JPH02276599A - 乾式分析要素の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は血液（全血、血漿、血清）、リンパ液のような
生物体液中のアルカリ性ホスファターゼ（Ａ　ＬＰ）の
活性を定量するのに有用な乾式分析要素の製造方法に関
する。

［従来の技術］ Ｐ−ニトロフェニルホスフェート（ｐ−ＮＰ）の塩が、
アルカリ性ホスファターゼに対する基質として知られて
いる。ジナトリウム塩は乾燥状態における安定性がよく
ないことは１９６５年頃すでによく知られていた。また
、ある種のアミン塩、例えばトリス（ヒドロキシメチル
）アミノメタン塩、ジシクロヘキシルアンモニウム塩は
比較的安定な試薬であることが、特公昭４５−３４８７
２号で知られている。

同公報に具体例として記載されているアミンは上記のほ
か、メチルアミン、エチルアミン、ジプロピルアミン、
トリブチルアミン、シクロヘキシルアミン、ジシクロヘ
キシルアミン、トリシクロヘギシルアミン、モノエタノ
ールアミン、ベンジルアミン、ジメチルアミン、トリチ
ルアミン、フルフリルアミン、アニリン、ジェタノール
アミン、モルホリンである。そしてこれらのｐ−ＮＰア
ミン塩が水に容易に溶解し得ることが記載されている。

しかし、これらのｐ−ＮＰの水溶性塩は、特公昭５３−
２１６７７（米国特許３９９２１５８）や特開昭５５−
１６４３５６（米国特許４２９２２７２）に記載の乾式
一体型多層分析要素に水溶液として適用して含浸させた
場合に安定性が良くない。このことは特開昭６０−２３
９７９９明細書にも指摘されている所である。

保存安定性のよいアルカリ性ホスファターゼ定量用乾式
分析要素の実現が望まれており、その目的で、特開昭６
０−２３９７９９では基質を溶液に溶解せず微粒子状に
して塗布ｉαに分散させて分析要素に含浸させる方法を
提案している。しかし乾燥状態あるいは貧溶媒中で基質
を機械的に分散するこの方法では再現性のよい結果を得
ることが容易でない、すなわち、この方法で得られた分
析要素は、高い分析精度を得ることが難しい。

また特開昭６２−２６５９９５には、ｐ−ニトロフェニ
ルホスフェート（ｐ−ＮＰＰ）のアミン塩又はアミノア
ルコール塩を、良溶媒（例えば水、メタノール）の溶液
とし、貧溶媒（例えばアセトン）と混合して析出させ、
液相と固相（ｐ−ＮＰＰの塩）を分離し、分離した固相
を溶解または分散して、液体展開層などのような液体透
過性層の塗布または浸漬組成物として用いる、アルカリ
性ホスファターゼ定量用乾式分析要素の製造方法が示さ
れている。それによると析出した固相を液相から分離す
るには、周知の方法を用いることができ重力沈降、遠心
沈降、慣性衝突、濾過のいずれの方法も用いることがで
きるが、重力沈降、遠心沈降、又は濾過が簡便であり、
濾過には、加圧濾過又は減圧濾過も用いることができる
。

しかし、析出した固相を液相から分離する工程は、いず
れの方法も手間がかかり、かつ、常に一定の収率な維持
するのが難しいので、再現性の悪化とコスト高を招く。

製造のための作業上履も簡易な方法は、基質であるｐ−
ＮＰＰの塩を良溶媒溶液のまま液体展開層などのような
液体透過性層の塗布または浸漬組成物として用いること
であるが、この方法で製造した乾式多層分析要素の保存
時の安定性が著しく悪いことよく知られた事実である。

そこで、作業コストが安く、収率が一定で、かつ、分析
要素の保存安定性が良い製造方法が望まれた。

本発明者は、検討の結果、ｐ−二トロフェニルホスフェ
ートのアミン塩又アミノアルコール塩をその良溶媒の溶
液とし、良溶媒の溶液と貧溶媒とを混合する際に、流れ
の線速度が２ｍ／分から３０＋ｗ／分の範囲の貧溶媒の
乱流に前記良溶媒の溶液を直径５０μｍから５．０ｍｍ
の範囲の円形断面のノズルを通して加えることにより、
製造されるアルカリ性ホスファターゼ定量用乾式分析要
素の保存時の安定性が著しく改善される事を見出して本
発明に到達した。

［発明の目的］ 本発明の目的は、保存安定性が良く、分析精度が高く、
シかも製造のための作業コストが安いアルカリ性ホスフ
ァターゼ定量用乾式分析要素を製造する方法の提供にあ
る。

［発明の構成コ 前３己の目的は、 ｐ−ニトロフェニル”ホスフェートのアミン塩又アミノ
アルコール塩をその良溶媒（例えば水、メタノール）に
溶解して溶液となし、 前記良溶媒溶液を貧溶媒（例えばアセトン）と混合して
前記の塩を固相として析出させ、 析出した同相を貧溶媒に分散して分散液となし、前記の
塩を液体透過性層に含浸させるために前記分散液を液体
透過性層に塗布し乾燥させる工程を含む液体透過性層を
有するアルカリ性ホスファターゼ定量用乾式分析要素の
製造方法において、前記良溶媒の溶液を貧溶媒と混合す
る工程が流れの線速度が２ａ／分から３０ｍ／分の範囲
の貧溶媒の乱流に前記良溶媒の溶液を直径５０μｍから
５．０關の範囲の円形の開口に相当する開口断面積の流
出開口を通して加えることを特徴とするアルカリ性ホス
ファターゼ定量用乾式分析要素の製造方法、によって達
成された。

［発明の構成の詳細な説明］ 前記の方法によって製造された乾式分析要素は、保存安
定性が良く、分析精度が高く、製造のための作業コスト
が相対的に安い。

本発明の方法で製造されるアルカリ性ホスファターゼ（
ＡＬＰ）定量用乾式分析要素においては、ρ−ニトロフ
ェニルホスフェートのアミン塩又アミノアルコール塩が
ＡＬＰの基質であるので、ＡＬＰの触媒作用によって加
水分解されて燐酸塩とｐ−二トロフェノールとが生成す
る。生成したρ−二トロフェノールはアルカリ性領域で
波長４０５ｎｍに吸収ピークを有するので、この吸収ピ
ーク近傍の波長の光で比色定量することができる。

ρ−ＮＰＰのアミン塩又はアミノアルコール塩としては
、例えば前記の特公昭４５−３４８７２に記載されてい
るトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、２−アミ
ノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール
、ジシクロヘキシルアミン、メチルアミン、エチルアミ
ン、ジプロピルアミン、トリブチルアミン、シクロヘキ
シルアミン、ジシクロヘキシルアミン、トリシクロヘキ
シルアミン、モノエタノールアミン、ベンジルアミン、
ジメチルアミン、トリチルアミン、フルフリルアミン、
アニリン、ジェタノールアミン、モルホリン等の塩があ
る。これらの塩は、水溶性である。またアルコール、特
にメタノールに可溶な塩は、２・アミノ−２−メチルプ
ロパン−１，３−ジオール塩及び２−アミノ−２−エチ
ルプロパン−１，３−ジオール塩である。これらの塩の
いずれかを、良溶媒の適当な濃度の溶液とする。

上記の塩の良溶媒は種類が少ないので、貧溶媒としては
広範囲のものが用いられる。良溶媒の例として水、メタ
ノール、エタノールがある。貧溶媒の例としてアセトン
、メチルエチルケトン、シクロヘキサン、ベンゼン、ト
ルエン等の有機溶媒がある。

貧溶媒は、塩溶液に塩が析出するに充分な量を加える。

貧溶媒の量は、重量比で、良溶媒の量の約１１ＩＯ以下
、好ましくは約１／１００から約１／１０の範囲である
。

流れの線速度が約２ｍ／分から約３０ｍ／分の範囲の貧
溶媒の乱流の作り方として、約帆５ｋｇ／ｃｍ２から約
５．０ｋｇ／ｃｔａ２の圧力をかけることができる耐圧
型のギアポンプ、シリンダ型ポンプ、ロータリーポンプ
、プランジャポンプ等のポンプで貧溶媒を細管中に送り
こみ、目的とする流速を得る方法、中に適当な邪魔板を
設けた細管の中に前記と同様にして貧溶媒を送りこみ、
目的とする流速を得る方法、貧溶媒を適当な容器に入れ
、貧溶媒の中に円盤状又は羽根状の撹拌用装置を入れ、
この撹拌用装置を約２千「１ｍから約５万ｒｐｍの回転
数で回転させて、目的とする流速を得る方法等がある。

ｐ−ＮＰＰ塩の良溶媒溶液を加える直径的５０μ−から
約５．０ｍ＋１相当の開口（開口の有効断面積約２００
０μＩＩ＋２から約２０ａ＋ｍ２）の流出開口（ノズル
）としては、種々のものを用いることができる。ノズル
の例として、ポリマー（ポリテトラフルオロエチレン、
硬化シリコーンゴム等）製のノズル又はチューブ、ステ
ンレス製のノズル又はチューブがある。ノズルの流出開
口は、ｌ固でもよくまた複数個でもよい。ノズルの流出
開口の断面の形状は一般的には円形又は楕円形であるが
、各頂点く隅）の丸い四角形、六角形等の多角形であっ
てもよい。

貧溶媒中では析出した微少な結晶が互いに凝集し、タル
ト状の沈澱を作りやすいので、貧溶媒中に界面活性剤（
−船釣に、ノニオン界面活性剤が好ましい）を含ませて
おくか、貧溶媒中に少量の良溶媒か弱溶媒を加えるのが
好ましい。あるいは、凝集した結晶をたがいに分けられ
るような分散装置を併用することも好ましい。

本発明の方法においては、前記のようにして調製された
ｐ−ＮＰＰ塩の良溶媒−貧溶媒混合溶媒分散液は公知の
方法により乾式分析要素の液体透過性１（例、多孔性展
開層）に塗布又は流延し、乾燥させてその層にρ−ＮＰ
Ｐ塩を含有させる。なお、ｐ−ＮＰＰ塩の分散液を液体
透過性層に塗布又は流延の後、露点１５℃以下、乾球温
度３５℃以上の風を吹き付けて乾燥することも本発明の
好ましいｌ実施態様例である。

液体展開層は織物布地、編物布地又はセルロース不織布
から成る多孔性展開層であることが好ましい、しかし、
プラッシュポリマーや粒状構造物から成る多孔性展開層
であってもよい。

本発明の製造方法は公知の多種の乾式分析要素に適用す
ることができる。特に自己顕色性基質と被検液のいずれ
をも透過し得る固体担体を含む分析要素に適用すること
ができる。分析要素は光透過性（又は透明）・液体不透
過性の支持体の上に、多孔性液体展開層のほかに下塗り
層、吸水層、接着層、反応試薬層、光遮蔽層、濾過層、
及び公知のその他の層を有する多層構造であってもよい
、かような分析要素として、米国特許３９９２１５８、
米国特許４０４２３３５及び特開昭５５−１６４３５６
（米国特許４２７２２９２）各明細書に記載の七のがあ
る。

支持体を用いる場合、本発明で製造される乾式分析要素
の実用的に採りうる構成は （１）支持体上に液体展開層を有するもの。

（２）支持体上に試薬層、液体展間層をこの順に有する
もの。この場合ｐ−ＮＰＰの塩は試薬層、液体展開層い
ずれに含まれてもよいが、ｉα体展開層に含まれるのが
好ましい。試薬層は２以上の試薬層からなってもよい。

（３）支持体上に試薬層、光遮蔽層、液体展開層をこの
順に有するもの。この場合のｐ−ＮＰＰ塩は試薬層、光
遮蔽層、液体展開層いずれに含まれてもよいが、イα体
展開層に含まれるのが好ましい。

（４）支持体上に検出層、光遮蔽層、液体展開層をこの
順に有するもの。ｐ−ＮＰＰの塩は光遮蔽層、液体展開
層いずれに含まれてもよいが、液体展開層に含まれるの
が好ましい。

（５）支持体上に検出層、光遮蔽層、試薬層、液体展開
層をこの順に有するもの。ｐ−ＮＰＰの塩は試薬層、光
遮蔽層、液体展開層いずれに含まれてもよいが、液体展
開層に含まれるのが好ましい。

（６）支持体上に検出層、第二試薬層、光遮蔽層、第一
試薬層、液体展開層をこの順に有するもの。ρ−ＮＰＰ
の塩は試薬層のいずれか、光遮蔽層、液体展開層いずれ
に含まれてもよいが、液体展間層に含まれるのが好まし
い。

上記（１）ないしく６）において検出層と試薬層もしく
は液体展開層の間、試薬層と液体展間層の間、光遮蔽層
と検出層、試薬層もしくは液体展間層の間、又は二つの
試薬層の間に、濾過層を設けてもよい。

支持体と検出層、試薬層又は液体展間層の間に吸水層を
有してもよい。また、支持体と検出層、試薬層もしくは
）α体展開層の間、試薬層と液体展開層の間、光遮蔽層
と検出層、試薬層もしくは液体展開層の間、又は二つの
試薬層の間にｐＨ緩衝層あるいは硬膜層等を設けてもよ
い０本発明の製造方法に好ましいのは上記（１）（２）
又は（３）の層構成である。

本発明の方法により製造される乾式分析要素において９
−ＮＰＰの塩は二つ以上の層（例えば試薬層と液体展間
層、あるいは第二試薬層と第一試薬層、第一試薬層と液
体展間層）に含有されてもよい、この場合に、ｐ−ＮＰ
Ｐの塩を支持体から遠い層か支持体に近い層のいずれか
に、他方より多く含有させることもできる。

本発明の方法で製造される乾式分析要素に用いることが
できる光透過性・水不透過性支持体の例としては、ポリ
エチレンテレフタレート、ビスフノールへのポリカルボ
ネート、ポリスチレン、セルロースエステル（例、セル
ローストリアセテート、セルロースアセテートプロピオ
ネート等）等のポリマーからなる厚さ約５０μ−から約
１０００μ讃、好ましくは約８０μｍから約３００μ■
の範囲のフィルム又はシート状の透明支持体がある。こ
れら支持体の表面には必要により下塗層を設けて、支持
体の上に設番すられる吸水層、試薬層等の層と支持体と
の接着を強固なものにすることができる。また、下塗層
のかわりに、支持体の表面に物理的活性化処理（例えは
グロー放電、コロナ放電）又は化学的活性化処理（例え
ばアルカリエツチング）を施して接着力の向上を図るこ
とができる。

本発明の方法でで製造される乾式多層分析要素には、光
透過性・水不透過性支持体の上に（場合によっては下塗
層等の他の層を介して）吸水層を設けることができろ。

乾式分析要素に備えられる吸水層は、親水性結合剤より
なり、水を吸収して膨潤する親水性ポリマーを層形成成
分とする層であることが好ましい。

吸水層に用いることがてきろ親水性ポリマーは、一般に
は水吸収時の膨潤率が３０℃で約１．５から２０、好ま
しくは約２．５から１５の範囲の天然又は合成親水性ポ
リマーである。そのような親水性ポリマーの例としては
、ゼラチン（例、アルカリ処理ゼラチン、酸処理ゼラチ
ン、脱イオンゼラチン等）、ゼラチン誘導体（例、フタ
ル化ゼラチン等〉、アガロース、プルラン、プルラン誘
導体、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、ポ
リビニルピロリドン等をあげることができる。

吸水層の乾燥時の厚さは約１μｍから約！００μｍ、好
ましくは約３μ慣から約３０μｍの範囲である。さらに
吸水層には、必要に応じて界面活性剤（カチオン性、両
性、又は、非イオン性）や緩衝剤を含有させることもで
きる０本発明の方法で製造される乾式分析要素の吸水層
には、光遮蔽性（反射性又は吸収性）微粒子を、必要に
応じて含有させることができる。

吸水層、試薬層、場合によっては光遮蔽層、濾過層等の
層の上には、多孔性展間層を接着し積層するための接着
層を設けてもよい、接着層は水で湿潤しているとき、又
は水を含んで膨潤したときに多孔性展間層を接着するこ
とができるような親水性ポリマーからなることが好まし
い、接着層に用いることができる親水性ポリマーの例と
しては、吸水層に用いられると同様な親水性ポリマーが
ある。これらのうちではゼラチン、ゼラチン誘導体、ポ
リアクリルアミド等が好ましい、接着層の乾燥膜厚は一
般に約０．５μ−から約２０　ｕｍ　ｓ好ましくは約１
μｍから約ｌＯμＩの範囲である。なお、接着層は展間
層以外の他の眉間の接着力を向上させるため、所望の層
上に設けてもよい。接着層は親水性ポリマーと、必要に
よって加えられる界面活性剤（カチオン性、両性、又は
、非イオン性）等を含む水溶液を公知の方法で、吸水層
等の上に塗布する方法などにより設けることができる。

本発明の方法で製造される乾式分析要素の試薬層に含有
させることができるｐＨ緩衝剤の例としては、炭酸塩、
硼酸酸塩、燐酸塩やＧｏｏｄのｐ）ｆｌｉｔ衝剤などの
公知の緩衝剤がある。これらの緩衝剤は？蛋白質・酵素
の基礎実験法」（堀尾武−１他著、南江堂、１９８１年
）等の公知文献を参考にして選択し、使用することがで
きる。

光遮蔽層は、皮膜形成能を有する親水性ポリマーをバイ
ンダーとして、光反射性微粒子が分散されている水浸透
性の層であることが好ましい。光反射性微粒子は、検出
層に生じた検出可能な変化（色変化、発色等）を光透過
性を有する支持体側から反射測光する際に、展開層に点
着供給された水性液体の色、特に試料が全血である場合
のヘモグロビンの赤色等を遮蔽するとともに光反射層又
は背景層としても機能する。

光反射性を有する微粒子の例としては、顔料微粒子、例
えば二酸化チタン微粒子（ルチル型、アナターゼ型又は
ブルツカイト型の、粒子径が約０．１μｍから約１．２
μｍの微結晶粒子等）、硫酸バリウム微粒子や、アルミ
ニウム微粒子等がある。これらのうちでは二酸化チタン
微粒子、硫酸バリウム微粒子が好ましい。特に好ましい
のは、ルチル型二酸化チタン微粒子である。

皮膜形成能を有する親水性ポリマーバインダーの例とし
ては、前述の吸水層又は検出層に用いられる親水性ポリ
マーのほかに弱親水性の再生セルロース、セルロースア
セテート等がある。これらのうちではゼラチン、ゼラチ
ン誘導体、ポリアクリルアミド等が好ましい。なお、ゼ
ラチン、ゼラチン誘導体には公知の硬膜剤を添加するこ
とができる。

光遮蔽層は、光反射性微粒子と親水性ポリマーとの水性
分散液を公知の方法により検出層、試薬層等の上に塗布
し乾燥することにより設けることができる。

乾式分析要素において、必要に応じ展開層中にも上記の
ような光反射性微粒子を含有させることもできる。

液体展開層は、ｉα体計量作用を有する展開層であるこ
とが好ましい。液体計量作用とは、展開層の表面に点着
供給された液体試料を、その中に含有している成分を実
質的に偏在さすることなく、横（水平）方向に単位面積
当りほぼ一定量の割合で広げる作用である。

展開層のマトリックスを構成する材料としては、濾紙、
不織布、織物布地（例、ブロード、ボブリン等の平織物
布地）、編物布地（例、トリコツ１Ｔ物布地、ダブルト
リコット編物布地、ミラニーズ絹物布地）、ガラス繊維
濾紙、プラッシュポリマー（メンブランフィルタ−）、
又はポリマーミクロビーズ等からなる三次元格子状構造
物等を用いることができる。

これらのうちでは、織物布地及び編物布地に代表される
繊維質層を用いることが好ましい。これらの詳細につい
ては特開昭５５−１６４３５６、特開昭５７−６６３５
９及び特開昭６０−２２２７６９を参照すればよい。

本発明の方法で製造される乾式分析要素に用いることが
できる織物布地又は編物布地は水洗等の脱脂処理により
糸、織物あるいは編物の製造時に付着した油脂類が実質
的に除去されていることが好ましい。

本発明の方法で製造される乾式多層分析要素は、−通約
１５ｎ＋ｍから約３０１１Ｉａｌの正方形又はほぼ同サ
イズ円形等の小片に裁断し、特開昭５７−６３４５２、
特開昭５４−１５６０７９、実開昭５８−１２５４２４
、実開昭５８−３２３５０及び特表昭５８−５０１１４
４各公報等に開示のスライド枠等に納めて分析スライド
として用いるのが製造、包装、輸送、保存及び測定操作
等の全ての観点で好ましい。

本発明の方法で製造される乾式分析要素は、約５μＬか
ら約３０μＬ５好ましくは約８μＬから約１５μＬの水
性液体試料（血液（全血、血漿、血清）、リンパ液等）
を展開層に点着供給し、必要に応じて約２０℃から約４
５℃の範囲の実質的に一定の温度でインキュベーション
しつつ、一方の側から（一体型多層分析要素においては
光透過性支持体側から）乾式分析要素内の色変化、発色
等の検出可能な変化の速度を反射測光し比色法の原理に
より液体試料中の測定対象成分（アナライト）であるア
ルカリ性ホスファターゼの活性値を分析する。

回エエ回 ［実施例１］ ■ｐ−ニトロフェニルホスフェート・ビス（トリス）塩
の再結晶化と分散 ｐ−ニトロフェニルホスフェート・ビス［トリス（ヒド
ロキシメチル）アミンコ塩１５ｇをｔｓｇの蒸留水に完
全に溶解させた。ついでこの水溶液をノニルフェノキシ
ポリエトキシエタノール（オキシエチレン単位平均４０
含有）５ｇを含むアセトン７５０ｇに下記の方法で加え
てｐ−ニトロフェニルホスフェートの塩の分散液を調製
した。

ノズル：孔径３００μｍＸ５００μｍの楕円形のポリテ
トラフルオロエチレン製のチューブ （日本クロマト工業（株）製ＬＣＰ−１１５）撹拌機：
高さ７ｍｎ＋の台形の羽根４枚が固定された直径１８ｍ
ｍの円盤が円筒状のハウジングに収められている撹拌機 （特殊機化工業（株）製ＡｔＪＴＯＨＯＭＯＭＩＸＥＲ
ＭＯＤＥＬ　Ｍ　５ＰＥＣＡ　） 円盤の羽根がない側に、円盤から３ｍｍの位置に、円盤
と直角に円盤に向って、前記のチューブ（ノズル）先端
を固定した 条　件：前記撹拌機の中にアセトン（貧溶媒）を溝たし
、円盤を約１万ｒｐｍて回転させながらシリンダー型ポ
ンプで３ｍＬ／分の流速で前記ノズル先端からρ−ニト
ロフェニルホスフェートの塩の水溶液（良溶媒溶液）を
添加し、分散液を調製した ■分析要素の製作（その１） 透明ポリエチレンテレフタレート支持体く厚さ１８０μ
ｍ）の表面を親水化処理し、その処理表面上に下記の被
覆量になるようにして緩衝剤層塗布水溶液を塗布し乾燥
して緩衝層を形成した。

緩衝剤層の被覆量 アルカリ処理脱イオンゼラチン　　　　８．４８／ｍ２
ノニルフエノキシボリグリシドール　８５０ｍ３／ｍ２
ポリ［Ｎ・［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−アク
リルアミド］（平均分子量約１０万）　８．９ｇ／ｍ２
Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）エチレンジアミン−Ｎ、
Ｎ’、Ｎ’−三酢酸　　　　　　　　　１４０ｍｇ／ｍ
２Ｚｎ（ＣＨ３ＣＯＯ）　・２Ｈ２０４０ｍｇ／ｍ２Ｍ
ｇＳＯ４φ７Ｈ２０９０ｇ／ｍ２ ５Ｎ−ＮａＯＨ水溶液　　　　　　　　　　　　２．１
ｚ／ｍ２上記緩衝層の上に下記の被覆量になるようにし
て硬化ゼラチン層塗布水溶液を塗布し乾燥して硬化セラ
チン層を形成した。

硬化ゼラチン層の被覆量 脱イオンゼラチン　　　　　　　　　　２．７８／ｍ２
ノニルフエノキシボリグリシドール　３０ｍｇ／ｍ２１
．２−ヒス（ビニルスルホニルアセトアミド）エタン１
６０ｍｇ／ｍ２ 上記硬化ゼラチンの上に下記の被覆量になるようにして
接着層塗布水溶液を塗布し乾燥して接着層を形成した。

脱イオンゼラチン　　　　　　　　　　　２．７ｚ／ｍ
２ノニルフエノキシボリグリシドール　　３０ｍｇ／ｍ
２接着層の表面に０．４％ノニルフェノキシポリグリシ
ドール水溶液をほぼ一様に塗゛布し、次に５００ポリエ
チレンテレフタレート紡績糸を３６ゲージで編んだトリ
コット編物布地を軽く圧力を加えつつ接着させて展開層
を形成した。

■分析要素の製作（その２） 前記の展開層に、■の工程で再結晶化したｐ・ニトロフ
ェニルホスフェート・ビス（トリス）塩の水−アセトン
分散液を用い、下記の組成の塗布液を調製した。この塗
布液を１２０ｍＬ／ｍ２の被覆量になるようにして塗布
し、露点θ℃、乾球温度４０℃の風（空気流）の乾燥ゾ
ーンの中を通過させて乾燥した。

塗布液組成 ■で調製したｐ−ニトロフェニルホスフェート・ビス（
トリス）塩の水−アセトン分散液　　７９０ｇポリビニ
ルピロリドン（平均分子ｆｆ１ｌＯ万）　　１５０ｇエ
タノール　　　　　　　　　　　　　　　６００ｇ以上
の方法により、本発明のＡＬＰ活性測定用一体型多層分
析要素を作成した。

［比較例１コ 実施例１において、■の工程をを下記■の工程に変更し
たほかは、実施例１と同様にして、ＡＬＰ活性測定用一
体型多層分析要素を調製した。

■ｐ−ニトロフェニルホスフェート・ビス（トリス）塩
の再結晶化 ｐ−ニトロフェニルホスフェート・ビス［トリス（ヒド
ロキシメチル）アミン］塩２０．７ｇを２５ｇの蒸留水
に完全に溶解させた。この水溶液にアセトン７５０ｇを
よく攪拌しながら加えた。約５分経過したら沈澱物を吸
引濾過し、エタノールで数回洗浄した。さらにアセトン
で洗浄して吸引乾燥した。得られた固形物質を、７５０
ｇのアセトン中に投入しガラス捧で攪拌して分散した。

［比較例２コ 実施例１において、■の工程で展開層に塗布する塗布液
の組成を下記■の水溶液（良溶媒溶液）に変更したほか
は、実施例１と同様にして、ＡＬＰ活性測定用多層分析
要素を調製した。

′■塗布水溶Ｔαの組成 ρ−ニトロフェニルホスフェート・ビス（トリス）塩５
ｇ ポリビニルピロリドン（平均分子ｊｌｌＯ万）　　１５
０ｇ水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　１８８０ｇ［性能評価試験］　［試験ｌ］ 実施例１及び比較例１．２において製作したＡＬＰ活性
測定用多層分析要素の保存時の安定性を見積もるため、
製作直後および減圧乾燥後４５℃で７日保存した後の波
長４００ｎｎ＋における要素の反射光学濃度値を積分球
型分光光度計で測定した。得られた結果を第１表に示す
。

第　　１　　表 ［試験２コ 実施例１及び比較例１．２において製作したＡＬＰ活性
測定用多層分析要素の保存時の安定性を見積るために、
これらの展開層に富士写真フィルム株式会社製のドライ
ケムキャリプレータしレベル１０μＬを点着し、３７℃
でインクベーション開始後２分と３分の波長４００ｎａ
＋における要素の反射光学濃度値を積分球型分光光度計
で測定した０次に予めｐ−ニトロフェノールの水溶液で
作成した反射光学濃度値から透過光学濃度値に変換する
変換式により、測定された反射光学濃度値を透過光学濃
度に変換した・。インクベーション間始後２分と３分の
透過光学濃度値の差から予め作成した透過光学濃度値−
ＡＬＰ活性単位検量線よりＡＬＰ活性単位を求め、得ら
れた活性単位の値を比較することで発色性能を評価した
。得られた結果を第２表に示す。

第　　２　　表 第１表及び第２表のデータより、本発明の簡略化された
方法で製造された実施例１の多層分析要素は、従来技術
である簡略化されていない方法で製造された比較例１の
多層分析要素と同程度の良好な保存安定性を持っている
ことが判明した。

方、ｐ−二トロフェニルホスフエート・ビス（トリス）
塩含有水溶液（良溶媒溶液）を展開層に塗布し乾燥して
製造された比較例２の多層分析要素は、本発明の方法又
は従来技術に従って製造された多層分析要素に比べて保
存安定性がきわめて悪いことが判明した。

［試験３コ 実施例１及び比較例１の展開層に塗布する塗布液中に分
散されたｐ−ニトロフェニルホスフェート・ビス（トリ
ス）塩の粒子サイズを光学顕微鏡で観測した。観測結果
を第３表に示す。

第　　３　　表 ［試験４］ 実施例１及び比較例１の展開層に塗布する塗布ン夜をそ
れぞれ５０ｍＬのメスシリンダーに５０ｍＬ目盛まで入
れて１時間静置し、液中に分散されたｐ−ニトロフェニ
ルホスフェート・ビス（トリス）塩の微粒子の沈降状況
を観察した。得られた結果を第４表に示す。

第　　４　　表 第３表及び第４表の観察結果から、本発明の方法で調製
されたｐ−ニトロフェニルホスフェート・ビス（トリス
）塩の微粒子分散液は極めて安定で、微粒子の沈降が極
めて生じにくいことが明らかである・

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）ｐ−ニトロフェニルホスフェートのアミン塩又ア
   ミノアルコール塩をその良溶媒に溶解して溶液となし、 前記良溶媒溶液を貧溶媒と混合して前記の塩を固相とし
   て析出させ、 析出した固相を貧溶媒に分散して分散液となし、前記の
   塩を液体透過性層に含浸させるために前記分散液を液体
   透過性層に塗布し乾燥させる工程を含む液体透過性層を
   有するアルカリ性ホスファターゼ定量用乾式分析要素の
   製造方法において、前記良溶媒の溶液を貧溶媒と混合す
   る工程が流れの線速度が２ｍ／分から３０ｍ／分の範囲
   の貧溶媒の乱流に前記良溶媒の溶液を直径５０μｍから
   ５．０ｍｍの範囲の円形の開口に相当する開口断面積の
   流出開口を通して加えることを特徴とするアルカリ性ホ
   スファターゼ定量用乾式分析要素の製造方法。