JPH0330700A - 核酸領域の検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、核酸領域の検出方法に関する。さらに詳細に
は、本発明は、ＤＮＡ又はＲＮＡ試料中の複数の検出す
べき領域を同時に検出することができる核酸領域の検出
方法に関する。本発明は、遺伝子の解析に基づ（各種遺
伝病や感染症の診断、ワクチンや生物製剤の品質チエツ
ク等に適用することができる。

［従来の技術１ 従来より、ＤＮＡ又はＲＮＡ　（以下、「核酸」と呼ぶ
ことがある）試料が特定の領域を有するか否かは、サザ
ンプロット法、ノーザンプロット法又はドツトプロット
法等により調べられていた。

最近、ｌコピーのＤＮＡ領域をも検出することができる
遺伝子増幅法が開発された（Ｒ，に。

５ａｉｋｉら、５ｃｉｅｎｃｅ、　２３０．１３５０［
１９８５））　、遺伝子増幅法では、検出すべき核酸領
域の両端部にそれぞれハイブリダイズする２種類のブラ
イマーとＤＮＡ又はＲＮＡポリメラーゼを用いて、相補
鎖合成と変性のサイクルを数千回繰返して、検出すべき
領域を数十万倍に増幅させる。従って、極めて微量の試
料中の核酸領域をも検出することができ、試料中、ｌコ
ピーの核酸領域をも検出することが可能である。

遺伝子増幅法を利用した遺伝子の解析方法も憫察されて
おり、例えば、　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃ１ｉｎｉｃ
ａｌＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　２：１
９４−１９８　（１９８８１には、遺伝子増幅法を用い
てヒトＴ細胞白血病ウィルスのプロウィルスを検出する
方法が記載されている。

しかしながら、遺伝子増幅法を利用した従来の検出方法
では、１回の操作で１つの領域を検出することしかでき
ない。従って、核酸中の複数の領域を検出する必要があ
る場合には、各領域についてそれぞれ検出操作（遺伝子
増幅法による増幅及びプローブとのハイブリダイゼーシ
ョン）を行なわなければならず、時間と労力がかかるも
のであった。

［発明が解決しようとする課題］ 従って、本発明の目的は、複数の核酸領域を同時に簡便
に検出することができる、核酸領域の検出方法を提供す
ることである。

［課題を解決するための手段］ 本願発明者らは、鋭意研究の結果、遺伝子増幅法により
増幅する、検出すべき核酸領域の大きさをそれぞれ異な
らしめ、遺伝子増幅法と電気泳動とを組合わせることに
よって複数の核酸領域を同時に簡便に感度良（検出する
ことができることを見出し本発明を完成した。

すなわち、本発明は、＋１１試料ＤＮＡ又はＲＮＡ中の
、大きさのそれぞれ異なる複数の検出すべき領域をポリ
メラーゼチェインリアクシコン法により同時に増幅させ
る工程と、（２）増幅後の試料を電気泳動にかけ、増幅
された上記検出すべき複数の領域をそれぞれの大きさに
基づいて分離する工程と、（３）分離された核酸断片を
検出する工程とを含む核酸領域の検出方法を提供する。

［発明の効果］ 本発明の方法によると、複数の核酸領域を同時に感度良
く検出することができる。従って、遺伝病や感染症の詮
所や、ワクチンや生物製剤の品質チエツク等において、
複数の核酸領域を検出する必要がある場合に、従来方法
に比べてはるかに簡便に検出することができ、有利であ
る。

［発明の詳細な説明］ 本発明の方法の第１工程では、検出すべき複数の核酸領
域を遺伝子増幅法により増幅する。遺伝子増幅法自体は
上記文献に記載されているように公知である。すなわち
、二本鎖核酸を変性して一本鎖にし、増幅すべき領域の
各鎖の５°末端領域とそれぞれハイブリダイズする、各
領域当り２種類のブライマーを各鎖とハイブリダイズさ
せ、ＤＮＡ又はＲＮＡポリメラーゼを用いて、上記ブラ
イマーを起点として相補鎖を合成して二本鎖にし、さら
にこれを変性して上記ブライマーとハイブリダイズさせ
、ＤＮＡ又はＲＮＡポリメラーゼを用いて相補鎖を合成
するというサイクルを繰返す。サイクルをｎ回繰返すと
理論上、その核酸領域は２″倍に増幅される。サイクル
の繰返し数は、特に限定されないが、通常２０回ないし
４０回程度が適当である。

本発明の第１工程において、特徴的なことは、複数の検
出すべき領域を同時に増幅することと、増幅する複数の
領域の大きさをそれぞれ異ならしむることである。複数
の領域を同時に増幅することは、各領域について上記し
た２種類のブライマーを反応させることによって行なう
ことができる。すなわち、例えば４つの領域を検出する
場合には、各領域の各鎖の５°末端領域とハイブリダイ
ズするブライマー、すなわち、合計′８種類のブライマ
ーを反応させればよい。また、増幅される複数の検出す
べき領域の大きさをそれぞれ異ならしむることは、ブラ
イマーの塩基配列を選択することにより達成することが
できる。すなわち、遺伝子増幅法により増幅される領域
は、二本鎖・核酸の第１鎖とハイブリダイズする第１の
ブライマーと、二本鎖核酸の第２鎖とハイブリダイズす
る第２のブライマーとによって挟まれた領域であるので
、第１及び／又は第２のブライマーの塩基配列を選択す
ることによって、それらの間に挟まれる領域の大きさを
任意に変えることができる。

本発明の方法では、ブライマーの塩基配列を選択するこ
とによって、増幅すべき複数の領域の大きさを異ならし
むる。このように、増幅領域の大きさをそれぞれ異なら
しむることによって、次の電気泳動工程において増幅さ
れた核酸分子をその大きさに従って容易に分離すること
が可能になる。

次に、試料を電気泳動にかけ、増幅された各核酸領域を
分離する。電気泳動による核酸分子の分離はこの分野に
おいて周知であり、サザンプロット法やノーサンプロッ
ト法において行なわれている方法をそのまま適用するこ
とができる。ゲルとしては通常アガロース又はポリアク
リルアミドゲルが用いられる。この電気泳動工程におい
て、第１工程で増幅された複数の検出すべき領域は、そ
の大きさに基づいて分離される。

次に、分離された核酸断片を検出する。これは例えば、
電気泳動による分離パターンを維持したまま１分離され
た核酸分子を基体上に転写、固定し、転写、固定された
核酸断片を検出することにより行なうことができる。こ
れらの工程自体はこの分野において周知であり、サザン
プロット法やノーサンプロット法において行なわれてい
る方法をそのまま適用することができる。すなわち、こ
こで用いられる基体としてはナイロンフィルターやニト
ロセルロースフィルターを好ましく用いることができる
。核酸分子の固定は、例えば、常法により、フィルター
を熱乾燥又は紫外線照射することにより行なうことがで
きる。転写、固定された核酸分子の検出は例えば、増幅
されたそれぞれの領域と特異的にハイブリダイズする標
識プローブをそれぞれ作用させ、それらの標識プローブ
が基体上の核酸分子と特異的に結合するかを調べること
により、検出すべき核酸領域が試料中に存在したか否か
を知ることができる。検出すべき領域は、それぞれの大
きさに応じて分離されたパターンを維持したまま基体上
に固定されているので、どの試料中にどの領域が存在し
、どの領域が欠損していたかを一目瞭然に知ることがで
き、極めて好都合である。あるいは、ゲル電気泳動後、
分離された核酸断片を基体上に転写、固定することなく
、ゲルを熱乾燥させ、上記と同様に標識プローブを用い
て、分離パターンを維持したまま核酸断片を検出するこ
とができる。

本発明の方法は、非常に基本的な技術であり、極めて広
い適用範囲を有する０例えば、複数のＤＮＡ領域が存在
するか否かを調べる必要がある遺伝子解析、それに基づ
く各種遺伝病や感染症の診断に適用することができる。

さらに、ワクチンやその他の生物製剤の品質を遺伝子解
析によりチエツクすることにも適用することができる。

すなわち、例えばエイズウィルス（ＨＩ　Ｖ）等のウィ
ルスは、その表面構造がしばしば変異するので一旦製造
したワクチンが効かなくなるおそれがあるが、本発明の
方法により、それらのウィルスの変異を迅速に追跡する
ことが可能になる。また。

遺伝子工学的に有用物質を大腸菌等の微生物や動植物細
胞内で生産させる場合に、宿主細胞の増殖に従って、そ
の有用物質をコードする領域が変異したり脱落したりす
るおそれがあるが、本発明の方法を適用してそのような
変異や脱落を複数の領域について迅速に知ることができ
る。また、複数の核酸分子を含む核酸混合物中の複数の
核酸分子を同時に検出することもできる。従って、本発
明の方法は、１種類の核酸分子中の複数の領域の検出に
適用できるだけではなく、異なる複数種類の核酸分子中
の領域を検出することにも適用することができる。

以下、本発明の方法を適用して成人Ｔ細胞白血病ウィル
ス（以下、ＡＴＬＶという）のプロウィルスを検出した
実施例を記載するが、本発明の方法は極めて適用範囲の
広い基本的な技術であって、複数の核酸領域を検出する
ことが望まれるあらゆる場合に適用することができるも
のであり、下記実施例に示すＡＴＬＶの検出や、ヒトの
疾病の診断にその適用が限定されるものではないことは
明らかである。

［実施例］ ｆｉｌ試料の調製 健常人及びＡＴＬ患者からの末梢血５〜１０ｍ１から比
重液を用いてリンパ球を分離し、常法によりリンパ球中
のＤＮＡを抽出した。

（２）ブライマー及び増幅領域 ＡＴＬＶのｇａｇ領域（およそ第８００〜２０９０塩基
）　、　ｐｏｔ領域（およそ第２５００〜５１８０塩基
）、ｅｎｖ領域（およそ第５１８０〜６６４０塩基）及
びｐＸ領域（およそ第６６８０〜８３６０塩基）を検出
するための、これら領域とそれぞれ重複する領域の第１
鎖及び第２鎖の５゛末端領域とそれぞれ特異的にハイブ
リダイズする、下記表に示す塩基配列を示すブライマー
を化学合成した１表中、各ブライマーの塩基配列の両側
の数字は、各ブライマーがハイブリダイズするＡ　Ｔ　
Ｌ　Ｖゲノムの塩基の位置を示す。

従って、例えばｇａｇ領域を検出するための領域として
は第１３７５塩基から１６３２塩基が規定され、この領
域が増幅される。増幅される各領域の大きさは、ｇａｇ
領域が１５８　ｂｐ、ｐｒｏ／ｐｏｌ領域力月２０　ｂ
ｐ、ｅｎｖ領域が１９３　ｂｐ、　ｐＸ−ＩＶが２２０
　ｂｐであり、増幅される各領域の大きさは異なってい
た。

（３）遺伝子増幅法 ｆｉｌ試料の調製 （１）で調製したＤＮＡ試料の一部を採り、トノスーＥ
ＤＴＡ（ＴＥ）緩衝液に最終濃度口、ｌｕｇ／μ１１．
：溶かした。その５０μｌを９５℃で５分間加熱し、混
存が予想されるＤＮＡ又はＲＮＡ分解酵素を変性させた
。−度攪拌後、６０００　ｒｐｍ、３０秒間遠心し、以
・下の操作に用いた。

ｆｉｉ１反応試薬混合物の調製 反応試薬混合物を、試験管１本当り以下の容量で、試料
数に合わせて反応混合物を作製した。

１０　ｘ　　Ｔｒｉｓ／にｃ１／ＭｇｃｌｚＭ衝液　　
　　　１０．１）ＯμｍｄＮＴＰ混合物（４ＮＴＰ）　
　　　　　　　　８．００　ｕ　１ｇａｇ領域ブライ７
−１（０゜５ｕ　ｇ／μｍ１　０．２５　ｕ　１ｇａｇ
領域プライｖ−２ｆＯ，５ｕｇ＃ｚｌ）　　０．２５Ｌ
Ｌ１ｐｏｌ領域ブライｖ　−１（０，５ｕｇ／ｕ　１１
　０．２５　ｕ　１ｐｏｌ領域ブラー１’？−２（０，
５＋ｕｇ＃ｚｌｌ　　０．２５ｕｌｅｎｖ領域ブライマ
ー１１０．５ｕ　ｇ／μｍ１　０．２５　ｕ　１ｅｎｖ
領域ブライマー２（（１，５ｕｇ＃ｚｌｌ　　０．２５
ＬＬ１ｐｘ　　領域ブライマー１　（０，５ｕｇ／ａｌ
ｌ　　０．２５　ｕｌｐｘ　　領域ブライマー２＋０．
５μｇ／μｌ）　　０．２５μＩＴａｑポリメラーゼ［
５１／ｕ　１１　　　　　０．５０　ｕ　１合計　　　
２０．５０ｔｉ１ ｆｉｉｉｌ遺伝子増幅 蒸留水？４．５０　ｕ　ｌ　、上記反応試薬混合物２０
．５０ｔＬｌ及び上記ＤＮＡ試料５．００ｕ　ｌを混合
し、６００　ｒｐｎ＋で３ｏ秒間遠心してベレットを沈
殿させた。２滴の鉱油を加えた後、６０００　ｒｐｍで
３０秒間遠心して気泡を抜いた。遠心管を市販の自動温
度コントローラーにセットし、遺伝子増幅を開喧した。

温度サイクルは、１）９４℃、２分間、２）６０°Ｃ，
３分間、３）７２°Ｃ１３分間であった。終了後、試料
を４℃で保存した。

（４）電気泳動 １％ウルトラピュアアガロース（ＢＲＬ社製）、２％Ｎ
ｕｓｉｖｅ　ＧＴＧアガロース（Ｆ　Ｍ　Ｃバイオプロ
ダクツ社製）及び０．３μｇ７ｍｌのエチジウムブロマ
イドを１　ｘＴＥ緩衝液に加熱して溶解し、アガロース
ゲルを作製した。（３）で得られた増幅終了後の試料に
６ｘローデイング緩衝液を加え、そのｌＯμｌをゲルの
各ウェルに入れ、電気泳動を行なった（５０ｍＡ、２〜
３時間）、マーカーを含む緩衝液も同じ条件で電気泳動
にかけた。

（５）サザンブロツティングによるＤＮＡの転写常法に
従い、（４）　で電気泳動分離されたＤＮＡをナイロン
フィルターに転写した。

（６）オリゴＤＮＡプローブの５゛末端標識上記表に示
した塩基配列を有する、各領域を検出するためのオリゴ
ＤＮＡプローブ（表中、プローブの塩基配列の左右の数
字は、そのプローブがハイブリダイズするＡＴＬＶゲノ
ムの位置を示す）の５′末端を３２ｐで標識した。標識
は、下記組成の反応混合物を３７℃で１時間インキュベ
トすることにより行なった。

混合オリゴＤＮＡプローブ（０，５μｇ／μｍ１０．６
μｌ滅閑蒸留水　　　　　　　　　　　　　５．４μｌ
ｒ　−”Ｐ　−ＡＴＰ　　（−３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ
ｌ　　　　　　　１０．Ｏｕ　１合計　　２０．Ｏｕ　
１ 反応後、Ｑｕｉｃ　５ｐｉｎカラム（Ｇ２５セフアデツ
クスカラム）（ベーリンガーーマンハイム社製）で分離
した（遠心３（１００ｒｐｍ、２分間）（７１ＤＮＡバ
ンドの“検出 ｆｉｌ　プレハイブリダイゼーション ５　ｘ　５ＳＰＥ、５Ｘデンハルツ溶液及び０．５％Ｓ
ＯＳから成る滴液２０＋ｍｌで１０　ｘ　２０　ｃｍ２
フィルターを処理し、５６℃で２時間インキュベートし
た。

（ｉｉｌハイブリダイゼーション ｆｉｔのブレパイプリダイゼーション後の液とｆｆ２Ｐ
−プローブ（２ｘ　１０’　ｄｐｍ／園１，４〜５　ｍ
ｌ／１０　ｘ　２０　ｃｍ２フィルター）を混合し、５
６℃で２時間インキュベートした。

ｆｉｉｉｌ洗浄 以下の洗浄を行なった。

１１２　ｘ　５ＳＰＥ１０．１％ＳＯＳ　、室温、１０
分間２）同上 ３１５　ｘ　５ＳＰＥ１０．１％ＳＯＳで５５℃、１０
分間ｆｉｖｌ現像 常法により、１〜２日間オートラジオグラフィーを行な
った。

（８）結果 結果を図に示す。図中、レーン１は健常人、レーン２な
いしレーン１１がＡＴＬ患者からの末梢血リンパ球ＤＮ
Ａについての結果を示す。レーン１２はマーカー（＄　
Ｘ　１７４の１ｌａｅ　ＩＩＩ消化物、断片サイズは１
３５７　ｂｐ、１０７８　ｂｐ、３７２　ｂｐ、６０３
ｂｐ、３１０　ｂｐ、２８１　ｂｐ、２７１　ｂｐ、２
３４　ｂｐ、　１９４　ｂｐ、１１８　ｂｐ及び７２　
ｂｐ　）の泳動パターンを示す。図がられかるように、
レーン１においてはＡＴＬＶの発現は全く認められず、
レーン２のＡＴＬ患者はＡＴＬＶの全領域を発現、レー
ン３の患者はｇａｇ領域のみを発現、レーン４の患者は
ｐａｌ領域のみを発現、レーン５の患者はｅｎｖ領域の
みを発現、レーン６の患者はｐＸ領域のみを発現、レー
ン７の患者はｇａｇ領域とｐａｌ領域のみを発現、レー
ン８の患者はｇａｇ領域どｅｎｖ領域のみを発現、レー
ン９の患者はｇａｇ領域とｐＸ領域のみを発現、レーン
ｌＯの患者はｐｏｌ領域とｅｎｖ領域のみを発現、レー
ン１１の患者はｇａｇ領域、ｐａｌ領域及びｅｎｖ領域
を発現していることがわかる。

上記実施例から明らかなように、本発明の方法によると
、検出すべき複数の核酸領域を感度良く同時に簡便に検
出することができることがわかる。

【図面の簡単な説明】 図は、本発明の方法を適用して、ＡＴＬＶのプロウィル
スの検出を行なった結果得られたオートラジオグラフィ
ーを示す図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 試料ＤＮＡ又はＲＮＡ中の、大きさのそれぞれ異なる複
   数の検出すべき領域を遺伝子増幅法により同時に増幅さ
   せる工程と、 増幅後の試料を電気泳動にかけ、増幅された上記検出す
   べき複数の領域をそれぞれの大きさに基づいて分離する
   工程と、 分離された核酸断片を検出する工程とを含む核酸領域の
   検出方法。