JPH02273191A - Ｌ―バリンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明はＬ−バリンの製造法に関し、さらに詳しくは、
微生物菌体内の酵素系を利用する方法により副生物の生
成を抑制して高収量でＬ−バリンを製造する方法に関す
る。

Ｌ−バリンは、必須アミノ酸の一つとして人間及び動物
の栄養上重要な役割をするもので、医薬、食品・、飼料
添加剤等の需要が近年急激に増加している。

［従来の技術と課題］ Ｌ−バリンは、他のアミノ酸の場合と同様に立体異性体
が存在するので、化学的合成法ではＬ−体のみの製造は
困難であり、工業的には主として醗酵法によって生産さ
れている。

しかしながら、公知の醗酵法によるし一バリンの製造で
は、Ｌ−バリンの蓄積に限界があり、新たな観点でＬ−
バリンを著量生成させる方法の提供が求められている。

本発明者らは先に、グルコースを含有する水溶液中で、
コリネ型細菌に属するビオチン要求性の微生物を酵素源
として用いて酵素反応させて、該水溶液中にＬ−バリン
を収率良く製造する方法（特開昭６３−２６７２８５号
公報参照）を提案している。

［発明の構成及び効果］ 本発明者らは、さらに効率良くＬ−バリンを製造させる
目的で、反応液組成等について鋭意検討した結果、コリ
ネ型細菌に属するビチオン要求性の微生物菌体又はその
処理物の存在下に、グルコ−スを水溶液中にて酵素反応
せしめてＬ−バリンを製造するに当り、該水溶液中のグ
ルコース濃度を０．０１〜０．６重量％の範囲内に維持
して酵素反応を行うことにより、副生ずるアラニンを大
幅に低減でき、その結果高収率でＬ−バリンが製造可能
なことを見い出し本発明を完成するに到った。

従って本発明の方法によれば、Ｌ−バリンを工業的に効
率良く製造することができる。

［発明の詳細な説明］ かくして本発明によれば、コリネ型細菌に属するビオチ
ン要求性微生物の菌体又はその処理物の存在下に、グル
コースを水溶液中にて酵素反応せしめてＬ−バリンを製
造するに当り、該反応液中のグルコース濃度を０．０１
〜０．６重量％の範囲内に維持することを特徴とするし
一バリンの製造方法が提供される。

以下、本発明の方法につきさらに詳細に説明する。

本発明の方法において使用される微生物は、コリネ型細
菌に属するビオチン要求性微生物であり、例えば、コリ
ネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ　ｉｕｍ）
属細菌、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ）属細菌、アルスロバクタ−（＾ｒｔｈｒｏｂａ
ｃｔｓｒ）属細菌等が含まれる。これらの微生物のうち
で特にエタノール資化性を有しているものが好ましく、
その中にはＬ−イソロイシン生産菌も含まれる。そのよ
うな微生物の具体例としては、 ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅ
ｒｉ−ｕｍ　ｆｌａｖｕｍ）Ｍ　Ｊ　２３３　［微工研
条寄第１４９７号（微工研菌寄第３０６８号より移管）
］、ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖ　１ｂａ
ｃｔｅｒ　ｉ−ｕｍ　ｆｌａｖｕｍ）ＭＪ　２３３−Ａ
Ｂ　−４１［微工研条寄第１４９８号（微工研菌寄第３
８１２号より移管）］、 ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅ
ｒｉ−ｕｍ　ｆｌａｖｃ＋ｍ）ＭＪ　２３３−ＡＢＴ　
−１１［微工研条寄第１５００号（微工研菌寄第８４２
３号より移管）］、 ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔａ
ｒｉ−ｕｍ　ｆｌａｖｕｍ）ＭＪ　２３３−ＡＢＤ−２
１［微工研条富第１４９９号（微工研菌寄第８０５５号
より移管）］等 が挙げられ、これらの菌が本発明において好適に用いら
れる。

な右、上記の微工研条寄第１４９８号の菌株は、微工研
条寄第１４９７号の菌株を親株としてＤＬ−α−アミノ
酪酸耐性を積極的に付与されたエタノール資化性微生物
である（特公昭５９−２８３９８号公報第３〜４欄参照
）。また、微工研条寄第１５００号の菌株は、微工研条
寄第１４９７号の菌株を親株としたＬ−α−アミノ酪酸
トランスアミナーゼ高活性変異株である（特開昭６２−
５１９９８号公報参照）。さらに、微工研条寄第１４９
９号の菌株は微工研条寄第１４９７号の菌株を親株とし
たＤ−α−アミノ酪酸デアミナーゼ高活性変異株である
（特開昭６１−１７７９９３号公報参照）。

これらの微生物の他に、ブレビバクテリウム・アンモニ
アゲネス（８ｒａｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｍｍｏｎ
ｉａｇｅｎｅｓ）ＡＴＣＣ６８７１、同ＡＴＣＣ１３？
　４５、同ＡＴＣＣ１３７４Ｂ、プレビバクテリム・デ
バリカタム（８ｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｄｉｖａ
ｒｉｃａｔｕａ＋）　Ａ　Ｔ　ＣＣ１４０２０等を用い
ることもできる。

以上に述べた本発明の方法に使用されるコリネ型細菌に
属するビオチン要求性の微生物菌体の調製に使用しつる
培地は、特に限定されるものではなく一般の微生物に使
用されるものでよい。

上記の微生物菌体の調製に使用する培地の窒素源として
は、例えば、アンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アン
モニウム、硝酸アンモニウム、尿素等を単独若しくは混
合して用いることができ、無機塩としては、例えば、リ
ン酸−水素カリウム、リン酸二水素カリウム、硫酸マグ
ネシウム等を用いることができる。この他に菌の生育等
に必要であれば、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コ
ーンステイープリカー、カザキノ酸、各種ビタミン等の
栄養素を培地に添加し用いることもできる。

培養は通気攪拌、振盪等の好気的条件下で行い、培養温
度は２０〜４０℃、好ましくは２５〜３５℃で行う。培
養途中のｐＨは５〜１０、好ましくは７〜８付近にて行
い、培養中のｐ）Ｉの調整には酸、アルカリを添加して
行う。

培養開始時のグルコース濃度は好ましくは１〜５重量％
、さらに好ましくは２〜３重景％が適する。培養期間は
（１，５〜３日間、最適期間は１〜２日間である。

本発明の方法を実施する場合、上記の如く培養すること
により得られる培養物から菌体を集め、水や適当な緩衝
液で洗浄した後そのまま使用することができる。あるい
は該菌体をそれ自体既知の方法で固定化し固定化物とし
て使用することもでる。微生物菌体又はその破砕物の固
定化法としては、例えば、アクリルアミド等の重合性モ
ノマーを用いる方法、アルギン酸塩やカラギーナン等の
適当な担体を用いて不溶化させる方法等が挙げられる。

本発明の方法においては、上記の如き微生物菌体又はそ
の処理物の存在下に、グルコースが水溶液中で酵素反応
せしめられＬ−バリンが製造される。

上記の酵素反応水溶液中におけるグルコース濃度は、通
常０．０１〜０．６重量％の範囲内に維持すればよいが
、好ましくは０．０５〜０．５重量％、特に好ましくは
０．１〜０．４重量％の範囲内とすることができる。酵
素反応水溶液中へのグルコースの添加は、グルコース濃
度が上記の範囲を越えない限り、連続的に行ってもよく
、あるいは間欠的に行ってもよい。

該酵素反応水溶液は、通常完全合成培地が好適に用いら
れるが、ここで完全合成培地とは、化学構造が既知の無
機窒素源及び無機塩を含有する水溶液である。

本発明に使用しろる完全合成培地の無機窒素源としては
、例えば、アンモニア、塩化アンモニラＡ、硫酸アンモ
ニウム、硝酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等が挙
げられ、また無機塩としては、例えば、リン酸−水素カ
リウム、リン酸二水素カリウム、硫酸マグネシウム、硫
酸マンガン、硫酸鉄等を挙げることができる。これらの
無機窒素源、無機塩は、単独でも２種以上混合して用い
ることもできる。

完全合成培地の一例を示すと、（ＮＨ，）２８０．２３
ｇ／Ｉｔ％Ｋ）１．ＰＯ，０，５ｇ　／　ｉ、ＫＪＰＯ
−０，５ｇ　／１、ＭｇＳロー　　・　７８２０　　０
．５　　ｇ／　ｌ、　Ｆｅ５０．　　”７８２０２０　
ｐｐｍ　、　Ｍｎ５Ｌ　　・４〜６）１２０２０　ｐｐ
ｍを含有するｐＨ１，６の水溶液が挙げられる。

上記の様に、本発明に使用される完全合成培地には、ビ
オチン又はビオチンを含む天然物は含有されないが、ビ
オチンを含有しないアミノ酸、ビタミン、糖類等を添加
することはできる。

本発明の方法において使用される、上記の如く調製され
た微生物菌体の使用量は、特に制限されるものではない
が、一般に１〜５０％（重塁／容量）の濃度で使用する
ことができる。

本発明において、酵素反応は、約２０〜約５０℃、好ま
しくは約３０〜約４０℃の温度で、通常約１０〜約７２
時間行われる。

上記酵素反応は、反応に用いられるグルコースを含有す
る水溶液中の溶存酸素濃度が０．０５９１１ｍ以上、８
　ｐｐｍ以下となる様に、反応系中に空気もしくは酸素
を、連続又は間欠的に供給して行うのが好ましい。

上記の如き反応方法によって得られる酵素反応液中に生
成した［、−バリンの分離・精製は、それ自体既知の方
法に従い、例えばイオン交換樹脂処理法、沈澱法等を適
宜組合せて行うことができる。

次に、実施例を挙げて本発明の方法をさらに具体的に説
明する。下記の実施例において、Ｌ−バリンの定性は、
ペーパークロマトグラフのＲｆ値、電気泳動法の易動度
、微生物定量法による生物活性値により確認した。定量
はロイコノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎ
ｏｓｔｏｃ　ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）ＡＴＣＣ８
０４２を用いるマイクロバイオアッセイ法と高速液体ク
ロマトグラフィー（高滓ＬＣ５Ａ）とを併用して行った
。また、アラニンの定量は上記高速液体クロマトグラフ
ィーにより行った。グルコース残存量の定量は、グルコ
ース定量用キット（和光純薬工業製ニゲルコースＣテス
トワコー）により行った。なお、下記の実験例において
％と表したのは重量％を意味する。

実施例１ 培地（尿素０．４％、硫酸アンモニウム１．４％、にＨ
，ＰＯ，０゜０５　％、　Ｋ、ｌ（ＰＯ，０，０５％、
　ＭｇＳ口。

？Ｈ２００，０５％、　　ＣａＣＪ！ｚ　　−２１（ａ
ｎ　　　２ｐｐｍ。

ＦｅＳＯ４・７）ＩＪ　　２ｐｐｍ　、　Ｍｎ５Ｏｎ　
　・４〜６１１Ｊ　２ＰＰｍ　。

ＺｎＳ口、−７Ｈ，０２Ｈ’ｌ！ｌ−、ＮａＣｊ！　　
２ｐｐｍ　、ビオチン　２００μｇ／ｌ、チアミン・１
（Ｃｊ！１００μｇ／ｌ、カザミノ酸　０．１％、酵母
エキス０．１％）１００ｍｊ！を５００ｄ容三角フラス
コに分注、滅菌（滅菌後ｐＨ７，０）した後ブレビバク
テリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　
ｆｌａｖｕｍ）　Ｍ　Ｊ　−２３３（微工研条寄第１４
９７号）を植菌し、無菌的にグルコースを５ｇ／ｌの濃
度になるように加え、３０℃にて２日間振盪培養を行っ
た。

次に、本培養培地（グルコース５％、硫酸アンモニウム
２．３％、ＫＨａＰＯｉ　　０．０５％、Ｋ２）ＩＰ口
、０．０５％、　ＭｇＳ口、　　−？Ｈ１００，０５％
、　ＦｅＳ口、　　−７Ｌ０　　２０ｐｐｍ　、　Ｍｎ
５Ｏ，・４〜６Ｈ＊ロ　２０ｐｐｍ　ｓビオチン２００
μｇ／ｌ、チアミン・ＨＣＪ１００μｇ／ｊ！、カザミ
ノ酸　０．３％、酵母エキス０．３％）の１０００７！
を２１容通気攪拌槽に仕込み、滅菌（１２０℃、２０分
間）後、前記前培養物の２０−を添加して、回転後１０
００　ｒｐｍ　、通気量１ｖｖｍ、温度３３℃、ｐ）１
７．６にて２４時間培養を行った。

培養終了後、培養物１００−ずつを遠心分離して集菌後
、脱塩蒸留水にて２度洗浄した菌体を反応液（（ＮＨ，
）＊ＳＯ，２０ｇ／ｌ、にｌ（、ＰＯ，０，５ｇ　／２
１　Ｋ１ｌＨＰＯ４０，５ｇ／ｌ　、　ＭｇＳ口、　　
・　７Ｈ２００，５ｇ／ｌ、Ｆｅ３口４−７ＬＤ　　２
０ｐｐｍ　、チアミン−ＨＣｌ１００μｇ　／１２．　
　（ｐＨ８，０）　）　５０−に懸濁し、ｐＨ調整のた
め、乾熱滅菌（１５０℃、５時間加熱）した炭酸カルシ
ウムを５０ｇ／ｌの濃度で添加して酵素反応液とした。

反応は５００−三角フラスコを用い、温度３３℃、回転
数２２　Ｏｒｐｍにて４０時間振盪により行った。すべ
ての実験区においてグルコースは、第１表に示した濃度
となるように１〜２時間の間隔で逐次添加し、全添加量
を２０ｇ／ｆとした。

反応終了後、遠心分離（４０００ｒｐｍＳ１５分間、４
℃）にて除菌した上清液中のし一バリン量及びアラニン
量を定量した。なお、対照区としては反応開始時にグル
コース２０ｇ／ｌ添加した反応液を用いた。

結果は第１表に示した。

第　　　１　　　表 し、また実施例１と同様の条件にて反応させた後上清液
中のＬ−バリン量及びアラニン量を定量した。

結果は第２表に示した。

第　　　２　　　表 ＊対照区（反応開始時にグルコース２０ｇ／　１添加）
での測定値を１００とする相対値。

実施例２ 実施例１と同様の条件にてブレビバクテリウム・フラバ
ム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｒｎ　ｆｌａｖｕｍ）
　Ｍ　Ｊ　−２３３−ＡＢ−４１（微工研条寄第１４９
８号）を培養＊対照区（反応開始時にグルコース２０ｇ
／ｊ！添加）での測定値を１００とする相対値。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）コリネ型細菌に属するビオチン要求性の微生物菌
   体又はその処理物の存在下に、グルコースを水溶液中に
   て酵素反応せしめてＬ−バリンを製造するに当り、該反
   応液中のグルコース濃度を０．０１〜０．６重量％の範
   囲内に維持することを特徴とするＬ−バリンの製造法。