JPH0236906B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は免疫的に不活性な部分および免疫決定
基としての特定のアミノ配列を含有することを特
徴とする抗原的に活性な合成ポリペプチドおよび
その製造方法に関する。 スエーデン特許出願第73−08917−９号および
米国特許第3960827号明細書において癌関連ポリ
ペプチド抗原（CAPA）、その単離方法ならびに
その癌診断および抗体製造における使用が記載さ
れている。前記CAPAは現在「組織ポリペプチド
抗原」をあらわすTPAの表示の下に商業化され
ている。前記特許出願および米国特許明細書から
明らかなように、自然抗原の単離は、たとえ実用
上有用な生成物を生成するとしても、高い製造コ
ストならびに腫瘍組織等のような所要の出発物質
の供給が場合により困難であることを包含する複
雑な処理手段である。この背景に対して、合成に
より製造される抗原が、その組成に関して正確に
特定された生成物を生成する可能性そしてさらに
前記生成物を都合のよい価格で製造することがで
きるという事実に鑑みて、極めて興味深いことは
いうまでもない。 添付の図面において、該図は赤血球凝集抑制試
験における天然CAPAと後記実施例１によつて得
られる本発明の代表的合成抗原との比較を示す
が、該図に関しては以下に詳記する。 本発明の主目的は前記特許出願明細書に記載の
ポリペプチド抗原により生成される抗体と単一特
異的に反応する抗原的に活性な合成ポリペプチド
を提提供することである。 本発明によれば、活性免疫決定基として式 −Ｙ−Tyr−Leu−Asp−Ｘ−Val −Arg−Ala−Leu−Glu −Ala−Ala−Ｚ− （式中ＸはLeuまたはLysを意味し、ＹはGlnま
たはLysでありそしてＺはAsnまはAspを意味す
る）のアミノ酸配列を含有する癌治療または癌診
断用合成ポリペプチド抗原が提供される。 上記一般式で用いられるアミノ酸の略語は以下
の意味を表わす。 アミノ酸 略語 アラニン Ala アルギニン Arg アスパラギン Asn アスパラギン酸 Asp グルタミン Gln グルタミン酸 Glu グリシン Gly イソロイシン Ile ロイシン Leu チロシン Tyr バリン Val トレオニン Thr フエニルアラニン Phe リジン Lys 本発明の好ましい態様では、式 −Ala−Ｙ−Tyr−Leu−Asp−Ｘ −Val−Arg−Ala−Leu −Glu−Ala−Ala−Ｚ−Gly− （式中Ｘ、ＹおよびＺは前記した意味を有する）
のアミノ酸配列を含有する合成ポリペプチド抗原
が提供される。 本発明はまた前記の抗原的に活性なポリペプチ
ドの製法にも関し、この本発明方法においては１
種のＮ−保護されたアミノ酸をエステル化によつ
て樹脂に結合させ、該Ｎ−保護基を除去し、そし
て第二のＮ−保護されたアミノ酸を前記の樹脂に
結合したアミノ酸のアミノ基とカツプリングさ
せ、該Ｎ−保護基を除去しそして第三のＮ−保護
されたアミノ酸と前記カツプリング工程を繰り返
す。以上の方法における保護基は通常の基であり
以下の記載において詳記される。前記の工程を所
望のアミノ酸列が得られるまでくり返し、次にポ
リペプチドを前記樹脂から開裂させる。前記の樹
脂に結合したアミノ酸にＮ−保護されたアミノ酸
を結合させる操作後にすべての副生成物および未
反応可溶性物質を洗去することが好ましい。 上記の合成に使用される樹脂はスチレンがその
主要部分を構成するスチレンとジビニルベンゼン
との共重合体、例えばスチレン約98％およびジビ
ニルベンゼン約２％からなる共重合体からなつて
いてもよい。 前記第一のアミノ酸とのカツプリングに対する
反応性基を与えるためにベンゼン環は一部クロロ
メチル化されているのが適当である。このクロロ
メチル化された樹脂をＮ−保護されたアミノ酸の
トリエチルアミン塩で処理する場合、ベンジルエ
ステルのタイプの結合が形成される。このような
結合は前述の合成過程において安定であるが、酢
酸またはトリフルオロ酢酸中HBrにより開裂さ
れ、前記のＮ−保護基が同時に除去され、そして
ペプチドが前記樹脂から分離される。 アミノ酸を保護するためには、酢酸中のHClに
より開裂するのが好都合な第３級ブチルオキシカ
カルボニル基を使用するのが適当である。さらに
また、この目的に対してはカルボベンゾキシ基を
使用することもできるが、この場合には前記保護
基の除去に際して酢酸中HBrを使用しなければ
ならない。保護基としてはｏ−ニトロフエニルス
ルフエニル基もまた使用し得る。その他の保護基
もまた使用しうるがそのような保護基は当業者に
明らかであろう。 上記の合成において最もよく使用されるカツプ
リング試薬はジシクロヘキシルカルボジイミドで
ある。塩化メチレンを溶媒として使用し、約50％
過剰の３級ブチルオキシカルボニルアミノ酸およ
びジシクロヘキシルカルボジイミドを使用する場
合には定量的反応が数分以内に達成される。ジメ
チルホルムアミドもまた溶媒として使用されう
る。前記合成手段のさらに詳細に関しては「プロ
テイン・シークエンス・デイターミネイシヨン」
（Saul.B.Needleman要約、Springer−Verlag，
Berlin−Heideleberg−NewYork発行、1970年）
の特に第308〜310頁が参照されている。その他の
カツプリング剤もまた適当であり当業者には明ら
かであろう。 次に本発明を以下の実施例により例示するがこ
れらの実施例は本発明を限定するものではない。 実施例 １ メリフイールド（Merrifield−前記文献参照）
による固相方法により次の生成物が得られる。 （式中、Ｒ＝樹脂部分、Boc＝第３級ブチルオキ
シカルボニル基、

【式】

【式】R₄＝R₂、R₅＝Ｈ、

【式】 R₇＝CH₃、R₈＝R₇、R₉＝R₂、R₁₀＝R₃、R₁₁＝
R₇、 R₁₃＝R₁、 R₁₄＝R₃、

【式】R₁₆＝R₃、

【式】 R₁₉＝R₇、R₂₀＝R₃、R₂₁＝R₂、R₂₂＝R₁₅、R₂₃
＝R₆、R₂₄＝R₂₅＝R₃、そしてR₂₆＝R₇ 前記第３級ブチルオキシカルボニル基を樹脂部
分との間のアミノ酸列は前述のアミノ酸略語を使
用した次の式 Ala−Leu−Leu−Asn−Asp−Glu −Leu−Ala−Gln−Tyr−Leu−Asp−Leu −Val−Arg−Ala−Leu−Glu −Ala−Ala−Asn−Gly −Glu−Leu−Glu−Val （） であらわされる。 Boc−バリン（樹脂ベンジルエステル）0.4ミ
リモルをベツクマンのペプチド合成容器のクベツ
トに移し、塩化メチレン（CH₂Cl₂）中で膨張さ
せた。前記の保護基Boc−基を塩化メチレン中過
剰のトリリフルオロ酢酸で処理することによつて
除去した。塩化メチレンで洗浄後、前記樹脂をト
リエチルアミンで中和し塩化メチレンで再度洗浄
した。CH₂Cl₂中に溶解させたＮ−Boc−グルタ
ミン酸ベンジルエステル（カツプリング工程１）
およびシクロヘキシルカルボジイミドを添加して
その混合物を30分間撹拌した。樹脂を洗浄し、前
記カツプリング工程を繰り返した。以上により前
記工程１においてR₂の導入が完了する。 合成の工程２はＮ−末端アミノ酸からＮ−Boc
を除去し、別のＮ−Boc−アミノ酸を使用して前
記カツプリング工程を繰り返すことによつて開始
される。前述のアミノ酸列の形成に際しては以後
の工程において次の試薬が使用される。工程 試 薬 ２ Ｎ−Boc−ロイシン ３ 工程１に同じ ４ Ｎ−Boc−グリシン ５ Ｎ−Boc−アスパラギン−キサントヒドリル
誘導体 ６ Ｎ−Boc−アラニン ７ 工程６に同じ ８ 工程１に同じ ９ 工程２に同じ 10 工程６に同じ 11 Ｎ−Boc−Ｇ−トシルアルギニン 12 Ｎ−Boc−バリン 13 工程２に同じ 14 Ｎ−Boc−アスパラギン酸ベンジルエステル 15 工程２に同じ 16 Ｎ−Boc−チロシン−３−クロロベンジルエ
ーテル 17 Ｎ−Boc−クルタミン−キサントヒドリン誘
導体 18 工程６に同じ 19 工程２に同じ 20 工程１に同じ 21 工程14に同じ 22 工程５に同じ 23 工程２に同じ 24 工程２に同じ 25 工程６に同じ 保護された樹脂結合ペプチドから保護基が除去
され、樹脂は無水弗化水素素を０℃において30分
間使用することによつて開裂され、そしてペプチ
ドが前記樹脂から10％酢酸水溶液により抽出され
る。蒸発後、残留物を0.1M MH₄HCO₃中セフア
デツクスG25フアイン（Sephadex G25Fine）上
のゲル過により精製する。ペプチドの凍結乾燥
後、満足すべきアミノ酸分析が達成され同時にゲ
ル過により測定されるごとき約3000の分子量が
得られる。理論的分子量値は2959.71である。 以上の方法により製造されたポリペプチドに関
し、天然癌抗原で標識されたタンニン酸処理ヒツ
ジ赤血球と天然癌抗原（CAPAまたはTPA）の
使用によつて製造される抗体との間の赤血球凝集
反応を抑制するその能力の研究がなされた。この
技術の詳細に関しては前述のスエーデン特許出願
第73−08917−９号および米国特許第3960827号明
細書が参照される。前記ポリペプチドの特異活性
は0.024単位／mg(U/mg)であることが見出された。
前記特異活性単位は最小数または最小量の抗体
（抗体の最大希釈）により十分凝集されるように
10⁹個のヒツジ赤血球の標識に要する活性ポリペ
プチドの1/6量として定義される。 前記の基本構造を有するポリペプチドの活性に
対して臨床的な作用を研究する目的である種の実
験が行なわれた。中央に位置するアルギニンをシ
クロヘキサンジオンによりPH13において保護する
と活性損失は99.5％に達した。しかしながら、前
記ポリペプチドをPH13の塩基性環境のみに前記と
同一時間にわたつて付す場合には活性はわずかに
約20％低下するに過ぎない。これは本発明による
ポリペプチド中アルギニンの存在がその抗原活性
に対して決定的重要性を有するという事実を示
す。ポリペプチド中のチロシンの効果を研究する
目的で前記ポリペプチドをPH9.5において沃素で
処理した。沃素を前記ポリペプチドのチロシン含
量に関して約10000倍の過剰量で使用する場合に
は約85％の活性損失が起こり、1000位過剰では約
75％の活性損失が起こり、これに対して100倍過
剰では40〜50％の活性が消失する。しかしなが
ら、わずかに約10倍の過剰ではポリペプチドの活
性は影響を受けない。 前記基本構造の特性によれば、該ポリペプチド
は酸性特性を有することが明らかであり、従つて
中性溶液中では陰性に帯電されるが、一方ではそ
のアルギニン部分の陽性帯電を保持している。 本発明のポリペプチドの抗原特性に対する化学
的根拠は以上に記載のとおりである。合成により
製造される生成物（その活性はハプテン性である
ということができる）により前記小決定基に基づ
いて達成された顕著な特異活性は癌分野において
免疫および試験の適用すなわち診断に関し開拓的
進進歩を達成する。 免疫学に関して既知の事実によれば、抗原活性
はハプテン決定基の構造だけでなくポリペプチド
のサイズの関数であることが明らかである。しか
しながら、前記サイズは該ペプチドの特異性に対
しては影響を与えることはなく、単に活性度に影
響を与えるに過ぎない。これは、より大きい分子
はより小さい分子よりも一層活性である傾向があ
るからである。従つて、前記ポリペプチドが適当
な免疫原的に活性なキヤリアー、例えばアルブミ
ン例えば卵卵白のようなプロテイン上に配置され
る場合には改良された活性が達成される。しかし
ながら、前記ポリペプチドはその基本的構造形態
すなわち少なくとも７個のアミノ酸単位を有する
形態においてすでに該ポリペプチドと相当する抗
体との反応を可能にするのに十分な抗原活性を示
す。さらに、前記ポリペプチドは抗体産生にも使
用されうる。しかしながら、この場合には前記ポ
リペプチドをキヤリアーとして作用する適当なプ
ロテインあるいは所謂「シユレツパー抗原」例え
ば豚血清とカツプリングさせることが必要であ
る。以上述べたように、前述の活性は７個のごと
く少数のアミノ酸単位特に９個のアミノ酸単位か
ら開始されるポリペプチド連鎖に対して付与さ
れ、大体26個のアミノ酸単位において最大とな
り、そして30個以上のアミノ酸単位においても活
性は依然として存在し、前記ポリペプチド連鎖の
前記のような免疫決定基でない部分は免疫的に不
活性であるが、免疫決定基に対する「キヤリア
ー」供給作用を有する。 本発明は決して前述の特定の態様に限定される
ものではない。従つて、前記ポリペプチドの製造
に際して、樹脂はベンゼン環およびさらにエステ
ル化化によりＮ−保護されたアミノ酸を結合する
能力を有する少くとも１個の基を含有するならば
任意のものでありうる。該エステル結合は相対的
に加水分解しやすくなければならず、またポリペ
プチド中のペプチド結合よりも一層開裂しやすい
ものでなければならない。しかしながら、前記エ
ステル結合は以上の合成の反応条件に耐え得るよ
うに十分安定でなければならない。 前述のカツプリング剤、ジシクロヘキシルカル
ボジイミドの代りとして、グルタミン単位および
アスパラギン単位を結合させる場合に所謂活性エ
ステル例えばシアノメチル、チオフエニルまたは
ニトロフエニルエステルによりカツプリングを行
なつてもよい。前記合成における溶媒としては所
謂非プロテン性溶媒が適当であり、特に若干親水
性または「半極性」の溶媒が適当である。 Ｎ−アミノ酸を保護する有用な基に関しては、
１個または２個のメチル基がフエニルによつて置
きかえられている第３級ブチルオキシカルボニル
基もまた有利に使用され得ることが知られてい
る。これに関連して、前記合成によつて得られる
生成物はＮ−保護基を含有し、樹脂に対してエス
テル化によつて結合しさらに長期間にわたつてな
んら破壊されることなく都合よく貯蔵され得るこ
とが指摘されうる。次にポリペプチドの用途に関
連して前記保護基および樹脂部分が除去されう
る。 本発明による製造に関して記載された前記のア
ミノ酸列において（保護基および樹脂部分を除去
した後の）末端基は常にそれぞれアミノ基および
カルボキシル基である。 前記実施例１において、合成されたポリペプチ
ドの抗原活性は次の方法で測定された。 ポリペプチド量の定量的測定法として、前記ペ
プチド７mgを緩衝液級血清すなわち不活性の人血
清２％を含有し、燐酸塩緩衝液によりPH約7.5に
緩衝化された生理食塩溶液1.4ml中に溶解させる。
連続希釈下、ポリペプチド濃度を漸減させた前記
溶液の一連の試料を調製し、TPAに対する特異
抗体を含有する所定の量の抗血清を前記各試料に
添加する。次に、生成する各試料に対してインキ
ユベーシヨン後、粒状キヤリアー上に担持された
ポリペプチドの所定の量を添加すると、利用し得
る抗体の量に担当する程度の赤血球凝集が起こ
る。これと並行して、既知のTPA漸減量を含有
する一連の対照試料を調製する。次に、一連の希
釈試験プレート上の対照試料の赤血球凝集沈着の
直径をその各空洞において測定し、得られる直径
値をTPA濃度に対してプロツトするとＳ字形曲
線が得られ、その中間部分は屈折点を急勾配の傾
斜として含有する。前記赤血球凝集沈着の直径
の、TPA濃度の関数としての曲線は添付の図面
において曲線Ｂとして示される。 前記の同一の図面において、合成ポリペプチド
の相当する曲線は曲線Ａとして示され、TPAの
特異活性が既知の場合、前述の合成ポリペプチド
の特異活性は0.024単位／ペプチドmgであること
が見出される。 実施例 ２ 実施例１と同様の方法で次のポリペプチドが製
造され、前記実施例１のポリペプチドとほぼ等し
い免疫活性を示すことが見出される。 Thr−Asp−Leu−Asp−Asp−Arg−Leu−
Ala−Lys−Tyr−Leu−Asp−Lys−Val−Arg−
Ala−Leu−Glu−Ala−Ala−Asp−Gly−Glu−
Leu−Glu−Val 実施例 ３ 実施例１と同様の方法で次のポリペプチドが製
造され、前記実施例１のポリペプチドとほぼ等し
い免疫活性を示すことが見出される。 Ala−Gln−Tyr−Leu−Asp−Leu−Val−Arg
−Ala−Leu−Glu−Ala−Ala−Asn−Gly−Glu
−Leu−Glu−Val 上記の決定基が不活性牛アルブミンと約１：１
のモル比で水溶性カルボジイミド（EDC）によ
りカツプリングされる場合に前記ペプチドの免疫
活性が保持される。 実施例 ４ 実施例１と同様の方法で次のポリペプチドが製
造され、前記実施例１のポリペプチドとほぼ等し
い免疫活性を示すことが見出される。 Leu−Asn−Asp−Glu−Leu−Ala−Gln−Tyr
−Leu−Asp−Leu−Val−Arg−Ala−Leu−Glu
−Ala−Ala−Asn−Gly−Arg−Leu−Glu−Val 実施例３に記載の方法と同様の方法で不活性ア
ルブミンにカツプリングされる場合その活性は保
持された。 実施例 ５ 実施例１と同様の方法で次のポリペプチドが製
造され、前記実施例１のポリペプチドとほぼ等し
い免疫活性を示すことが見出される。 Asn−Asp−Ile−Leu−Ala−Gln−Tyr−Leu
−Asp−Leu−Val−Arg−Ala−Leu−Glu−Ala
−Ala−Asn−Gly 実施例 ６ 実施例１と同様の方法で次のポリペプチドが製
造され、前記実施例１のポリペプチドとほぼ等し
い免疫活性を示すことが見出される。 Asp−Asp−Arg−Leu−Ala−Lys−Tyr−
Leu−Asp−Lys−Val−Arg−Ala−Leu−Glu−
Ala−Ala−Asp−Gly 実施例 ７〜22 実施例１と同様の方法で次のポリペプチドが製
造され、前記実施例１のポリペプチドとほぼ等し
い免疫活性を示すことが見出される。

【表】 実施例 23 実施例１と同様の方法で次のポリペプチドが製
造され、前記実施例１のポリペプチドとほぼ等し
い免疫活性を示すことが見出される。 Thr−Asp−Leu−Asp−Asp−Arg−Leu−
Ala−Lys−Tyr−Leu−Asp−Lys−Val−Arg−
Ala−Leu−Glu−Ala−Ala−Asp−Gly−Glu−
Leu−Glu−Val−Phe−Asp−Glu−Leu−Asn−
Leu−Gln 実施例 24 実施例１と同様の方法で次のポリペプチドが製
造され、前記実施例１のポリペプチドとほぼ等し
い免疫活性を示すことが見出される。 Ala−Leu−Leu−Asn−Asp−Glu−Leu−Ala
−Gln−Tyr−Leu−Asp−Leu−Val−Arg−Ala
−Leu−Glu−Ala−Ala−Asn−Gly−Arg−Leu
−Glu−Val−Phe−Asp−Glu−Leu−Asn−Leu
−Gln 実施例 25 実施例１と同様の方法で次のポリペプチドが製
造され、前記実施例１のポリペプチドとほぼ等し
い免疫活性を示すことが見出される。 Ala−Leu−Leu−Asn−Asp−Ile−Leu−Ala
−Gln−Tyr−Leu−Asp−Leu−Val−Arg−Ala
−Leu−Glu−Ala−Ala−Asn−Gly−Arg−Leu
−Glu−Val 前記実施例１〜25で得られたポリペプチドと
Ｘ、ＹおよびＺとの関係を次の表に示す。

【表】

【表】 本発明の生成物、方法、条件および処理手段に
おいては各種の変形および同等物の置換がなされ
てもよく、従つて本発明は前述の特許請求の範囲
に記載されるすべての範囲によつてのみ限定され
るのであり、それらに対する均等物の教義の適用
を包含する。

【図面の簡単な説明】

添付の図面は赤血球凝集抑制試験の結果をあら
わし、曲線Ａは本発明の実施例１で得られる本発
明の合成ポリペプチドに関しそして曲線Ｂは対照
試料である天然癌抗原CAPAに関するものであ
る。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 活性免疫決定基として −Ｙ−Tyr−Leu−Asp−Ｘ−Val−Arg −Ala−Leu−Glu−Ala−Ala−Ｚ− （式中ＸはLeuまたはLysを意味し、ＹはGlnま
   たはLysでありそしてＺはAsnまたはAspを意味
   する）のアミノ酸配列を含有する癌治療または癌
   診断用合成ポリペプチド抗原。 ２ アミノ酸配列 −Ala−Ｙ−Tyr−Leu−Asp−Ｘ−Val −Arg−Ala−Leu −Glu−Ala−Ala−Ｚ−Gly− （式中Ｘ、ＹおよびＺは前記した意味を有する）
   を含有する前記第１項記載の抗原。 ３ 一方の末端位置の所望のＮ−保護されたアミ
   ノ酸とキヤリアーとをエステル化によりカツプリ
   ングさせ、該Ｎ−保護基を除去し、アミノ酸配列
   の第二の所望のＮ−保護されたアミノ酸を前記の
   キヤリアーと結合したアミノ酸のアミノ基とカツ
   プリングさせ、該Ｎ−保護基を開裂させそして以
   上のカツプリングを所望のアミノ酸配列を与える
   ための所望の回数反復し、得られるポリペプチド
   を前記キヤリアーから開裂させそして保護基をポ
   リペプチドから除去することによりアミノ酸配列
   を段階的に構成して、活性免疫決定基として式 −Ｙ−Tyr−Leu−Asp−Ｘ−Val −Arg−Ala−Leu−Glu −Ala−Ala−Ｚ− （式中ＸはLeuまたはLysを意味し、ＹはGlnま
   たはLysでありそしてＺはAsnまたはAspを意味
   する）のアミノ酸配列を含有する癌診断または癌
   治療用合成ポリペプチド抗原を製造する方法。 ４ Ｎ−保護されたアミノ酸とキヤリアー結合ア
   ミノ酸またはアミノ酸配列とのカツプリング後毎
   に副生成物および未反応可溶性物質を洗去するこ
   とからなる前記第３項記載の方法。 ５ カツプリング試薬としてジシクロヘキシルカ
   ルボジイミドを使用することからなる前記第３項
   または第４項記載の方法。 ６ 溶媒として塩化メチレンまたはジメチルホル
   ムアミドを使用することからなる前記第３項ない
   し第５項のいずれか一項に記載の方法。 ７ 保護基として第３級ブチルオキシカルボニル
   基を使用することからなる前記第３項ないし第６
   項のいずれか一項に記載の方法。