JPH02287257A

JPH02287257A - ヒトｇ―ｃｓｆの測定方法

Info

Publication number: JPH02287257A
Application number: JP9167989A
Authority: JP
Inventors: Katsumi Tachibana; 立花　勝己; Hideo Inoue; 英男井上
Original assignee: Kirin Amgen Inc
Current assignee: Amgen K A Inc
Priority date: 1989-04-11
Filing date: 1989-04-11
Publication date: 1990-11-27
Anticipated expiration: 2013-02-16
Also published as: JP2713349B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】産業上の利用分野本発明は微開のヒｈ　Ｇ　−ＣＳ　Ｆ、待に血漿中のヒ
トＧ−ＣＳＦの高感度な酵素免疫測定方法に関するもの
である。

従来の技術Ｇ−ＣＳＦは、造血因子のひとつであり、ヒト膀胱癌細
胞株５６３７（ＡＴＣＣＨＴ８−９）の培葺液中に存在
していることが丞されている（ウェルト等；　Ｐｒｏｃ
。

Ｎａｔｌ＾ｃａｄ、ｓｃｉ、Ｕ、ｓ、Ａ、８２．１５２
６−１５３０．（１９８５））。

又、この遺伝子をコードするＤＮＡ配列が決定され（特
表昭６３−５００６３６）、遺伝子組換えによるＧＣＳ
Ｆの生産が可能となっている。

Ｇ−ＣＳＦは骨髄幹細胞に作用し、好中球への分化を促
進する因子であり（メトカルフ等；Ｂｆｏｏｄ。

６７（１）、３７−４５．（１９８６））　、分化した
好中球に対しても貧食能や０２　産生等の好中球機能を
亢進させる作用があることが報告されている（潟尾等；
Ｂｌｏｏｄ、　７０（２）、　４０４−４１１（１９８
７））。また、化学療法剤投与時に誘発される骨髄抑制
を早期に回復させる作用も動物実験レベルで明らかにさ
れ、臨床上の効果が大いに期待されている（コーエン等
；Ｐｒ０Ｃ，Ｎａｔ１．＾ｃａｄ、ｓｃｉ、、　８４．
２９８４−２９８８　（１９８７））。

Ｇ−ＣＳＦの臨床応用を考慮した場合、治療効果と体内
のＧ　−ＣＳ　Ｆのレベルとの相関を明示してゆく必要
があるが、このためには体内に存在するＧ−ＣＳＦを正
確に定量しなければならない。

一方、Ｇ−ＣＳＦが白血病細胞の増殖を支持する作用を
持つという報告もされており（ベレンガ等；　Ｂｆｏｏ
ｄ、　６９（６）、　１７７１−１７７Ｇ　（１９８７
））　、体内のＧ−ＣＳＦレベルと病態との関連性を明
らかにするためにも、血漿中のＧ−ＣＳＦ酢の高感度な
測定方法は有力な手段になるものと思われる。

ところが、血漿中にはＧ−ＣＳＦの免疫学的？ＡＩＩ定
に干渉する物質が存在しており、この物質がＧ−ＣＳＦ
と結合あるいは抱合して、Ｇ−ＣＳＦの抗原性をマスク
していると考えられ、このために血漿中のＧ−ＣＳＦｆ
ｆｉを直接測定することはできなかった。そこで、これ
まではＧ−Ｃ３Ｆの測定に次の様な方法が用いられてき
た。

即ち、血漿を有機溶媒と混合し、血漿中の脂質及び大部
分の蛋白質を除去する。次にイオン交換樹脂にＧ−ＣＳ
Ｆを含む血漿中の物質を吸着させ、樹脂との親和性の差
を利用してＧ−ＣＳＦと干渉物質を分離し、Ｇ−１ｃｓ
Ｆのみを回収する。これに放射性物質を用いて標識した
Ｇ−ＣＳＦとＧ−Ｃ３Ｆに対する抗体を加え、生じるＧ
−ＣＳ　Ｆ抗体複合体の放射能の強さを測定し、その値
がらＧ−ＣＳＦｆｔｋを求めるというものである。

また、放射性物質を利用するラジオイムノアッセイ（Ｒ
ＩＡ）の代替方法としては、酵素免疫測定法（ＥＲＡ＞
がよく知られているが、これは固相に測定しようとする
抗原に対する抗体を結合させ、これに抗原を反応させて
洗浄した後、更に酵素標識した抗体を反応させて抗原６
を測定するという方法である（石川等；臨床化学、第３
さ、第３７４頁（１９７４））。

なお、ヒトＧ−ＣＳＦのＥＲＡに関しては、不溶化した
抗とｌ〜Ｇ−ＣＳＦ抗体に血清を加え反応さゼた後に、
ペルオキシダーゼ標識Ｆａｂ’　を加えることを特徴と
１６方法が報告されている（日本血液学会′ｊ１１誌第
５１巻　第２号　第３９０頁）。

明が解決しようとする課題上記のような抽出操作とＲＩＡを組合わせた従来法は、
■抽出操作が繁雑であり、抽出効率が低く、バラツキが
あること、■−度に扱える試１１の数が少ないこと、■
ｔＩｉ割性物質性物質するため、標識抗体の使用及び廃
液の処理等に制約が多いこと等の欠点がある。

一方、これまでに報告されているＧ−ＣＳＦのＥＩＡで
は、十分な感度が得られずバラツキも大きかった。

Ｇ−ＣＳＦの臨床上の応用を考えた場合、体内における
Ｇ−ＣＳＦの量を正確に把握することは必須であり、従
って、より簡便で、高感度でかつバラツキの少ないＧ−
ＣＳＦの測定方法が必要とされている。

課題を解決するだめの手段本発明者らは、上記課題を改善すべく鋭意検討をｍねた
結果、ヒトＧ−Ｃ３Ｆに対する抗体消化断片を用い、非
イオン性界面活性剤等を反応系に介在させることにより
、上記要求を満足し得る優れた測定方法を見出し、本発
明に到達したものである。

即ち、本発明は、ヒトＧ−ＣＳＦの酵素免疫測定方法に
係わるものであり、該測定方法は、標識抗体として抗体
消化断片を用いること、及び不溶化抗体とヒトＧ−ＣＳ
Ｆとの抗原抗体反応を非イオン性界面活性剤の存在下に
行なわせることを特徴とするものである。

本発明で用いる標識抗体の消化断片としては、非特異的
結合を最小にするために■ｇＧのＦＣ部分を除いた抗体
消化断片、即ち、Ｆａｂ’が好適である。

また本発明で用いる標識酵素としては、ＥＩＡにおいて
通常使用されているものであればどのような酵素でもか
まわないが、特に西洋ワサビペルオキシダーゼが好まし
い。

Ｆａｂ’及び標識抗体は当該技術分野における従来の慣
用手段で調製することができる。

本発明の不溶化抗体及び標識抗体には、複数の部位に結
合することができ、しかも抗原に対する親和性が高いと
考えられるポリクローナル抗体を使用することが好まし
い。

本発明の測定方法の一つの特徴は、血漿中の干渉物質の
影響を排除して測定の感度及び信頼性を高めるために、
ヒトＧ−Ｃ３Ｆと不溶化抗体との抗原抗体反応に際して
、非イオン性界面活性剤、更にはエチレンジアミンテト
ラ四酢酸す１〜リウム（ＥＤＴＡ）を反応系に存在させ
ることである。

本発明で使用し得る非イオン性界面活性剤としては、ポ
リオキシエヂレンラウリルアルコールエーデル、ポリオ
キシエチレンモノステアレート、ポリオキシエヂレンオ
クチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタ
ン１−リオレエート、ポリオキシエチレンソルビタンモ
ノオレエ−ト、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレ
エート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエ−ト
、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレ−１・など
のポリオキシエチレン誘導体が挙げられ、親水性親油性
バランス（ＨＬＢ）値１１〜１７のものが特に好ましい
。代表的な例としては、ＨＬＢ値が１６．７であるポリ
オキシエチレンソルビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ
　２０）を挙げることができる。

非イオン性界面活性剤の使用量は、用いる非イオン性界
面活性剤の種類によって多少異なるが、反応系に対して
、０，０１〜１重量％、特に０１〜１巾吊％が好ましい
。但し、過剰の界面活性剤は抗体どＧ、−ＣＳＦの結合
をかえって阻害することとなり、また非特異的な発色を
強めるので、非イオン性界面活性剤は１重量％以下で使
用することが望ましい。

本発明測定方法では、非イオン性界面活性剤の添加と同
様な目的で、ＥＤＴＡを更に前記抗原抗体反応系に存在
させると優れた効果が１ｑられるものである。ＥＤＴＡ
はかかる目的で約０　、　ｒ、　ｑ♀％本発明測定方法
の前記抗原抗体反応系に非イオン性界面活性剤及びＥＤ
ＴＡを存在させる方法としては、予め血漿ないし血清試
料中にこれらの物質を添加させておくか、又は、別途、
該反応系に試料を添加する前か又は後に加えることもで
きる。

本発明の測定方法では更に、ヒトＧ−ＣＳＦと不溶化抗
体との抗原抗体反応時間を、通常のＥＩＡに較べて長く
すると良好な結果が得られる。従って、かかる反応は約
４℃で１２〜２４時間行なうことが好ましい。

本発明の測定方法において、これまで述べた点以外につ
いては、従来の慣用ＥＩＡで通常用いられている手段・
条件等と同様にして行なうことができる。

実施例以下、実施例を挙げ、本発明の詳細な説明する。

Ｘ１」（−ユ抗体の精製ウサギ抗ヒトＧ−ＣＳＦ血清に飽和硫酸アンモニウム溶
液を撹拌しながら徐々に加え、４５％飽和とすることに
より粗免疫グロブリン分画を沈澱させ、２０００　ｒｐ
ｍ、　１０分間遠心分離を行なって、沈澱物を集めた。

沈澱物をＰＢＳに溶解させ、同じ緩衝液に対して透析し
た。次にＰｒｏｔｅｉｎ＾カラム（ＨＡＰＳＩｒ　：　
ＢＩＯＩｔＡＤ）によってＩｏＧ分画を精製した。

実施例　２酵素標識抗体の製造石川らの方法（石川栄治ら、「酵素免疫測定法１第２版
１９８２年医学書院）により行なった。

（１）ＩｇＧからＦａｂ’　の調１実施例１の方法を用いて精製した１ｇ０１００■を０．
１Ｍ塩化ナトリウムを含むｏ、ＩＭＭ引■液（ｐＨ４，
５）に対し透析し、４重量％のペプシンを加え、３７℃
で２４時間反応させた後、ｐＨ７，０に調整することに
より消化を止めた。次にＨＰＬＣ（ＴＳＫＧｅｔ　Ｇ３
０００ｓｗ）によりゲル濾過を行ないＦ（ａｂ’）２両
分を集めた。

（２）ペルオキシダーゼ標識−Ｆａｂ’の調製Ｆ　（ａ
ｂ’）、、を８！Ｉｔｇ／ｘｉ！とし、その２ｍを０．
１ＭリンＩＩＩＷｌｆｉ液ｐ１１６．０に透析し１０分
の１容積の０．１Ｈ２−メルカプトエチルアミン−５ｎ
ＨＥＤＴＡを添加し、３７℃で９０分分間光反応させた
。次にＨＰ　Ｌ　Ｃでゲル濾過してＦａｂ’　を得た。

西洋ワサビ　ペルオキシダーゼ２ｑを０．１Ｍリン酸緩
衝液（ａｌｌ　７．０＞　　０．３ａｉ！に溶解し、４
（Ｎ−マレイミドエチル）シクロヘキサン−１−カルボ
ン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド　エステルのＮトジ
メチルホルムアミド溶液３０成を添加した。３０℃で６
０分間反応させた後、ＨＰＬＣでゲルＥ過してペルオキ
シダーゼ−マレイミドを得た。

次に、Ｆａｂ′　２ｍｇとペルオキシダーゼ−マレイミ
ド１．８ｍ５を０．１Ｍリン酸緩衝液（ａｌｌ６．０）
２．５ｍＨＥＤ丁＾１ｄ中３０℃で１時間反応させた。

５０ｍＭのトエチルマレイミド６ｇを加え、ＨＰＬＣで
ゲル濾過することにより、未反応物を除き、ペルオキシ
ダーゼ標識−Ｆａｂ’　を得た。

実施例　３抗ヒトＧ−ＣＳＦ抗体不溶化マイクロタイタープレート
の製造実施例１で得られた抗ヒトＧ−Ｃ３Ｆ抗体（ＩｇＧ）を
５０ｍＨ炭酸緩衝液ｐｌ＋９．２で３００埒／　７！ど
なるように希釈し、この５０成を各ウェルに分注し、室
温で２時間放置した。反応液を除去し、ＰＢＳで３回洗
浄後、５％ＢＳＡを含ムＰＢｓ　２５０ｄヲ各ウエルに
分注し、室温で１〜２時間放置し、反応液を除去後ＰＢ
Ｓで３回洗浄した。

史−ｆＵＰＪ４゜ペルオキシダーゼ標”Ｊ　−Ｆ　ａ　ｂ　’　を用いた
ヒトＧ−ＣＳＦの測定（１）１％ＢＳＡを含むＰＢＳ中での測定１％ＢＳ八を
含むＰ　Ｂ　Ｓ　（１％ＢＳ△−ＰＢＳ）でヒトＧ　−
ＣＳ、Ｆを希釈して調製した標準液（緩衝液系標準液）
を実施例３で製造したマイクロタイタープレートにそれ
ぞれ１ウエルあたり５０μずつ分注した。４℃で１２時
間放置後、反応液を除去し、ＰＢＳで５回洗浄した。実
施例２で調製したペルオキシダーゼ標識−Ｆａｂ’　を
１％ＢＳＡ−ＰＢＳで希釈し、各ウェルに５０ρずつ分
注した。

室温で２　［１ｉ−１？！ｌ放置後、液を捨て、ＰＢＳ
で５回洗浄した。０．４Ｒｇ／ｉｄ　Ｏ−フェニレンジ
アミン０００６％過酸化水素水を含む０．１％クエン酸
緩衝液ｐＨ５，２を各ウェルに１００ｐｉ分注侵、室温
で１０分間反応させた。　　ＩＮ　ＩＩＩＪ）　５０／
Ｊを加えて反応を停止実施例　４ペルオキシダーゼ標ｎ　　Ｆａｂ’　を用いたヒトＧ−
Ｃ３Ｆの測定（１）１％Ｆ３ＳΔを含むＰＢＳ中での測定１％ＢＳＡ
を含むＰ　Ｂ　Ｓ　（’１％ＢＳＡ−ＰＢＳ）でヒトＧ
’ＣＳＦを希釈して調製した標準液（緩衝液系標準液）
を実施例３で製造したマイクロタイタープレートにそれ
ぞれ１ウエルあたり５０成ずつ分注した。４℃で１２時
間放置後、反応液を除去し、ＰＢＳで５回洗浄した。実
施例２で調製したベルΔキシダーゼ標識−Ｆａｂ’を１
％ＢＳ△ＰＢＳで希釈し、各ウェルに５０成ずつ分注し
た。

室温で２時聞放［Ｌ液を捨て、ＰＢＳで５回洗浄した。

０．４ｍ９／ｌｄ　Ｏ−フェニレンジアミン０．００６
％過酸化水素水を含む０．１％クエン酸緩衝液ｐ１１５
．２を各ウェルに　１００成分注後、室温で１０分間反
応させた。ＩＮ　ＨＣｌ１５０ρを加えて反応を停止さ
ぜ、ｅｏｏｎｍを対照に４９２ｒ＋ｍの吸光度を測定し
た。

４９２ｎ１１１の吸光度を縦軸に、ヒトＧ−Ｃ３Ｆの濃
度を横軸に取り、片対数グラフを用いて標準曲線を作成
した（第１図参照）。

（２）ｕ常人血漿中での測定ＥＤＴ△を０，５重量％添加して調整した虹常人血漿に
、ヒトＧ−ＣＳＦを添加して系列希釈して作った標準ｇ
＜健常人血漿標準液）を実施例４（１）の方法で測定し
た。得られた検ｍ線を第２図に示す。ところが、この測
定結束は感度が低くバラツキが大きかった。また、この
検量線は干渉物質のため緩衝液系標準液で求めた検量線
と一致せず、ヒトＧ−ＣＳＦの低Ｑ度領域では検１線よ
り高く。

ヒトＧ−Ｃ３Ｆの高濃度領域では低い饋を丞した。

これは、血漿中でヒトＧ−ＣＳＦは安定して存在してい
るものの、ＩｆＩｌ漿中の干渉物質によりヒトＧ−Ｃ３
Ｆと抗体の結合が一部阻害されているためと考えられた
。

（３）非イオン性界面活性剤を添加した叶常人の血漿中
での測定血漿中に種々の非イオン性界面活性剤を添加し、血漿中
の干渉物質の影響を出来る限り小さくする条件について
の検討を行なった。健常人血漿標準液に非イオン性界面
活性剤としてＴｗｅｅｎ　２０（ＰＯＬＹ　　５ＣＩＥ
ＮＣＥ　　Ｗ＾ＩＩＲＩＮＧＴＯＮ、ＰＡ社ｔＪ　　）
　　、　Ｔｗｅｃｎ　　８５（ポリオキシエチレンソル
ビタントリオレエート、トＩ　Ｌ　Ｂ　＝　１１．０、
純正化学ｉＩ１社製）、Ｂｒ１ｊ−３５（ポリオ−（ジ
エチレンラウリルアルコールエーテル、１−ＩＬＢ＝１
６．９、ナカライテスク（）菊社製）を１０％（Ｖ／Ｖ
）添加し、実施例４（１）と同様に測定した。

結束を第３図に示す。血漿に非イオン性界面活性剤を添
加すると緩衝液系標準液における検量線とよく一致する
ようになることが分る。なお、非イオン性界面活性剤の
添加慴の検討として、種々の濃度のＴｗｃｅｎ　２０を
血漿体積に対し１０％（Ｖ／Ｖ）添加し、実施例４（１
）の方法で測定した。血漿中のＴｗｅｃｎ　２０の濃度
を上げていくと、測定結果は、次第に緩衝液系標準液に
お【ノる検量線に近付いていき、０．１〜１％Ｔｗｅｅ
ｎ　２０の添加条件で最もよい結果が１９られた（第４
図参照）。１重量％より多量の丁ｗｅｃｎ　２０の添加
は非特異的反応を起こしたり、抗ヒＩ−Ｇ−ＣＳ　Ｆ抗
体との結合を阻害するので好ましくなかった。また、非
イオン性界面活性剤の至適濃度は、各非イオン性界面活
性剤ごとに異なっていた。

（４１？！２数の健常人血漿中での測定１車番％Ｔｗｅ
ｅｎ　２０−０．５１ｆｆｔ％［ＤＴＡとなるようにｒ
ｗｅｅｎ　２０８３よびＥＤＴＡを添加した種々の白菊
試料にヒトＧ−Ｃ３Ｆを添加して系列希釈して作った標
準液を測定すると緩衝液系標準液における検量線とよく
一致することが分った（第５図参照）。

（５）白血病思考血漿中での測定白面病患名血漿試料中に、１用υ％Ｔｗｅｅｎ　２０−
０．５ｆｆ［％Ｅ　ＤＴＡとなるようにＴｗｅｅｎ　２
０及びＥＤＴＡを添加し、実施例４（１）の方法で測定
した結果を表１に示す。なお、これら血漿中のＧ−ＣＳ
Ｆｆｆｉは、緩衝液系標準液における検量線から求めた
。

表ＣＭＬ：慢性骨髄性白血病ＡＬＬ　：急性リンパ球性白血病ＣＬＬ：慢性リンパ球性白血病

【図面の簡単な説明】

第１図はヒトＧ−Ｃ３Ｆを１％ＢＳＡ−ＰＢＳで系列希
釈して作った標準液（緩衝液系標準液）における検量線
を示す。第２図は健常人血漿にヒトＧ−ＣＳＦを添加し、系列希
釈して作った標準液（健常人血漿標準液）における検量
線を示す。図中、Ｏは緩衝液基標べｔａを、その他のシンボルは健
常人血＋５標準液を示す。第３図は健常人血漿ｖｐ、１１１．液に非イオン性界面
活性剤を添加した場合の検量線を示Ｊ。図中の各シンボルの意味は以下の通り。Ｏ：緩衝液系標準液口＝１％Ｔｗｅｅｎ　２０を含む健常人血５１標準液■
：　１％　Ｔｗｅｅｎ　８５を含む健常人血＋標準液◇
：　ｏ、ｏｉ％Ｂｒ１ｊ−３５を含む健常人血漿標準液
・：健常人血漿標準液第４図は健常人血漿中１１ｆ−液へのＴｗｅｃｎ　２０
の添加口とその検量線を示す。図中の各シンボルの意味はＬス下の通り。０：！１ｉｉｉ液系４！ＩＱ−液・：健常人血漿標準液口：１ｘのＴｗｅｅｎ　２０を含む健常人血漿標準液■
：０．ＩＸのＴｗｅｅｎ　２０を含む健常人血漿標準液
◇：０．０１％のＴｗｅｃｎ　２０を含む健常人血漿標
準液第５図は複数の釘常人血漿試料を１型口％ｒｗｅｅ
ｎ　２０−０．５型Ｏ％ＥＤＴ＾となるよう調整した場
合の検ω線を示す。図中、Ｏはｇｍｉ系標準液を、その他のシンボルはＴｗ
ｅｅｎ　２０を含む健常人血漿標準液を示す。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）ヒトＧ−ＣＳＦの酵素免疫測定方法であつて、標
識抗体として抗体消化断片を用い、かつ不溶化抗体とヒ
トＧ−ＣＳＦとの抗原抗体反応を非イオン性界面活性剤
の存在下に行なわせることを特徴とする前記測定方法。
（２）前記抗原抗体反応に際して、エチレンジアミン四
酢酸二ナトリウムを更に存在させることを特徴とする請
求項１に記載の測定方法。
（３）前記界面活性剤が０．０１〜１重量％の範囲で存
在することを特徴とする請求項１又は２に記載の測定方
法。
（４）前記界面活性剤が０．１〜１重量％の範囲で存在
することを特徴とする請求項３に記載の測定方法。
（５）前記界面活性剤が、ＨＬＢ値１１〜１７のもので
あることを特徴とする請求項１ないし４のいずれかに記
載の測定方法。
（６）前記界面活性剤が、Ｔｗｅｅｎ２０であることを
特徴とする請求項４に記載の測定方法。
（７）エチレンジアミン四酢酸二ナトリウムが約０．５
重量％の割合で存在することを特徴とする請求項１ない
し６のいずれかに記載の測定方法。
（８）不溶化抗体とヒトＧ−ＣＳＦとの抗原抗体反応を
約４℃で１２〜２４時間行なわせることを特徴とする請
求項１ないし７のいずれかに記載の測定方法。
（９）不溶化抗体及び標識抗体としてポリクローナル抗
体を使用することを特徴とする請求項１ないし８のいず
れかに記載の測定方法。