JPS59500720A - モノクロ−ナル抗体を用いるアフィニティ精製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 モノクローナル抗体を用いるアフィニティ精製方法発明の分野 本発明はアフィニティクロマトグラフィによる抗原及び抗体の精製に関する。も う一つの側面において、本発明はモノクローナル抗体如関するものである。

背　景 宿主動物の抗原に対する応答により産生され、免疫吸着剤としての固体支持体に 結合されている血清抗体な用いるアフイニティクロマトグラフィによる抗原の精 製は永年用いられて来ている方法である。この方法は、しかしながら、その有用 性を損う少なくとも二つの深刻な欠て試料から抗原を抽出する場合に、非吸着不 純物が免疫吸着剤から洗浄された似に抗原を抗体から解離するために苛酷な条件 が必要とされる。このために必要とされる条件は、例えば、３未満のｐＨ或いは ／／を越えるｐＨ或−・はグアニジノ或いは尿素溶液のような濃厚なカオトロー ｆ　（ｃｈａｏｔｒｏｐｅ）は抗原及び抗体を変性させる可能性があり、抗原の 免疫化学的及び／又は生物学的性質を破壊せずども減少させ、免疫吸着剤の有用 寿命を短縮させる。

抗原に対して高い親和性を有する抗体を用いる際に伴う問題を回避するために、 似い親和性の固定化抗体を免疫吸着剤として用いることが常套手段となっている 。これらの抗体の使用により穏やかな非−変性条件を用いて免疫吸着剤からの抗 原の溶出が可能となる。しかしながら、結合抗原から不純物を溶出するためにカ ラムを洗浄する必須工程は又抗原の成るものを非常に多く溶出するため（Ｃ分離 効率が太き（減少される。更に、低親和性抗体）ま比較的低濃度即ち約／　Ｏｎ ？、７ｍ１未満で媒体中に存在する抗原を効率的に結合することができない。

ハイプリドーマ技術の出現に伴い、モノクローナル抗体を得ることが可能となり 、それは引続いて、それに対して産生された抗原のアフィニティ精裂における免 疫吸着剤としての用途が提案されている。例えは、ステンマン等（Ｓｔｅｎｍａ ｎ　ｅｔ　ａ６．＋　Ｊ、　１ｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ。

グ乙、３３’７Ｃ７９ｇ／）〕、スタルカップ等［５ｔａｌｌｃｕｐ　ｅｔ　ａ ｌｊ、、　Ｊ、　Ｉｒｒｍｕｎｏｌｏｇｙ、／　２７　＋　９２　’１（７９ｇ ／）〕及びカッツマ７等［Ｋａｔｚｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　ｓｅｔ、　ＬＩＳＡ、　７　ｇ　＋　／ 乙、２　（／９ｇ／）］の報文を参照。これらの報文は、使用されたモノクロー ナル抗体はせいぜい抗原に対する適度の親和性を有するに過ぎず、穏やかな条件 を用いた免疫吸着剤からのそれらの脱着を可能にするということを示唆している 。即ち、モノクローナル抗体を免疫吸着剤として用いる今日までの経験は、それ らの性質は通常の抗血清の「ポリクローナル」抗体のそれに並行するものである ことを示唆して（・る。即ち、低い親和性の抗体の使用は穏やかな条件下におけ る抗原の溶出を可皆にするのに対して、高い親和性の抗体は抗原を抗体から解離 するために苛酷な条件を必要とする。

発明の要約 周知の如く、ハイブリドーマは融合促進剤の存在下におけるＢ−リンパ球とミエ ローマ細胞とのランダムな融合により形成される。瀞合により産生ずることので きるハイブリドーマの集団の各ハイブリドーマは容具ったモノクローナル抗体を 分泌する。典型的には、ハイブリドーマ集団のスクリーニングを行い、有用な量 の抗体を得るため（τ所望の抗原特異性の抗体を分泌するものを更にクローニン グする。不発明者等は、特異的抗原に対する抗体を分泌するハイブリドーマの集 団の中の抗原に対して高い親和性を有する抗体を分泌する部分集団のハイブリド ーマにおいて、一段と少ない数のハイブリドーマが第一の環境においては抗原に 対して高い親和性を有するが、しかし、第二の環境においてははるかに低い親和 性を有する抗体を分泌することを見出し、この環境のいずれの抗原或いは抗体の いずれの菟疫化学的或いは生物学的性質に有害でないことを見出した。高親和性 抗血清中におけるこれらの抗体の存在が見過ごされていたのは、抗血清中だおけ る高親和性抗体の大部分が、抗原が抗体から分離される前に苛酷な条件を必要と するものであり、それらが抗血清の免疫化学的性質を支配していたからであると 思われる。

従って、多数融合の産生物であり得るハイブリドーマ集団をスクリーニングする ことができ、第一の環境においては高い親和性を有し、第二〇環境においては像 い親和性を有するモノクローナル抗体を産生ずるものを同定し、且つそれらのハ イブリドーマの少なくとも一つをクローニングして、それの産生ずる十分な量の 抗体を倚ることかでき、それのアフィニティクロマトグラフィ用の高度に有効な 免疫吸着剤としての用途を可能にすることを見出した。本発明において使用する 抗体は、その親和性恒数（Ｋａ）　が約７０９以上である場合に高い親和性を示 すものと考えられる。そのにａ　が１０８　未満である載台に低し・親和性を示 すものと考えられる。

図面の簡単な説明 第１図及び第２図は固体相上に固定化された四種の異ったモノクローナル抗体に 結合された放射線標識化ヒト成長ホルモンの脱着に及はすｐＨの変化の影響を反 映するデータのグラフである。

好ましい実施態様の説明 本発明に従えば、抗原の精製は下記工程よりなる方法により達成される： ａ）第一の環境において高い親和性を有し、及び第二の環境において低い親和性 を有する（これらの環境のし・ずれも抗原の所望とする免疫化学的性質に実習的 な不可逆変化を起こさない）モノクローナル抗体を選択する工程； ｂ）この抗体を置体支持体上（／Ｃ「定１’ヒする工程；Ｃ）この固定什された 抗体を第一の環墳内において不純な抗原を含有する試料と接触させて、抗原を抗 体に結合させる工程； ｄ）未結合不純物を結合抗原から分離する工程；及び ｅ）溶出液として第二の環境である媒体を用いて抗原を精製された形態で固定化 抗体から溶出する工程。

既述の如く、本発明において有用な抗体は、公知の方法を用いたミエローマ細胞 と８−リン・ぞ球の融合により得られたハイプリドーマ集団から産生される抗体 をスクリーニングすることにより得ることができる。Ｂ−リンパ球は、典型的に は、標的抗原が予め免疫原として投与された高度免疫化された動物から採取され た膵臓細胞である。その特異性が所望抗原に対するものであるモノクローナル抗 体を産生ずるノ・イブリドーマが同定された後、それらを更にスクリーニングに 付してそれ等の親和性が抗原或いは抗体に対して損傷を与えない環境において変 化する抗体を産生ずるものを同定する。例えば、抗原類は、通常ｐＨ１ｌ〜７０ ．５の範囲内の溶液中において安定である。ｐＨ感受性の抗体を免疫吸着剤用に 得るためには、モノクローナル抗体のスクリーニングは一つのｐＨの範囲即ち、 約１０　以上、好ましくは／θ　以上のＫａ　においては抗体に対する高い親和 性を有し、第二のｐｈ即ち約７０８、好ましくは７０６　未満において低い親和 性を有するものを同定するように行われる。この穏のスクリーニングは抗体を固 定支持体上に固定化させ及びそれを抗原を結合させた径異ったｐ）ｉにおいて起 こる抗原の脱着の程度を測定することＫより行うことができ、測定は例えば、放 射線標識化抗原を用い、固体相及び／又は上澄液により発生される放射能を計数 することにより行われる。

同様のスクリーニングを行うことにより、その他の種類の環境変化に対応する抗 体を同定することができる。

本発明においては、その抗原を結合する能力がｐＨにおける変化に感受性を有す るモノクローナル抗体を開発することが好ましい。この点に関し、本発明の抗体 は１つのｐｌにおいて高い親和性を有し、この第一の１））Ｉよりもより高いか 或いはより借い第二のｐＨにおいては低い親和性を有するよ５ＩＣ選択される。

通常第一のｐＨはｐ１１７或いはその近辺であるが、しかし、これは必須要件で はない。

しかしながら、異った種類の環境条件の変化に対応する抗体を選択することも又 、本発明の範囲に含まれろものである。例えは、溶離媒体としてのカオトロープ 溶液の存在下において、高い親和性から低℃・親和性への変化を起こすモノクロ ーナル抗体を選択することが可能である。

適当なカオトロープ類としては、にＢｒ　、　Ｋｌ　、　ＫＳＣＮ　、グアニジ ノ、尿素及びｖ９ｃ１２がある。即ち、カオトロープの不存在下においては、７ ０９　以上のＫａ　を有し、その濃度が問題とされる抗原に対して有害でない特 別のカオトロープの存在下において７０８　未満のＫａ　を有するモノクローナ ル抗体を選択することがで診ろ。カオトローｆｇ受性の選択は又特別のｐＨにお ける緩衝液中においても行われる。或いは又一定の濃度のカオトロープの存在下 傾おいて、ｐ）Ｉ変化に感受性を有する抗体を選択することも可能である。

その抗原に対する親和性がｐｉ（或いはカオトロープ濃度以外の変化により適度 に低下するモノクローナル抗体を選択することも可能である。抗体のスクリーニ ングを行ってその抗原結合能力が溶離媒体の変化により影響を及ぼされることの できる媒体感受性の種類の中にはホウ酸塩感受性、メチルマンノシド感受性及び 非−イオン性或いはイオン性洗剤及びトリプトファン及びチロシンなどの特別の アミノ酸に影響を及はす試薬に対する感受性などが挙げられる。

アフイニテイクロマトグラフィに使用するためには、選択されたモノクローナル 抗体は、アフィニティクロマトグラフィにおいて通常使用される任意の固体支持 体に結合することができる。これらの支持体としては、セファロース、ポリスチ レン、ガラス、ナイロン、セルロース、ポリメチルメタクリレート、シリカケ８ ル、ポリアクリルアミド及びニトロセルロースなどが挙げられる。

以下の実施例は、その抗原に対する親和性が第一の環境における高い親和性から 第二の環境における低い親和性（いずれの環境も抗原の免疫化学的性質に損傷を 与えない）へ変化するモノクローナル抗体を得る本発明の応用及びそれらのアフ ィニティクロマトグラフィ用の免疫吸着剤としての有用性を例示するものである 。

実施例／ ヒト成長ホルモンで高度免疫化されたＢａ１ｂ／ｃ　マウスから採取された膵臓 細胞をポリエチレングリコールを用いてマウスのミエローマ細胞（Ｎ　Ｓ　−１ 或イハｓ　Ｐ　−２１０系統）と融合させた。得られたハイプリドーマのクロー ニング及ヒスクリーニング？行ってセファロースビーズ上において　ｌ　−ＨＧ Ｈ及びウマ抗−マウスｌ、Ｇを用いるラジオイムノアッセイによりＨＧＨに対し て特異的な抗体を分ｌするハイプリドーマを決定した。この抗−ＨＧＨを産生ず るハイプリドーマを更にスクリーニングしてｐＨ７において少なくとも約７０９ のＫａを有する抗体を産生ずるハイプリドーマを同定した。これらを更にスクリ ーニングしてその親和性がり〜１０．夕の範囲にわたるｐｈの変化に感受性のあ るハイプリドーマを同定した。ダ種のモノクローナル抗体のＩ）Ｈ感受性を反映 するデータを表／及び表λ及び第１図及び第Ω図に示す。これらの個個の抗体を それぞれＡ、Ｂ、Ｃ及びＤの文字で示す。これらのデータは次のよう忙して得た 。１２５１　で標識化されたＨＧＨをｐＨ７において、ポリスチレン球体上に予 め固定された個々の抗体に結合させた。各球体はほぼ／　ｎｆの抗原及び１０． ０００ｃｐｍを含有した。各々３個を７０％ウマ血清中の／ｍｌのＰＢＳ中にお いて示されたｐＨにおいてグ時間インキュベートさせた。ｐＨの調整は、炭酸ナ トリウムの緩衝液（ウマ血清中７０％）の添加（（よりｐ１１７を得るか或いは 酢酸ナトリウム緩衝液（ウマ血貴中１０％）を用いてｐＨ７を得た。インキュベ ーション後ｇｏθμｌ　の上澄液の計数を行った。各ｐｎにおける脱着抗原のカ ウント数を表／及びコに記録し、第１図及び第２図にカウント豊毎×１０　の脱 着ＨＧＨ来 ３ ｐＨ抗体Ａ　抗体Ｂ ３．０　’Ａｇ１０　曙Ｕ２ ３．３　’Ａ乙、２５　０．　ｇ　０３’１．０　’１．／３乙　０３Ｓ７ １Ｉ左　７６０ｇ　０２グｇ ！、、０　θ１ｌｌｌｑＯ，２０乙 ５５　０／７乙　０／乙コ ム０　Ｃ２２００，／９乙 ムＳ　Ｃ３３乙　θ／乙７ ’Ｚ　０　０．３２　ｇ　θ／乙コ 米３つの上澄液の平均 表　コ カウント１分Ｘ　／　０＝の脱着ＨＧＨ来ｐｎ　抗体Ｃ抗体Ｄ ’ＺＯＯ，２３４０，７ｇ７ ’７５　０．２０ｇ　０．３３乙 ｇ、０　０．２１Ｉ０　０．．３２／ ｇｓ　ｏ６乙Ａ　０２７７ ９．０　０．ｌＩＯ／　０．．２３７ ｑ３　１０３ｇ　Ｏ，，１ｇ７ ／θ０　３．０３０　０．３乙ダ １０、！；　１７ｇ０９　０りｇｌＩ ／１０　３ＪＯｇ　３．’ｌ乙０ ＊−３つの上澄液の平均 表／のデータ特に第１図にプロットされるデータは抗体已によるＨＧＨの結合は 本質的にｐｈ３．ｓ〜７の範囲に亘るＩ）Ｈの変化には感受性を有しないが、し かし、抗体Ａに対するＨＧＨの結合はｐｌ：　４１．３−　’１．０の範囲（（ おいて相当に減少し、抗体はｐＨ＆、ｌｌにおいては抗原を有効には結合しない ことを示している。

他方表２及び第２図のデータは抗体りによるＨＧＨの結合は本質的にｐＨ７，０ 〜７０．５の範囲に亘るｐｈ変化に対しては感受性を有しないのに対し、抗体Ｃ によるＨＧＨの結合はｐＨ９，ｓ〜１０．汐の範囲において相当に減少し、この 抗体がｐＨ／　０．ｊ！；　においては抗原を有効には結合しないことを示して いる。

抗体Ａ及びＣからｐＨ４，０及び１０汚において溶離された上澄液をＰＢＳ緩衝 液（ウマ血清中７０％）に添加し、ｐＨ７に調整し、試料をプールした。これら のプールされた試料を抗体Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤ並びにＨＧＨに対するλつのその他 のモノクローナル抗体で被覆されたポリスチレン球体をインキュベートした。こ れらの抗体の各々はＨＧＨ分子の異った領域を認識する。これらの６つの抗体の うち、抗体Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤを含むＳつの抗体でｐＨり或いはｐｉ１／　０．！ ；において溶離された抗原の免疫反応性は影響を受けておらず、第６番目の抗体 に対しては僅かに減少したにすぎなかった。これらのデータは抗原のｐｌ；グ、 ０或いはｐ）ｌ　／　０．！ｒにおける溶離はその免疫化学的性質に悪影響を及 ぼさないことを示している。

実施例コ 前立腺酸ホスファターゼ（ＰＡＰ）で高度免疫化されたＢａ１ｂ／ｃ　マウスか ら採取された膵臓細胞と実施例／に記載したマウスのミエローマ細胞との融合か ら得られた抗−ＰＡＰモノクローナル抗体を産生ずるハイブリドーマのスクリー ニングにより得られた極めて変化しやすい酵素であるＰＡＰに対する高親和性モ ノクローナル抗体（にａ　：５　Ｘ　／　０１０’）は乙、ｏ　〜１１．ｏのｐ Ｈの範囲において抗原結合感受性を示すことが判明した。この抗体は、充填され たセファロースビーズ／−当り／■の抗体の濃度でＣＮＢｒ　技術を用いてセフ ァロースビーズに結合し、精液からのＰＡＰを精製するため如次のように使用し た。

Ｈｙｂｒ　ｉ　ｔｅｃｈ社（カリフォルニア州すンノエコ゛）により製造される ＰＡＰ分析キッ）　ＴＡＮＤＥｉφ　（商標名）を用℃・たイムノラジオメトリ ックアッセイにより」］］定された０、９　／　、２　ｖｖ’ｍｉノＰ　Ａ　Ｐ を含有する７７０μｌｌ　のヒ液の試料を５−の酢酸緩衝液（０，／　３　Ｍ　 ＮａＣ１を含有するウマ血清中７０％の酢酸ナトリウム）で稀釈し、ｐｈ乙を有 する３／μｙ　ｐＡＰＡｎｌの溶液を得た。

このｐＡｐ溶液を／Ｊｍｌのセファロースビーズヲ含有するカラム中を７ｍｌ／ 時の速度で通過させ、カラムを７、Ｓ７の出発緩衝液で洗浄した。溶出液（りｍ ｌの試料及び７．クーの洗浄液）のイムノメトリックアッセイは９９．３％のＰ ＡＰがカラムに吸着したことを示した。このＰＡＰを０．／　３　Ｍ　ＮａＣ６ を含有するｐｉ−１１７の０．７　Ｍ酢酸緩衝液で溶離した。３つの／艷の画分 を集め、ｐｕｔ、００５０　ｍＭ　クエン酸緩衝液に対して透析させた。プール され、透析された両分のＰＡＰ含量はイムノラソオメ）　ｌ）ツクアッセイによ りカラムに適用した全量の３’１％と測定された。透析物質の純度は、ドデシル 硫酸ナトリウム及び０ｒｎｓｔｅｉｎ−Ｄａｖｉｓ　ＰＡＧＥによりめられた。

イずれの場合にも、単一バンドが観察された。酵素活性測定が行われた結果、精 製ＰＡＰはその酵素活性を保持することが判明した。

カラム上のＰＡＰのり乙％という保持率はおそらく少な（とも部分的には非−特 異的結合及びカラムからの抗原の［尾状流出（ｔｒａｉｌ）Ｊ　を生ずる大過剰 の抗体の使用によるものと思われる。前者は、カラムを溶離を達成した後十分に 洗浄して溶離する物質を除去する条件下に試料でカラムを予備処理することによ り減少することができる。後者は、結合抗体の濃度を低下させることにより減少 することができる。最徒に、セファロースは拡散及び立体的問題を生じさせる孔 径の不均一性のため（（アフイニテイクロマトグラフイの理想的なマトリックス ではない。

実施例３ クラミジアに関連する抗原の精製はそれを可溶化するのが困難なので複雑である 。しかしながら、それは各種洗剤中において可溶化することが可能である。高度 免疫化されたＢａ１ｂ／ｃ　マウスからの膵臓細胞と実施例／に記載したマウス ミエローマ細胞と融合して得られたクラミジアの抗原に対するモノクローナル抗 体を産生ずる〕・イブリドーマにしいてその洗剤濃度に対する感受性についテス クリーニレグを行った。９種のそのような抗体の結合に及ぼす洗剤の影響を表３ に示す。使用された洗剤はデオキシコレート（ＤＯＣ）、ドデシル硫酸ナトリウ ム（ｓｏｓ）及びＮｏｎ１ｄｅｔ　Ｐ　−’Ｉ　Ｏ（Ｎ　Ｐ　’Ｉ　Ｏ）として 販売されているオクチルフェノキシポリエトキシエタノールであった。Ｅｈｒ　 ｌ　ｉｃｈ腹水を対照例として使用した。

表３のデータはマイクロタイタープレート上で抗原を被覆し、それを表に示す洗 剤の濃度において緩衝液中で各抗体の溶液でインキュベートして得られた。イン キュベーション後プレートを洗浄し、ワサビダイコン７９−オキシダーゼ（ＨＲ Ｐ）で標識化されたポリクローナルヒツソ抗−マウス抗体と反応させた。インキ ュベーションは室温で７時間行われた。プレートを再び洗浄し、ＨＲＰに対する クロマゲン基質であるオルトフエニレンノアミン（○ｏｐ）の溶液と反応させた 。各ウェル中のつ光度は’ｌ　９０　ｎｍ　において測定し、表３に示した。

表　３ 抗−クラミジアモノクローナル抗体に よる結合に及ぼす洗剤の影響 抗体　０．Ｄ、Ｏ，Ｄ、０．０．　Ｏ，Ｄ、　Ｏ，Ｄ、’反応混　Ｅｈｒ　ｌ　 ｉｃｈ　抗体　抗体　抗体　抗体合物　腹水　１　２　３　４ 水性緩 漬液２　０．００　１０乙　／／３　１０２　θ９り、２％ＤＯＣθ０２　／、 １０　０．７０　０．／／　０．２！；２％ＮＰ−ダθ　０．００　０．２０　 θ／／　θｇｏ　ｏ、ｏ’ｂの％ＤＯＣθ０３　／３７　／３乙　／、２２／コ ＳＯ／％ｓｏｓ　０．０！　７１７　１．２０　／３０　１０３１’ｌワＱ　ｎ ｍ　におけるＯ、Ｄ、をθ、ｏりの標準偏差をもって２つの試料の平均として得 た。

コ　水性緩衝液はｇ％ウマ血清、２％ウシ胎児血清を有するＡｕｔｏｐｏｗ培養 培地である。実験で使用された全ての洗剤はこの緩衝液中に稀釈された。

３、　対照例として使用。

これらのデータは、異った洗剤及び洗剤濃度の選択されたモノクローナル抗体の 結合に及はす影響を示す。抗体Ａ／及び抗体λは水性緩衝液中においてクラミジ アに対して比較的高い親和性を有し、それは２％ＮＰ−１ＩＯ以外はいずれの洗 剤の影響も受けなかった。抗体３はλ％ＤｏＣ中洗おいて低い親和性を有したが 、その他の媒体中においては高い親和性を保持した。抗体ダは２％ＤＯＣ及び２ ％Ｎｐ−１１０中では低い親和性を有したが、その他の旗体中ＬＣおいては高い 非相性を有した。

その他の実験において、抗原１反頃マイクロタイターグレートを先ず表３に示し た濃度の洗剤で７時間インキュベートし、その後洗浄した。その後抗クラミジア 抗体をウェル中でインキュベートし、引続き洗浄後１−Ｉ　Ｒｐｉ識化抗−マウ ス抗体をインキュベートした。このインキュベーションに引続き洗浄後、酵素基 質でインキュベートした。各ウェル中で測定した光学密度を水性緩衝液で予備処 理したウェルと対比したところ、抗原が洗剤により害されていないことを示唆し た。従って、これらのモノクローナル抗体を抗体と相客れる洗剤中において抗原 を可溶化させ、この調剤を固定化抗体のカラム上に通過させて抗原を結合させる ことによりクラミソア抗原のアフィニテイ精製に使用することができた。引続い て、抗体が抗原に結合しない別の洗剤組成物でカラムを溶離することにより抗原 を放出させる。

以上の駿明から、ｆばれたモノクローナル抗体を免疫吸着剤として用いるアフイ ニテイクロマトグラフィにより抗原の効率のよい精製が抗原を変性させない条件 下において達成されることが当業者には明らかであろう。この方法の特別の応用 としては、抗原が自然に存在する試料中における精製及び貯酸時に劣化した放射 ＠標識化抗原の精製が含まれる。７つの特別の応用は、組撲えＤＮＡ技術により 得られた蛋白質生成物の精製がある。その様な生成物の中如はインシュリン及び ヒト成長ホルモンが挙げられる。匍清からの複合蛋白質及びＦａｃｔｏｒ　Ｖ　 或℃・はＦａｃｔｏｒ■の単離も本発明の方法を用いてｏＴ亜である。

又、方法を逆にして固定化抗原を免疫吸着剤として用いることによりモノクロー ナル抗体を精製することも可能である。例えば、貯蔵の結果劣化したイムノラソ オメトリツクアツセイに使用された放射ｆｆ１ＲＧＦ識化抗体をこの様にして精 製することができる。このモノクローナル抗体は又、固定化抗原を免疫吸着剤と して使用することにより腹水液或いは培養培地から回収することもできる。

如何なる特別の理論による制約を受ける意図を有するものではないが、ｐＨの変 化に伴５　Ｋａ　の変化は抗原及び抗体の相互に複合化する能力を変えるところ のヒスチノン残基のプロトン付加或いはりノン又はおそらくはチロシン或いはア ギニン残基の脱プロトン化の効果であるように思われる。影響を及ぼされない特 別の残基は分子の結合領、域内と存在しても存在しなくてもよい。

抗原に対する動物の免疫応答により産生する抗体の中には環境における変化に対 するこれらの感受性が変わる抗体が含まれるという本発明者等の発見に基き、ポ リクローナル抗血清を分別して本発明の環堺感受性モノクローナル抗体と同様な 挙動をする抗体の混合物を得ることも又本発明の範囲に含まれるものである。こ の分別は固定化された抗原な過剰の抗血清と第一の所望の環境条件において接触 させ、次いでこの免疫吸着剤を洗浄して未結合物質を除去することにより達成す ることができる。

この工程に引続いて免疫吸着前１−を第二の環境である媒体と接触させ、第一の 環境条件下においては溶烏１・されなかった抗体を溶離させる。例えば、ｐｈ７ において高い親和性及びｐｌＩＩｌにおいて低い親和性を示す抗体を得たい場合 には、固定化抗原をｐ）ｉ　７において過剰の抗血清と接触させ、固定化された 抗原をｐ１！７にお（・て媒体で洗浄して、ｐ１１７において低い親和性を示す 抗体を除去する。この免疫吸着剤を次いでｐｉ；　１７において溶離してｐＨＩ ｆにおいて低い親和性を示す抗体を除去する。この溶離液はその抗原との結合が ｐ１１７〜ｐＨ４ｔの範囲のｐＨにおける変異下に感受性を示す抗体の両分を含 有する。尿素その他の抗原−抗体結合の抑制剤を用いて同様の分別を行うことが 出来る。

得られた抗体の集団は、更ににａ　「スイッチ」よりもむしろ固有の似い親和性 により溶離する抗体を除去するため忙補助分別を必要とする場合がある。

二重特異性を有するハイブリッドモノクローナル抗体をアフイニテイ精製に使用 することも又本発明の範囲に含まれる。ハイブリッドモノクローナル抗体を得る 方法は同時に出願された出願であるマルチニス等の「二重特異性を有する抗体、 それらの製法及び用途Ｊ　［ＭａｒＮｎｉｓｅｔ　ａｌ、”Ａｎｔｉｂｏｄｉｅ ｓ　Ｈａｖｉｎｇ　Ｄｕａｌ　５ｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ。

Ｔｈｅｉｒ　Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　Ａｎｄ　Ｕｓｅｓ　Ｔｈｅｒｅｆｏｒ” 、　５ｅｒｉａｌ　＆（Ｌｙｏｎ　ａｎｄ　Ｌｙｏｎ　Ｄｏｃｋｅｔ　／乙２／ ワｇ）〕に記載されている。

この特許出願の開示内容は本発明において準用する。

このハイブリッドモノクローナル抗体）・ま異った抗原知対するλつの特異性を 有する。本発明（（おいて使用するためＫは、このハイブリッド抗体：・まそれ がアフイニテイクロマトグラフイにおいて免疫吸着剤として使用される抗原に対 する特異性においてｐｈその他の環境感受性を示すように選択される。ハイブリ ッドにより示される他の特異性は、固体支持体に接合されている第２の抗体に対 して高い親和性を有するように選ばれる。このハイブリッド抗体が固体支持体に 適用されると、それは第一の抗原により支持体に接合される。勿論、ハイブリッ ドの第２の抗原に対する親和性は第１、部ち標的抗原の溶離を可能にする環境条 件において実質的に低下してはならない。しかしながら、好ましくは第一の抗原 の抗体への結合ンま、標的抗原の免疫吸着剤からの溶離を可能にする環境条件と は異った環境条件に感受性を有するものであるのが良い。例えば、ハイブリッド 抗体は標的抗原に対する親和性がｐＨの低下により炒少され、第２の抗原に対す る親和性がｐＨを増大−針る二とにより減少されるように選９ 択すレる。これにより支持体が不純物により汚染されるか、或いはその有用性を 損うその他の理由により・ハイブリッドモノクローナル抗体を固体支持体から迅 速匠脱着したい場合にその様な迅速の脱着を可能にする。

本発明の環境感受性は又、溶液中においては不安定な抗原を固相に貯蔵するため に使用することもできる。例えば、放射線標識化された抗原を固定化抗体に貯蔵 のためと結合させ必要に応じて脱着させることができる。脱着に先立っては、貯 蔵中に発生した劣化生成物を除去するために免疫吸着剤を洗浄する。反対の方法 も又可「である。即ち、固相において不安定な抗体を貯蔵するために抗原を使用 することができる。例えば、ラジオアッセイにおいて使用される放射線標識化抗 体を抗原：抗体複合体として貯蔵し、必要に応じて脱着される。

以上は、本発明の現時点における好ましい実施例の説明であり、本発明は以下に 掲げろ請求の範囲によってのみ限定されるべきものである。

〆 ／２々２ｆ 国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ／　第一の環境においては抗体を産生させた抗原に対して高い親和性を有し、及 び第二の環境においてはその抗原に対して低（・親和性を有することを特徴とす るモノクローナル抗体（但し、し・ずれの環境も抗原或いは抗体の免疫化学的性 質を実質的に不可逆的に変更しない）。 ユ　第一の環境における抗原に対する抗体の、浩合恒数が約７０９　以上であり 、第二の環境における抗体の抗原に対する結合恒数が約７０８　以下である特許 請求の範囲第１項記載のモノクローナル抗体。 ３、　第一の環境における結合恒数が７０１０以上であり、第二の環境における 結合恒数が７０６　以下である特許請求の範囲第λ項記載のモノクローナル抗体 。 ｑ　第一の環境が第一のｐＨを有する液体媒体であり、第二の環境が第二のｐＨ を有する液体媒体である特許請求の範囲第１項、第２項又は第３項の（・ずれか に記載のモノクローナル抗体。 Ｓ　第一の環境のｐＨが　であり、第二の１境のｐＨが約ダ乃至約１０．３の範 囲である特許請求の範囲第を項記載のモノクローナル抗体。 ６　第二の環境がカオトロープ試薬を含有する特許請求の範囲第１項、第２項又 は第３項記載のモノクローナル抗体。 ７　カオトロープ試薬が尿素、グラニノン、ＫＳＣＮ　、　ＫＢｒ、Ｋ１及びＭ μ２よりなる群から選ばれる特許請求の範囲第１項記載のモノクローナル抗体。 ｇ　７つの特異性が第一の抗原に対するものであり、第二の′＃異性が第二の抗 原に対するものである二重特異性す有スるハイブリッドモノクローナル抗体であ って、第一の抗原に対する特異性は第一の環境におし・て高い親和性を有し、第 二の４境においては、低い親和性を有するものであり（但し、いずれの１境も第 一の抗原或いは抗体の免疫化学的性質を実質的に不可逆的に変更させなし・）、 及び第二の抗原に対するハイブリッド抗体の親和性は該第−及び第二の環境にお いて実質的に異ることを特徴とするハイブリッドモノクローナル抗体。 ９　抗体が第一の環境にお（・て第二の抗原に対する親和性を有し、第三の環境 において第二の抗原に対して低い親和性を有する特許請求の範囲第ｇ項記載のハ イブリッドモノクローナル抗体。 １０第一の環境が第一のｐＨｋ有する液体媒体であり、第二の環境が第二のｐＩ Ｉを有する液坏媒体であり、第三の環境が第三のｐＨを有する液体媒体である特 許請求の範囲第９項記載のハイブリッドモノクローナル抗体。 ／／　抗体が固体支持体に結合されて（・る特許請求の範囲第１項、？Ａ２項、 第３項、第ｇ項又は第９項に記載のモノクローナル抗１本。 ／２固体支持体がセファロース、ポリスチレ／、ガラス、ブイロン、セルロース 、ポリメチルメタクリレート、シリカダル、ポリアクリルアミド及びニトロセル ロースよりなる群から選ばれる特許請求の範囲第１１項記載のモノクローナル抗 体。 ／３．下記工程を含んでなることを特徴とする抗原の精製方法； ａ）第一の環境において高い親和性を有し、及び第二の環境において低い親和性 を有する（これらの環境のいずれも抗原及び抗体の所望の免疫化学的或いは生物 学的性質に実質的な不可逆変化を起こさない）抗体を選択する工程：　′ ｂ）この抗体を固体支持体上に固定化する工程；Ｃ）第一の環境内において、抗 原を抗体に結合させる工程； ｄ）未結合不純物を結合抗原から分離する工程；及びｅ）溶出液として第二の環 境である媒体を用いて抗原を精製された形態で固定化抗体から溶出するＬ程。 ／グ抗体がモノクローナル抗体である特許請求の範囲第７３項記載の方法。 ／夕　第一の環境における抗体に対する抗体の結合恒数が約７０９　以上であり 、第二の環境における抗体の抗原に対する結合恒数が約７０８　以下である特許 請求の範囲第７３項又は第１を項記載の方法。 ／６　第一〇Ａ境における結合恒数が７０１０以上であり、第二の環境における 結合恒数が／θ６　以下である特許請求の範囲第１３項又は第１グ項記載の方法 。 ／７　第一の環境が第一のｐＨを有する液体媒体であり、第二の゛環境が第二の ｐＨな有する液体媒体である特許請求の範囲第１３項又は第１グ項記載の方法。 ７ｇ　第一の環境のｐｉｌ　お　よ　び　第二の環境のｐｎが約ダ乃至約／　０ ．５の範囲である特許請求の範囲第１７項記載の方法。 ／７−第二の環境がカオトロープ試薬を含有する特許請求の範囲第７３項又は第 １グ項記載の方法。 澱　カオトロープ試薬が尿素、グアニジノ、にＳＣＮ、’　ＫＢｒ、にｌ及びＭ ｇＣｌ２よりなる群から選ばれる特許請求の範囲第１ｑ項記載の方法。 ２／　モノクローナル抗体が、精製されるべき抗原に対して第一の特異性、及び 第二の抗原に対して高い親和性を有する第二の特異性を有するハイブリッドモノ クローナル抗体であり、第二の抗原は固体支持体上に固定化されており、抗体が 固体支持体上で固定化される手段を与えており、抗体の第二の抗原に対する親和 性が第二の環境内にお（・て実質的に低下されない特許請求の範囲第１り項記載 の方法。 、２２　抗体が第三の環境において第二の抗原に対する低い親和性を有する特許 請求の範囲第２７項記載の方法。 、！３第一の環境が第一のｐｎを有する液体媒体であり、第二の−・環境が第二 のｐｉｌを有する液体媒体であり、第三の環境が第三のｐｔｌを有する液体媒体 である特許請求の範囲第ユニ項記載の方法。 遊　抗体が抗血清画分である特許請求の範囲第７３項記載の方法。 Δ　血清抗体を分別して第一の環境において抗原に対して高い親和性及び第二の 環境にお（・て抗原に対する低い親和性を有する画分を得る方法において（但し 、℃゛ずれの環境も抗原或いは抗体の免疫化学的性質を実質的に不可逆的に変更 しない）、抗原を固体支持体上に固定化させ、抗原な第一の１境において血清抗 体と接融させて抗体を抗原に結合し、及び溶Ａ液として第二の環境である媒体を 用いて抗原の両分を溶雅咳ることよりなり、溶゛誰された抗体が第二の環境にお （・て抗原に対して低い親和性を有ゴることを特徴とする方法。 ム第一の環境が第一のｐＨ￥有する液体媒体であり、第二の環境が第二のｐＨを 有する液体媒体である特許請求の範囲第２Ｓ項記載の方法。 ２７　第一の環境のｐｌ（お　よ　び　第二の環境のｐ■カー約グ乃至約／　０ ．３の範囲である特許請求の範囲第λ６項記載の方法。 ｌ　第二の環境がカオトロープ試薬を含有する特許請求の範囲第２！；ｆＡ記載 の方法。 ２ｑ　成る抗原に対して第一〇環境にお（・て高（・親和性を有し、及びその抗 原に対して第二の環境にお（・てイ氏（・、親和性を有する抗体（但し、いずれ の環境も抗原又をま抗体の免疫化学的性質を実質的に不可逆的に変更させない） の精製方法であって、下記ｒ、程な含んでなることを特徴とする方法： ａ）抗原を固体支持体上に固定化する工程：ｂ）抗体を第一の環境において抗原 と結合させる工程；Ｃ）未結合不純物を結合抗体から分離する工程、及びｄ）抗 体を精製した形態で固定化された抗原から溶離液として第二の環境である媒体を 用いて溶離させる「程。 ３０　抗体がモノクローナルづ死体である特許請求の範囲第３９項記載の方法。 ３／　第一の環境が第一のｐｎを有する液体媒体であり、第二の環境が第二のｐ Ｈを有する液体媒体である特許請求の範囲第２９項記載の方法。 ３コ第一の環境のｐＨお　よ　び　第二の環境のｐＨｌが約９乃至約１０Ｓの範 囲である特許請求の範囲第３７項記載の方法。 ３３　第二の環境がカオトロープ試薬な含有する特許請求の範囲第２９項記載の 方法。 ３ｑ　カオトロープ試薬が尿素、グアニジノ、ＫＳＣＮ　、　ＫＢｒ、に１及び Ｍｇα２よりなる詳から選ばれる特許請求の範囲第３３項記載の方法。