当
な領域で、Ｂａｍ１ｌｌリンカ−によって変更でき、Ａ
ＣＮＰＶベクター類の一つのもののパラセンジャー位置
に挿入できる。

すてに明らかにされたように、Ｂ、ｔ、毒素遺伝子をコ
ードしたヌクレオチド配列を第１表に示す。

推定されたアミノ酸配列を第２表に示す。

この技術で１４知のように、タンパクのアミノ酸配列は
、ＤＮＡのヌクレオチド配列によって決定される。遺伝
暗号の重剰性のため、すなわちタンパクをつくるのに使
用されるアミノ酸のほとんどに対して一つ以上の暗号化
ヌクレオチドトリブレット（コドン）を使用できるため
、一つの特定アミノ酸に対して異なるヌクレオチド配列
がコードできる。このため、遺伝暗号を次のように描く
ことができる。

フェニルアラニン（Ｐｈｅ）　　　ＴＴＫロイシン（Ｌ
ｅｕ）　　　　　　　　ＸＴＹイソロイシン（ｌＩｅ）
ＡＴＭ メチオニン（Ｎｅｔ）　　　　　　　ＡＴＧバリン（Ｖ
ａｌ）　　　　　　　　　ＧＴＬセリン（Ｓｅｒ）　　
　　　　　　　ＱＲＳプロリン（Ｐｒｏ）　　　　　　
　　ＣＣＬスレオニン（Ｔｔ＋ｒ）　　　　　　ＡＣＬ
アラニン（Ａｌａ）　　　　　　　　ＧＣＬチロシン（
Ｔｙｒ）　　　　　　　ＴＡにヒスチジン（Ｈｉｓ）　
　　　　　ＣＡＫグルタミン（Ｇｌｎ）　　　　　　　
ＣＡＪアスパラキン（Ａｓｎ）　　　　　ＡＡにスリン
（Ｌｙｓ）　　　　　　　　　ＡＡＪアスパラギン酸（
Ａｓｐ）　　　　ＧＡＫグルタミン酸（Ｇｌｕ）　　　
　　　ＧＡＪシスティン（Ｃｙｓ）　　　　　　ＴＧＫ
トリプトファン（Ｔｒｐ）　　　　ＴＧＧアルギニン（
Ａｒｇ）　　　　　　−ＧＺグリシン（Ｇｌｙ）　　　
　　　　　ＧＧＬ終結信号　　　　　　　　　ＴＡ、１ 解読法：各三文字のデオキシヌクレオチドの三つ絹は、
左側に５１末端、右側に３′末端をもつ伝令ＲＮＡのト
リヌクレオチドに対応する。本明細書に記載のＤＮＡは
すべて、ウラシルにはチミンを置き換えた、ｍＲＮＡの
配列に対応する配列のＤＮＡ鎖のものである６文字はデ
オキシヌクレオチド配列を形成するプリン又はピリミジ
ン塩基を示す。

Ａ＝アデニン Ｇ＝ニブアニ ン＝シトシン Ｔ＝チミン ＹがＡまたはＧの場合は、Ｘ＝Ｔ又はＣ１■が℃または
Ｔの場合は、Ｘ＝Ｃ。

ＸがＣの場合は、Ｖ＝Ａ、　Ｇ、　Ｃ又ハＴ。

×がＴの場合は、Ｖ＝Ａ又はＧ。

ＺがＡ又はＧの場合は、Ｗ＝Ｃ又はＡ。

ＺがＣ又はＴの場合は、Ｗ　：　Ｃ。

１１ｃ（７）場合は、Ｚ＝Ａ、　Ｇ、　Ｃ又ハＴ。

−がＡの場合は、Ｚ＝Ａ又はＧ。

ＳがＡ、　Ｇ、　Ｃ又はＴの場合は、ＱＲ＝ＴＣ，又は
その代わりにＳがＴ又はＣの場合は、０Ｒ＝ＡＧ。

Ｊ＝Ａ叉はＧ に＝Ｔ叉はＣ Ｌ＝嶋Ｔ、　Ｃ又はＧ。

門＝Ａ、　Ｃ叉はＴ。

ｈ記は、Ｂ、ｔ、毒素の新規なアミノ酸配列が、このタ
ンパクの同じアミノ酸配列をコードした同等なヌクレオ
チド配列によって調製できることを示す、従って、本発
明はこのような同等なヌクレオチド配列を包含する。更
に、アミノ酸配列の変更がタンパクの二次構造を変更し
ないならば、確認された構造及び機能のタンパクが、こ
のような変更によって構築できることが示された［カイ
ザー令イー・ティー（にａｉｓｅｒ、　Ｅ、Ｔ、）及び
ケズディ・エフ番ジエイ（Ｋｅｚｄｙ、　Ｆ、、１．）
（１９８４年）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２２３巻２４９−２５
５頁］。このように、本発明はタンパクの二次構造を変
更しないような本明細書に記載のアミノ酸配列の変異体
、又は構造が変更される場合、生物活性がある程度保持
されるような変異体を包含する。

２３４１０ＧＴＴＣＣＴＴＡＴ　ＧＧＣＣＧＣＴＴＴＣ
ＡＧＣＣＣＡＡＡＧＴ　ＣＣＡＡＴＣＧＧＡＡ　ＡＧＴ
ＧＴＧＧＡＧＡ　ＧＣＣＧＡＡＴＣＣＡ２４０１　ＴＧ
ＣＣＣＣＣＣＡＣＡＣＣＴＴＧＡＡＴＧ３４６１　ＡＣ
ＧＧＡＡＧＧＡＡ　ＣＡＴＴＴＡＴＣＧＴ　ＧＧＡＣＡ
ＧＣＧＴＧ　ＧＭＴＴＡＣＴＣＣＴＴＡＴＧＧＡＧＧＡ
　Ａ舎ｌλ１．新規毒業の推定アミノ＃１２！列　Ｃｙ
ｉ ｅ　ＧＬｕ ３１　Ｔｈｒ　ＧＬｙ　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　ＩＬ
ａ　Ａｓｐ　ＩＬｅ　Ｓａｒ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ
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　ＧＬｙ　　ＩＬ・３７６　Ａｓｎ　Ａｉｎ　ＧＬｎ　
ＧＬｎ　Ｌｅｕ　Ｓ＠ｒ　ＶａＬ　　Ｌａｕ　Ａｓｐ　
ＧＬｙτｈｒ　ＧＬｕ　Ｐｈｅ　ＡＬａ　Ｔｙｒ３９１
　ＧＬｙ　Ｔｈｒ　Ｓａｒ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ｌ＠ｕ　
Ｐｒｏ　Ｓａｒ　ＡＬａ　ＶａＬ　Ｔｙｒ　Ａｒｇ　Ｌ
ｙｓ　Ｓ＠ｒ　ＧＬｙ４０６　Ｔｈｒ　ＶａＬ　Ａａｐ
　Ｓａｒ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　ＧＬｕ　ＩＬｅ　Ｐｒｏ　
Ｐｒｏ　ＧＬｎ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ａｉｎ　ＶａＬ４２
１　　Ｐｒｏ　　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　　ＧＬｎ　ＧＬｙ　
Ｐｈｅ　　Ｓｅｒ　　Ｈｉｓ　　Ａｒｇ　　Ｌｅｕ　　
Ｓｅｒ　　Ｈｉｓ　　ＶａＬ　　Ｓｅｒ　Ｍｅｔ４３６
　Ｐｈｅ　Ａｒｇ　Ｓａｒ　ＧＬｙ　Ｓａｒ　Ｓ＠ｒ　
Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　ＶａＬ　Ｓａｒ　ＩＬａＩＬｅ　Ａｒ
ｇ　ＡＬａ　Ｐｒ。

４５１　Ｍｅｔ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ｔｒｐ　ＩＬｅ　Ｈ
ｉｓ＾ｒｇ　Ｓｅｒ　ＡＬａＧＬＬＩ　Ｐｈ＠＾ｓｎ　
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【図面の簡単な説明】

７＄１図は、Ｂ、ｔ、ＰＳ８１ＧＧとＢ．ｔ、１ｌＤ−
１カらのプラスミド製剤のアカロースゲル電気泳動の写
真を示す。 ａ、未切断Ｂ、ｔ、ＰＳ８１ＧＧ １］、　Ｈｉｎｄｍテ切断されたＢ、ｔ、ＰＳ８１ＧＧ
Ｃ９未切断Ｂ、ｔ、ＨＤ−１ ［１，８ｉｎｄｍテ切断されたＢ、ｔ、Ｈ［ｌ−１出願
人　マイコゲン　コーポレーション代理人　弁理士　佐
々井　弥太部（外１名）ご５２３１１脚、〜 茗　１１ 手 続 補 正 事件の表示　　　　　　　　　平成Ｏ１年特許願第２８
４６８１号ギエンシス分離体と、鱗翅類活性毒素をコー
ドした遺伝子補正をする者 事件との関係　　　　　　特許出願人 性　　所　　　アメリカ合衆国　９２１２＋　　カリフ
ォルニア州ゴ　オベルリン　ドライブ　５４５１ 氏名（名称）　マイコゲン　コーポレーションディエ ４代理人 補正により増加する発明の数　　　　　増加せず補正の
対象　　　　　　　　　　　　　　９図面補正の内容　
　　　別紙の通り

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ＮＲＲＬＢ−１８４２５の確認特性をもったＢ．ス
   リンギエンシスＰＳ８１ＧＧ、又はその変異種の昆虫防
   除有効量に鱗翅類害虫を接触させることからなる、鱗翅
   類害虫の防除法。 ２、該害虫が鱗翅目に属している、特許請求の範囲第１
   項による方法。 ３、該害虫がビートアワヨトウ（ｂｅｅｔ　ａｒｍｙｗ
   ｏｒｍ）である、特許請求の範囲第２項による方法。 ４、害虫が食べることがわかっている植物を播種する時
   に、Ｂ．スリンギエンシスＰＳ８１ＧＧを粒状餌に混入
   して、土上に置くか又は土中に入れることにより、Ｂ．
   スリンギエンシスＰＳ８１ＧＧの害虫防除有効量に該害
   虫を接触させる、特許請求の範囲第１項による方法。 ５、（１）Ｂ、スリンギエンシスＰＳ８１ＧＧ又はその
   変異種、胞子又は結晶を含む粒状餌をつくり；かつ （２）粒状餌を土上に置くか又は土中に入れる；ことを
   含めてなる、土壌に生息する鱗翅目害虫の防除法。 ６、該粒状餌がトウモロコシ種子を土中に蒔くのと同時
   期に施用される、特許請求の範囲第５項による方法。 ７、実質的に無傷のＢ．ｔ．ＰＳ８１ＧＧ細胞又はその
   変異種が、目標害虫環境に施用される時に、殺虫活性を
   長くするために処理される、特許請求の範囲第１項又は
   第５項による方法。 ８、殺虫剤担体と組み合わせたＢ．スリンギエンシスＰ
   Ｓ８１ＧＧ、又はその変異種、胞子又は結晶を含めてな
   る物質の組成物。 ９、該担体が食欲刺激剤又は誘引剤を含む、特許請求の
   範囲第８項による物質の組成物。 １０、種子被覆剤として使用される処方剤成分と組み合
   わせたＢ．スリンギエンシスＰＳ８１ＧＧ又はその変異
   種を含む、物質の組成物。 １１、鱗翅目害虫に対して活性のあるＮＲＲＬＢ−１８
   ４２５の確認特性をもったＢ．スリンギエンシスＰＳ８
   １ＧＧ又はその変異種。 １２、ＮＲＲＬＢ−１８４２５の確認特性をもったＢ．
   スリンギエンシスＰＳ８１ＧＧ又はその変異種の昆虫防
   除有効量に鱗翅目害虫を接触させることを含めてなる、
   鱗翅目の害虫の防除法。 １３、第２表に示すアミノ酸配列のＢ．ｔ．毒素をコー
   ドしたＤＮＡ。 １４、第１表に示すヌクレオチド配列をもった、特許請
   求の範囲第１３項によるＤＮＡ。 １５、第２表に示すアミノ酸配列をもち、かつ鱗翅目昆
   虫に対して活性のある毒素、及びタンパクの二次構造を
   変更しないか、又は構造が変更されるとしても、生物活
   性がある程度保持されるようなその変異種。 １６、第２表に示すアミノ酸配列をコードしたヌクレオ
   チド配列の全部又は一部をもったＤＮＡを含めてなる組
   換えＤＮＡ運搬ベクター。 １７、原核生物又は真核生物ホストへ運搬され、その中
   で複製される、特許請求の範囲第１６項によるＤＮＡ運
   搬ベクター。 １８、第２表に示すアミノ酸配列をもったＢ．ｔ．毒素
   を発現させるために形質転換される細菌ホスト。 １９、第２表に示すアミノ酸配列をもったＢ．ｔ．毒素
   がコードされているＢ．ｔ．毒素遺伝子を含有するプラ
   スミドベクターで形質転換させた、特許請求の範囲第１
   ８項による大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）。 ２０、特許請求の範囲第１８項によるホストであり、Ｎ
   ＲＲＬＢ−１８４２８の確認特性をもった大腸菌（ｐＭ
   ＹＣ３８８）。 ２１、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ア
   ゾトバクター（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）、エルウィニ
   ア（Ｅｒｗｉｎｉａ）、セラティア（Ｓｅｒｒａｔｉａ
   ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌ−ｌａ）、リゾビ
   ウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、ロードシュードモナス（
   Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、メチロフィリウ
   ス（Ｍｅ−ｔｈｙｌｏｐｈｉｌｉｕｓ）、アグロバクテ
   リウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅ−ｒｉｕｍ）、アセトバク
   ター（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）又はアルカリゲネス（
   Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）の種である、特許請求の範囲
   第１８項による微生物。 ２２、微生物が有色素で葉面接着性である、特許請求の
   範囲第２１項による微生物。 ２３、特許請求の範囲第２１項による微生物を鱗翅類昆
   虫に、又は該昆虫の環境に投与することを含めてなる、
   鱗翅目昆虫類の防除法。 ２４、投与が根の周辺に対してである、特許請求の範囲
   第２３項による方法。 ２５、投与が葉面に対してである、特許請求の範囲第２
   ４項による方法。 ２６、投与が水に対してである、特許請求の範囲第２３
   項による方法。 ２７、目標害虫環境に施用されると持続的な殺虫活性を
   もった実質的に無傷の処理細胞を含有する殺虫剤を含め
   てなる殺虫剤組成物であって、該殺虫剤が鱗翅類昆虫に
   有毒なポリペプチドで、細胞内にあり、第２表に示すア
   ミノ酸配列をもったＢ．ｔ．毒素を発現できる形質転換
   された微生物の発現の結果としてつくられる場合の殺虫
   剤組成物。 ２８、環境中で殺虫活性を長くするために処理細胞が化
   学的又は物理的手段によって処理される、特許請求の範
   囲第２７項による殺虫剤組成物。 ２９、細胞が原核生物又は低級真核生物である、特許請
   求の範囲第２８項による殺虫剤組成物。 ３０、原核生物細胞が腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃ
   −ｔｅｒｉａｃｅａｅ）、バシラス科（Ｂａｃｉｌｌａ
   ｃｅａｅ）、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ
   ）、らせん科（Ｓｐｉｒｉｌｌａｃｅａｅ）、乳酸杆菌
   科（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）、シュードモ
   ナス科（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ）、アゾト
   バクター科（Ａｚｏ−ｔｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ）及
   びニトロバクター科（Ｎｉｔｒｏｂａｃ−ｔｅｒａｃｅ
   ａｅ）からなる群から選ばれる、特許請求の範囲第２９
   項による殺虫剤組成物。 ３１、低級真核生物細胞が藻菌類（Ｐｈｙｃｏｍｙｃｅ
   −ｔｅｓ）、子のう菌類（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ）、
   及び担子菌類（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ）からな
   る群から選ばれる、特許請求の範囲第２９項による殺虫
   剤組成物。 ３２、細胞が有色素細菌、酵母又はカビ（菌類ｆｕｎｇ
   ｉ）である、特許請求の範囲第２７項による殺虫剤組成
   物。 ３３、第２表に示すアミノ酸配列のポリペプチド毒素を
   コードした、鱗翅類昆虫に有毒なバシラス・スリンギエ
   ンシス毒素遺伝子の発現結果である細胞内毒素を含有す
   る処理された実質的に無傷の単細胞微生物であって、細
   胞を目標昆虫環境に施用する時に殺虫活性を長くするよ
   うな条件下に該細胞が処理される場合の微生物。 ３４、環境中で殺虫活性を長くするために細胞が化学的
   又は物理的手段によって処理される、特許請求の範囲第
   ３３項による細胞。 ３５、該微生物がシュードモナスであり、該毒素が第２
   表に示すアミノ酸配列をもったＢ．ｔ．毒素である、特
   許請求の範囲３３項による細胞。 ３６、該細胞がヨウ素で処理される、特許請求の範囲第
   ３５項によるシュードモナス細胞。 ３７、シュードモナス・フルオレッセンスである、特許
   請求の範囲第３３項による細胞。 ３８、ｐＭＹＣ３８８と指定されるプラスミド。