JPH02276960A - 電場反転型エレクトロブロッティングおよびエレクトロエリューション - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野］ この発明は、膜または塩溜に電場を介してＤＮＡ。

ＲＮＡまたはタンパク質を移動するための装置に関する
。

（従来の技術〕 米国特許第４，６２２，１２４号明細書は、ゲルから膜
のような受け器に電気泳動的に分離したＤＮＡ、ＲＮＡ
またはタンパク質を移動するのに使用される改良横型エ
レクトロブロック−を記載する。この膜は、分離結果を
保存するのにより適した記録媒体である。このエレクト
ロプロット法では、ゲルおよび膜が一対の電極間で緩衝
剤と接触し続けるように設置され、十■および−Ｖを有
する複数の電極を充電することにより直流がかけられて
いる。各電極に対する電荷の符号は、ゲルに隣接する電
極上の符号が移動されるためのＤＮＡ　、　ＲＮＡまた
はタンパク質の正味の符号と同一となるように選ばれる
。

この形式では、帯電したＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク
質が強制的に膜まで運ばれる。電極上の電荷を逆転する
目的の試みは全くなされていない。

この工程は、ＤＮＡ、　ＲＮＡまたはタンパク質の分子
量があまり大きくない限り非常に良好に作動する。

しかしながら、約２Ｘ１０’塩基対より大きい分子量に
対するこのダイレクトフィールドの取り組み方は、ゲル
から高分子物質を移動させるのに適さず、少なくとも合
理的な長さの時間内（１日未満）では移動しない。

エレクトロブロッティングを介する移動の外の関連する
移動法としてはエレクトロエリューションが挙げられ、
この方法では分離が仕分けされた記録のままにＤＮＡ、
ＲＮＡまたはタンパク質を維持することを必要としない
。その代わりとして、例えばＤＮＡは予め同定されてい
て、そしてそれが精製またはクローン化することができ
るように抽出されていることが必要である。この場合に
は、例えば米国特許第４．５７６．７０２号に記載され
るように、ＤＮＡがゲルから透析カップ膜または塩溜の
ような受け器に運ばれる。この場合には、受け器とゲル
の両者が２つの電極間にあり、そしてエレクトロブロッ
ティングについて概述したような２つの電極を充電する
ことにより直流が流れるように緩衝剤浴中に置かれる。

さらにまた、このエレクトロエリューション法は、移動
する分子量が約２×１０４塩基対未満である。場合にの
み有効に作動する。

化学的な溶離（エリューション）もまた試みられており
、この方法ではゲルが溶融され、次いでＤＮＡ　ＲＮＡ
またはタンパク質が水相−油相分離により１抽出される
。しかしながら、これはその処理で混合することが必須
な工程であり、そしてこの混合がＤＮＡ、ＲＮＡまたは
タンパク質を許容できない程ずれさせる剪断応力をもた
らすので満足できるものでないことが証明された。

〔発明が解決しようとする課題〕

従って、この発明の目的は適当な受け器により大きな分
子量のＤＮＡ、　ＲＮＡまたはタンパク質を効率よく移
動させることができるエレクトロブロッティングおよび
／またはエレクトロエリューション法ならびにそのため
の装置を提供するにある。

このように大きな分子量の物質は、電場の方向を変える
ように一対の電極により交互に電場を印加することで電
気泳動分離を目的とするゲル内で移動することができる
ことが見い出された。例えば、米国特許第４，７４０，
２８３号および同４，７３７，２５１号明細書に記載さ
れる方法が挙げられる。しかしながら、これらのいずれ
の特許もゲルの外への移動をもたらす手段としての電場
変化の使用を示唆しない。より具体的には、米国特許第
４，７４０，２８３号の残余部がゲルを通して大きな分
子量のものを動かすのに方向を互い違いにするように電
場をたとえ処理するとはいえ、エレクトロブロノにより
移動しようとする場合、その特許は既にエレクトロブロ
ッティングでまさに行われてきたように単一方向のみに
直流を流すことを示す（第５図）。

〔課題を解決するための手段〕

本発明の要点は、ゲル内で大きな分子のＤＮＡ、　ＲＮ
Ａおよびタンパク質を電気泳動的に分離するのに使用さ
れる方法であって、米国特許第４，７４０，２８３号の
教示するものと非類似のゲルから別の受け器に前記のよ
うな物質を電気的に移動させるのに効果がある。

より具体的には、本発明の−の態様に従えば本発明の目
的は、電気泳動ゲルからさらなる処理に通する受け器ま
たは膜に分離した核酸またはタンパク質を移動させる方
法によって達成される。この方法は、ａ）予め分離した
核酸またはタンパク質を有するゲルを適当な受け器が設
置された緩衝剤または膜と接触するように置く工程、ｂ
）ゲル緩衝剤−受け器の組み合わせ体または膜の両側に
２つの電極を位置付ける工程、ｃ）２つの電極の一つに
ＴＩ時間電荷＋Ｖｌを印加し、そして核酸またはタンパ
ク買上の正味の電荷と同一符号の電荷を有するゲルに接
近するもう一つの電極の電荷を−■１にする工程、ｄ）
時間Ｔ１と同一または相違する時間Ｔ２の間、１ｖ１１
およびｌＶ２ならびにＴ１およびＴ２がゲルから受け器
または膜まで分離した核酸もしくはタンパク質の正味の
移動を確実にする大きさに選ばれるように−Ｖ２値およ
び＋Ｖ２値でそれぞれ−の電極およびもう一つの電極上
に電荷を帯びさせる工程、ならびにｅ）前記移動が終了
するまで工程Ｃ）およびｄ）を繰り返す工程を含んでな
る。なお、記号は、変動しうる絶対値を意味する。この
方法は、エレクトロブロッティングとエレクロエリュー
ションの双方に有用である。

本発明のもう一つの態様によれば、本発明の目的は電気
泳動ゲルから受け器に分離した核酸またはタンパク質を
電気的に移動させる装置により達成される。この装置は
、ａ）核酸またはタンパク質が分離したゲルを保持する
手段およびこの核酸またはタンパク質相の受け器（前記
保持する手段は緩衝液を保持するのに適するタンクを含
んでいる）、ｂ）電極間にゲルと受け器が位置付けられ
るように保持する手段内に配列された一対の電極、Ｃ）
所定の電圧■１または■２が所定の時間電極のいずれか
をバイアスし、もう一つの電極がそれぞれ−■１またＮ
ｔ−ｖ２に同時に荷電されるための電圧源、ｄ）電極間
の電圧源を交互に切り替え、そして■１値または■２値
から電圧を選ぶためのスイッ手段、ならびにｅ）予め選
んだパターンに従ってスイッチ手段を制御するための制
御手段を含んでなる。

従って、電気的移動技法を使用する移動ができないと考
えられていた分子量のＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質
をそれぞれプロットまたはエリュートするようにエレク
トロブロッティング装置およびエレクトロエリューショ
ン装置を操作するための手段および方法が提供される。

このような手段を提供する好ましい装置は、米国特許第
４，６２２．１２４号明細書のエレクトロブロッティン
グ装置の語または米国特許第４，５７６．７０２号明細
書のエレクトロブロッティング装置の語で論じられてい
る。さらに、本発明は電気泳動媒体から膜までＤＮＡ、
　ＲＮＡまたはタンパク質を電気移動させることができ
る他の装置で有用である。

前述したように、好ましいエレクトロブロッティング装
置は米国特許第４．６２２．１２４号明細書に記載され
、またその第１図に示されている。それはゲルＧおよび
そのゲルと接触する状態で設置される膜Ｍを受容するた
めの保持タンク８、ならびに緩衝液を含んでなる。この
タンクは、対向する側壁１４　、１８および１６　、２
０、ヒンジ３４でレール３２に丁番付けされる底面壁２
４ならびに上面壁またはＭ１２を含んでなる。底面壁２
４はそれらの上に巻かれた電極２６を有し、この電極は
電気コネクター２８に接続する。ゲル−膜の組み合わせ
体の両側の電極は電極７０であり、スクリーンまたはプ
レート６６に固定される。この電極は順次コネクター７
２に接続する。そらせ板７６はゲル−膜の組み合わせ体
Ｇ−Ｍのための支持体上で気泡の蓄積を妨げる方に気泡
を向ける目的でゲル−膜の組み合わせ体間に位置付けら
れる。支持体４４は、支持体４３との間に前記組み合わ
せ体Ｃ−Ｍを挟んで支持体４３に固定する。

このエレクトロプロッターに利用できる緩衝剤は次のと
おりである。

工へ旦■底 ０．０４　　モル濃度のトリス−酢酸〔トリス（ヒドロ
キシメチル）アミノメタンアセテート〕０．００１モル
濃度のＥＤＴＡ　［エチレンジアミン四酢酸］ 残余　水 ｐ１１＝約８．０ これらの装置の残りの部材およびその使用は、米国特許
第４，６２２，１２４号明細書に記載されており、それ
らの詳細は引用することにより特に本明細書の内容とな
る。

また一方、いくつかのエレクトロプロッターではゲルお
よび膜が電極それ自体で一緒に保持され（示していない
）、緩衝剤タンクが省略されている。これは、ゲル中に
十分緩衝剤が残存するので電気移動法に必要な緩衝を供
給することが可能である。

米国特許第４，６２２．１２４号明細書に示される装置
と相違する点は、電場の交互の方向をエレクトロブロッ
ティングまたはエレクトロエリューションに印加する制
御回路部品が電場の反転を提供することである。すなわ
ち、電気泳動にのみ印加される電場反転を教示する米国
特許第４．７３７，２５１号明細書に記載される回路部
品が使用できるか、またはこの回路部品は米国特許第４
，７４０，２８３号明細書に記載されるものであること
ができる。商業上の使用におけるこのような回路部品の
態様の装置は、それぞれＤＮＡ　５ｔａｒにより販売さ
れ商品名ｒＤＮＡ　５ｔａｒＰｕｌｓｅ」またはベック
マン・インストルメント（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｉｎｓｔｒ
ｕｍｅｎｔｓ）製の商品名ｒＧｅｎｅｌｉｎｅＳｙｓ　
ｔｅｍＪの下で入手することができる。しかしながら、
電場の電圧および電流を供給する動力源は電気泳動用に
使用するものでなく、明らかな相違がある。

より具体的には、利用可能な回路部品は第２図で図式的
に示される。これは、接点Ｔ１およびＴ２でＳＷｌおよ
びＳＷ２の２つのソリッドステートのスイッチ要素の一
側面に接続される適当な電力源１１５を図示する。エレ
クトロブロッティングが行われる場合には、このような
電力源は１４０ボルトで０．５〜２．５アンペアの電流
を好ましくは生ずる。エレクトロエリューションが望ま
れる場合には、例えば電力源が２０〜３０ミリアンペア
で１００〜１５０ポルトを生ずるように選ばれる。第１
図のエレクトロプロッターは、第２図でデバイス１０と
して図式的に示されている。電極２６とそのコネクター
２８はスイッチＳＷＩとＳＷ４に配線され、これらは二
極、双投スイッチとして働＜（ＳＷＩは電力源１１５に
電極２６を接続するか、またはそのスイッチが入ったと
き計４はそれを接地用導体に接続する）。

同様に、電極７０とそのコネクター７２はスイッチＳＷ
２と舖３に配線され、二極、双投スイッチとしても働き
そしてＳＶＩおよびＳＷ４が開閉される場合に同時に作
動するように制御される。こうして図示した電極２６が
スイッチＳＷＩを介して電力源１１５に接続され十■の
電圧を供給する場合、スイッチＳＷ３および電極７０は
接地用導体に接続される。すべてのスイッチが同時に開
閉する場合、ＳＷ２が電極７０を電力源１１５に接続し
、同時にスイッチＳＷＩとＳＷ３が開きそしてスイッチ
舖４が電極２６を接地用導体に接続する。スイッチ制御
ロジック１１８はスイッチ計１〜ＳＷ４を作動させるの
に役立つ。この制御ロジックはタイミング制御ロジック
１１７により駆動され、市販のシーケンスタイマーまた
は演算レベルの信号を発生しうるプログラム可能な制御
器から構成することができる。通常の入力デバイス１１
６は使用者によるタイミング制御ロジック１１７のプロ
グラミングを可能にする。

回路部品の残部は常法により構成することができる。こ
のような回路部品は、ある時の電圧子Ｖもしくは−■が
極性が反転する前に徐々に変化（例えば、増大）するか
または＋Ｖ値もしくは−Ｖがそれぞれの時に「前方ｊ方
向もしくは「逆方」方向に印加されうる常用のランピン
グ手段を含むことができる。

このスイッチ制御ロジックは、矢印２００（第２図）の
方向に総体的な導電力を供給するように操作されねばな
らない。このことは、ＤＮＡ　、　ＲＮＡまたはタンパ
ク質をゲルから抜き出すのに最も好ましくなるように電
極２６または７０の一つに長時間＋Ｖを印加することで
行われる。殆どのＤＮＡおよびＲＮＡは正味が負の電荷
を有するので、前記は電力源１５に由来する＋Ｖは電極
７０上にそれがあるよりも長く電極２６上に存在する必
要があることを意味する。例えば、電圧は１２０秒間電
極２６に印加され、次いで電極７０にほんの４０秒間印
加されうる。

時々「電場反転（ｆｉｅｌｄ　１ｎｖｅｒｓｉｏｎ）　
」と称されるこの移動方式は、前述したところにより容
易に明らとなったであろう。受け器への正味の移動は、
予め印加された電極７０上の一電圧Ｖ１と等しい電ｉ７
０上に十電圧Ｖｌを保持させることにより達成すること
ができるが、−電圧が印加された時間よりも短い時間で
ある。または、−電圧は十電圧が電極７０に印加される
時間Ｔ１より短かいかもしくは同じ時間である時間Ｔ２
の間、十電圧ｖ１より小さい量を印加することができる
。またさらに、電極７０上の一電圧ｖ２は、その容量と
して十電圧Ｖｌよりも遥かに小さくすることができ、−
ｖ２に対する印加時間Ｔ２は＋Ｖ１の印加時間ＴＩより
も大きくなるため、容量の差違（Ｖ２−Ｖｌ）はいまだ
受け器への正味の移動を保証する。より具体的に好まし
い態様では、適当な受け器としての膜に沿ってゲルを置
きニゲル−緩衝剤−膜の組み合わせ体の両側に２つの電
極を位置付けし；負荷電したＤＮＡまたはＲＮＡの場合
には電圧十■１を電極２６に（一方、電極７０上は＝■
１が置かれる）Ｔ１時間（例えば、１２０秒）印加し：
次いでＴ１よりの短時間であるＴ２時間、電極２６は電
圧−■１を有するが電極７０が電圧＋Ｖ１を有するよう
に電荷を切り替え；そして移動が終了するまでその工程
を繰り返すことによって移動が生ずる。

また一方、米国特許第４，７３７，２５１号明細書に記
載されるような同じ結果は、Ｔ１時間の等しい長さの間
電極７０に電圧＋Ｖ２を印加することによって達成する
ことができ、ここでＶ２の絶対値（以後’１Ｖ２１Ｊ）
は１ｖ１１より小さい。この場合には、より小さい電圧
の第２電力源が使用され、ＳＷ２と配線Ｔ２は電力源１
５に対するよりもむしろ第２電力源に接続される。

さらにもう一つの態様では、詳細には米国特許第４，５
７６．７０２号明細書に記載されるように、移動用の適
当な受け器が塩溶であり、装置はエレクトロエリューシ
ョン装置である。この特許の詳細は引用することにより
明らかに本明細書の内容となる。これらの装置では、ゲ
ルと受け器がエレクトロブロック−のゲルと膜の様に接
触していない。

他方、電力源とスイッチの制御は、前述したような異な
るレベルの電圧と電圧を供給する電力源を有するがまさ
にエレクトロブロッティングについて記載したのと同じ
であり、そのため前記特許第４、５７６、７０２号のエ
レクトロエリューターは、第２図のエレクトロプロッタ
ー装置１０で置換することができる。

〔発明の効果〕

ｘし’）ｔ−ロフロソティングまたはエレクトロエリュ
ーシゴンが２Ｘ１０’塩基対より大きな分子量のＤＮＡ
、　ＲＮＡまたはタンパク質に共通して実施することが
できる点に本発明の技術的利点がある。

ゲル中の物質の電気泳動分離を起こすのに使用されるい
くつかの装置もまた、分離した物質の他の受け器への移
動に有用である点で本発明のもう一つの利点がある。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の実施に適するエレクトロブロッティ
ング装置を部分的に露出させた透視図であり、そして 第２図は、電場の切り替えを供給する電気移動装置で利
用される電気的制御のブロックダイアグラムである。 図中の数字は以下の意味を有する： ４２　、４４−ゲル保持手段、 ２６　、７０一対向する電極、 １１５−電力源、 ＳＷＩ〜５Ｗ４−スイッチ手段、 １１７、１１８−制御回路部品。 図面の浄１４（内容に変更なし）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、電気泳動ゲルから次の処理に適する受け器または膜
   に分離した核酸またはタンパク質を移動させる方法であ
   って、 ａ）予め分離した核酸またはタンパク質を有するゲルを
   適当な受け器が設置された緩衝剤、または核酸もしくは
   タンパク質が移動される膜と接触するように置く工程、 ｂ）その接触したゲルとゲル−緩衝剤−受け器の組み合
   わせ体または膜を逆向きに配列した電極間に位置付けす
   る工程、 ｃ）前記２つの電極の一つにＴ１時間の間＋Ｖ１の電荷
   を印加し、そして電荷−Ｖ１にしたもう一つの電極を核
   酸もしくはタンパク質の正味の電荷と同一符号の電圧を
   有する前記ゲルに接近させる工程、 ｄ）時間Ｔ１と同一もしくは相違するＴ２時間の間、−
   Ｖ２および＋Ｖ２値のそれぞれ前記一つの電極およびも
   う一つの電極に電荷を印加し、ここで｜Ｖ１｜および｜
   Ｖ２｜ならびにＴ１およびＴ２をゲルから受け器または
   膜に分離した核酸またはタンパク質の正味の移動を確実
   にする大きさに選ぶ工程、ならびに ｅ）その移動が終了するまで工程（ｃ）およびｄ）を繰
   り返す工程、を含んでなる方法。 ２、電気泳動ゲルから受け器に分離した核酸またはタン
   パク質を電気的に移動させるための装置であって、 ａ）核酸またはタンパク質が分離したゲルを保持する手
   段およびこの核酸またはタンパク質用受け器、 ｂ）前記ゲルと前記受け器を電極間に位置付けられるよ
   うに配列した一対の電極、 ｃ）所定の電圧Ｖ１またはＶ２で所定の時間前記電極の
   いずれかをバイアスし、前記電極もう一つがそれぞれ同
   時に−Ｖ１または−Ｖ２に荷電する電圧源、 ｄ）前記電極間の前記電圧源を交互に切り替えそしてＶ
   １値またはＶ２値から電圧を選択するためのスイッチ手
   段、ならびに ｅ）予め選んだパターンに従う前記スイッチ手段を制御
   するための制御手段、を含んでなる装置。