JPH0640833B2 - 肝炎ｂウイルルに対する単クロ−ン性抗体 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、新規なハイブリッドマ細胞系（ｈｙｂｒｉｄ
ｏｍａ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ）から分泌される。肝炎Ｂ
表面ウイルス（ＨＢｓＡｇ）に対する単クローン性（ｍ
ｏｎｏｃｌｏｎａｌ）抗体に関し、とくに肝炎Ｂウイル
ス感染に対する検定系における前記単クローン性抗体の
使用に関する。

連続的に継代培養できる新規な細胞系の開発は、近年に
おいて研究の重要な領域である。このような細胞系の１
つの特定の用途は抗体の製造にあり、そして体細胞交雑
（すなわち、細胞融合）の導入は純粋な単クローン性抗
体を製造できる研究器具を提供した。抗体分泌細胞を骨
髄腫細胞と融合し、そして生ずる抗体分泌性ハイブリッ
ドの組織培養でクローンを発生させることによって、特
定の抗体を分泌できる安定なハイブリッド単クローン性
細胞系を生成し、選択できることが発見された。

こうして、単クローン性細胞系において、純粋な単特異
性抗体が１つのもとの抗体分泌細胞から生ずるので、前
記特異性抗体の製造を確保することができる。

純粋な単特異性抗体を製造する能力は抗原の精確なスク
リーニング、精製に、そして治療／予防の用途に、明ら
かに大きい実用性があり、そして本発明はこれらの技術
を肝炎Ｂウイルスの感染に関連して使用することに関す
る。

急性および慢性の肝炎Ｂ感染の診断は、患者の血液中の
ＨＢｓ抗原の検出に依存する。これは、一般に、ポリス
チレンビーズ上へ吸収されたウサギまたはウマの抗ＨＢ
ｓ血清を利用する放射線免疫検定により行われてきた。
患者の血清中のＨＢｓ抗原は固相は抗体へ結合し、次い
で放射標識した抗ＨＢｓをさらに使用することにより検
出できる。肝臓中のＨＢｓ−Ａｇを検出する他の技術
は、二重層免疫蛍光を用いる。しかしながら、この技術
はウサギにおいて抗血清を増大する一次手順を含み、そ
して抗体は高価な、時間を要するアフイニテイクロマト
グラフィーにより精製する。

ＨＢｓ抗原を検出するための放射線検定技術の使用は、
輸血サービスに関連してよく確立されているが、病院の
患者のスクリーニングに一般に広く実施されてきていな
い。病院内の感染の危険を防ぐためにこれが明らかに望
ましいということは別にして、とくに肝炎ウイルスの保
菌者である産科の患者の同定はきわめて重要である。な
ぜなら、保菌者の母親の同定により、出産直後の乳児に
高度免疫グリブリンを投与し、こうして肝炎の発現およ
び慢性保菌者の危険をかなり減少できるからである。

肝炎Ｂウイルスの感染のためのスクリーニングおよびこ
の疾患の可能な処置の増加は、大量の入手容易な高品質
の抗ＨＢｓ血清を必要とする。新規なハイブリッド単ク
ローン細胞系が今回見出され、これをＲＦ−ＨＢｓ−１
と表示する。これは培養において安定であることが示さ
れ、肝炎Ｂ表面抗原に対する単クローン性抗体を分泌す
る。その上、これらの細胞系は液体窒素中に貯蔵し、そ
れから回収することができ、こうして純粋な肝炎Ｂ表面
抗原に対する純粋な単一特異性抗体の入手容易な供給物
を提供する。

したがって、本発明は、ハイブリッドマ細胞系ＲＦ−Ｈ
Ｂｓ−１により分泌される、肝炎Ｂ表面抗原に対する単
クローン性抗体を提供する。望ましくは、単クローン性
抗体は、他の免疫材料を含まない実質的に純粋な形態で
ある。また、本発明は、これの単クローン性抗体と適当
な担体または希釈剤とを含有する組成物を提供する。

本発明の単クローン、それゆえ、単一特異性（ｍｏｎｏ
−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗体は、培養上澄液から、あるい
は、以後示すように、マウスの腹水症の流体または血清
から回収できる。それらの各々はＨＢｓ−Ａｇに対する
活性を示し、マウスＩｇＧ_１の重鎖およびマウスのＫの
軽鎖に対して生じたウサギの抗血清により沈殿するが、
マウスのＩｇＧ_２ａ、ＩｇＧ_２ｂ、ＩｇＭまたはＩｇＡ
あるいはマウスのλの軽鎖に対するウサギの抗血清で沈
殿しない。こうして、単クローン性抗体は、ＨＢｓＡｇ
（ａｄおよびａｙ）の主要なサブタイプと反応するＩｇ
Ｇ_1(k)マウス免疫グロブリンであり、そして細胞系ＲＦ
−ＨＢｓ−１を培養することによって製造できる。

また、本明細書では、さらに２つの単クローン性抗体Ｉ
およびＩＩを産生し得るさらに２つのハイブリッドマ細
胞系ＩおよびＩＩが開示される。これら抗体は特にアツ
セイ系において、ＲＦ−ＨＢｓ−１抗体と組み合わせて
用いることができるＨＢｓ−Ａｇに対する単クローン性
抗体を示している。

細胞系ＲＦ−ＨＢｓ−１、ＩおよびＩＩは、ハイブリッ
ドマ（ｈｙｂｒｉｄｏｍａ）細胞系である。これらの細
胞系は、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（Ｅｕ
ｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６、２９２（１９７６））の
方法に従い、濃縮した肝炎Ｂ表面抗原（ＨＢｓＡｇ）お
よびＨＡＴ感作マウス骨髄腫（ｍｙｅｌｏｍａ）細胞系
（Ｐ３−ＮＳ１／１−Ａｇ４−１）で前もって免疫し
た、Ｂａｌｂ／ｃマウスからの脾細胞を融合することに
よって製造されたものである。これらの融合した細胞系
の３種を用いてクローンを発生することにより、それぞ
れＲＦ−ＨＢｓ−１、ＩおよびＩＩと表示するハイブリ
ッドマ単クローン性細胞系が単離された。

細胞系ＲＦ−ＨＢｓ−１、ＩおよびＩＩの各々は、大き
さおよび形状の両方が親ＮＳ１骨髄腫と形態学的に類似
し、平均大きさが１３μｍである細胞のかなり均一な固
体群として現われる。それらの各々は培養において球形
で現われ、中央に位置する核を有し、そして核体積に等
しいか、それより大きい、大きな細胞質領域をもつ。Ｒ
Ｆ−ＨＢｓ−１は親系統（ｐａｒｅｎｔａｌ ｌｉｎ
ｅ）と異なる。ＲＦ−ＨＢｓ−１は、親系統に似て固体
の基層、たとえば、ガラスまたはプラスチックへ部分的
に結合するが、この表面から激しい攪拌により分離する
ことができ、トリプシン処理またはＥＧＴＡによる処理
を必要としない。それはまた攪拌培養容器内で懸濁培養
物として生長する。Ｉは生長して部分的に基層へ結合
し、継代培養のためにトリプシン処理を必要とするが、
ＩＩは静止懸濁培養物として生長し、培養物を希釈し、
たとえば、１：１０に希釈することにより通過を行う。
細胞はそれぞれ１４．６時間、１０．７時間および９．
２時間の倍加時間を有し、ＲＰＭＩ−ＦＣＳ培地（下を
参照）中で生長し、各々の２〜３日の間隔の養分供給を
必要とし、ＲＦ−ＨＢｓ−１について２〜３日、Ｉにつ
いて３〜４日、そしてＩＩについて２〜３日の間隔の継
代培養を必要とする。

ハイブリッドマ細胞系ＲＦ−ＨＢｓ−１、ＩおよびＩＩ
の各々は、抗体を分泌し、そして連続培養において少な
くとも３カ月間抗体を分泌し続ける。

したがって、また、本発明はＲＦ−ＨＢｓ−１と表示す
るハイブリッドマ細胞系を提供し、それらは肝炎Ｂ表面
抗原に対する単クローン性抗体を分泌し、細胞系は好ま
しくは他の細胞物質を含まない、実質的に純粋な形態で
存在し、そして、さらに、本発明は、この細胞系と、前
記細胞系を維持できる栄養培地とを含有する組成物を提
供する。ＲＦ−ＨＢｓ−１、ＩおよびＩＩに適当な培地
は炭素源、窒素源、必要に応じて、ビタミン類および／
または無機塩類を含有し、このような培地の一例は胎児
の子牛血清を補充したＲＰＭＩ−１６４０、たとえば、
ＲＰＭＩ−ＦＣＳ（下を参照）である。

ハイブリッドマ細胞系ＲＴ−ＨＢｓ−１の製造におい
て、Ｂａｌｂ／ｃマウスを、最終抗原濃度０．７ｍｇ／
ｍｌにおいて、完全フロイントのアジュバント（ＣＦ
Ａ）で１：１に希釈した精製ＨＢｓの０．２ｍｌの腹腔
内注射により免疫する。（使用したＨＢｓ抗原（サブタ
イプａｄｗ）はＨＢｓ抗原陽性血清から、塩化セシウム
密度勾配遠心分離により精製した）。４週間後、マウス
をＨＢｓ抗原／ＣＦＡ混合物の０．２ｍｌをさらに注射
して増強した。６週間後、固相放射免疫により測定し
て、ＨＢｓ抗原に対する抗体の最高の力価を与えたマウ
スを、ＣＦＡ中のＨＢｓ抗原の０．２ｍｌ Ｉ．Ｐ．注
射でさらに増強し、この最後の増強後５日で殺し、脾を
切除した。

脾を、１０％Ｖ／Ｖの胎児子牛血清、２ミリモルとグル
タミンおよび各１００ＩＵのペニシリンおよびストレプ
トマイシンを補充したＲＰＭＩ−１６４０培地（ＲＰＭ
Ｉ−ＦＣＳ）中で３７℃、ｐＨ７．２および２ｇ／の
重炭酸ナトリウム濃度において、細片にくだき、そして
生ずる懸濁液を滅菌した１０ｍｌの注射器に数回おだや
かに出し入れした。単一細胞懸濁液を未分離の数個の残
留塊りからデカントし、そして細胞を血清不含ＲＰＭＩ
−１６４０中で２回洗い、１５００ｇで５分間遠心分離
した。洗浄した細胞ペレットをＲＰＭＩ−１６４０中に
再懸濁した。

マウスの骨髄腫の半合流培養物Ｐ_３−ＮＳ１／１−Ａｇ
４−１（すなわち、１０％Ｖ／Ｖの胎児子牛血清、２ミ
リモルのグルタミン、１００ＩＵのペニシリン、１００
μｇのストレプトマイシンおよび２×１０^-5モルの８−
チオグアニンを補充し、重炭酸塩／ＣＯ_２で緩衝化した
ＲＰＭＩ−１６４０培地中で３７℃において連続培養状
態に維持した、生長の活性段階の細胞の培養物）を、そ
れらの培養容器から、おだやかなトリプシン処理により
分離し、そして４００ｇの遠心分離により血清不含ＲＰ
ＭＩ−１６４０中で２回洗浄した。洗浄した細胞をＲＰ
ＭＩ−１６４０中に再懸濁し、デカンテーションした。

交雑を行うために、全脾細胞固体群を骨髄腫細胞と、丸
底の滅菌した１０ｍｌの遠心分離器の管中で、１０対１
の脾細胞対骨髄腫細胞の比で、混合し、１５００ｇの遠
心分離により共ペレット化した。上澄液を除去後、ＲＰ
ＭＩ−１６４０中のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）
１５００の４０％（Ｗ／Ｗ）の３７℃に予備加温した溶
液の１ｍｌを細胞ペレットに加え、細胞とおだやかに混
合した。細胞−ＰＥＧ混合物を３７℃で正確に７分間保
温し、次いでＰＥＧ溶液を、ＰＥＧ濃度が０．５％（Ｗ
／Ｗ）以下になるまで、等体積のＲＰＭＩ−１６４０の
反復添加により、徐々に希釈して細胞を分離した。この
懸濁液を１５００ｇで遠心分離し、細胞ペレットをおだ
やかに再懸濁し、血清不含ＲＰＭＩ−１６４０中で２回
洗浄し、１０００ｇで再懸濁した。洗浄した細胞ペレッ
トを１ｍｌのＲＰＭＩ−ＦＣＳ中におだやかに再懸濁
し、３７℃で２時間インキュベートし、次いで細胞をＲ
ＰＭＩ−ＦＣＳ中１×１０^６細胞／ｍｌで、２４×２ｍ
ｌの多数のウェルをもつ組織培養平板中に分配し、３７
℃で５％ＣＯ_２／９５％空気雰囲気中で培養した。

融合後２４時間において、各フラスコ中の培地の半分を
ＨＡＴ培地（１×１０^-4モルのハイポキサンチン、４×
１０^-7モルのアミノプテリンおよび１．６×１０^-5モル
のサイミジンを補充したＲＰＭＩ−ＦＣＳ）で置換し
た。これらの培養物を、新鮮なＨＡＴ培地で、このよう
に、最初の３日間毎日、その後２〜３日の間隔で、補充
してＨＡＴ培地中で生長する能力もつ雑種細胞を確実に
選択した。

ＨＡＴ培地をＨＴ培地（ＲＰＭＩ−ＦＣＳ＋ハイポキサ
ンチンおよびサイミジン）で段階的に置換し、これは融
合後第４０日において開始し、次いで融合後第５２日に
おいてＲＰＭＩ−ＦＣＳ中の生長に適合した。

雑種培養からの上澄液を、ウェルが１００個の細胞より
多い生長を示すとすぐに、ＨＢｓ抗原に対する抗体につ
いて評価した。ただ１つの培養ウェルが抗体産生細胞を
含有したが、他の培養ウェルは事実生きているハイブリ
ッド細胞を含有していなかった。

次いで、この１つの培養ウェルからの抗体産生雑種細胞
を、免疫しないＢａｌｂ／ｃマウスからの脾細胞の供給
（ｆｅｅｄｅｒ）層上へもとの培養物を限界希釈し、Ｒ
ＰＭＩ−ＦＣＳ中の９６×０．２ｍｌの複合皿中で雑種
を生長させることによって、まずクローン発生させた。
生長はクローン発生計画の開始時にハイブリッド細胞を
含有することが確認された１６のウェルにおいて行わ
れ、そしてこれらから細胞系ＲＦ−ＨＢｓ−１を、ＨＢ
ｓ抗原に対する単クローン抗体を分泌する安定なハイブ
リッド細胞系を提供するものとして、選択した。この細
胞のクローンを引き続いて２回再クローン発生を行い、
その結果１００％の抗体産生クローンが得られた。

Ｉと表わされるハイブリッドマ細胞系の製造において、
生まれてから６週間の雄のＢａｌｂ／ｃマウスを、アフ
イニテイ精製ＨＢｓＡｇ（サブタイプａｙ）で、完全フ
ロイントのアジュバント（ＣＦＡ：０．２ｍｌ／マウ
ス）中の２０μｇのＨＢｓＡｇの腹腔内注射により、免
疫した。２週間後、ＣＦＡ中の５μｇのＨＢｓＡｇの
Ｉ．Ｐ．注射をさらに行ってマウスを増強し、血清抗Ｈ
ＢｓＡｇの最高の力価を与えるマウスを、さらに２週間
後生理的食塩水中の５μｇのＨＢｓＡｇのＩ．Ｐ．注射
により増強した。最後の増強後３日おいて、マウスを殺
し、脾を切除した。この時間において、マウスは１：１
０００の血清抗ＨＢｓ−Ａｇ力価を有した。（すべての
抗ＨＢｓＡｇ測定値を“ＡＵＳＡＢ”比−免疫測定（ア
ボット・ラボラトリーズ）により決定し、そしてこの規
格における抗体力の価を最大結合の５０％を与える希釈
として与える）。

免疫したマウスからの脾細胞を、ＲＰＭＩ−ＦＣＳ中で
３７℃、ｐＨ７．２および２．０ｇ／の重炭酸ナトリ
ウム濃度において解離した。全脾細胞固体群を血清不含
培地（ＲＰＭＩ−１６４０）で２回洗い、Ｐ３−ＮＳ１
／１−Ａｇ４−１マウス骨髄腫細胞と１０：１（脾細
胞：骨髄腫細胞）の比で混合し、ペレットにし、ＲＰＭ
Ｉ−１６４０中の４０％（Ｗ／Ｗ）ポリエチレングリコ
ール（ＰＥＧ）１５００の１ｍｌ中に懸濁した。７分間
の保温後、ＰＥＧを細胞からＲＰＭＩ−１６４０の徐々
の添加によりおだやかに希釈した。細胞懸濁液をＲＰＭ
Ｉ−１６４０中で１回洗い、１５００ｇで遠心分離し、
次いで３ｍｌのＲＰＭＩ−ＦＣＳ中で２時間保温し、次
いで細胞を２×１０^６細胞／ウェルで２ｍｌの培養ウェ
ル中にプレート（ｐｌａｔｅ）した。すべての作業は３
７℃で実施した。

細胞を３７℃でＲＰＭＩ−ＦＣＳ中で５％ＣＯ_２／９５
％空気雰囲気で一夜培養し、次いで各培養ウェル中の培
地の半分をＨＡＴ培地で置換した。培養物を新鮮なＨＡ
Ｔ培地と共に供給するが、この方法において、最初の３
日間１日の間隔で、次いで２〜３日の間隔で供給して、
ＨＡＴ感作骨髄腫細胞からハイブリッド細胞を選択し
た。融合後ほぼ３週間で、ハイブリッド細胞をＲＰＭＩ
−ＦＣＳ培地へ導入した。

はじめプレートした１６８のウェルのうちで、１４８は
ハイブリッド細胞を生長させ、それらのうちで４つは抗
ＨＢｓＡｇ活性の生成を示した。これらの４つのうち
で、融合後２０日で現われた１つのハイブリッド培養物
はＨＢｓＡｇに対する抗体を算出しつづけた。この細胞
系を３回クローン発生させ、生ずる抗体分泌クローンの
１つはＩと表示する細胞系でる。

ＩＩと表わされるハイブリッドマ細胞系の製造におい
て、生まれてから６週間の雄のＢａｌｂ／ｃマウスを、
アフイニテイ精製ＨＢｓＡｇ（サブタイプａｄ）で、完
全フロイントのアジュバント（ＣＦＡ；０．２ｍｌ／マ
ウス）中の２０μｇＨＢｓ−Ａｇの腹腔内注射により免
疫した。３週間後、マウスをＣＦＡ中の５μｇのＨＢｓ
Ａｇの追加のＩ．Ｐ．腹腔内注射により増強し、血清抗
ＨＢｓＡｇの最高の力価を与えたマウスをさらに１０日
間後生理的食塩水中の５μｇのＨＢｓＡｇのＩ．Ｐ．注
射により増強した。最後増強後５日において、マウスを
殺し、脾臓を切除した。この時間において、マウスは
１：７０００の血清抗ＨＢｓＡｇ力価を有した。

次いで、手順は免疫マウスからの脾細胞の解離から、交
雑細胞の２×１０^６細胞／ウェルにおける２ｍｌの培養
ウェル中への３７℃におけるプレイテイング（ｐｌａｔ
ｉｎｇ）まで、ハイブリッドマ細胞系ＲＦ−ＨＢｓ−２
の製造において用いた手順と同一であった。また、培養
および選択の条件はその手順と同一であり、そして初め
プレートした１４４のウェルのうちで、１２９個がハイ
ブリッド細胞を生長させ、それらのうち５つは抗ＨＢｓ
Ａｇ活性を生成した。これらの５つのうちで、融合後１
５日で現われた１つのハイブリッド培養物はＨＢｓＡｇ
に対する抗体を生成した。この細胞系は３回クローン発
生させ、生ずる抗体分泌クローンの１つがＩＩと表示す
る細胞系である。

本発明のもう一つの態様は、ハイブリッドマ細胞系ＲＦ
−ＨＢｓ−１の細胞を栄養培地中で培養することからな
る、前記細胞系の増殖法にある。また、この増殖法は、
培地から分離できる本発明の抗体を製造する１つの手段
を表わす。本発明の細胞ならびに細胞系ＩおよびＩＩの
ための適当な栄養培地は炭素源、窒素源、必要に応じ
て、ビタミン類および／または無機塩類を含有し、たと
えば、胎児子牛血清を、たとえば、培地に基づいて約１
０重量％の量で補充した、ＲＰＭＩ−１６４０である。
前述のＲＰＭＩ−ＦＣＳはとくに適する。細胞を生長さ
せるとき、適当な初期濃度はＲＦ−ＨＢｓ−１について
１×１０^５細胞／ｍｌ、細胞系Ｉについて１×１０^５細
胞／ｍｌ、そして細胞系ＩＩについて２×１０^５細胞／
ｍｌである。これらの濃度は、望ましくは、それぞれ１
×１０^６細胞／ｍｌ、２×１０^６細胞／ｍｌおよび３×
１０^６細胞／ｍｌを超えてはならない。

本発明の細胞系を栄養培地中で培養することに加えて、
本発明の細胞系または細胞系ＩもしくはＩＩをマウス中
に移植して腹水腫瘍を定着させることもできる。これ
は、一般に、たとえば、４×１０^５〜１×１０^６細胞／
マウスをプリスタン（２，６，１０、１４−テトラメチ
ルペンタデカンで初回抗原刺激を受けた（ｐｒｉｍｅ
ｄ）Ｂａ１ｂ／ｃマウスに腹腔内注射することによって
実施する。また、腹水腫瘍の定着は、プリスタンの初回
抗原刺激を受けないマウスにおいても達成することがで
き、この場合、ＲＦ−ＨＢｓ−１細胞を増殖するとき、
１×１０^６〜２×１０^６細胞／マウスを注射すべきであ
るが、細胞系ＩおよびＩＩについての細胞／マウスの最
小値は４〜５×１０^５である。また、細胞系は皮下注射
により固形腫瘍として生長させることができる。

次いで、ハイブリッドマにより分泌された単クローン性
抗体は、腹水症の流体またはマウスの血清から回収する
ことができ、そして細胞系を増殖しかつ抗体を製造する
この方法は本発明のさらなる態様を表わす。単クローン
性抗体を得るこの手段は、抗体の収量が、たとえば、細
胞の塊状培養から得られる収量よりも１０倍程度に多く
あることができるという利点を提供する。マウス中で細
胞を生長させるのに通常約２〜３週間を要する。

本発明の抗体は、前述のような源から精製しないで使用
できるが、好ましくは使用前に精製する。たとえば、ア
フイニテイクロマトグラフィーにおいて使用するセフア
ロースへ結合すべき抗体は一般に硫酸アンモニウム沈殿
により精製するが、ヨード化すべき抗体またはビオチン
接合すべき抗体は一般に蛋白質Ａ精製を行う。

本発明のハイブリッドマ細胞は、たとえば、２０％のＦ
ＣＳを含有するＦＣＳ補充ＲＰＭＩ−１６４０培地中
に、たとえば、５×１０^６細胞／ｍｌ以上において、凍
害防御物質として１０％のジメチルスルホキシドを用い
て、液体窒素中で凍結することにより貯蔵できる。凍結
速度は好ましくは＋４０℃〜−１００℃の間で１〜２℃
／分に制御し、そして凍結した細胞は液体窒素の冷蔵庫
内で−１００℃以下、たとえば、−１７０℃で貯蔵でき
る。

細胞系ＲＦ−ＨＢｓ−１により産生される単一特異性抗
体は、肺炎Ｂウイルスに感染された患者の精確なスクリ
ーニング試験を提供することにおいて、とくに価値があ
る。これらの抗体は、細胞物質または血清の中のＨＢｓ
Ａｇの存在を検出するとき、たとえば、免疫蛍光顕微鏡
法または免疫電子顕微鏡法を用いる、測定系において使
用できる。定量的測定は固相放射測定法により実施する
ことができ、そしてＲＦ−ＨＢｓ−１抗体はＨＢｓＡｇ
分子上に比較的高い頻度で表われる抗原エピトープ（ｅ
ｐｉｔｏｐｅ）を認識するので、これに関して有用であ
る。しかしながら、本発明によるとくに有用な固相放射
測定系は単クローン性抗体とＲＦ−ＨＢｓ−１との組み
合わせを用いる。

ＨＢｓ−Ａｇを認識する他の抗体は、ＨＢｓ−Ａｇ上に
低い頻度で存在するエピトープに対して高い親和性をも
ち、一緒に固相として、後の実施例において説明するよ
うに、ＨＢｓ−Ａｇを検出する放射測定法に、ＲＦ−Ｈ
Ｂｓ−１抗体と組み合わせて、使用できる。ＩおよびＩ
Ｉ抗体からなる固相はＨＢｓＡｇの一工程放射測定法に
応用できる（下の実施例７はこれらの２種々の抗体がそ
れらの間ですべてのＨＢｓ−Ａｇ分子をいかにして認識
するかを明らかにする）が、この固相にＲＦ−ＨＢｓ−
１抗体を加えると、それは二工程測定法において使用す
るとき保護物質として作用する。なぜなら、ＲＦ−ＨＢ
ｓ−１抗体は、他の２つの単クローン抗体よりもＨＢｓ
Ａｇに対して親和性が低いが、それ自体すべてのＨＢｓ
Ａｇ分子を認識し、こうして抗原の固相への定着を確実
するからである。これらの単クローン性抗体を用いる固
相放射測定系において、ＲＦ−ＨＢｓ−１抗体はすべて
のＨＢｓＡｇ分子を認識するばかりでなく、また分子上
に高い頻度で存在するＨＢｓＡｇのエピトープを認識す
るという事実のため、測定において他の２つの抗体より
も高い計数値を、単独で、あるいは組み合わせて、与え
るので、放射標識したトレーサーとして使用することが
好ましい。放射測定においてすべての３種の単クローン
性抗体を使用するときの支持は、競争結合の研究（下の
実施例４参照）により提供され、これらの研究はＩまた
はＩＩ抗体のいずれもがＲＦ−ＨＢｓ−１抗体のＨＢｓ
Ａｇへの結合を妨害しないことを証明している。

こうして、本発明による好ましい診断法は、ヒトまたは
動物から採取した血清試料を、二工程において固相の形
態でＲＦ−ＨＢｓ−１抗体ならびに抗体ＩおよびＩＩと
一緒にインキュベートし、固相を洗浄し、そしてそれを
トレーサーとして放射標識したＲＦ−ＨＢｓ−１抗体と
ともにインキュベートするか、あるいは一工程測定にお
いて固相の形態で抗体ＩおよびＩＩ、およびトレーサー
として放射標識ＲＦ−ＨＢｓ−１抗体とともにインキュ
ベートすることからなる。これらの測定系の各々におい
て、固相は好ましくは抗体を被覆したプラスチックまた
はガラスの支持体からなる。この支持体は、たとえば、
ポリスチレンの、ビーズ、棒または管の形であることが
とくに好ましい。また、本発明は、これらの被覆した支
持体、たとえば、ビーズを提供し、さらに、ＲＦ−ＨＢ
ｓ−１抗体ならびに抗体ＩおよびＩＩで被覆したまたは
抗体ＩおよびＩＩで被覆したプラスチックまたはガラス
の支持体、たとえば、ビーズ、棒または管を含有する第
１容器と、放射標識物質を結合したＲＦ−ＨＢｓ−１抗
体を含有する第２容器とからなる診断キットを提供す
る。（これらの測定系において、ＲＦ−ＨＢｓ−１抗体
を２つの単クローン性抗体ＩおよびＩＩと一緒に使用す
る代わりに、ＲＦ−ＨＢｓ−１抗体を、ＨＢｓ−Ａｇを
認識する１種または２種以上の他の単クローン性抗体と
一緒に使用できる。） 本発明による別の測定法は、放射標識物質を使用する代
わりに、一般にＲＦ−ＨＢｓ−１抗体に結合する、たと
えば、酵素標識物質またはビオチン標識物質を用いるこ
とがきる。さらに、ＨＢｓ−Ａｇに対する赤血球凝集測
定に、本発明のＲＦ−ＨＢｓ−１抗体を使用できる。

また、固相、たとえば、臭化シアノゲン活性化セフアロ
ース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）４Ｂ（ＣｎＢｒ−Ｓ４Ｂ；
スウエーデン国ウツプサラ所在の、フアーマシア・フア
イン・ケミカルズ）へ結合した本発明の単クローン性抗
体を、ワクチンの製造に使用するために精製された形態
でＨＢｓ−Ａｇを製造する目的で、あるいは患者に与え
るべき物質からＨＢｓ−Ａｇを除去する目的で、ＨＢｓ
−Ａｇを、たとえば、ヒトまたは動物の物質から除去す
るために使用できる。こうして、また、本発明は、生物
学的試料をＲＦ−ＨＢｓ−１抗体と固相において接触さ
せて抗原を抗体に結合させ、引き続いて所望の精製され
た物質を固相から分離することからなる、生物学的試料
から肝炎Ｂ表面抗原を単離する方法を提供する。

また、本発明のＲＦ−ＨＢｓ−１の抗体は、抗体を患者
へ直接に投与する抗ウイルス剤としての臨床的応用にお
いて、価値がある。単クローン性抗体は肝炎Ｂウイルス
を担持する患者の処置において役立ち、そして細胞上の
受容体部位へのウイルスの結合を阻止することによりウ
イルスの感染性を中和することができ、またウイルスの
食作用および細胞内消化を促進することができる。潜在
的には、高度免疫ガンマグロブリンのための基質とし
て、これに関連して、これらの単クローン性抗体を使用
すると、従来の血清を用いる場合における、大量の非特
異性免疫グロブリンと少量の特異性抗体の生成を、回避
することができる。ＲＦ−ＨＢｓ−１抗体は、ＨＢＶ担
体における耐性を、ＨＢｓ−Ａｇへの結合およびそれを
より免疫原性とすることにより、破壊する作用をするこ
ともできる。

こうして、本発明のもう一つの態様は、本発明のＲＦ−
ＨＢｓ−１単クローン性抗体と、製薬学的に許容しうる
不活性担体または希釈剤とからなる製薬学的組成物であ
る。治療的および／または予防的使用のため、この組成
物は固体または液体の形態であることができ、そして常
法により非経口的または経口的に投与できる。こうし
て、この組成物は、注射可能な溶液あるいは錠剤、カプ
セル剤、溶液または懸濁液の形態であることができる。

単クローン性細胞系ＲＦ−ＨＢｓ−１は、Ｃ．Ｎ．Ｃ．
Ｍ（Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅ
Ｃｕｌｔｕｒｅ ｄｅ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ
ｓ、パリ市パスツール研究所）に、それぞれ、１９８０
年３月２６日寄託され、受記番号１−１１７が付され
た。

本発明を、次の実施例によりさらに説明する。

実施例１ 細胞系ＲＦ−ＨＢｓ−１の試験管内培養 ＲＦ−ＨＢｓ−１細胞を、５〜２０％（Ｖ／Ｖ）の胎児
子牛血清を補充したＲＰＭＩ−１６４０培地に、１×１
０^５細胞／ｍｌで接種した。細胞の生長速度はすべての
培地において本質的に同一であった（１４．６時間±
２．５の倍加時間）が、生長時間は１５％および２０％
の胎児子牛血清において長くした。

１×１０^５細胞／ｍｌの接種密度は最適な生長に対して
好ましいが、これより低い密度を用いることができ、そ
の場合生長時間は長くなる。二次培養は２〜３日ごとに
行うべきである。

実施例２ 細胞系の生体内培養 ２Ａ：ＲＦ−ＨＢｓ−１ 生まれてから６週間のＢａｌｂ／ｃマウスの２０匹に、
０．５ｍｌのプリスタン（２，６，１０，１４−テトラ
メチル−ペンタデカン）の腹腔内注射により第１日目と
第７日目に初回抗原刺激を与えた。第１４日目におい
て、各マウスに１×１０^６の生きている雑種腫ＲＦ−Ｈ
Ｂｓ−１細胞を腹腔内に移植した。移植後１０日におい
て、すべてのマウスは多量腫瘍生長の微候を示した。こ
れらを殺し、腹水症の流体を１９ゲージの針で集めた。
腹水症の流体を２０００ｇで遠心分離し、ＲＦ−ＨＢｓ
−１抗体を含有する透明な上澄液を集め、−２０℃で貯
蔵した。

２Ｂ：細胞系Ｉ Ｂａｌｂ／ｃマウスに、Ｉ型の細胞の移植前に、１週間
で２回の０．５ｍｌのプリスタンの腹腔内注射により、
初回抗原刺激を与えた。次いで、各マウスに４×１０^５
の生きているＩ型の細胞を移植し、腹水腫瘍を生成させ
た。２０〜２５日後、マウスが腹水流体の最大収量を生
じたとき、マウスを殺し、腹水流体はほぼ２０ｍｇ／ｍ
ｌの蛋白質を含有し、それらのうち１５０μｇ／ｍｌは
純粋な抗体Ｉであることがわかった。

２Ｃ：細胞系ＩＩ Ｂａｌｂ／ｃマウスに、ＩＩ型の細胞の移植前に、１週
間で２回の０．５ｍｌのプリスタンの腹腔内注射によ
り、初回抗原刺激を与えた。次いで、各マウスに５×１
０^５の生きているＩＩ型の細胞を移植し、腹水腫瘍を生
成させた。１５〜２０日後、マウスが腹水流体の最大の
収量を与え、この流体は１８０μｇ／ｍｌの抗体ＩＩを
含有することがわかった。

実施例３ ポリスチレンビーズのＲＦ−ＨＢｓ−１単ク
ローン性抗体ならびに単クローン性抗体ＩおよびＩＩに
よる被覆 ポリスチレンビーズを単クローン性抗体で、腹水流体の
形態において、種々の希釈度でｐＨ９．６の重炭酸塩緩
衝液（０．０１５モルのＮａ_２ＣＯ_３：０．０３５モル
のＮａＨＣＯ_３）中で、攪拌しながら２０℃において１
時間保温し、次いで同じ抗体−緩衝液混合物中で４℃に
おいて１６時間保温することにより、被覆した。次いで
ビーズを洗浄し、室温において、２００μの¹²⁵Ｉ−
ＨＢｓ−Ａｇ（アボット・ラボラトリーズ）ととに４時
間保温して、最適の被覆条件を決定した（下表１参
照）。

この実施例において使用した被覆緩衝液のｐＨは９．６
が最適であることがわかった。さらに、ビーズをＲＦ−
ＨＢｓ−１を含有する単クローン性抗体の組み合わせで
被覆するとき、抗体を通常ビーズへ一緒に加える。なぜ
なら、ビーズへ単クローン抗体を順番に加えると改良が
得られないからである。

ビーズを、抗体でいったん被覆すると、蒸留水で３回洗
い、吸収パッド上で遠心分離により乾燥できる。これら
のビーズは−２０℃において少なくとも３カ月間安定で
ある。

実施例４ ＨＢｓ−Ａｇの認識 細胞系ＲＦ−ＨＢｓ−１により産生された単クローン性
抗体は、ＨＢｓＡｇのａｄおよびａｙサブタイプに対し
て共通であり、かつ次の競争結合の研究により証明され
るように、抗体ＩおよびＩＩが認識するＨＢｓＡｇのエ
ピトープと異なる、エピトープを認識する。

混合したサブタイプのＨＢｓＡｇ（ＡＵＳＡＢ：アボッ
ト・ラボラトリーズ）で被覆したポリスチレンビーズ
を、５０μｇ／ｍｌの蛋白質Ａ精製したＲＦ−ＨＢｓ−
１抗体または抗体ＩもしくはＩＩと一緒に、あるいは等
しい力価のＨＢｓＡｇに対するウマの抗血清と一緒に、
室温で一夜インキュベートし、次いで実施例５における
ようにヨウ素化した（１０００，０００ｃｐｍ）¹²⁵Ｉ
−ＲＦ−ＨＢｓ−１または¹²⁵Ｉで標識された抗体Ｉと
一緒に、室温でさらに４時間インキュベートした。結果
を下表２に記載する。

これらの結果が示すように、ＲＦ−ＨＢｓ−１抗体およ
び抗体Ｉの抗体はそれら自体の結合を抑制するが、他の
抗体による結合の抑制は存在しない。他方において、ウ
マの抗血清は、事実、ＲＦ−ＨＢｓ−１抗体の結合を抑
制した。

実施例５ 放射測定法における細胞系抗体の使用 ＲＦ−ＨＢｓ−１抗体を、ＰｒｏｗｓｅおよびＪｅｎｋ
ｉｎ（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｓｔｒｙ １５、４２９−
４３６、１９７８）の方法に従い、プロテインＡ−セフ
アロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）カラム（フアーマシア
・フアイン・ケミカルス・スウエーデン国アップサラ）
からのｐＨ５．５における溶離により、ＲＦ−ＨＢｓ−
１細胞系を移植したマウスからの腹水流体から精製し
た。このようにして精製したＲＦ−ＨＢｓ−１抗体の５
μｇを、１５μの合計反応体積の２．５μｇのクロラ
ミン（Ｃｈｌｏｒａｍｉｎｅ）Ｔを用い、４℃で３０秒
間保温して、¹²⁵対抗体の等モル比を得ることによっ
て、０．５ｍＣｉの¹²⁵Ｉでヨウ素化した。（抗体Ｉお
よびＩＩを同様にして精製し、ヨウ素化した。） ＲＦ−ＨＢｓ−１抗体または抗体ＩもしくはＩＩまたは
これらの単クローン性抗体で被覆したポリスチレンビー
ズ、あるいはＡｕｓｒｉａ ＩＩビーズを、２００μ
のＨＢｓＡｇ−ｖｅヒト血清と一緒に、あるいは２０ｎ
ｇ／ｍｌのＨＢｓＡｇを含有する２００μのヒト血清
と一緒に、４５℃で２時間保温し、洗浄し、そして¹²⁵
Ｉ−ＲＦ−ＨＢｓ−１、¹²⁵Ｉ−抗体Ｉまたは¹²⁵Ｉ−抗
体ＩＩ（ほぼ１００，１００ｃｐｍ／測定）と一緒に４
５℃においてさらに１時間インキュベートし、洗浄し、
計数した。結果を、ｃｐｍ（少なくとも２つの試料の平
均）として、あるいはＨＢｓＡｇ＋Ｖｅ試料およびＨＢ
ｓＡｇ−ｖｅ試料（＋／−）を用いて得られた計数値の
間の比として、表わす。

この表が示すように、最高の＋／−比、それゆえ最高の
感度の測定値は、すべての３種類の単クローン性抗体を
固相において使用し、トレーサーとして¹²⁵Ｉ−ＲＦ−
ＨＢｓ−１抗体を使用したとき、得られた。

実施例６ ＨＢｓＡｇの検知の限界 ＲＦ−ＨＢｓ−１抗体もしくは抗体ＩもしくはＩＩ、あ
るいはそれらの抗体の組み合わせで、最適濃度で被覆し
たポリスチレンビーズを、２００μのＨＢｓＡｇ−ｖ
ｅヒト血清または既知量のＨＢｓＡｇを含有する２００
μのヒト血清と一緒に４５℃で２時間インキュベート
し、洗浄し、２００μの¹²⁵Ｉ−ＲＦ−ＨＢｓ−１
（２００，０００ｃｐｍ／測定）と一緒に４５℃でさら
に１時間インキュベートした。

結果を下表４に記載する。また、この表４に、ＡＵＳＲ
ＩＡ ＩＩ ＲＩＡを用いる同様な滴定値のＨＢｓＡｇ
の結果を記載する。結果はｃｐｍ（少なくとも２回の実
験の平均）または＋／−比として表わす。

実施例７ ＨＢｓＡｇ陽性試料の検出 ＡＵＳＲＩＡ ＩＩ ＲＩＡまたはヘパテスト（Ｈｅｐ
ａｔｅｓｔ）（２５３＋ｖｅ；４７−ｖｅ）によりＨＢ
ｓＡｇ＋ｖｅまたはＨＢｓＡｇ−ｖｅであることが示さ
れた。３００のヒトの血清の試料の２００μのアリコ
ートを、抗体ＩまたはＩＩの単クローン抗体で、あるい
はＲＦ−ＨＢｓ−１抗体ならびに抗体ＩおよびＩＩの単
クローン抗体の混合物で被覆したポリスチレンビーズと
一緒に、４５℃で２時間インキュベートした。洗浄後、
ビーズを¹²⁵Ｉ−ＲＦ−ＨＢｓ−１（２００，０００ｐ
ｍｃ／測定）と一緒に４５℃でさらに１時間インキュベ
ートし、洗浄し、計数した。

下表５に示すように、２５３のＨＢｓ−Ａｇ陽性の試料
のうちで、２１９は抗体Ｉで陽性であったが、３４は陰
性であった。しかしながら、ＨＢｓＡｇ陽性であるが、
抗体Ｉと非反応性であることが示された３４試料のすべ
ては、固相として抗体ＩＩを用いて測定したとき、陽性
の値を与えた。同様に、試験した２５３のＨＢｓＡｇ＋
ｖｅ試料のうちで、１０は固相として単独で使用した抗
体ＩＩで検出されなかったが、これらの１０の試料のす
べては、固相として抗体Ｉを用いて測定したとき、陽性
の値を与えた。

実施例８ ＨＢｓＡｇについての２工程放射測定 ＲＦ−ＨＢｓ−１抗体ならびに抗体ＩおよびＩで被覆し
たポリスチレンビーズを、５５μｇ／ｍｌでＨＢｓＡｇ
を含有する２００μのヒト血清と一緒に、あるいは２
００μのＨＢｓＡｇ−ｖｅヒト血清と一緒に、２０
℃、３７℃または４５℃において種々な時間インキュベ
ートした。これらのビーズを洗浄し、そして¹²⁵Ｉ−Ｒ
Ｆ−ＨＢｓ−１トレーサーと一緒に２０℃、３７または
４５℃において追加の時間インキュベートし、洗浄し、
計数した。

ＨＢｓＡｇについての２工程ＲＦ−ＨＢｓ単クローン抗
体の測定についての好適なインキュベーション時間は、
こうして次のとおりである。

単クローン性抗体被覆ビーズを用いる血清の第１インキ
ュベーション： 室温において４時間または 室温において１６時間 ＲＦ−ＨＢｓ−１トレーサーを用いる洗浄ビーズの第２
インキュベーション： 室温において２時間 実施例９ ＨＢｓＡｇについての一工程放射測定法 抗体ＩおよびＩＩ［腹水流体（ａｓｃｉｔｉｃｆｌｕｉ
ｄ）の１：２００希釈］で被覆したポリスチレンビーズ
を、２００μのＨＢｓＡｇ−ｖｅヒト血清または２０
ｎｇ／ｍｌのＨＢｓＡｇおよび１０μの¹²⁵Ｉ−ＲＦ
−ＨＢｓ−１（１００，０００ｃｐｍ／測定）と一緒
に、２０℃で種々な時間インキュベートし、洗浄し、計
数した。結果をｃｐｍ（２回の別々の実験の平均）とし
て、ありはＨＢｓＡｇ＋ｖｅおよびＨＢｓＡｇ−ｖｅの
試料を用いて得られた計数値の間の比として、表わす。

この実施例におけるようにビーズ、試料およびトレーサ
ーと一緒にインキュベートすると、ビーズと試料を予備
インキュベートした場合よりもすぐれた結果が得られ、
そしてこれらの結果はトレーサーと試料を予備インキュ
ベートした場合得られる結果とほとんど異ならない。

この一工程の測定は、抗体が単クローンであり、従来の
抗血清に似ず、抗原性結合部位について完全ではないの
で、可能であり、そして二工程の測定法よりも作業の数
が少ないので、ＨＢｓ−Ａｇについて非常に急速なスク
リーニング法を要する場合、たとえば、輸血センターお
よび血液製品研究所において、使用するのに魅力的な系
である。この測定は２時間以内で実施することができ、
感度の明らかな損失はない。

実施例１０ ＨＢｓＡｇのアフイニテイクロマトグラフィーにおける
ＲＦ−ＨＢｓ−１抗体の使用 ＲＦ−ＨＢｓ−１抗体、とくに硫酸アンモニウム沈殿に
より腹水流体から精製したこの抗体を、製造業者の示唆
に従いＣｎＢｒ−Ｓ４Ｂ（スウエーデン国アツプサラ所
在のフアーマシア・フアイン・ケミカルズ社）へ結合し
た。ＨＢｓＡｇを含有する１００ｍｌのヒト血清をこの
カラムに下向きに通し、この血清からＨＢｓＡｇの９
８．７％を除去した。さらに、除去された抗原の１００
％は３モルのＫＩを用いてカラムから溶離できる。この
抗原はマウスおよびウサギにおいて免疫原性であり、そ
して全血清についてのウサギの抗血清に対する免疫電気
泳動法により、他のヒト血清汚染物質を除去できること
が示された。

実施例１１ 細胞物質中のＨＢｓＡｇの局在化におけるＲＦ−ＨＢｓ
−１抗体の使用 ＲＦ−ＨＢｓ−１細胞の培養物からの上澄液中のＲＦ−
ＨＢｓ−１抗体を用いて、ＨＢＶ含有ヒトまたはチンパ
ンジーからの肝バイオプシーの凍結部分中、あるいはウ
イルスを含有する細胞中のＨＢｓＡｇを同定した。抗原
−抗体複合体を、蛍光分子へ結合したマウスの免疫グロ
ブリンに対するヤギの抗血清で可視化した。さらに、プ
ロテインＡ精製ＲＦ−ＨＢｓ−１抗体をビオチンへ接合
した。この接合は、１ｍｌのｐＨ８．３の重炭酸塩−生
理的食塩水緩衝液（０．１モルのＮａＨＣＯ_３：０．５
モルのＮａＣｌ）中の１ｍｇのＲＦ−ＨＢｓ−１抗体を
１ｍｇ／ｍｌでＤＭＳＯ中に溶けた９０μｇのビオチン
スクシンイミドと一緒に２０℃で４時間インキュベート
することによって、行った。４℃でリン酸塩緩衝生理的
食塩水に対して一夜透析した後、ＲＦ−ＨＢｓ−１抗体
−ビオチン接合体を、アビジン−フルオロクローム（ａ
ｖｉｄｉｎ−ｆｌｕｏｒｏｃｈｒｏｍｅ）またはアビジ
ン−フエリチン（ａｖｉｄｉｎ−ｆｅｒｒｉｔｉｎ）と
組み合わせて使用して、ＨＢｓＡｇをそれぞれ免疫蛍光
顕微鏡法および免疫電子顕微鏡法により可視化した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 ジヨ−ジ・ジヤノシイ イギリス国ミドルセツクス・ハロウ・トウ イフオ−ドロ−ド24 (72)発明者 ホワ−ド・クリストフア−・トマス イギリス国ロンドン・エヌダブリユ−11オ −クウツドロ−ド103 (56)参考文献 特開 昭56−73029（ＪＰ，Ａ)

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】パスツール研究所に受託番号ＣＮＣＭ−Ｉ
   −１１７として寄託されているハイブリッドマ細胞系Ｒ
   Ｆ−ＨＢｓ−１により分泌される肝炎Ｂ表面抗原に対す
   る単クローン性抗体。
2. 【請求項２】パスツール研究所に受託番号ＣＮＣＭ−Ｉ
   −１１７として寄託されているハイブリッドマ細胞系Ｒ
   Ｆ−ＨＢｓ−１を培養し、そして産生される抗体を回収
   することを特徴とする肝炎Ｂ表面抗原に対する単クロー
   ン性抗体の製造方法。
3. 【請求項３】パスツール研究所に受託番号ＣＮＣＭ−Ｉ
   −１１７として寄託されているハイブリッドマ細胞系Ｒ
   Ｆ−ＨＢｓ−１により分泌される肝炎Ｂ表面抗原に対す
   る単クローン性抗体と担体または希釈剤とからなること
   を特徴とする肝炎Ｂを診断または治癒するための組成
   物。
4. 【請求項４】パスツール研究所に受託番号ＣＮＣＭ−Ｉ
   −１１７として寄託されているハイブリッドマ細胞系Ｒ
   Ｆ−ＨＢｓ−１により分泌される単クローン性抗体を、
   免疫蛍光顕微鏡法、免疫電子顕微鏡法、固相放射測定検
   定系または酵素連鎖免疫検定法において利用することを
   特徴とする生物学的試料中の肝炎Ｂ表面抗原の存在を診
   断する方法。
5. 【請求項５】前記ハイブリッドマ細胞系ＲＦ−ＨＢｓ−
   １により分泌される単クローン性抗体とＲＦ−ＨＢｓ−
   Ａｇを認識する他の単クローン性抗体の１種またはそれ
   以上を、ヒトまたは動物から採取した血清試料と固相中
   でインキュベートし、前記固相を洗浄し、そしてそれを
   トレサーとして放射標識または酵素標識した前記細胞系
   ＲＦ−ＨＢｓ−１により分泌される単クローン性抗体と
   インキュベートすることを特徴とする特許請求の範囲第
   ４項記載の方法。
6. 【請求項６】前記ハイブリッドマ細胞系ＲＦ−ＨＢｓ−
   １により分泌される単クローン性抗体以外のＨＢｓ−Ａ
   ｇを認識する抗体とトレサーとして、放射標識または酵
   素標識した前記ＲＦ−ＨＢｓ−１により分泌される単ク
   ローン性抗体を、ヒトまたは動物から採取した血清試料
   と固相中で、中間の洗浄工程を用いないでインキュベー
   トすることを特徴とする特許請求の範囲第４項記載の方
   法。