JPH0230668B2 - - Google Patents
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- JPH0230668B2 JPH0230668B2 JP57221049A JP22104982A JPH0230668B2 JP H0230668 B2 JPH0230668 B2 JP H0230668B2 JP 57221049 A JP57221049 A JP 57221049A JP 22104982 A JP22104982 A JP 22104982A JP H0230668 B2 JPH0230668 B2 JP H0230668B2
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- freeze
- sensitized blood
- cell suspension
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- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/96—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood or serum control standard
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- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Description
本発明は、凍結乾燥感作血球の製造法に関す
る。 近年、インスリン、甲状腺ホルモン、α−フエ
トプロテイン（以下AFPと略称する）、人胎盤性
性腺刺激ホルモン（以下hCGと略称する）、HB
抗原及び抗体など尿及び体液中に分泌される微量
の生体成分を測定してその結果を臨床診断あるい
は病気の予後判定に利用することが広く行なわれ
ている。しかし、これらの生体成分はいずれも微
量であるため、通常の化学分析では測定が困難で
あり、一般的には免疫化学的方法、特に測定感度
の非常に高い放射免疫測定法（以下RIA法と略称
する）及び酵素免疫測定法（以下EIA法と略称す
る）によらなければならない。しかし、RIA法、
EIA法とも操作が複雑で簡便性、迅速性が欠ける
ほか、RIA法ではアイソトープの入手、管理およ
び測定のための高価な設備が必要である。この
点、血球を担体として利用した受身血球凝集反応
（以下PHAと略称する）は特別の測定設備も必要
とせず、その上操作の簡便性、迅速性、経済性の
面からも優れている。しかも近年、血球の処理
法、感作方法、抗原及び抗体の精製法の改善等に
より、PHA法の感度は著しく向上し、EIA法、
RIA法の感度と匹敵するようになつた。 一般にPHA法で使用する感作血球は哺乳動物
や鳥類から採取した血球を天然のまま、あるいは
グルタールアルデヒド、ピルビンアルデヒド、ホ
ルムアルデヒドなど適当な固定剤で処理した後さ
らにタンニン酸、ビス−ジアゾベンジジンなどの
結合剤で処理した上、対応する抗原又は抗体を感
作して調整することが出来る。 しかしながら、液状の感作血球は冷所に置いて
も保存性が悪いという欠点を有する。 感作血球は保存性を良くするために、凍結乾燥
法が用いられる。しかし感作血球は凍結乾燥した
ものでもなお、感度低下や、血球凝集像の乱れが
認められ、その上凍結乾燥感作血球品の外観なら
びに溶解性に難点があつた。 本発明者らはかかる技術的背景の下に、鋭意検
討したところ、凍結乾燥時に二糖類、血清アルブ
ミンおよびアミノ酸、さらに糖アルコールを共存
させることにより、長期間安定で凝集像も鮮明で
しかも外観ならびに用時の分散性の優れた凍結乾
燥感作血球が得られることを見い出し、これに基
づいてさらに研究した結果、本発明を完成した。 本発明は、二糖類、血清アルブミン、ア
ミノ酸および糖アルコールを溶存させた感作血
球浮遊液を凍結乾燥することを特徴とする凍結乾
燥感作血球の製造法である。 本発明方法に用いられる二糖類としては、たと
えばシヨ糖、ラクトース、トレハロース、ゲンチ
オビオース、セロビオース、マルトースなどが挙
げられる。なかでも、シヨ糖、ラクトースが好ま
しい。 本発明方法で用いられる血清アルブミンとして
は、たとえば哺乳動物に由来し、常套手段で得ら
れた血清アルブミンが使用出来る。その例として
は、たとえばヒト血清アルブミン、ウマ血清アル
ブミン、ウシ血清アルブミン、ヒツジ血清アルブ
ミン、ヤギ血清アルブミン、ウサギ血清アルブミ
ンなどが挙げられる。なかでも、ウシ血清アルブ
ミンが好ましい。 本発明で用いられるアミノ酸としては、脂肪族
のもの、芳香族のもの、複素環式のもののいずれ
でもよい。その例としては、たとえば脂肪族酸性
アミノ酸（例、グルタミン酸、アスパラギン酸）、
脂肪族中性アミノ酸（例、グリシン、アラニン、
バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレ
オニン、グルタミン、アスパラギン）、脂肪族塩
基性アミノ酸（例、リジン、アルギニン）、脂肪
族含硫アミノ酸（例、システイン、シスチン、メ
チオニン）、芳香族アミノ酸（例、フエニルアラ
ニン、チロジン）、複素環式アミノ酸（プロリン、
ヒスチジン）などが挙げられる。なかでも、グル
タミン酸、グリシンが好ましい。 これらのアミノ酸は、塩を形成したものでもよ
い。該塩としてはたとえば、ナトリウム塩、カリ
ウム塩などが挙げられる。特に、グルタミン酸、
アスパラギン酸などの酸性アミノ酸はナトリウム
又はカリウム塩として用いることが好ましい。ま
たリジンなどの塩基性アミノ酸は適当な酸で中和
したのち使用することが好ましい。 本発明方法においては、感作血球浮遊液にさら
に糖アルコールを溶存させることが好ましい。該
糖アルコールとしては、たとえばヘキシツト
（例、マンニツト、ソルビツト）、ペンチツト
（例、アラビツト、キシリツト）、テトリツト
（例、エリトリツト）などが挙げられる。なかで
も、マンニツトが好ましい。 本発明の溶存させる化合物の使用量は、凍結乾
燥に付される感作血球浮遊液全量〔感作血球濃度
を約4v／ｖ％とした場合〕に対し、二糖類の濃
度が約１〜15w／ｖ％、さらに好ましくは約２〜
10w／ｖ％となる量、血清アルブミンの濃度が約
0.1〜3w／ｖ％、さらに好ましくは約0.3〜2w／
ｖ％となる量、アミノ酸の濃度が約0.1〜5w／ｖ
％、さらに好ましくは約0.3〜2w／ｖ％となる
量、糖アルコールの濃度が約１〜30w／ｖ％、さ
らに好ましくは約３〜15w／ｖ％となる量がそれ
ぞれ用いられる。上記感作血球濃度が約4v／ｖ
％以外の場合には、上記の溶存させる化合物の使
用量は上記濃度と比例する量を用いることが出来
る。 凍結乾燥処理は、感作血球の凍結乾燥に適して
いる方法、条件が採用される。該処理は、感作血
球浮遊液を、たとえば温度としては約−40〜＋40
℃で、圧力としては約0.5〜10×10-2mmHgで、時
間としては約24〜72時間で行なわれる。 かくして得られる凍結乾燥感作血球はきわめて
安定で長時間室温以上で保存しても実質的に抗原
抗体反応の作用能は低下が認められず、かつ特異
性も保たれており凝集反応像も鮮明でありその上
美麗な粉末で外観にも優れており、しかも用時蒸
留水、生理食塩水及び各種緩衝液に対しての分散
性も優れているので用時に容易に感作血球浮遊液
を調製することが出来る。 このように、本発明の方法で得られた凍結乾燥
感作血球は、感作血球に要求される条件すなわち
(1)保存安定性、(2)凝集像の鮮明性（陰性像、陽性
像）、(3)凍結乾燥品の外観および(4)分散性のすべ
てを満足する優れたものである。 本発明方法に用いられる感作血球浮遊液は、通
常、固定化処理した哺乳動物赤血球又は鳥類赤血
球を血清学的活性物質で感作した後、適当な緩衝
液に浮遊させたものである。 該赤血球としては、たとえばヒト、ウマ、ウ
シ、ヒツジ、ヤギ、ウサギなどの哺乳動物赤血球
やニワトリ、ガチヨウ、七面鳥などの鳥類赤血球
が使用出来る。 該固定化処理は、一般に赤血球の固定に利用さ
れる固定剤のいずれを用いてもよく、たとえばホ
ルマリン、ピルビンアルデヒド、グルタールアル
デヒドなどが用いられる。上記のようにして固定
処理した赤血球をさらにタンニン酸処理して感作
してもよい。このタンニン酸処理は、自体公知の
方法に準じて行なうことができ、たとえば、固定
赤血球浮遊液にタンニン酸含有液（通常約0.001
〜0.04w／ｖ％程度が好ましい）を振盪下に小量
ずつ添加したのち、室温下に約0.5〜３時間程度
放置または振盪することにより、血清学的活性物
質に対する吸着能が増強された赤血球を得ること
ができる。 このようにして得られた赤血球に感作させる血
清学的活性物質としては、抗原、ハプテンおよび
抗体などのいずれであつてもよい。たとえば免疫
グロブリン、アルブミン、フイブリノーゲン（フ
イブリンおよびそれらの分解産物）、AFP、Ｃ反
応性タンパク、β2−ミクログロブリン、ミオグロ
ビン、ガン胎児性抗原、肝炎ウイルス抗原、
hCG、ヒト胎盤性ラクトーゲン、インスリンなど
のタンパク、ホルモン、投与薬剤など、またそれ
らの抗体などが挙げられる。かかる血清学的活性
物質で前記した赤血球を感作するに際しては、自
体公知の感作処理を採用することができ、赤血球
と血清学的活性物質とを水性溶媒（たとえば水、
生理食塩水、各種緩衝液など）中で接触させるの
がよく、一般に血清学的活性物質含有液と赤血球
の水性溶媒浮遊液とを混合し、静置することによ
り行なわれるが、所望により撹拌もしくは振盪し
て接触時間を短縮するようにしてもよい。血清学
的活性物質含有液としては、該活性物質を含有す
る血清、血漿もしくは精製活性物質含有液などが
挙げられる。とりわけ精製した血清学的活性物質
の溶液を用いて感作処理を行なうのが好ましく、
この場合通常約0.001〜10mg／mlとりわけ約0.01
〜２mg／ml程度の活性物質を含有する溶液を、約
１〜20％（Ｖ／Ｖ）とりわけ３〜10％（Ｖ／Ｖ）
程度の上記赤血球浮遊液に等容量添加するのがよ
い。本感作処理は、一般にPH約５〜８で約20〜60
℃の温度で行なうのが好ましい。本感作処理後、
所望により感作赤血球を水性溶媒で洗浄してもよ
い。かくして得られた感作赤血球は、水性溶媒た
とえばPH7.4のリン酸食塩緩衝液やPH７のヘペス
食塩緩衝液に約２〜20％（ｖ／ｖ）になるように
浮遊させる。 以下に実施例を挙げて、本発明をさらに具体的
に説明する。 実施例 １ (1) 抗hCG免疫グロブリンの調製 精製hCG（単位10000IU／mg）を完全フロイ
ントアジユバントと混合し、ウサギに免疫して
得た抗hCG血清（ウサギ）を飽和硫酸アンモニ
ウムを添加し塩析を行なつた。3000rpm30分間
遠心分離し、生じた沈殿を生理食塩水に溶解
し、一晩生理食塩水で透析して抗hCG免疫グロ
ブリン液を得た。 (2) 抗hCG感作血球浮遊液の調製 羊血球を常法に従つてピルビンアルデヒドで
固定化し、さらに公知の方法｛ジヤーナル・オ
ブ・エキスペリメンタル・メデイシン
（Journal of Experimental Medicine）第93
巻（1951年）第107項｝でタンニン酸処理して
得たタンニン酸処理固定化羊血球をリン酸緩衝
液に浮遊させた。これと上記hCG免疫グロブリ
ン液をリン酸緩衝液に濃度約0.13mg／mlに希釈
溶解したものとを等量混合し、56℃２時間反応
させて抗hCGを血球に感作した。 次いで得られた抗hCG感作血球を生理食塩水
で洗浄後、正常ウサギ血清0.5％を含むヘペス
緩衝食塩水中に１晩放置した後、生理食塩水で
洗浄し、表１記載の添加剤含有ヘペス緩衝食塩
水を用い４％（ｖ／ｖ）抗hCG感作血球浮遊液
を調製した。 (3) 凍結乾燥抗hCG感作血球の調製 上記抗hCG感作血球浮遊液を0.25mlずつバイ
アル瓶（２ml容量）に分注し約−30〜−40℃で
予備凍結したのち、真空凍結乾燥機に入れ排気
して真空にし温度を30℃まで徐々に上げなが
ら、約40時間乾燥した。ついで窒素ガスを充填
したのち、バイアルを封栓して、凍結乾燥抗
hCG感作血球を得た。 (4) 凍結乾燥感作血球の試験 実施例１(3)で調製した各凍結乾燥品につき37
℃に於ける外観、ヘペス緩衝食塩水に対する分
散性、感度の安定性、血球凝集像の鮮明さを調
べた。結果は表１に示すとおりである。なお、
感度の測定法は下記の通りである。すなわち、
上記凍結乾燥抗hCG感作血球１バイアルに対し
ヘペス緩衝食塩水１mlを添加し、１％抗hCG感
作血球浮遊液を調製した。各感作血球浮遊液
0.2mlずつを半球形の底部を有する内径約10mm
の小試験管にとり、これにhCG標準液0.1mlを
加え振とう混合し２時間静置後、試験管底部に
生ずる沈降像から沈降環が生ずる場合を陰性、
生じない場合を陽性として結果を判定した。結
果を第１表に示す。
る。 近年、インスリン、甲状腺ホルモン、α−フエ
トプロテイン（以下AFPと略称する）、人胎盤性
性腺刺激ホルモン（以下hCGと略称する）、HB
抗原及び抗体など尿及び体液中に分泌される微量
の生体成分を測定してその結果を臨床診断あるい
は病気の予後判定に利用することが広く行なわれ
ている。しかし、これらの生体成分はいずれも微
量であるため、通常の化学分析では測定が困難で
あり、一般的には免疫化学的方法、特に測定感度
の非常に高い放射免疫測定法（以下RIA法と略称
する）及び酵素免疫測定法（以下EIA法と略称す
る）によらなければならない。しかし、RIA法、
EIA法とも操作が複雑で簡便性、迅速性が欠ける
ほか、RIA法ではアイソトープの入手、管理およ
び測定のための高価な設備が必要である。この
点、血球を担体として利用した受身血球凝集反応
（以下PHAと略称する）は特別の測定設備も必要
とせず、その上操作の簡便性、迅速性、経済性の
面からも優れている。しかも近年、血球の処理
法、感作方法、抗原及び抗体の精製法の改善等に
より、PHA法の感度は著しく向上し、EIA法、
RIA法の感度と匹敵するようになつた。 一般にPHA法で使用する感作血球は哺乳動物
や鳥類から採取した血球を天然のまま、あるいは
グルタールアルデヒド、ピルビンアルデヒド、ホ
ルムアルデヒドなど適当な固定剤で処理した後さ
らにタンニン酸、ビス−ジアゾベンジジンなどの
結合剤で処理した上、対応する抗原又は抗体を感
作して調整することが出来る。 しかしながら、液状の感作血球は冷所に置いて
も保存性が悪いという欠点を有する。 感作血球は保存性を良くするために、凍結乾燥
法が用いられる。しかし感作血球は凍結乾燥した
ものでもなお、感度低下や、血球凝集像の乱れが
認められ、その上凍結乾燥感作血球品の外観なら
びに溶解性に難点があつた。 本発明者らはかかる技術的背景の下に、鋭意検
討したところ、凍結乾燥時に二糖類、血清アルブ
ミンおよびアミノ酸、さらに糖アルコールを共存
させることにより、長期間安定で凝集像も鮮明で
しかも外観ならびに用時の分散性の優れた凍結乾
燥感作血球が得られることを見い出し、これに基
づいてさらに研究した結果、本発明を完成した。 本発明は、二糖類、血清アルブミン、ア
ミノ酸および糖アルコールを溶存させた感作血
球浮遊液を凍結乾燥することを特徴とする凍結乾
燥感作血球の製造法である。 本発明方法に用いられる二糖類としては、たと
えばシヨ糖、ラクトース、トレハロース、ゲンチ
オビオース、セロビオース、マルトースなどが挙
げられる。なかでも、シヨ糖、ラクトースが好ま
しい。 本発明方法で用いられる血清アルブミンとして
は、たとえば哺乳動物に由来し、常套手段で得ら
れた血清アルブミンが使用出来る。その例として
は、たとえばヒト血清アルブミン、ウマ血清アル
ブミン、ウシ血清アルブミン、ヒツジ血清アルブ
ミン、ヤギ血清アルブミン、ウサギ血清アルブミ
ンなどが挙げられる。なかでも、ウシ血清アルブ
ミンが好ましい。 本発明で用いられるアミノ酸としては、脂肪族
のもの、芳香族のもの、複素環式のもののいずれ
でもよい。その例としては、たとえば脂肪族酸性
アミノ酸（例、グルタミン酸、アスパラギン酸）、
脂肪族中性アミノ酸（例、グリシン、アラニン、
バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレ
オニン、グルタミン、アスパラギン）、脂肪族塩
基性アミノ酸（例、リジン、アルギニン）、脂肪
族含硫アミノ酸（例、システイン、シスチン、メ
チオニン）、芳香族アミノ酸（例、フエニルアラ
ニン、チロジン）、複素環式アミノ酸（プロリン、
ヒスチジン）などが挙げられる。なかでも、グル
タミン酸、グリシンが好ましい。 これらのアミノ酸は、塩を形成したものでもよ
い。該塩としてはたとえば、ナトリウム塩、カリ
ウム塩などが挙げられる。特に、グルタミン酸、
アスパラギン酸などの酸性アミノ酸はナトリウム
又はカリウム塩として用いることが好ましい。ま
たリジンなどの塩基性アミノ酸は適当な酸で中和
したのち使用することが好ましい。 本発明方法においては、感作血球浮遊液にさら
に糖アルコールを溶存させることが好ましい。該
糖アルコールとしては、たとえばヘキシツト
（例、マンニツト、ソルビツト）、ペンチツト
（例、アラビツト、キシリツト）、テトリツト
（例、エリトリツト）などが挙げられる。なかで
も、マンニツトが好ましい。 本発明の溶存させる化合物の使用量は、凍結乾
燥に付される感作血球浮遊液全量〔感作血球濃度
を約4v／ｖ％とした場合〕に対し、二糖類の濃
度が約１〜15w／ｖ％、さらに好ましくは約２〜
10w／ｖ％となる量、血清アルブミンの濃度が約
0.1〜3w／ｖ％、さらに好ましくは約0.3〜2w／
ｖ％となる量、アミノ酸の濃度が約0.1〜5w／ｖ
％、さらに好ましくは約0.3〜2w／ｖ％となる
量、糖アルコールの濃度が約１〜30w／ｖ％、さ
らに好ましくは約３〜15w／ｖ％となる量がそれ
ぞれ用いられる。上記感作血球濃度が約4v／ｖ
％以外の場合には、上記の溶存させる化合物の使
用量は上記濃度と比例する量を用いることが出来
る。 凍結乾燥処理は、感作血球の凍結乾燥に適して
いる方法、条件が採用される。該処理は、感作血
球浮遊液を、たとえば温度としては約−40〜＋40
℃で、圧力としては約0.5〜10×10-2mmHgで、時
間としては約24〜72時間で行なわれる。 かくして得られる凍結乾燥感作血球はきわめて
安定で長時間室温以上で保存しても実質的に抗原
抗体反応の作用能は低下が認められず、かつ特異
性も保たれており凝集反応像も鮮明でありその上
美麗な粉末で外観にも優れており、しかも用時蒸
留水、生理食塩水及び各種緩衝液に対しての分散
性も優れているので用時に容易に感作血球浮遊液
を調製することが出来る。 このように、本発明の方法で得られた凍結乾燥
感作血球は、感作血球に要求される条件すなわち
(1)保存安定性、(2)凝集像の鮮明性（陰性像、陽性
像）、(3)凍結乾燥品の外観および(4)分散性のすべ
てを満足する優れたものである。 本発明方法に用いられる感作血球浮遊液は、通
常、固定化処理した哺乳動物赤血球又は鳥類赤血
球を血清学的活性物質で感作した後、適当な緩衝
液に浮遊させたものである。 該赤血球としては、たとえばヒト、ウマ、ウ
シ、ヒツジ、ヤギ、ウサギなどの哺乳動物赤血球
やニワトリ、ガチヨウ、七面鳥などの鳥類赤血球
が使用出来る。 該固定化処理は、一般に赤血球の固定に利用さ
れる固定剤のいずれを用いてもよく、たとえばホ
ルマリン、ピルビンアルデヒド、グルタールアル
デヒドなどが用いられる。上記のようにして固定
処理した赤血球をさらにタンニン酸処理して感作
してもよい。このタンニン酸処理は、自体公知の
方法に準じて行なうことができ、たとえば、固定
赤血球浮遊液にタンニン酸含有液（通常約0.001
〜0.04w／ｖ％程度が好ましい）を振盪下に小量
ずつ添加したのち、室温下に約0.5〜３時間程度
放置または振盪することにより、血清学的活性物
質に対する吸着能が増強された赤血球を得ること
ができる。 このようにして得られた赤血球に感作させる血
清学的活性物質としては、抗原、ハプテンおよび
抗体などのいずれであつてもよい。たとえば免疫
グロブリン、アルブミン、フイブリノーゲン（フ
イブリンおよびそれらの分解産物）、AFP、Ｃ反
応性タンパク、β2−ミクログロブリン、ミオグロ
ビン、ガン胎児性抗原、肝炎ウイルス抗原、
hCG、ヒト胎盤性ラクトーゲン、インスリンなど
のタンパク、ホルモン、投与薬剤など、またそれ
らの抗体などが挙げられる。かかる血清学的活性
物質で前記した赤血球を感作するに際しては、自
体公知の感作処理を採用することができ、赤血球
と血清学的活性物質とを水性溶媒（たとえば水、
生理食塩水、各種緩衝液など）中で接触させるの
がよく、一般に血清学的活性物質含有液と赤血球
の水性溶媒浮遊液とを混合し、静置することによ
り行なわれるが、所望により撹拌もしくは振盪し
て接触時間を短縮するようにしてもよい。血清学
的活性物質含有液としては、該活性物質を含有す
る血清、血漿もしくは精製活性物質含有液などが
挙げられる。とりわけ精製した血清学的活性物質
の溶液を用いて感作処理を行なうのが好ましく、
この場合通常約0.001〜10mg／mlとりわけ約0.01
〜２mg／ml程度の活性物質を含有する溶液を、約
１〜20％（Ｖ／Ｖ）とりわけ３〜10％（Ｖ／Ｖ）
程度の上記赤血球浮遊液に等容量添加するのがよ
い。本感作処理は、一般にPH約５〜８で約20〜60
℃の温度で行なうのが好ましい。本感作処理後、
所望により感作赤血球を水性溶媒で洗浄してもよ
い。かくして得られた感作赤血球は、水性溶媒た
とえばPH7.4のリン酸食塩緩衝液やPH７のヘペス
食塩緩衝液に約２〜20％（ｖ／ｖ）になるように
浮遊させる。 以下に実施例を挙げて、本発明をさらに具体的
に説明する。 実施例 １ (1) 抗hCG免疫グロブリンの調製 精製hCG（単位10000IU／mg）を完全フロイ
ントアジユバントと混合し、ウサギに免疫して
得た抗hCG血清（ウサギ）を飽和硫酸アンモニ
ウムを添加し塩析を行なつた。3000rpm30分間
遠心分離し、生じた沈殿を生理食塩水に溶解
し、一晩生理食塩水で透析して抗hCG免疫グロ
ブリン液を得た。 (2) 抗hCG感作血球浮遊液の調製 羊血球を常法に従つてピルビンアルデヒドで
固定化し、さらに公知の方法｛ジヤーナル・オ
ブ・エキスペリメンタル・メデイシン
（Journal of Experimental Medicine）第93
巻（1951年）第107項｝でタンニン酸処理して
得たタンニン酸処理固定化羊血球をリン酸緩衝
液に浮遊させた。これと上記hCG免疫グロブリ
ン液をリン酸緩衝液に濃度約0.13mg／mlに希釈
溶解したものとを等量混合し、56℃２時間反応
させて抗hCGを血球に感作した。 次いで得られた抗hCG感作血球を生理食塩水
で洗浄後、正常ウサギ血清0.5％を含むヘペス
緩衝食塩水中に１晩放置した後、生理食塩水で
洗浄し、表１記載の添加剤含有ヘペス緩衝食塩
水を用い４％（ｖ／ｖ）抗hCG感作血球浮遊液
を調製した。 (3) 凍結乾燥抗hCG感作血球の調製 上記抗hCG感作血球浮遊液を0.25mlずつバイ
アル瓶（２ml容量）に分注し約−30〜−40℃で
予備凍結したのち、真空凍結乾燥機に入れ排気
して真空にし温度を30℃まで徐々に上げなが
ら、約40時間乾燥した。ついで窒素ガスを充填
したのち、バイアルを封栓して、凍結乾燥抗
hCG感作血球を得た。 (4) 凍結乾燥感作血球の試験 実施例１(3)で調製した各凍結乾燥品につき37
℃に於ける外観、ヘペス緩衝食塩水に対する分
散性、感度の安定性、血球凝集像の鮮明さを調
べた。結果は表１に示すとおりである。なお、
感度の測定法は下記の通りである。すなわち、
上記凍結乾燥抗hCG感作血球１バイアルに対し
ヘペス緩衝食塩水１mlを添加し、１％抗hCG感
作血球浮遊液を調製した。各感作血球浮遊液
0.2mlずつを半球形の底部を有する内径約10mm
の小試験管にとり、これにhCG標準液0.1mlを
加え振とう混合し２時間静置後、試験管底部に
生ずる沈降像から沈降環が生ずる場合を陰性、
生じない場合を陽性として結果を判定した。結
果を第１表に示す。
【表】
【表】
【表】
上記の結果から明らかなように、本発明の二
糖類、血清アルブミンおよびアミノ酸さらに糖
アルコールを溶存し凍結乾燥する方が、個々の
成分の一種のみを溶存し凍結乾燥した場合、該
成分のうちの二種（すなわち、(a)二糖類および
血清アルブミン、(b)二糖類およびアミノ酸、(c)
血清アルブミンおよびアミノ酸）を溶存し凍結
乾燥した場合および該成分のうち糖アルコール
と他の一種または二種（すなわち、(d)糖アルコ
ールおよび二糖類、(e)糖アルコール、二糖類お
よび血清アルブミン、(f)糖アルコール、二糖類
およびアミノ酸）を溶存し凍結乾燥した場合よ
りも、抗hCG感度血球の外観、溶解性、感度、
陰性像の面で優れた安定性効果を示している。 実施例 ２ 実施例１と同様にして得た抗hCG感作血球浮遊
液に対して、次に示す安定剤を添加して行つた安
定性試験の結果を第２表に示す。なお、試験方法
は実施例１と同じである。各感作血球の感度は、
実施例１に示した試験法において、陽性反応を示
す最小hCG濃度で表わした。 表２から明らかなごとく、苛酷安定性試験（37
℃４週間保存）及び10℃、12カ月保存で、安定剤
としてマンニツト、シヨ糖、牛血清アルブミン及
びグルタミン酸ナトリウム（又はグリシン）を添
加した場合、感度、外観、溶解性、陰性像ともに
良好な成績であつた。
糖類、血清アルブミンおよびアミノ酸さらに糖
アルコールを溶存し凍結乾燥する方が、個々の
成分の一種のみを溶存し凍結乾燥した場合、該
成分のうちの二種（すなわち、(a)二糖類および
血清アルブミン、(b)二糖類およびアミノ酸、(c)
血清アルブミンおよびアミノ酸）を溶存し凍結
乾燥した場合および該成分のうち糖アルコール
と他の一種または二種（すなわち、(d)糖アルコ
ールおよび二糖類、(e)糖アルコール、二糖類お
よび血清アルブミン、(f)糖アルコール、二糖類
およびアミノ酸）を溶存し凍結乾燥した場合よ
りも、抗hCG感度血球の外観、溶解性、感度、
陰性像の面で優れた安定性効果を示している。 実施例 ２ 実施例１と同様にして得た抗hCG感作血球浮遊
液に対して、次に示す安定剤を添加して行つた安
定性試験の結果を第２表に示す。なお、試験方法
は実施例１と同じである。各感作血球の感度は、
実施例１に示した試験法において、陽性反応を示
す最小hCG濃度で表わした。 表２から明らかなごとく、苛酷安定性試験（37
℃４週間保存）及び10℃、12カ月保存で、安定剤
としてマンニツト、シヨ糖、牛血清アルブミン及
びグルタミン酸ナトリウム（又はグリシン）を添
加した場合、感度、外観、溶解性、陰性像ともに
良好な成績であつた。
【表】
実施例 ３
(1) 抗AFP免疫グロブリンの調製
臍帯血から通常の方法により得られた
AFP16mgを0.5M NaClを含む0.1M NaHCO38
mlに溶解し、予めＮ／1000HClで洗浄したブロ
ムシアン化セフアロース4B〔フアルマシア・フ
アイン・ケミカルズ社（スエーデン）製〕３ｇ
に加え、５℃で一夜撹拌した。反応終了後
0.5M NaClを含む0.1M NaHCO3で十分洗浄
し、次いでHClでPH８に調製した0.5Mエタノ
ールアミン10mlを添加して室温で１時間反応さ
せた後、(1)1M NaClを含む0.1M酢酸緩衝液
（PH4.0）(2)1M NaClを含む0.1Mホウ酸緩衝液
（PH8.0）および(3)0.15M NaClを含む0.02Mホ
ウ酸緩衝液（PH8.0）で順次洗浄しカラムに充
填した（2.2〓×2.5cm）。35mlのヤギ抗AFP血清
を飽和硫酸アンモニウム法で塩析沈殿させ、得
られたγ−グロブリン画分を上記のAFP結合
セフアロース4Bカラムに付した。0.15M NaCl
を含む0.02Mホウ酸緩衝液（PH8.0）でカラム
を洗浄し、次いで0.17Mグリシン−塩酸緩衝液
（PH2.2）で溶出することによつて抗AFP抗体を
得た。 (2) 抗AFP感作血球浮遊液の調製 ヤギ赤血球を常法に従つてグルタールアルデ
ヒドで固定化し、さらにタンニン酸処理して得
たタンニン酸処理固定化ヤギ血球を30％（Ｖ／
Ｖ）の濃度にリン酸緩衝液中に浮遊させ、これ
に実施例３(1)で調製した抗AFP抗体のリン酸
緩衝液溶液（0.7mg／ml）を等容量混合し、56
℃で３時間反応させてAFPをヤギ血球に感作
した。次いで得られた感作血球を生理食塩水で
洗浄し、正常ウサギ血清0.5％を含むリン酸食
塩緩衝液中で放置した後、生理食塩水で洗浄
し、５％マンニツト、2.5％シヨ糖、0.5％グル
タミン酸ナトリウム、0.5％牛血清アルブミン
および0.1％NaN3を含む水溶液に1.8％（Ｖ／
Ｖ）になるように抗AFP感作血球を浮遊させ
た。 (3) 凍結乾燥抗AFP感作血球の調製 実施例３(2)で調製した抗AFP感作血球浮遊
液を0.5mlずつバイアル瓶に分注し、実施例１
(3)と同様の方法で凍結乾燥抗AFP感作血球を
調製した。このようにして得た抗AFP感作血
球について、実施例１(4)と同様の試験をAFP
標準液について実施したところ、表３に示すよ
うに、感度、外観、溶解性、陰性像ともに良好
な結果を与えた。
AFP16mgを0.5M NaClを含む0.1M NaHCO38
mlに溶解し、予めＮ／1000HClで洗浄したブロ
ムシアン化セフアロース4B〔フアルマシア・フ
アイン・ケミカルズ社（スエーデン）製〕３ｇ
に加え、５℃で一夜撹拌した。反応終了後
0.5M NaClを含む0.1M NaHCO3で十分洗浄
し、次いでHClでPH８に調製した0.5Mエタノ
ールアミン10mlを添加して室温で１時間反応さ
せた後、(1)1M NaClを含む0.1M酢酸緩衝液
（PH4.0）(2)1M NaClを含む0.1Mホウ酸緩衝液
（PH8.0）および(3)0.15M NaClを含む0.02Mホ
ウ酸緩衝液（PH8.0）で順次洗浄しカラムに充
填した（2.2〓×2.5cm）。35mlのヤギ抗AFP血清
を飽和硫酸アンモニウム法で塩析沈殿させ、得
られたγ−グロブリン画分を上記のAFP結合
セフアロース4Bカラムに付した。0.15M NaCl
を含む0.02Mホウ酸緩衝液（PH8.0）でカラム
を洗浄し、次いで0.17Mグリシン−塩酸緩衝液
（PH2.2）で溶出することによつて抗AFP抗体を
得た。 (2) 抗AFP感作血球浮遊液の調製 ヤギ赤血球を常法に従つてグルタールアルデ
ヒドで固定化し、さらにタンニン酸処理して得
たタンニン酸処理固定化ヤギ血球を30％（Ｖ／
Ｖ）の濃度にリン酸緩衝液中に浮遊させ、これ
に実施例３(1)で調製した抗AFP抗体のリン酸
緩衝液溶液（0.7mg／ml）を等容量混合し、56
℃で３時間反応させてAFPをヤギ血球に感作
した。次いで得られた感作血球を生理食塩水で
洗浄し、正常ウサギ血清0.5％を含むリン酸食
塩緩衝液中で放置した後、生理食塩水で洗浄
し、５％マンニツト、2.5％シヨ糖、0.5％グル
タミン酸ナトリウム、0.5％牛血清アルブミン
および0.1％NaN3を含む水溶液に1.8％（Ｖ／
Ｖ）になるように抗AFP感作血球を浮遊させ
た。 (3) 凍結乾燥抗AFP感作血球の調製 実施例３(2)で調製した抗AFP感作血球浮遊
液を0.5mlずつバイアル瓶に分注し、実施例１
(3)と同様の方法で凍結乾燥抗AFP感作血球を
調製した。このようにして得た抗AFP感作血
球について、実施例１(4)と同様の試験をAFP
標準液について実施したところ、表３に示すよ
うに、感度、外観、溶解性、陰性像ともに良好
な結果を与えた。
【表】
実施例 ４
(1) 抗ヒトIgE感作血球浮遊液の調製
羊血球を用い、常法に従つて、グルタールア
ルデヒド固定をし、さらにタンニン酸処理して
得たタンニン酸処理固定化羊血球を10％（Ｖ／
Ｖ）の濃度になるようにリン酸緩衝液中に浮遊
させ、これに濃度0.1mg／mlの抗ヒトIgEヤギ血
清ガンマグロブリンのリン酸緩衝液を等容量混
合し、56℃２時間反応させて抗ヒトIgEガンマ
グロブリンを羊血球に感作した。次いで得られ
た感作血球を生理食塩水で洗浄し、正常ウサギ
血清0.5％を含むリン酸食塩緩衝液中に放置し
た後生理食塩水で洗浄し、10％マンニツト、５
％シヨ糖、１％牛血清アルブミン、１％グルタ
ミン酸ナトリウム及び0.1％NaN3を含む水溶液
に４％（Ｖ／Ｖ）になるように抗ヒトIgE感作
血球を浮遊させた。 (2) 凍結乾燥抗ヒトIgE感作血球 実施例４(1)で調製した抗ヒトIgE感作血球浮
遊液を0.5mlずつバイアル瓶（容量２ml）に分
注し、実施例１(3)と同様な方法で凍結乾燥抗ヒ
トIgE感作血球を調製した。 (3) 感度の測定 このようにして得た凍結乾燥抗ヒトIgE感作
血球についてＶプレートを使用するマイクロタ
イター法を用いて、ヒトIgEの測定を行なつ
た。すなわち、凍結乾燥感作血球１バイアルに
対しヘペス緩衝食塩水１mlを添加して、感作血
球浮遊液を調製した。一方ヒトIgE標準希釈液
をＶプレートウエルに0.05ml分取し、リン酸緩
衝液食塩水を用いて、２倍段階希釈系列を作
り、これに前記の感作血球浮遊液0.05mlを加え
て混合、振とうし、室温で１時間静置後、各ウ
エル底部の凝集像より、凝集の起つているもの
を陽性とし、そうでないものを陰性として結果
を判定した。 感作血球の感度は陽性反応を示す最小ヒト
IgE濃度で表わした。結果は第４表に示された
ごとく、外観、溶解性は無論のこと、感度、陰
性像とも良好な成績を示した。
ルデヒド固定をし、さらにタンニン酸処理して
得たタンニン酸処理固定化羊血球を10％（Ｖ／
Ｖ）の濃度になるようにリン酸緩衝液中に浮遊
させ、これに濃度0.1mg／mlの抗ヒトIgEヤギ血
清ガンマグロブリンのリン酸緩衝液を等容量混
合し、56℃２時間反応させて抗ヒトIgEガンマ
グロブリンを羊血球に感作した。次いで得られ
た感作血球を生理食塩水で洗浄し、正常ウサギ
血清0.5％を含むリン酸食塩緩衝液中に放置し
た後生理食塩水で洗浄し、10％マンニツト、５
％シヨ糖、１％牛血清アルブミン、１％グルタ
ミン酸ナトリウム及び0.1％NaN3を含む水溶液
に４％（Ｖ／Ｖ）になるように抗ヒトIgE感作
血球を浮遊させた。 (2) 凍結乾燥抗ヒトIgE感作血球 実施例４(1)で調製した抗ヒトIgE感作血球浮
遊液を0.5mlずつバイアル瓶（容量２ml）に分
注し、実施例１(3)と同様な方法で凍結乾燥抗ヒ
トIgE感作血球を調製した。 (3) 感度の測定 このようにして得た凍結乾燥抗ヒトIgE感作
血球についてＶプレートを使用するマイクロタ
イター法を用いて、ヒトIgEの測定を行なつ
た。すなわち、凍結乾燥感作血球１バイアルに
対しヘペス緩衝食塩水１mlを添加して、感作血
球浮遊液を調製した。一方ヒトIgE標準希釈液
をＶプレートウエルに0.05ml分取し、リン酸緩
衝液食塩水を用いて、２倍段階希釈系列を作
り、これに前記の感作血球浮遊液0.05mlを加え
て混合、振とうし、室温で１時間静置後、各ウ
エル底部の凝集像より、凝集の起つているもの
を陽性とし、そうでないものを陰性として結果
を判定した。 感作血球の感度は陽性反応を示す最小ヒト
IgE濃度で表わした。結果は第４表に示された
ごとく、外観、溶解性は無論のこと、感度、陰
性像とも良好な成績を示した。
Claims (1)
- １ 二糖類、血清アルブミン、アミノ酸お
よび糖アルコールを溶存させた感作血球浮遊液
を凍結乾燥することを特徴とする凍結乾燥感作血
球の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP22104982A JPS59109862A (ja) | 1982-12-15 | 1982-12-15 | 凍結乾燥感作血球の製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP22104982A JPS59109862A (ja) | 1982-12-15 | 1982-12-15 | 凍結乾燥感作血球の製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS59109862A JPS59109862A (ja) | 1984-06-25 |
| JPH0230668B2 true JPH0230668B2 (ja) | 1990-07-09 |
Family
ID=16760687
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP22104982A Granted JPS59109862A (ja) | 1982-12-15 | 1982-12-15 | 凍結乾燥感作血球の製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS59109862A (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5059518A (en) * | 1988-10-20 | 1991-10-22 | Coulter Corporation | Stabilized lyophilized mammalian cells and method of making same |
| IT1250075B (it) * | 1991-12-18 | 1995-03-30 | Serono Cesare Ist Ricerca | Composizioni farmaceutiche contenenti gonadotropine. |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS4921052A (ja) * | 1972-06-16 | 1974-02-25 |
-
1982
- 1982-12-15 JP JP22104982A patent/JPS59109862A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS59109862A (ja) | 1984-06-25 |
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