JPH0272888A

JPH0272888A - Ｌ−バリンの製造法

Info

Publication number: JPH0272888A
Application number: JP22141188A
Authority: JP
Inventors: Masato Terasawa; 真人寺沢; Shoichi Nara; 昭一奈良; Masayuki Inui; 将行乾; Hideaki Yugawa; 英明湯川
Original assignee: Mitsubishi Petrochemical Co Ltd
Current assignee: Mitsubishi Chemical Corp
Priority date: 1988-09-06
Filing date: 1988-09-06
Publication date: 1990-03-13

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は、酵素反応によるし一バリンの製造法に関する
ものである。

本発明によれば、高収量で効率よくし一ノ＜リンを製造
することができる。

Ｌ−バリンは、必須アミノ酸の一つとして人間及び動物
の栄養上重要な役割をするもので、医薬、食品、飼料添
加剤等の需要が近年急激に増加している。

（従来の技術と課題）Ｌ−バリンの工業的製造法としては、他のアミノ酸の場
合と同様に立体異性体が存在するので、化学的合成法で
はＬ一体のみの製造は困難となり、主として醗酵法によ
っている。

しかしながら、公知の醗酵法によるし一バリンの製造で
は、Ｌ−バリンの蓄積に限界があり、新たな観点でＬ−
バリンを著量生成させる方法の提供が求められている。

本発明者らは先に、グルコースを含有する水溶液中で、
ビオチン要求性のコリネ型細菌に属する微生物を酵素源
として用いて酵素反応させ、該水溶液中にＬ−バリンを
収率良く製造する方法（特願昭６２−１０１６７７号）
を提案している。

（発明の構成及び効果）本発明者らは、さらに効率良くＬ−バリンを製造させる
目的で、反応液組成等について鋭意検討した結果、ビオ
チン要求性のコリネ型！Ｉｌ菌に屈する微生物菌体を、
グルコースと窒素源を含有する水溶液にて酵素反応させ
て該溶液中にＩ、−バリンを生成せしめるに際し、該溶
液中のグルコース重量と窒素源の窒素重量の比（以下Ｃ
／Ｎ比という）を５〜４０の範囲で酵素反応を行うこと
により高収率でＬ−バリンを製造出来ることを見出し、
本発明に到達した。

本発明によれば、グルコースと窒素源を含有する水溶液
中で、ビオチン要求性のコリネ型細菌に属する微生物を
酵素源として用いて、酵素反応させるに際し、該水溶液
中のＣ／Ｎ比を５〜４０の範囲で反応を実施することに
より、グルコースの消費量を大幅に低減化出来、その結
果Ｌ−バリンの対グルコース収率を大幅に向上させるこ
とが可能となった。従って本発明の方法によれば、Ｌバ
リンを工業的に効率よく製造できる。

（発明の詳細な説明）本発明の方法は、微生物菌体の増殖を全く伴わない条件
下に、し−バリンを製造する酵素反応のみによるし一バ
リンの製造法を提供するものである。

本発明に使用される微生物は、ビオチン要求性のコリネ
型細菌に属するものであり、好ましくはエタノール資化
性のものである。このなかにはＬ−イソロイシン生産菌
が含まれる。本発明に使用される微生物菌体としては例
えば、ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ　　ｆｌａｖｕｍ）　ＭＪ−２３３（微
工研条寄　第１４９７号）、ブレビバクテリウム・フラ
バム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　　ｆｌａｖｕ＋
ｗ）　ＭＪ−２３３−ＡＢ−４１（ｌａｋ工研条寄第１
４９８号）、ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖ
ｉｂａｃＬｅｒｉｕｍ　　ｆｌａｖｕ＋＊）　Ｍ　Ｊ　
−２３３−Ａ　ＢＴ−１１（微工研条寄　第１５００号
）及びブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ　　ｆｌａｖｕ＋ｗ）　ＭＪ−２３３−
ＡＢＤ−２１（ｔ３に工研条寄第１４９９号）等であり
、これらの閃が本発明に好適に用いられる。

なお、上記の（微工研条寄　第１４９８号）は（微工研
条寄　第１４９７号）を親株としてＤＬ−α−アミノ酪
酸耐性を積極的に付与されたエタノール資化性微生物で
ある（特公昭５９−２８３９８号公報３〜４欄参照）。

（微工研条寄　第１５００号）は、（＠工研条寄　第１
４９７号）を親株としたし一α−アミノ酪酸トランスア
ミナーゼ高活性変異株である（特開昭６２−５１９９８
号公報参照）、また、（微工研条寄　第１４９９号）は
（微工研条寄　第１４９７号）を親株としたＤ−α−ア
ミノ酪酸デアミナーゼ高活性変異株である（特開昭６１
−１７７９９３号公報参照）。

これらの微生物菌体の他にブレビバクテリウム・アンモ
ニアゲネス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｍｍｏ
ｎｉａｇｅｎｅｓ）ＡＴＣＣ６８７１，同ＡＴＣＣ１３
７４５、同ＡＴＣＣ１３７４６、ブレビバクテリウム・
デバリカタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕ曽ｄｉｖａ
ｒｉｃａｔｕｍ）ＡＴＣＣ１４０２０等を用いることも
出来る本発明に用いられるビオチン要求性のコリネ型細
菌に属する微生物菌体は、微生物菌体そのままで用いる
こともできるし、又これらを公知の手法で固定化された
固定化物を使用することもできる。この固定化手法とし
ては、菌体をアクリルアミド等の重合性モノマーを用い
たり、アルギン酸塩あるいはカラギーナン等の適当な担
体に不溶化させる等がある。

本発明の方法に使用される上記のビオチン要求性のコリ
ネ型細菌に属する微生物菌体の調製に使用する培地は、
特に限定されるものではなく一般の微生物に使用される
ものでよい。

本発明に使用する微生物菌体の調製に使用する培地の窒
素源としてはアンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アン
モニウム、硝酸アンモニウム、尿素等を単独若しくは混
合して用いることが出来る無機塩としては、リン酸−水
素カリウム、リン酸二水素カリウム、硫酸マグネシウム
等が用いられる。この他に菌の生育等に必要であれば、
ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンステイープリ
カー、カザミノ酸、各種ビタミン等の栄養素を培地に添
加し用いる。　培養は通気攪拌、振盪等の好気的条件下
で行い、培養温度は２０〜４０℃、好ましくは２５〜３
５℃で行う。培養途中のｐＨは５〜ｌＯ１好ましくは７
〜８付近にて行い、培養中のｐ　Ｈの調整には酸、アル
カリを添加して行う。

培養開始時のグルコース濃度は好ましくは１〜５市Ｔ％
、更に好ましくは２〜３重量％が適する、培養期間は０
．５〜３日間、最適期間は１〜２日間である。

このようにして得られた培養物から菌体を集めて、水又
は適当な緩ｉｈ液で洗浄し、本発明の方法の酵素反応に
使用する。

本発明の方法においては、上記で調整された微生物菌体
（ここには、その固定化物も含まれる）の存在下、少な
くともグルコースと窒素源を含有する水溶液にて酵素反
応させるに際し、Ｃ／Ｎ比を２〜４５、好ましくは５〜
４０に設定し酵素反応を行う０通常用いられるグルコー
ス濃度は、０５〜２０重量％、好ましくは１−１０重量
％である。反応に用いる窒素源の窒素濃度は通常０゜０
１〜４市量％、好ましくは０．０２〜２重量％である。

該水溶液は、通常完全合成培地が好適に用いられるが−
１ここで完全合成培地とは、化学構造が公知の無機窒素
源及び無機塩を含有する水溶液である。本発明に用いら
れる完全合成培地の無機窒素源としては、アンモニア、
塩化アンモニウム、ｌｉｔ酸アンモニウム、硝酸アンモ
ニウム、リン酸アンモニウム等が例示でき、また無機塩
としては、リン酸−水素カリウム、リン酸二水素カリウ
ム、硫酸マグネシウム、硫酸マンガン、硫酸鉄等が例示
される。これらの無機窒素源、無機塩は、単独でも２種
以上混合して用いることもできる。

完全合成培地の一例を示すと、（ＮＨ４）　２　Ｓ０４
　２３　ｇ／ｊ！　；ＫＨ２Ｐ　０４　０．　５　ｇ／
β；Ｋ　２　ＨＰ　Ｏ４０、５ｇ　／　１　；　Ｍ　ｇ
　Ｓ　Ｏ４・７Ｈ２００，５ｇ／１２　；　ＦｅＳＯ４
Ｈ７Ｈ２０２０ｐｐｍ；ＭｎＳＯ４・４〜６Ｈ２０２０
ｐｐｍ含有するｐＨ７，６の水溶液がある。

上述の様に、本発明に使用される完全合成培地には、ビ
オチン又はビオチンを含む天然物は含有されないやビオ
チンの含有されないことの明らかな化学構造のアミノ酸
、ビタミン、ｍ類等を添加して使用することはできる。

本発明の方法において使用される、上記の様に調製され
た微生物菌体の使用量は、特に制限されるものではない
が、一般に１〜５０％（ｗ　Ｌ　／　ｖｏｌ）の濃度で
使用することができる。

本発明において、酵素反応は、約２０〜約５０℃、好ま
しくは約３０〜約４０℃の温度で、通常約１０〜約７２
時間行われる。

−Ｆ記酵素反応は、反応に用いられるグルコース及び窒
素源を含有する水溶液中の溶存酸素濃度がｏ、Ｏ５ｐｐ
ｍ以上、ｓｐｐｍ以上となる様に、反応系中に空気もし
くはｒ！！素を、連続又は間歇的に供給して行うのが好
ましい。

上記のような反応方法によって得られる反応液中に生成
したし一バリンの分離・精製は、醗酵法によるアミノ酸
の分離・精製と同様に行え、例えば公知のイオン交換樹
脂処理法あるいは、沈澱法等により行うことができる。

′ＸＪＬ区以下の実験例において、Ｌ−バリンの定性は、ペーパー
クロマトグラフのＲｆ値、電気泳動法の易動度、微生物
定量法による生物活性値により確認した。定量はロイコ
ノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏ
ｃ　ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）　Ａ　Ｔ　ＣＣ８０
４２を用いるマイクロバイオアッセイ法と高速液体クロ
マトグラフィー（高滓ＬＣ−５Ａ）とを併用して行った
。グルコース残存量の定量は、グルコース定量用キット
（和光純薬工業製ニゲルコースＣテスト　ワコー）によ
り行った。また、下記の実験例において％と表したのは
重量％を怠味する。

実施例−１培地（尿素０．４％、硫酸アンモニウム１．　４％、Ｋ
Ｈｚ　ＰＯ４０，０５％、Ｋ２　ＨＰ　０４０　。

０５％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２００，０５％、ＣａＣ１ｚ
　　・２Ｈｚ　０　２ｐｐｍ、Ｆｅ５０゜７Ｈ２０２ｐ
ｐｍ、ＭｎＳＯ４−４〜６Ｈ２０２ｐｐｍ＋　ＺｎＳＯ
４・　７Ｈ２０２ｐｐｍ。

ＮａＣｅ　　２ｐＩ）ｍ、ビオチン　２００μｇ／ｌ、
チアミン・Ｈ（１！１００μ（Ｈ７ｇ、カザミノ酸　０
．１％、酵母エキス０．１％）１００ｍｊ＋を５００ｍ
ｆ容三角フラスコに分注、滅菌（滅菌１＆ｐＨ７，０）
した後ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａ
ｃＬｅｒｉｕ＋ｍ　　ｆｌａｖｕｍ）　Ｍ　Ｊ　−２３
３（微工研条寄　第１４９７号）を植菌し、無菌的にグ
ルコースを５ｇ／／の濃度になるように加え３０℃にて
２日間振盪培養を行った。

次に、本培養培地（グルコース５％、硫酸アンモニウム
２．３％、ＫＨ２ＰＯ４０，０５％、Ｋ、Ｈｌ）０．０
．０５％、Ｍｇ５Ｏ，・７Ｈ２００，０５％、Ｆｅ５０
．　　・７Ｈ２０２０ｐｐｍ、Ｍｎ５Ｏ４・４−６Ｈ２
０２０ｐｐｍ、ビオチン　２００μｇ／ｌ、チアミン・
ＨＣＩ　　１１００ｔｔ／Ｒ、カザミノ酸　０．３％、
酵母エキス　０．３％）のＩＯｏｏｍｌを２１容通気攪
拌槽に仕込み、滅菌（１２０℃、２０分間）後、前記前
培養物の’ｌ　Ｑ　ｍ　ｌを添加して、回転数１１００
Ｑｒｐ、通気ｑ　ｌ　ｖ　Ｖ　ｍ　、　？ｍ度３３℃、
ｐ　Ｈｌ、６にて２４時間培養を行った。

培養終了後、培養物１００ｍ１ｔずつを遠心分離して集
菌後、説塩蒸留水にて２度洗浄した菌体を反応液〔グル
コース１００　ｇ　／　ｌ　、Ｋ　Ｈ２Ｐ　Ｏ４０，５
ｇ／ｌ、Ｋ２　ＨＰＯ４０，５ｇ／Ｉｔ、Ｍｇ５ｏ、−
７８２００，５ｇ／１．、ＦｅＳＯ４７１１２０２０ｐ
ｐｍ、チアミン−塩酸塩　１００μｇｅｌ、（ｐＨ８，
０））５０ｍｆに懸濁後、Ｃ／Ｎ比が第１表に示した実
験区になるよう窒素源を添加した。なお、窒素源として
硫酸アンモニウムを用いた。またｐＨｍ整の為、乾熱滅
菌（１５０℃、５時間加熱）シた炭酸カルシウムを５０
　ｇ／１２の濃度で添加した。反応は５００ｍｌ：角フ
ラスコを用い、３３℃、回転数２２Ｏｒｐｍにて４０時
間振盪反応を行った。

反応終了後、遠心骨１ｉｔｕ　（４０００ｒｐｍ、　１
５分間、４℃）にて除菌した上清液中のし一バリン量及
びグルコース残量を定量した。

結果は第１表に示した。

第　　１　　表結果を第２表に示した。

第　　２　　表し−バリンｄ混δマ更（ｇ／１）Ｌ−バリア４弾ｄ口＊　（ｇ／ｌ）実施例−２実施例−１とＩｉ’ＪＭｋでブレビバクテリウム・フラ
バム（Ｂｒｅｖｉｈａｃｔσ１１１１　　ｆｌａ四−Ｍ
Ｊ−２３３−ＡＢ−４１Ｇｆ）ｔσ研条寄　第１４９８
号）を培養限また実施１！ＩＩ−Ｉ　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　Ｌ−バリンとグルコース残量
を萌した。

実於伸１−３実帽列−１と＊”Ｍ）’ｌｄ’Ｌ４ごてブレビバクテリ
ウム・フラバムΦｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｓ＋　　ｆ
ｌａｖｍ　ＭＪ−２３３−ＡＢＴ−１１＠σ扇条寄第１
５００号）を培養しまた実８ｅｌ−Ｉ　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　Ｌ−バリンとグルコース残
量を定呈した４ｂ何列Ｉ　トｌｉ’？恥で’４４牛にて反応させたＶゴｎ勿ｐ
のＬバリンとグルコース残Ｖを定結果を第３表に示し心量した結果を第４表に示した。

第表第表バリン性邦ｄフ丈（ｇ／／）しバリン１刃あ間室（ｇ／ｌ）Ｊ】何列−４実於仲１−１と目”１４）’ｌｄ！Ｗでブレビバクテリ
ウム・フラバム小ｒｅｖ　ｉ　ｂａｃ　ｔｅｒ　ｉ　ｍ
「１ａｖｕ＋＋＋）　ＭＪ−２３３ＢＤ２１　Ｇσ研条寄　第１４９９号）を培養限また実ｆ切
仄

Claims

【特許請求の範囲】

（１）ビオチン要求性のコリネ型細菌に属する微生物菌
体を、グルコースと窒素源を含有する水溶液にて酵素反
応させて該溶液中にＬ−バリンを生成せしめるに際し、
該反応液中のグルコース重量と窒素源の窒素重量の比（
グルコース量／窒素量）を５〜４０の範囲で酵素反応を
行うことを特徴とするＬ−バリンの製造法。