JPH02276573A - 肝炎ｂウイルスに対する単クローン性抗体産生ハイブリツドマ細胞系 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、肝炎８表面ウィルス（ＨＢｓＡｇ）に対する
単クローン性（ｍｏｎｏｃｌｏｎａ＋）抗体を分泌する
新規なハイブリツドマ細胞系に関し、とくに肝炎Ｂウィ
ルス感染に対する検定系における面記単クローン性抗体
の使用に関する。

連続的に二次培養できる新規な細胞系の開発は、近年に
おいて研究の重要な領域である。このような細胞系の１
つの特定の用途は抗体の夷造にあり、そして体細胞交雑
（すなわち、細胞融合］の導入は純粋な単クローン性抗
体を製造できる研究器具を提供した。抗体分泌細胞を骨
髄腫細胞と融合し、そして生ずる抗体分泌性ハイブリッ
ドに組織培養でクローンを発生させることによって、特
定の抗体を分泌できる安定なハイブリッド単グローン性
細胞系を生成し、選択できることが発見された。

こうして、単りローン性訓胞系において、純粋な単特異
性抗体が１つのもとの抗体分泌細胞から生ずるので、前
記特異性抗体の製造を確保することができる。

純粋な単特異性抗体を製造する能力は抗原の精確なスク
リーニング、精製に、そして治療／予防の用途に、明ら
かに大きい実用性があり、そして本発明はこれらの技術
を肝炎Ｂウィルスの感染に関連して使用することに関す
る。

急性および慢性の肝炎Ｂ感染の診断は、患者の血液中の
ＨＢｓ抗原の検出に依存する。これは、一般に、ポリス
チレンビーズ上へ吸収された９サギまたはウマの抗Ｈａ
ｓ血清を利用する放射線免疫検定により行われてきた。

患者の血清中の１１　Ｂ　ｓ抗原は固相の抗体へ結合し
、次いで放射標識した抗）（Ｂｓをさらに使用すること
にふ−り検出できる。

肝臓中のＨＢｓ−Ａｇを検出する他の技術は、二重層免
疫螢光を用いる。しかしながら、この技術はウサギにお
いて抗血清を増大する一次手順を含み、そして抗体は高
価な、時間を要するアフイニテイクロマトグラフイーに
より精製する。

ＨＢｓ抗原を検出するための放射線検定技術の使用は、
輸血サービスに関連してよく確立されているが、病院の
患者のスクリーニングに一般に広〈実施されてきていな
い。病院内の感染Ｑ危険を防ぐためにこれが明らかに望
ましいということは別にして、とくに肝炎ウィルスの保
菌者である産科の患者の同定はきわめて重要である。な
ぜなら、保菌者の母親の同定により、出産直後の乳児に
超免疫グロブリンを投与し、こうして肝炎の発現および
慢性保菌者の危険をかなり減少できるからである。

肝炎Ｂウィルスの感染のだめのスクリーニン〆およびこ
の疾患の可能な処置の増加は、大量の入手容易な高品質
の抗ＨＢｓ血清を必要とする。÷−擾類−の新規なハイ
ブリッド単クローン性細胞系が今回見出され、これらを
ＢＦ−ＨＢｓ−１、ＲＦ　−ＨＢ　ｓ　−２およびＲＦ
−ＨＢｓ−４と表示する。これらは培養において安定で
あることが示され、各々は肝炎８表面抗原に対する単ク
ローン性抗体を分泌する。そ、の上、これらの細胞系は
液体窒素中に貯蔵し、それから回収することができ、こ
うして純粋な肝炎８表面抗原に対する純粋な抗原の入手
容易な供給物を提供する。

したがって、本発明は、ハイブリツドマ細胞系ＲＦ−Ｈ
Ｂｓ−１，ＲＦ　−４Ｂ　ｓ−２ｔ７’ｃハＲＦ　−１
（Ｂｓ−４１Ｃより分泌される、肝炎８表面抗原に対す
る単クローン性抗体を提供する。望ましくは、単クロー
ン性抗体は、他の免疫材料を含まない実質的に純粋な形
態である。また、本発明は、これらの単クローン性抗体
の１種またはそれ以上と適当な担体または希釈剤とを含
有する組成物を提供する。

本発明の単りンツ、それゆえ単特異性（ｍｏｎｏ−ｓｐ
ｅｃ　ｉｆ　ｉｃ）　　抗体は、培養上澄液から、ある
いは、以後示すように、マ９スの腹水症の流体または血
清から回収できる。それらの各々はＨＢ　ｓ　−Ａｇに
対する活性を示し、マウスのＩｇＧ１高分子景鎖（ｈｅ
ａｖｙ　　ｃｈａｉｎ）　　およびマ９スのに低分子鎖
（ｌｉｇｈｔ　　ｃｈａｉｎ）　　に対して増大したウ
サギの抗血清により沈殿するが、７９スのＩｇＧ２ａ。

’ｇＧｔｂ、ＩｇＭまたはＩｇＡあるいは７９スのλ低
分子鎖に対するウサギの抗血清により沈殿しない。こう
して、各単クローン性抗体は、ｌ（ＢｓＡｇ（ａｄおよ
びａｙ）の主要なサブタイプと反応するＩｇ（３ｔ（Ｋ
）７９ス免疫グロブリンであり、そして、；ｉ［ｆｌ胞
系ＲＦ−ＨＢｓ−１、Ｔ（Ｆ−ｆ（Ｂ　ｓ　−２または
ＲＦ−ｆ（Ｂｓ−４を培養することによって装造できる
。

細胞系ＲＦ−ＨＢｓ−１、Ｒ，Ｆ−ＨＢｓ−２ｂ−工び
ＲＦ’−ＨＢｓ−４は、−為イフ゛リッドマ（ｈｙｂｒ
ｉ−ｄｏｍａ）細胞系である。これらの細胞系は、Ｋｏ
ｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ　　（Ｅｕｒ、Ｊ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、６，２９２　（１９７６））の方法に
従い、濃縮した肝炎８表面抗原（ＨＢｓＡｇ）およびｆ
（ＡＴ感作マウス骨髄腫（ｍｙｅｌｏｍａ）細胞系（Ｐ
３−ＮＳＩ°／１−Ａｇ４−１）で前もって免役した、
Ｂａ１ｂ／ｃ　マウスからの牌細胞を融合することによ
って製造されたものである。これらの融合した細胞系の
３種を用いるクローン発生することにより、それぞれＲ
Ｆ−１（Ｂｓ−１，ｌ（，１’−ｒＬＢｓ−’ｌおよび
几Ｆ−１（Ｂｓ−４と表示するハイブリツドマ単クロー
ン性細胞系が単離された。

細胞系ＲＦ−ＨＢｓ−１、ｌもＦ−３Ｂｓ−２およびＲ
Ｆ−ＨＢｓ−４の各々は、大きさおよび形状の両方が親
ＮＳｌ骨髄腫と形態学的に類似し、平均大きさが１３μ
ｍである細胞のかなり均一な個体群として現われる。そ
れらの各々は培養において球形で現われ、中央に位置す
る核を有し、そして核体積に等しいかｙψｈ７Ｆ７％＠
ｔｉｔ、、’ｊ％ｓシー１（Ｂｓ−１は親系統（ｐａｒ
ｅｎｔａｌ　　１ｉｎｅ）と異なる。

ＲＦ−ＨＢｓ−１は、親系統に似て固体の基層、たとえ
ば、ガラスまたはプラスチックへ部分的に結合するが、
この表面から激しい攪拌により分離されることができ、
トリプリジン化またはＥＧＴＡによる処理を必要としな
い。それはまた攪拌培養容器内で懸濁培養物として生長
する。几Ｆ−）（Ｂｓ−２は生長して部分的に基層へ結
合し、二次培養のためにトリプミン化を必要とするが、
ＲＦ−ＨＢ　Ｓ　−４は静止懸濁培養物として生長し、
培養物を希釈し、たとえば、１：１０に希釈することに
より通過を行う。細胞はそれぞれ１４．６時間、１０．
７時＋ｂ’１および９．２時間の２倍時間を有し、Ｒ，
ＰＭＩ−ＦＣ３培地（下を参照］中で生長し、各々の２
〜３日の間隔の養分供給を必要とし、ＲＦ−）ＩＢｓ−
１について２〜３日、ＲＦ−ＨＢｓ−２について３〜４
日、そしてＲＦ−ＨＢｓ−４について２〜３日の間隔の
二次培養を必要とする。

ハイブリツドマ細胞系ＲＦ−ＨＢｓ−１、−１２シーよ
び−４の各々は、本発明の抗体を分泌し、そして連続培
養において少なくとも３力月間抗体を分泌し続ける。

したがって、また、本発明はＲＦ−ＨＢｓ−１、−２）
よび−４と表示するハイブリツドマ細胞系の各々を提供
し、それらは肝炎８表面抗原に対する単クローン性抗体
を分泌し、細胞系は好ましくは他の細胞物質を含まない
、実質的に純粋な形態で存在し、そして、さらに、本発
明は、これらの細胞系の１種またはそれ以上と、前記細
胞系を維持できる栄養培地とを含有する組成物を提供す
る。

適当な培地は炭素源、窒素源、必要に応じて、ビタミン
＃Ｉ訃よび／または無機塩類を含有し、このような培地
の一例は胎児の子牛血清を補充したＲＰＭＩ−１６４０
、たとえば、ＲＰＭＩ−Ｆ’ｃＳ６（下を参照）である
。

ハイブリツドマ細胞系ＲＦ−ＨＢｓ−１の製造において
、Ｂａ１ｂ／ｃ　マウスを、最終抗原濃度０．７ｍｙ／
ｄにおいて、完全７０インドのアジュバント（ＣＦＡ）
で１：１に希釈した稍＃ＨＢｓの０．２ｄの腹腔内注射
により免疫する。（使用したＨＢｓ抗原（サブタイプ　
ａｄｗ　）はＨＢｓ抗原陽性血清から、塩化セシウム密
度勾配遠心分離により３！製した）。４週間後、７９ス
をＨＢｓ抗原／ＣＦＡ混合物の０．２−をさらに注射し
て増強した。６週間後、固相放射免疫により決定して、
ＨＢｓ抗原に対する抗体の最高の力価を与えたマウスを
、ＣＦＡ中のＨＢｓ抗原の０．２ｄ１．Ｐ、注射でさら
に増強し、この最後の増強後５日で殺し、牌を切除した
。

牌を、１０％Ｖ／Ｖの胎児子牛血清、２ミリモルのグル
タミンおよび各１００ＩＵのペニシリンおよびストレプ
トマイシンを補充した几ＰＭＩ−１６４０培地（ＲＰＭ
Ｉ−Ｆｅ２）中で３７℃、ｐＨ７，２および２９／Ｌの
重炭酸ナトリウム濃度において、細片にくだき、そして
生ずる＠濁液を滅菌したｌ　Ｏｄの注射器に０回おだや
力為に出し入れした。単一細胞懸濁液を未分離の数個の
残留塊りからデカントし、そして細胞を血清不含ＲＰＭ
Ｉ−１６４０中で２回洗い、１５００ｙで５分間遠心分
離した。洗浄した細胞ペレットをＲＰＭＩ−１６４０中
に再ＷＡ濁した。

マウスの骨髄種の半合流培養物Ｐ、−ＮＳ、１／１−Ａ
ｇ４−１　（ｆなりち、１０　％　Ｖ　／　Ｖ　（７）
胎児子牛血清、２ミリモルのグルタミン、１００ＩＵの
ペニシリン、１００μ２のストレプトマイシンおよヒ２
　Ｘ　１０−’　モルの８−チオグアニンを補充し、重
炭酸塩／Ｃｏ２で緩衝したＲＰＭＩ−１６４０培地中で
３７０において連続培養状態に維持した、生長の活性段
階の細胞の培養物）を、それらの培養容器から、おだや
かなトリプシン化により分離し、そして４００ｇの遠心
分離により血清不含ＲＰＭＩ−１６４０中で２回洗浄し
た。洗浄した細胞をＲＰＭＩ−１６４０中に再懸濁し、
デカンテーションした。

交雑を行うために、金牌細胞個体群を骨＊腫細胞と、丸
底の滅菌した１ＯＩＩｔの遠心分離器の管中で、１０対
１の牌細胞対骨髄＠細胞の比で、混合し、１５０（ｌの
遠心分離により共ペレット化した。上澄液を除去後、Ｒ
ＰＭＩ−１６４０中のポリエチレングリコール（ＰＥＧ
）１５００の４０％（Ｗ／Ｗ）の３７℃に予備加温した
溶液のｌ　ｍｌを細胞ペレットに加え、細胞とおだやか
に混合した。細胞−ＰＥＧ混合物を３７０で正確に７分
間保温し、次いでＰＥＧ溶液を、ＰＥＧ濃度が０．５％
（Ｗ／Ｗ）以下になるまで、等体積のＲＰ　Ｍ　ｌ−１
６４０の反復添加により、徐々に希釈して細胞を分離し
た。この懸濁液を１５００９で遠心分離し、細胞ペレッ
トをおだやかに再懸濁し、血清不含ＲＰ　Ｍ　Ｉ　−１
６４０中で２回洗浄し、１ｏｏｏｙで再懸濁した。洗浄
した細胞ペレットをｌ　ｍｌのＲＰＭＩ−Ｆｅ２中にお
だやかに再懸濁し、３７℃で２時間培養し、次いで細胞
をＲＰ　Ｍ　Ｉ　−Ｆ　ＣＳ中Ｉ　Ｘ　Ｉ　Ｏ’細胞／
　ｍｌで、２４×２ｊＩｇの多敬のくほみの組織培養平
板中に分配し、３７℃で５９６ＣＯ□／９５％空気雰囲
気中で培養した。

融合後２４時間において、各フラスコ中の培地の半分を
１（ＡＴ培地（Ｉ　Ｘ　１０−’モルのハイポキサンチ
ン、４Ｘ１０−７モルのアミノプテリンおよび１．６　
Ｘ　１０−’　モルのサイミジンを補充したＲＰＭＩ−
Ｆｅ２）で置換した。これらの培養物を、新らしいＨＡ
Ｔ培地で、このように、最初の３日間毎日、その後２〜
３日の間隔で、補充してｆ（ＡＴ培地中で生長する能力
をもつ雑種細胞を確実に選択した。

ＨＡＴ培地をＨＴ培地（ＲＰＭＩ−ＦＣ８＋ハイポキサ
ンチンおよびサイミジン）で段階的に置換し、これは融
合後第４０日において開始し、次いで融合後書５２日に
おいてＲＰＭ　Ｉ　−Ｆ　ＣＳ中の生長に適合した。

雑種培養からの上澄液を、くぼみが１００個の細胞より
多い生長を示すとすぐに、ＨＢｓ抗原に対する抗体につ
いて評価した。ただ１．つの培養くぼみが抗体産生細胞
を含有したが、他の培養くぼみは事実生きているハイブ
リッド細胞を含有していた。

次いで、この１つの培養くぼみからの抗体産生雑種細胞
を、免疫しないＢａ１ｂ／ｃ　マウスからの牌細胞の供
給（ｆｅｅｄｅｒ　３層上へもとの培養物を限界希釈し
、ＲＰＭＩ−Ｆｅ２中の９６Ｘ０．２ｍの複合皿中で雑
種を生長させることによって、初めクローン発生させた
。生長はクローン発生計画の開始時にハイブリッド細胞
を含有することが確認された１６のくぼみにおいて行わ
れ、そしてこれらから細胞系ＲＦ−ＨＢｓ−１を、ＨＢ
ｓ抗、原に対する単クローン抗体を分泌する安定なハイ
ブリッド＋ｄＩＩ）！ｉｌｌ系を提供するものとして、
選択した。この細胞のクロンを引き続いて２回再クロン
発生を行い、その結果１００％の抗体産生クローンが得
られた。

ハイブリッド細胞系ルＬ’−４８ｓ−’ｌの製造におい
て、生まれてから６週間の雄のＢａ１ｂ／ｃ　マウスを
、アフイニテイＭ　Ｊ！　ＨＢ　ｓ　Ａ　ｇ　　（サブ
タイプａｙ）　　で、完全フロイントのアジュバント（
ＣＦＡ；０．２ａｔ／マウス）中の２０μ２の）（Ｂｓ
Ａｇの腹腔内注射により、免疫した。２週間後、ＣＦＡ
中の５μ９のｌ（Ｂ　ｓ　Ａ　ｇの１．　Ｐ、注射をさ
らに行ってマウスを増強し、血清抗ＨＢ　ｓ　Ａ　ｇ　
　の最高の力価を与えるマウスを、さらに２週間後生理
的食塩水中の５μ２のＨＢｓＡｇの１．）’、注射によ
り増強した。最後の増強後３日にかいて、マウスを殺し
、牌を切除した。この時間において、マウスは１：ｔｏ
ｏｏの血清抗Ｍ　Ｈｓ　−Ａ　ｇ力価を有した。（すべ
ての抗ＨＩＪ　ｓ　Ａ　ｇ測定値を°’ＡＵＳＡＢ”比
−免疫測定（アボット・ラボラトリーズ）により決定し
、そしてこの規格における抗体の力価を最大結合の５０
鴫を与えるＳ釈として与えるＪ０免疫したマウスからの
牌細胞を、ＲＰＭＩ−Ｆｅ２中で３７０．ｐＨ７，２お
ｊび２．Ｏ１／ｌの重炭酸ナトリウム濃度において解離
した。金牌細胞１固体群を血清不含培地（Ｈ，ＰＭＩ　
−１６４０３で２回洗い、Ｐ３−ＮＳＩ／１−Ａｇ４−
１　　マウス骨商腫細胞と１０：１（牌紬胞：骨ｔａ腫
細胞］の比で混合し、ペレットにし、ＲＰＭＩ−１６４
０中の４０％（Ｗ／Ｗ）ポリエチレンクリコール（ＰＥ
Ｇ）１５００のｌ　ｍｌ中に懸濁した。７分間の保温後
、ＰＥＧを細胞からＲＰＭＩ−１６４０の徐々の添加に
よりおだやかに希釈した。細胞懸濁液１１’（ＰＭＩ−
１６４０中で１回洗い、１５００？ｆ　遠心分離し、次
いで３ｍｌのｌ（ＰＭＩ−１”Ｃ８中で２時間保温し、
次いで細胞を２Ｘ１０’、Ｉａ胞／〈ぼみで２１Ａｔの
培養くぼみ中にプレー）　（ｐｌａ−ｔｅ）した。すべ
ての作業は３７Ｃで実施した。

ａ＠ｔ＝３７℃でＲＰＭＩ−ＦＣ８中テ５　％　Ｃｏ。

７９５％空気雰囲気で一夜培養し、次いで各培養くぼみ
中の培地の半分を）ＩＡＴ媒地で置侯した。

培養物に倉らしいＨＡＴ培地を、このようにして、厳初
の３日（肖１日の間隔で、次いで２〜３日の１冑隔て供
給して、ＰＬＡＴ感作骨感作骨髄小細胞イフリット細胞
全選択した。融合後はぼ３週曲で、ハイブリッド細胞を
ＲＰＭＩ−ＦＣ８培地へ導入した。

はじめプレートした１６８のくぼみのうちで、１４８は
ハイブリッド細胞を生長させ、それらのうちで４つは抗
ｆ（ＢｓＡｇ　　活性の生成を示した。

これらの４つのうちで、融合後２０日で現われた１つの
ハイブリッド培蓋物はＨＢｓＡｇ　Ｋ対する抗体を産出
しつづけた。この細胞系を３回りｏ　−ン発生させ、生
ずる抗体分泌クローンの１つはｌＬ［’−ｒｉ１３ｓ−
２と表示する細胞系である。

ハイブリッド細胞系ＲＦ　−−−１Ｂ　ｓ　−４の製造
において、生まれてから６週間の雄のＢａ１ｂ／ｃマウ
スを、アフイニテイ’ｆＪｌｆｆｆ（ＢｓＡｇ　　（サ
ブタイ７”　ａ　ｄ　）　で、完全フロイントのアジュ
バント（ＣＦＡ；　０．２ａｇ／”ウス）中の２０μ９
　　ｉ（Ｂｓ−Ａｇの腹腔内注射によシ免疫した。３週
間後、マウスをＣＦＡ中の５μ２０ＨＢ　ｓ　Ａ　ｇ　
　の追加の１、Ｐ、腹腔内注射に工９増強し、血清抗）
（ＢｓＡｇの最高の力値を与えたマウスをさらｖｃ１０
日間後日間的生理的食塩水中２の）（ＢｓＡｇの１．Ｐ
、注射にエリ増強した。最後工冑り生後５日において、
マウスを殺し、牌１藏を切除した。この時間において、
マウスは１　ニア０００の血清抗ＨＢｓＡｇ　　力価を
有した。

次いで、手順は免疫マウスからの牌細胞の解離力）ら、
交Ａ′ｆｆ剣胞の２　Ｘ　１０’　細胞／くぼみにおけ
る２ｍｌの培養くぼみ中への３７Ｃにおけるグレイティ
ング（ｐｌａｔｉｎｇ）まで、ハイブリツドマ細胞系１
（、Ｆ−ＨＢｓ　−２の製造において用いた手順と同一
であつ、ｔｏまた、培養および選択の条ｆｌ−はその手
順と同一であり、そして初めプレートした１４４のくほ
みのうちで、１２９はハイブリッド細胞を生長させ、そ
れらのうち５つは抗ＨＢ　ｓ　Ａ　ｇ活性を生成した。

これらの５つのうちで、融合後１５日で現われた１つの
ハイブリッド培養物はｉ（ＢｓＡｇ　　に対する抗体を
生成した。この細胞系は３回クローン発生させ、生ずる
抗体分泌クローンの１つをＲＦ−ＨＢｓ−４と表示する
細胞系である。

本発明のほかの面は、ハイブリツドマ細胞系ＲＦ−ＨＢ
ｓ−１、′ＦＬＦ−ＨＨｓ−２または１ｔｌＩ゛−１４
Ｂｓ−４の１つの細胞を栄養培地中で培養することから
なる、前記細胞系の増殖法にある。また、この増殖法は
、培地から分離できる本発明の抗体を製造する１つの手
段を表わす。本発明の細胞のだめの適当な栄養培地は炭
素源、窒素源、必要に応じて、ビタミン類および／また
は無機塩類を含有し、たとえば、胎児子牛血清を、たと
えば、培地に基づいて約ｌＯ重童係の量で補充した、几
１）ＭＩ−１６４０である。前述のＲＰＭＩ−Ｆｅ２は
とくに適する。細胞を生長させるとき、適当な初期濃度
はＲＦ−ｆ（ｔ３　ｓ　−１ニラｒてｌＸ１０’細胞／
履ＩＸＫＦ−１（Ｂｓ−２について１×１０５細胞／ｍ
ｅ、そしてＲＦ−）（Ｂｓ−４について２Ｘ１０５細胞
／　ｍｌである。これらの農産は、望ましくは、それぞ
れｌＸ１０’＋Ｉ４１１胞／履’％２Ｘ１０１１　細胞
／ｖｓｌおよび３Ｘ１０’細胞／−を超えてはならない
。

本発明の細胞系を栄養培地中で培養することにＤ口えて
、細ｆａ系の各１つを７９ス中に移植して腹水１ａ瘍を
定着させることもできる。これは、一般に、たとえば、
４Ｘ１０’〜Ｉ　Ｘ　１０’細胞／マウスをプリスタン
（２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカンで初
回抗原刺激を受けた（ｐｒｉｍｅｄ）Ｂａｌｂ／ｃ　　
−ｔウスに腹腔内注射することによって実施する。また
、腹水腫瘍の定着は、プリスタンの初回抗原刺激を受け
ない７９スにおいても達成することができ、この場合、
Ｒ，Ｆ−ＨＢｓ−１Ｍ胞を増殖すルトキ、ｌ×１０６〜
２×１０’細胞／マウスを注射すべきであるが、ＲＦ−
ＨＢｓ−２およびＲ１”　−ＨＢ　Ｓ　−４についての
細胞／マウスの最小値は４〜５　Ｘ　１０’　である。

また、細胞系は皮下注射により固形腫瘍として生長させ
ることができる。

次いで、ハイブリツドマにより分泌された単クローン性
抗体は、腹水症の流体またはマウスの血清から回収する
ことができ、そして細胞系を増殖しかつ抗体を製造する
この方法は本発明のさらにほかの面を表わす。単クロー
ン性抗体を得るこの手段は、抗体の収量が、たとえば、
細胞の塊状培養から得られる収量よりも１０倍程度に多
くあることができるという利点を提供する。マウス中で
細胞を生長させるのに通常約２〜３週間を要する。

本発明の抗体は、前述のような源から精製しないで使用
できるが、好ましくは使用前に精製する。

たとえば、アフイニテイクロフトグラフイーにおいて使
用するセファロースへ結合すべき抗体は一般に硫酸アン
モニ９ム沈殿により精義するが、ヨード化すべき抗体ま
たはビオチン接合すべき抗体は一般に蛋白質入精製を行
う。

本発明のハイブリツドマａ３Ｆｅｌは、たとえば、２０
％のＦｅ２を含有するＦＣ８補充Ｒ，ＰＭＩ−１６４０
培地中に、たとえば、５Ｘ１０’細胞／ｄ以上において
、凍害防御物質として１０％のジメチルスルホキシドを
用いて、液体窒素中で凍結することにより貯蔵できる。

凍結速度は好ましくは＋４０℃〜−１０００の間で１〜
２Ｃ／分に制御し、そして凍結した細胞は液体窒素の冷
蔵庫内で一１００℃以下、たとえば、−１７０℃で貯蔵
できる。

細胞系ルＦ−ＨＢｓ−１、−２および−４により産出さ
れる単特異性抗体は、肝炎Ｂウィルスに感染された患者
の精確なスクリーニング試験を提供することにおいて、
とくに価値がある。これらの抗体は、細胞物質または血
清の中のＨＢｓＡｇの存在を検出するとき、たとえば、
免疫螢光顕微鏡法または免疫電子顕微鏡法を用いる、測
定系において使用できる。足置的測定は固相放射測定−
法により実施することができ、セしてＲＦ−１（Ｂｓ−
１抗体は）（ＢｓＡｇ　　分子上に比較的高い頻度で現
われる抗原エピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ）　を認識する
ので、これに関して有用である。しかしながら、本発明
によるとくに有用な固相放射測定系は単クローン性抗体
の組み合わせを用いる。

ＲＰ　−ｒｌ　Ｂ　ｓ　−２およびＲＦ−ＨＢｓ−４の
祷胞系が産出する抗体は、ＨＢｓ−Ａｇ上に低い頻度で
存在するエピトープに対して高い親和性をもち、−緒に
固相として、後の実施例において説明するようＫ　、Ｈ
Ｂ　ｓ　−Ａ　ｇｆ：検出する放射測定法に、単独で、
あるいはＲＦ　−ＨＢ　ｓ　−１抗体と組み合わせて、
使用できる。ＲＦ−ｉ（Ｂｓ−２およびＲＦ’−ＨＢｓ
−４抗体からなる固相は）（ＢｓＡｇの一工程放射測定
法に応用できる（下の実施例７はこれらの２種々の抗体
がそれらの間ですべてのＨＢｓ−Ａｇ　分子をいかにし
て認識するかを明らかにする）が、この固相にＲＦ−Ｈ
Ｂｓ−１抗体を加えると、それは二工程測定法において
使用するとき保護物質として作用する。なぜなら、Ｈ，
Ｆ−ｌ（Ｂｓ−１抗体は、他の２つの単クローン抗体よ
りもｆｌ　Ｂ　ｓ　Ａ　ｇ　に対して親和性が低いが、
それ自体すべての［ＢｓＡｇ分子を認識し、こうして抗
原の固相への定着を罹災するからである。これらの単ク
ローン性抗体を用いる固相放射測定系において、ＲＦ−
ＨＢｓ−１抗体はすべてのｌ（Ｂｓｌ（ｇ分子を認識す
るばかりで彦く、また分子上に高い頻度で存在する）（
ＢｓＡＨのエピトープを認識するという事実のため、測
定において他の２つの抗体工りも高い計数値を、単独で
、あるいは組み合わせで、与えるので、放射標識したト
レーサーとして使用することが好ましい。放射測定にお
いてすべての３種の単クローン性抗体を使用するときの
支持は、競争結合の研究（下の実施例４参照）により提
供され、これらの研究はａＦ−ｍＢｓ−２またはＲＦ−
ｄＢｓ−４抗体のいずれもがＲＦ−ＨＢｓ−１抗体のｌ
（ＢｓＡｇ　　への結合を妨害しないことを証明してい
る。

こうして、本発明による好ましい診断法は、ヒトま禿は
動物か゛ら採取した血清試料を、二工程において固相の
形態でＲＦ−ＨＢｓ−１、ｋ（、Ｆ−１−１Ｂｓ−２お
工びＲＦ−１−１８５−４抗体と一緒に培養し、固相を
洗浄し、そしてそれをトレーサーとして放射標識した几
Ｆ−１（ＢＳ−１抗体とともに培養するか、あるいは−
工程測定において固相の形態でＲＦ−ＨＢｓ−２および
凡Ｆ−ＨＢｓ−４抗体、およびトレーサーとして放射標
識ＲＦ−ＨＢｓ−１抗体とともに培養することからなる
。これらの測定系の各々において、固相は好ましくは抗
体を被覆したプラスチックまたはガラスの支持体からな
る。

この支持体は、たとえば、ポリスチレンの、ビーズ、棒
または管の形であることがとくに好ましい。

また、本発明は、これらの被覆した支持体、たとえば、
ビーズを提供し、さらに、几Ｆ−ＨＢｓ　−，１、Ｉ（
、Ｆ−ＨＢｓ−２およびｋＦ’−１Ｂｓ−４抗体で被覆
したまたは几Ｆ−ＨＢｓ−２およびＲＦ−ＨＢｓ−４で
被覆したプラスチックまたはガラスの支持体、たとえば
、ビーズ、棒または管を含有する第１容器と、放射標識
物質を結合したＲＦ−ＨＢｓ−１抗体を含有する第２容
器とからなる診断キットを提供する。（これらの測定系
において、几Ｆ−ＨＢｓ−１抗体を本発明の他の２つの
単クロ、−ン性抗体と一緒に使用する代わシに、ＲＦ−
１（Ｂｓ−１抗体をｄＢｓ−Ａｇを認識する１種または
２種以上の他の単クローン性抗体と一緒に使用できる。

］本発明による別の測定法は、放射標識物質を使用する
代わりに、一般にＲＦ−ＨＢｓ−１抗体に結合する、た
とえば、酵素標識物質またはビオチン標識物質を用いる
ことができる。さらに、ＨＢｓ−Ａｇに対する赤血球凝
集測定に、本発明の抗体の１種またはそれ以上を使用で
きる。

また、固相、たとえば、臭化シアノゲン活性化セファロ
ーズ（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）　４Ｂ　（ＣｎＢｒ　−８
４Ｂ；ス９エーデン国つップサラ所在の、７アーマシア
・ファイン・ケミカルズ］へ結合した本発明の単クロー
ン性抗体の１ｍｌまたはそれ以上を、ワクチンの製造に
使用するために精製された形態でｌ（Ｈｓ−Ａｇを製造
する目的で、あるいは患者に与えるべき物質から［Ｂｓ
−Ａｇを除去する目的で、ＨＢｓ−Ａｇを、九とえば、
ヒトまたは動物の物質から除去するために使用できる。

こうして、また、本発明は、生物学的試料をＲＦ−ＨＢ
ｓ−１，ＲＦ−ＨＢｓ　−２および／またはＲＦ−ＨＢ
ｓ−、ａ抗体と固相において接触させて抗原を抗体に結
合させ、引き続いて所望の精製された物質を固相から分
離することからなる、生物学的試料から肝炎Ｂ表面抗原
を単離する方法を提供する。

また４、本発明の）（ＢｓＡｇ　　に対する単クローン
性抗体、とくに几Ｆ−［Ｂｓ−４からの抗体は、抗体を
患者へ直接に投与する抗９イルス剤としての臨床′色芯
用において、価値がある。単クローン性抗体は患者の処
置において肝炎Ｂウィルスを担持する役割をもつことが
でき、そして細胞上の受容体部位へのウィルスの結合を
阻止することにょプウイルスの感染性を中和する仁とが
でき、また９イルスの食作用および細胞内消化を促進す
ることができる。潜在的には、超免疫ガンマグロブリン
のための基質として、これに関連して、これらの単りロ
ーン注抗体を使用すると、従来の血清を用いる場合にお
ける、大量の非特異性免疫グロブリンと少量の特異性抗
体の生成を、回避することができる。各抗体、とくにＲ
Ｆ−ＨＢｓ−１からの抗体は、）ＩＢＶ担体における耐
性を、ｌ（Ｂｓ−Ａｇへの結合およびそれをよシ免疫原
性とすることにより、破壊する作用をすることもできる
。

こうして、本発明のほかの面は、本発明の単クローン性
抗体の１種またはそれ以上と、製薬学的に許容しうる不
活性担体または希釈剤とからなる製薬学的組成物である
。治療的および／または予防的使用のため、この組成物
は固体°または液体の形態であることができ、そして常
法によシ非経ロ的または経口的に投与できる。こうして
、この組成物は、注射可能な溶液あるいは錠剤、カプセ
ル剤、溶液または懸濁液の形態であることができる。

単クローン性細胞系ＲＥ−ＨＢｓ−１、ＲＦ−ＨＢｓ−
２およびＲＰ−ＨＢｓ−４は、Ｃ，Ｎ、　Ｃ。

Ｍ、（Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　Ｎａｔｉｏｎａｌｅ　　
ｄｅＣｕ１ｔｕｒｅ　ｄｅ　Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓ
ｍｓ、パリ市パスツール研究所）に、それぞれ、１９８
０年３月２６日、１９８１年３月２４日および１９８１
年３月２４日に寄託され、それぞれ、受入れ番号１−１
１７、ｌ−１５０および１５１が付された。

本発明を、次の実施例によりさらに説明する。

ＲＰ−ＨＢ　ｓ　−ＩＭｍ　ｔ、５〜２０　％　（Ｖ　
／　Ｖ　）の胎児子牛血清を補充したＲＰＭＩ−１６４
０培地に、ｌＸｌ０’細胞／−ｊで種づけした。細胞の
生長速度はすべての培地において本質的に同一であった
（１４．６時間上２゜５の倍加時間］が、生長時間は１
５％および２０ｔ４の胎児子牛血清において長くした。

ｌＸｌ０’細淘／ｄの種まき密度は最適な生長に対して
好ましいが、これより低い密度を用いることができ、そ
の場合生長時間は長くなる。二次培養は２〜３日ごとに
行うべきである。

生まれてから６週間のＢａ１ｂ／’ｃ７９スの２０匹に
、０．５−のプリスタン（２，６，１０，１４−テトラ
メチル−ペンタデカン］の腹腔内注射により第１日目と
第７８目に初回復原刺激を与えた。

第１４Ｂ１において、各マクスにｌＸｌ０’の“生きて
いる雑種層ＲＦ−ＨＢｓ−１細胞を腹腔内に移植した。

移植後１０日において、すべてのマウスは多量腫瘍生長
の徴候を示した。これらを殺し、腹水症の流体を１９ゲ
ージの針で集めた。腹水症の流体を２ＱＯＯｆで遠心分
離し、ＲＦ−１（Ｂｓ−１抗体を含有する透明な上澄液
を集め、−２００で貯蔵した。

２　Ｂ　：　ＲＦ−ＨＢ　ｓ　−’２ Ｂａｌｂ／Ｃｆｆ’７スに、３Ｆ−ＨＢｓ−２細胞の移
植前に、１週間で２回の０．５−のプリスタンの腹腔内
注射により、初回抗原刺激を与えた。次いで、各７９ス
に４Ｘ１０’の生きている’［（、Ｆ　−ＨＢｓ−２ａ
胞を移植し、腹水腫瘍を生成させた。

２０〜２５日後、７９スが腹水流体の最大収量を生じた
とき、マウスを殺し、腹水流体はほぼ址Ｏ■／　ｍｌの
蛋白質を含有し、それらのうち１５０μｔ／ｄは純粋な
Ｈ，Ｆ−ＨＢｓ−２抗体であることがわかった。

２Ｃ：　ＲＦ−ＨＢｓ−４ Ｂａｊｂ／ｃマウスに、ＲＦ−１４Ｂｓ−４細胸の移植
前に、１週間で２回の０．５１１４のプリスタンの腹腔
内注射により、初回抗原刺激を与えた。次いで、各マウ
スに５　Ｘ　１０’の生きているＲ　Ｆ　−ＨＢ　ｓ　
−４細胞を移植し、腹水腫瘍を生成させた。１５〜２０
日後、マウスは腹水流体の最大の収量を与え、この流体
は１８０　／Ｊ　９　／　ｍのＲＦ−ＨＢｓ−４抗体を
含有することがわかった。

ポリスチレンビーズを３種々の単クローン性抗体の各々
で、腹水流体の形態において、種々の希釈度でｐＨ９，
６の重炭酸塩緩衝液（０，０１５モルのＮａ、Ｃｏ、：
０．０３５％ルのＮａＨＣＯ，）中で、攪拌しながら２
０℃において１時間保温し、次いで同じ抗体−緩衝液混
合物中で４℃において１６時間保温することにより、被
覆した。次いでビーズを洗浄し、室温において、２００
μｔの＋ｚｓ　１−Ｈ１３Ｓ−Ａｇ　（アボット・ラボ
ラトリーズ］とともに４時間保温して、最適の被覆条件
を決定した（下表１参照）。

この実施例において使用した被覆緩衝液のｐＨは９．６
が最適であることがわかった。さらに、ビーズを単クロ
ーン性抗体の組み合わせで被覆するとき、抗体を通常ビ
ーズへ一緒に加える。なぜなら、ビーズへ単クロン抗体
を順番に加えると改良が得られないからである。

ビーズを、抗体でいったん被覆すると、蒸留水で３回洗
い、吸収パッド上で遠心分離にょシ乾燥できる。これら
のビーズは一２０ｃにおいテ少すくとも３力月間安定で
ある。

実施？ｌＪ　４ 認識 細胞系ＲＦ−１１Ｂｍ　−１によシ産生七れた単クロー
ン性抗体は、ＨＢａＡｇのａｄおよびαＶサブタイプに
対して共通であシ、かつ次の競争結合の研究によシ証明
されるように、ＲＦ−ＨＢａ−２およびＲＦ−ＨＢｓ　
−４が認識するＨＢｓＡ仏のエピトープと異なる、エピ
トープを認識する。

混合したサブタイプのＨＢ　ｓ　Ａ　ｇ　（ＡＵＳＡＢ
　ニアボット・ラボラトリーズ）で４Ｍ　４％したポリ
スチレンビーズを、５０μｆ　／　１１ｇの蛋白質Ａ精
製したＲＦ−ＨＢ８−１、ＲＦ’−！１Ｂ８−２または
ＲＦ−ＨＨ８−４；冗坏と一緒に、あるいは等しい力価
のＨＢｓ−Ａｇに対するウマの抗血清と一鑵に、室温で
一夜保温し、次いで実施例５におけるようにヨウ素化し
た（１０００，０００ｃｐｍ）”’７−ＲＦ−ＨＨｓ−
１または１２’　Ｉ−ＲＦ−ＨＢ　ｓ　−２抗体と一緒
に、室温でさらに４時間保温した。結果を下狭２に記載
する。

これらの結果が示すように、ＲＦ−１１Ｅ　ｓ　−１お
よびＲＦ−ＨＥｓ−２の抗体はそれら自体の産金を抑制
するが、他の抗体による結合の抑制は４在しない。他方
において、ウマの抗血清は、事英、ＲＦ−ＨＢｓ　−１
抗体の結合を抑制じた。

実施例５ 放射測定法における細胞系抗体の使用 ＲＦ−ＨＢｓ−１抗体を、ＰｒｏｗｓａおよびＪａｎｋ
ｉｎ　（Ｉｔｗｎｕｎｏｃｈｇｔｎｉｓｔｒｙ　１５　
４２９−４３６．１９７８）の方法に従い、蛋白質Ａ−
セファｏ　−ス（５ｅｐｈａｒｏｓｔｔ　）カラム（フ
ァーマシア・ファイン・ケミカルス・スウェーデン国ア
ップサラ）からのｐＨｓ、ｓにおける溶離により、ＲＦ
−ＨＢｓ−１，細胞系を移植したマウスからの腹水流体
から精製した。このようにして精製したＲＦ’−ｔｌＢ
ｓ−１抗体の５μｔを、１５μノの合計反応体積の２５
μ２のクロラミｙ　（Ｃｈｉ　ｏｒａｍｉｎｅ　）Ｔを
用い、４Ｃで３０秒間保温して、１２５１対抗体の等モ
ル比を得ることによって、０．５ｍＣ１の１”ｌテヨｆ
ｙ”ｊＡ化り、、た。（ｋＦ−ＨＢｓ−２嘔よびＲＦ−
Ｈｈｓ　−４抗体を同様にして積装し、ヨウ素化した。

） ＲＦ−ＨＢｓ−１％ＲＦ−ＨＢｓ　−２、ＲＦ’−ＨＢ
ｓ−４またはこれらの単クローン性抗体で被覆したポリ
スチレンビーズ、あるいはＡｕ５ｒｉαｎビーズを、２
００μＪのＨＢｓＡｇ−ｖｅ　ヒ）血イ青と一緒に、ろ
るいは２０　ｎｇ／　ｍｌ　ｔＤ　ＨＢｓＡｇ　ｆ含有
する２００μｌのヒト血清と一緒に、４５Ｃで２時間保
温し、洗浄し、そしてＩ２’Ｉ−ＲＦ−ＨＢｓ−１，”
”Ｉ−−ＲＦ−ＨＢｓ−２’！７ｔ−１ｄ１２”Ｉ−Ｒ
Ｆ’−’ＢＢｓ−４（はぼ１０　Ｇ、０００　ｃｐｍ／
剣定）と−緒に４５０においてさらに１時間保温し、洗
浄し、計数した。結果を、ｃｐｍ（少なくとも２つの試
料の平均）として、あるいはＨＢｓＡｇ＋υｅ試料およ
びＨＢ　ｓ　Ａ　ｇ−シー試料（＋／−）を用いて得ら
れた計数値の間の比として、猥わす。

この表が示すように、最高の＋／−比、それゆえ最高の
感にの一１足値は、すべての３棟類の単クローン性抗体
を固相において便用し、トレーサ＝として５ｚｓＩ−Ｒ
１；’　−ｈＢ　８−１を使用したとき、得られた。

実施例６ ＨＢｓＡａの検知の限界 ＲＦ−ＨＢ’ｓ−１、ＲＦ−ＨＢａ−２またはＲＦ−Ｈ
Ｂｓ　−４単クロ一ン性抗体、またはそれらの抗体の組
み合わせで、最適弗度で俵横したポリスチレンビーズ７
．２００μｊのＨＢｓＡｇ−ｖｅヒト血清または既知潅
・のＨＢｓＡｇを含有する２００μｌのヒト血清と一緒
に４５ｔｌ？で２Ｆ＃間保温し、洗浄し、２００　ｔｔ
　ｌ　（Ｄ　””Ｉ　−ＲＦ−ＨＢｓ−１（２ｏｏ、ｏ
ｏｏｃｐｍ／測定）と−爾に４５Ｃでさらに１時間保温
した。

結果を下表４に記載する。また、この表４に１、ＡＵＳ
ＲＩＡ　　ｍ　　ＲＩＡ　を用いる同僚な滴定値のＨＢ
　ｓ　−Ａ　ｇの結果を記載する。結果はｃｐ惰（少な
くとも２回の実験の平均）または＋／−比として表わす
。

冥施例７ ３糧類の単クローン性抗体によるＨＢｓＡｇ＠Ｂｓ１ｇ
機出 ＡＵＳＲＩＡ　　ａ　　ＲＩＡ　またはへパテスト（Ｈ
ｅｐａｔａｓｔ）　（２５３＋υｇ　Ｈ４？−ｖｇ）に
よりＨＢｓＡｇ＋ｖｅ　４１ｆｃＦｉＩｉＢｓＡｇ−ｖ
ｅ　であることが示された、３００のヒトの血清の試料
の２００μｊのアリコートを、ＲＦ−ＨＢｓ　−２また
けＲＦ−ＨＥｓ−４の単クローン抗体で、あるいはＲＦ
−Ｈｔ３ｓ　−１，ＲＦ−ｕＢｓ−２およびＲＦ−ｈＨ
ｓ　−４の単クローン抗体の混曾吻で、液覆し次ポリス
チレンビーズと一緒に、４５Ｃで２時間保温した。洗浄
後、ビーズを＋＊５ｌ−ＨＦ−ＨＢｓ−１（２００，０
００ｃｐｍ／測定）と−緒に４５Ｃでさらに１時間保温
し、洗浄し、計数した。

下表５に示すように、２５３のＨＢｓ−Ａｇ陽性の試料
のうちで、２１９はＲＥ’−：ＭＢｓ−２抗体で陽性で
あったが、３４は陰性でめった。しかしながら、ＨＢｓ
Ａｇ陽性であるが、ＲＦ−ＨＢｓ−９２と非反応性であ
ることが示された３４試料のすべては、固相としてＲＦ
−ＨＢｓ−４抗体を用いて測定したとき、陽性の値を与
えた。同様に、試験した２、５３のＨＢｓＡｇ＋τｅ試
料のうちで、ｌＯは固相として単独で使用したＲＦ−Ｈ
Ｂｓ−４抗体で検出されなかったが、これらの１０の試
料のすべては、固相としてＲＦ−ＨＢｓ−２抗体を用い
て測定したとき、陽性の値を与えた。

実施例８ ＲＦ−ＨＥｓ−１、ＲＦ’　−／ｌＢ　Ｂ　−２２，’
？よびノにン“−１１Ｂｓ　−４で核種したポリスチレ
ンビーズを、５５μｔ／ゴのＨＨｓＡｇ　を含有す・る
２００μｊのヒト血清と一緒に、あるいは２００μＩの
ＨＢｓＡｇ−ｖａヒト血清と一緒に、２０Ｃ１３７Ｃま
たは４５ｒにおいて種々な時間保温した。これらのビー
ズを洗浄し、そして”’Ｉ−ＲＦ−ＨＢｓ−１）レーサ
ーと一緒に２０Ｕ、３７ｔｌ’または４５Ｃにおいて追
加の時間保温し、洗浄し、計数した。

ＨＢｓＡＨについての２工程ＲＦ−ＨＢｓＢｓ単一ロー
ン抗体定についての好適な検温時間は、こうして次のと
おシである。

単クローン性抗体被覆ビーズを用いる血清の第１保温： 室温において４時間また轄 室温において１６時間 ＲＦ−ＨＢｓ　−１）レーサーを用する洗浄ビーズの第
２保温： 室温において２時間 実施例９ ＲＦ−ＨＨｓ−２およびＮＦ−ＨＩ３ｓ−４抗体〔腹水
流体（α５ｃｉｔｉｃ　ｆｌｕｉｄ　）の１：２００希
釈〕で被覆したポリスチレンビーズを、２００μｌのＨ
ＢｓＡｇ−シーヒト血清または２０　ｎｇ／ｄｔ７）　
ＨＢ　ｓ　Ａ　ｇ　オよび１０１１１の鳳ｔＳＩ−ＲＦ
−ＨＢ　ｓ　−１（１００，０００ｃｐｍ／ｍ＋ｉ定）
と−緒に、２（Ｉ’で棟々な時間保温し、洗浄し、計数
した。

結果をｃｐｍ　（２回の別々の笑験の平均）として、あ
るいはＨＢａＡｇ＋ｖｇおよびＨＨｓＡｇ−ｖｅの試料
を用いて得られた計数１１坂の浦の比として、表わす。

この実施例におけるようにビーズ、試料およびトレーサ
ーと一緒に保温すると、ビーズと試料を予備保温した場
合よシもすぐれた新来が得られ、そして仁れらの結果は
トレーサーと試料を予備保温した場合侍られる結果とｔ
よとんど異ならない。

この−工程の測定は、仇体が単クローンであり、従来の
抗血清に似ず、抗原性結合部位について完全ではないの
で、可能でるり、そして二工程の測定法よシも作業の数
が少ないので、ＨＢ、ｓ−Ａｇについて非常に急速なス
クリーニング法を要する場合、たとえば、槽血センター
および血液製品研究所において、使用するのに魅力的な
系である。

この測定は２時間以内で実施することができ、感度の明
らかな損失はない。

実施例１０ ＲＦ−ＨＢｓ−１抗体、とくにｍｋアンモニウム沈殿に
よシ屓水成体から精製したこの仇体を、製造業者の示唆
に従いＣｎＨｒ−８４Ｂ（スウェーデン国アップサラ所
在のファーマシア・ファイン・ケミカルズ社）へ結合し
た。ＨＢｓＡｇ　ｆ含有する１００−のヒト皿清ｔこの
カラムに下向きに通し、この血清からＨＢｓＡｇ　の９
ａ７％を除去した。さらに、除去された抗原の１００％
は３モルのＫｌを用いてカラムから＃陶できる。この抗
原はマウスおよびウサギにおいて免疫原性であり、そし
て全血清についてのウサギの抗血清に対する免疫電気泳
動法により、他のヒト血清汚染物質を除去できることが
示された。

実施例１１ ＲＦ−ＨＢｓ−１細胞の培に：吻からの上澄液中のＲＦ
’−ＨＢｓ−１すｌ：坏’ｆ　Ｉ−ｉいて、ｌ１ＢＶ含
有ヒトまたはチンパンジーからの肝バイオプシーの凍結
部分中、あるいはウィルスを含有する細胞中のｔｉＢｓ
Ａｇ　　を回定した。抗原−ｊ）［体片体全、螢光分子
へ、に６したマウスの免疫グロブリンに対するヤギの抗
血清で可視化した。さらに、蛋白質Ａ精成Ａ’　Ｆ−Ｉ
Ｉ　Ｂ　ｓ　−１抗体をビオチンへ接合した。

この接合は、ｌ　ｍｌのｐ　Ｈ８，３の重炭鐵塩−生理
的貴塩水緩衝液（０，１モルのＮαＨＣＯ，：　ｏ、ｓ
モルのＮａＣＬ）中（７）ｌ　ｍ９（ＤＲＦ−１ｉＢ　
Ｓ　−１抗体’ｋ１ｍ９／　ｍｌでＤＭＳＯ中ｖｃ浴け
た９ｏμ２のビオチンスクシンイミドと一緒に２０Ｃで
４時間保温することによって、行った。４Ｃでリン酸基
緩衝−生理的食塩水に対して一夜透析しｆｃ後、ＲＰ”
−ｊｉＢｓ−１抗体−ビオチン接曾体を、アビジンーフ
ルオロクｏ−ム（ａｖｉｄｉｎ−ｆ　ｌｕｏｒｏｃｈｒ
ｏｍｅ　）またはアビジン−フェリチア　（ａｖｉｄｉ
ｎ−ｆｅｒｒｉｔｉｎ−）と組み合わせて使用して、Ｈ
ＢｓＡｇ　　２それぞれ免役螢光！９１微・′磯法およ
び免疫′域子顕微焼法によシ可視化した。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、パスツール研究所に受託番号ＣＮＣＭ−Ｉ−１１７
   として寄託された肝炎Ｂ表面抗原に対する単クローン性
   抗体を分泌するハイブリツドマ細胞系ＲＦ−ＨＢｓ−１
   。 ２、パスツール研究所に受託番号ＣＮＣＭ−Ｉ−１１７
   として寄託された肝炎Ｂ表面抗原に対する単クローン性
   抗体を分泌するハイブリツドマ細胞系ＲＦ−ＨＢｓ−１
   を、その栄養培地中で培養することを特徴とする前記細
   胞系の試験管内増殖方法。 ３、パスツール研究所に受託番号ＣＮＣＭ−Ｉ−１１７
   として寄託された肝炎Ｂ表面抗原に対する単クローン性
   抗体を分泌するハイブリツドマ細胞系ＲＦ−ＨＢｓ−１
   をマウスに移植して腹水腫瘍を定着させることを特徴と
   する前記細胞系の生体内増殖方法。 ４、パスツール研究所に受託番号ＣＮＣＭ−Ｉ−１１７
   として寄託された肝炎Ｂ表面抗原に対する単クローン性
   抗体を分泌するハイブリツドマ細胞系ＲＦ−ＨＢｓ−１
   とこの細胞系を維持できる栄養培地からなることを特徴
   とする組成物。 ５、パスツール研究所に受託番号ＣＮＣＭ−Ｉ−１１７
   として寄託された肝炎Ｂ表面抗原に対する単クローン性
   抗体を分泌するハイブリツドマ細胞系ＲＦ−ＨＢｓ−１
   により分泌された単クローン性抗体を、宿主に投与する
   ことを特徴とする宿主の肝炎Ｂ感染を治療する方法。 ６、パスツール研究所に受託番号ＣＮＣＭ−Ｉ−１１７
   として寄託された肝炎Ｂ表面抗原に対する単クローン性
   抗体を分泌するハイブリツドマ細胞系ＲＦ−ＨＢｓ−１
   により分泌された単クローン性抗体と、生物学的試料を
   固相中で接触させて、肝炎Ｂ表面抗原を前記抗体に結合
   させ、引き続いて肝炎Ｂ表面抗原物質を固相から分離す
   ることを特徴とする生物学的試料から肝炎Ｂ表面抗原を
   単離する方法。 ７、パスツール研究所に受託番号ＣＮＣＭ−Ｉ−１１７
   として寄託されたハイブリツドマ細胞系ＲＦ−ＨＢｓ−
   １により分泌された単クローン性抗体およびＨＢｓ−Ａ
   ｇを認識する他の１種またはそれ以上の単クローン性抗
   体で被覆したプラスチック支持体を含有する第１の容器
   と、前記細胞系ＲＦ−ＨＢｓ−１により分泌され且つ放
   射標識物質または酵素標識物質を結合させた単クローン
   性抗体を含有する第２の容器からなることを特徴とする
   キット。