JPH02273538A - リポソームの保存方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （発明の分野） 本発明はりポンームの保存方法に関し、更に詳しくは、
保存液にゼラチンを添加した保存方法に関する。

（従来の技術） リポソーム（Ｌｉｐｏｓｏｍｅ　）は、脂質コ分子膜か
らなる閉鎖小胞体である。天然の生体膜は、脂質の２分
子構造をとっていると言われており、このリポソームは
生体膜のモデル膜としてその物理化学的性質の研究に広
く用いられている。また、リポソームは内部の水層や膜
内に種々の物質を閉じ込めることが出来、細胞と融合し
た）、細胞に取り込まれたシするので、生体内へ物質を
送夛こむキャリヤーとして利用される。

リポソームを利用した研究は、生物学、医学、薬学など
広範な分野にわたってお夛、酵素や制ガン剤を運ぶキャ
リヤーとしての利用、免疫学分野での利用、細胞との相
互作用、ドラッグデリバリ−システムとしての利用等が
研究されている。

リポソームは上述したように、極めて広範な利用分野を
有するが、その問題点として膜構造の脆弱性が指摘され
ている。

即ち、膜形成物質である脂質の化学的、または物理的変
化によす膜の配向が乱れ、内包物の漏出、リポソーム同
志の会合、凝集が起こり、やがて沈！Ｇを生成してしま
う現象である。

そこでリポソーム膜の強化法として、従来、多抛で被覆
したリポソームの製法（特開昭Ａ／−４り１０／号）や
水素結合によって構造強化されたリン脂質（日本化学会
誌　！ぶり頁、ｌりｒ７年）、また脂質にアスコルビン
酸エステルを混合する方法（％開昭６Ｏ−２Ｊ／乙ｏｒ
号）、保存液の外部浸透圧を高くする方法（％開昭６２
−コタ１ｊｔｒ号）などが提案されてき九が、いずれも
内包物の漏出抑制という観点が主体であり、実用する場
合に最とも重要となる保存液中での凝集抑制には技術的
な進歩が見られていなかった。

最近、グリセロールを用いる凝集抑制法が（特開昭６Ｑ
〜７９３２号）開ボされ死が、この方法１」７、はん雑
でありか一′）脂質類、コし・ステロ−Ａ−等を高温（
４０″〜／ＡＱ’Ｃ）下でグリセロールに分散するもの
であり、内包物として使用できるものは著しるし２く限
定されるなどの問題点も有し７てい７１：。

（発明の目的） 従って本発明の目的は、膜構造が強化され、保存時の＃
！粂が少ない安定なリポソームの保存方法を提供ノ゛る
ことに、ある。

（発明の構成） 本発明の目的はり・Ｈ°ンームの保存液中にゼラチンを
添加することを％徴とするマイクロカプセルの保存力法
によって達成された。

本発明者等は、内包物の漏出、凝集という観点で、リボ
ン−・ムの膜構造を強化する方法を鋭意研究しｔ−結果
、リボン・−ム保存液に、ゼラチンを添加することによ
り漏出、凝集が犬きく抑制できることを見出（−た。

本発明で用いるゼラチンは、等電点が４％　、　ｆ　＋
−９，０の間にあるものなら良く、分子量は／万一・−
コ００万の間に分布していれば良い。用いる内包液のｒ
＞１４に応じて組合せて用いると良い。本発明で用いる
ゼラチンは、新田ゼラチン四社より入手できる。

本発明で用いるゼラチンの添加濃度は好ま（７くは保存
液髪のθ。７％〜１０％てわり、特に好１し２＜ｄ、、
θ４！チー、を俤のＩ％ｊｌである。、θ５／チ以下で
Ｌ本発明の効果は、晃られない。

本発明におけるリポソーム膜形成脂質（（は、特に制限
はなく、リポソームを形成するものであれば、天然壕カ
ニは合成の脂質（リン脂質及び／又は糖脂質）が使用可
能である。

その例として、レシチン、ホスファチジルエタノールア
ミンホスファチジン酸、ホスファチジルセリ／、ホスフ
ァチジルイノシトール、ホスファチジオグリＱ１３・−
ルスフィンゴミエリン、カルシオリピンおよびこれらと
常法に従って水素添カｏしたものが挙げられ、これらを
適当に組合→ごて用いることもできる。

さらＫ　リボノ−・７−膜の構成成分には所望（（よシ
スプ日−１に、コレス／″ｐ−ル等の膜構造強化剤をイ
ー呵用ブることが好ましい、更に電荷付与物質（例えば
ステア１ノン酸、ｔレイン醒、リノール酸、リルン酸）
を添加することへできる。

本発明のリポ゛ノ〜ムは、（れ自体、ｔたそ７″１．に
攬々の物質全包含さびＩで、多方面の分野に利用される
。

例えば、イ１体ｊ摸−５の親和性な、・利用（７で細胞
１分離剤と１４、て使用することができる。

ｔ、ｉｉ　ｉ＋ｉ　　ｖｉｔｒｏｔ、たはｉ　ｎ　　ｖ
　ｉ　ｖ　ｉ）で不安定なもの、体内で徐々に放出され
、あるい１−Ｊ：特定の朦器に速やかに分布ブすること
が用型される薬物のキャリヤーとして利用することもで
きる。このような親水性薬物としては例えばアドリアマ
イシン、ブクチノマイシン、贋イトマイシン、／−β−
アラビノフシシルシトシ／、プレオマイシン、シスプラ
チン等の抗がん剤、インターフェロン等の抗ウィルス剤
、アミノ配塘体（例えば、ゲンタマイシン）％β−ラク
タム系（例エハス＃ペニシリン、セフオチアム、セフメ
ツキシム）等の抗生物質、ＴＴｌ、Ｈ，リュウブロライ
ド、インスリン等のペプチドホルモン剤、リゾチーム、
アスパラギナーゼ、グリセロ−ル等の酵素剤、ムラミＡ
−ジペプチド、ムラミルトリペプチド等の免疫賦活剤、
イムノグロフ゛す／、各種トキシン等の蛋白質が挙げら
れる。

その他薬剤以外のものでも、マーカー、あるいはプラス
ばド、ＤＮＡ、ＲＮＡ等、生体内に投与して有効なもの
で騎〉れば特（／（′：制限されることはない。

本発明のリポソームはそれ自体公知の方法によって製造
される。

すなわちポルチクスイング法（Ａ、Ｄ、Ｂａｎｇｈａｍ
Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ　、、−ムＪ、２３１（／ヂ
乙り。

ソニケーシ”３７法（Ｃ，Ｈｕａｎｇ、Ｂｉｏｃｈｅｒ
ｎ、。

Ｌ１３グ＃（／りｔ９）〕、プレベシクル法〔■（７Ｔ
ｒａｕｂｌｅ、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、Ｒｅｓ、Ｐｒｏｇ。

Ｂｕ　Ｉ　１　、、ヱ、コア３（ｌり７／）〕、エタノ
ール注入法ＣＳ、Ｂａｔｚｒｉ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉ
ｏｐｈｙｓ。

Ａｃｔａ、、Ｊヱｒ、１０／ｊ（／９７３）〕、フレン
チプレス押出法［：Ｙ、Ｂａｒｅｎｈｏｌｌｚ、、ＦＥ
ＢＳ。

Ｌｅｔｔ、、Ｐ？、２１０（／９７り）］、コール酸除
去法（Ｙ、Ｋａｇａｗａ、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、。

ｕ４’４．ｊ４Ｃ７７（／り７１）〕、〕トリトｙＸ−
ｉｏｏバッチ法Ｗ、Ｊ、Ｇｅｒｒｉｔｓｅｎ、Ｅｕｒ。

Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、Ｉｊ　、コ！ｊ（／り７Ｆ））
。

Ｃａ２＋融合法［：Ｄ、ＰａＰａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏ
ｓ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ、ｊヱｐ、
４ＡｒＪ（／り７ｔ）、ｌ、ｚ−チル注入法ＣＤ、Ｄｅ
ａｍｅｒ。

Ｂｉ□ｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ、、４１Ｃ
Ｊ　、　　Ａコタ（／り７ｊ））、アニーリング法ＣＲ
。

Ｌａｗａｃｚｅｃｋ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ
、ＡＣｌａ。

五五、、ｌ　、　Ｊ　／　Ｊ　（／り７ｔ）〕、凍結融
解融合法［：Ｍ、Ｋａｓａｈａｒａ、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃ
ｈｅｍ、。

ｓｒｘ　、　７３ｒｕ　（／　タフ７　））　、Ｗ１０
／Ｗエマルジョ／法（Ｓ、　Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ、　Ｊ
、　Ｃｏ１１ｏｉｄＩｎｔｅｒｆａｃｅ　　Ｓｃｉ、、
Ａ２　、／　４′り（／Ｐ７７）］。

逆相蒸発法ＣＦ、５ｚｏｋａ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。

人ｃａｄ、　Ｓｃ　ｉ、　Ｕ　８人、７！、　　弘／り
４４（／り７ｔ）〕など多くの方法が知られているが、
本発明では上記いずれの調製法を用いてもよくまたこれ
らに限定されるものではない。

次に実施例をめげて本発明の作用効果をさらに具体的に
説明する。

実施例１゜ 表１の組成を有するリポソームを逆相法（Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　、７　ｊ　（り
）４４７　Ｐ≠（／り７１）特開昭１１−／／Ｉ弘Ｉｊ
号）により作製した。また漏出試験用にカルボキンフル
オレセインを内包マーカーとして用いた。所定量のホス
ファチジルコリン、コレステロールをクロロホルム２０
ｍ１に溶解し九溶液をｊＯｘｌのナス型フラスコに入れ
る。ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を留去し、
フラスコ内壁に薄膜を形成させた。

次いでジエチルエーテルコθＩｗ／を加えて脂質を溶解
し、更にＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ＝７．ｔ）を３ｄ加え
た。

そして、ナス７．７スコ内の気相１ｋＮ２ガスで置換し
た後にナスフラスコをコＯ０Ｃに保ちながら、均一なけ
んだく液ができるまで、約５分間プローブ型の超音波照
射を行った。

次にロータリーエバポレーターで２０°−２！０Ｃの減
圧下、ジエチルエーテルの大部分を留去した。このよう
にしてできたゲル状脂質を２Ｑ秒間ポルテックスで混合
した後、−〇〜λｊ０Ｃの減圧下、溶媒を完全に除去し
た。

これにＨＥＰＥＳ緩衝液ｌ！ｄを入れ（ｐＨ＝７．１）
２００Ｃで２０分間超音波照射を行なった。５ｅｐｈａ
ｒ□ｓｅ　弘Ｂでゲル濾過後、各フラクションについて
（株式会社、日科機製；コールターＮ−≠−サブミクロ
／粒子アナライザー使用）平均粒径とリン脂質濃度（和
光製ニリン脂質測定用キット使用）ｔ−測定した。そし
て平均粒径Ｏ０／〜Ｏ１λμの７ラクシヨンを用いリン
脂質濃度を３．ｏｘｉｏ　　　ＭＫＭ整した。

その調整液に種々の濃度のゼラチンを添加して全量１０
ｍ１とじ九。

ゼラチンは平均分子ｔ／万（等電点μ、？）とｉｏ万の
もの（等電点ｒ、ｚ＞２種用いた。

我／ リボノ−・ム液組成　（七ρ（七） 衣コ ＥＰＣ＝＝ Ｃｈｏｌ　　　＝ ｐ　ＭＰＣ＝ ＰＡ　　　　＝ 卵黄由来ホスクアチジＡ・フリ：／ コレステロール ジミリストイルホスン“アチジト−２リンホスファチジ
ン酸 一東試験 凝集試験は、組成／−・・−／　７　（力／Ｉボキシノ
ノト２櫨レセイン含まず）のザ／プルをｙｏｅ′ｃｔ７
）ｌｙｐ温室（τ保存ｊ７、粒径１１１１１定、と１ｊ
視によって行つ六二１、結果な表、２に示す１、 表λの結果から、本発明の方法を用いることにより無添
加の場合と較べてリポソームの凝集が少なく粒径もはと
んど変化し２ないことがわかる。

ゼラチン量をθ、／−１０％の間で種々変化させても同
様の傾向が見られた。

（発明の効果） 本発明の方法は脂質を水中に分散させ／ξ時（（形成さ
れるリポソームの保存時の凝集を抑制するのに有効でお
る。

発明者らは、リポ゛ンーム保存液中に様々な添加剤金入
れ艮期間に渡る試験結果の末ゼラチンが予想以上の凝集
抑制効果音もたらすことをｉｔ＋目−、；ｌ’＋Ｔもの
である。

特許出願人　富士写真ンイルム株式会社４、補正の対象
　　明細書の「発明の詳細な説明」の欄 平成１ 年７月ｌ／日。

事件の表示 平成 ７年特願第２３２！を号 ２、発明の名称 リポソームの保存方法 補正をする者 事件との関係

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. リポソームの保存液中にゼラチンを添加することを特徴
   とするリポソームの保存方法。