JPH0238601B2 - - Google Patents

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JPH0238601B2
JPH0238601B2 JP61053838A JP5383886A JPH0238601B2 JP H0238601 B2 JPH0238601 B2 JP H0238601B2 JP 61053838 A JP61053838 A JP 61053838A JP 5383886 A JP5383886 A JP 5383886A JP H0238601 B2 JPH0238601 B2 JP H0238601B2
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Deru Bono Rinarudo
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Pajera Pierugiuzetsupe
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MEDEIORANAMU PHARM Srl
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Description

【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野） 本発明は実質上、純粋な形状の、天然のヘパラ
ン硫酸およびデルマタン硫酸の新規の製造法に関
する。 更に詳しくは、本発明は、二つのムコ多糖類の
構造を一体的に保持させることのできる穏和な処
理によりプロテオグリカン類の蛋白質成分を除去
することに基づく、大動脈、心筋層および特別血
管化器官類からの動物組織のプロテオグリカン類
の混合物からヘパラン硫酸およびデルマタン硫酸
を製造する方法に関する。 本方法は、ヘパラン硫酸およびデルマタン硫酸
を実質上、純粋形で、即ち他のムコ多糖族で汚染
されずに得ることができ、生成物自身のどのよう
な化学的又は酵素的劣化をも避け、かつ工業生産
に容易に移行できる点において、既知の技術の方
法を越えた、疑いのない利点を提供する。 （従来の技術） 身体の各種中心に広く分布しているムコ多糖類
は不均質の高分子錯体から構成されており、かつ
果たすことが求められている役割に実質上、依存
して異なる構造および薬理学面を持つている。 構造の、従つて薬理学面の変化が、公知の方法
による工業的精製のために用いられる化学および
酵素処理により、しばしば生ずる。 ヘパラン硫酸およびデルマタン硫酸は概して、
ヘパラン処理の副産物であるムコ多糖混合物から
得られる。 ヘパリンを回収し、その汚染物を除去するのに
必要な、長い一連の化学および酵素処理、沈殿、
分別、等は常にヘパラン硫酸およびデルマタン硫
酸構造の劣化を生じ、その結果、使用の分別およ
び精製に関して、薬理学面の変化を生ずる。 公知技術の方法により操作する場合、ムコ多糖
類を解き放つ反応は蛋白質分解酵素を用いて55℃
で行なわれる。蛋白質凝固は100℃に加熱するこ
とにより行なわれ、更に錯体化は第四アンモニウ
ム塩を用いて行なわれる。当該技術の現状におい
て知られている、上記程、強力でない方法は特に
困難であり、高くつき、かつ実験室調製としてだ
け行なわれるに過ぎない。 （本発明が解決しようとする問題点） 大動脈中に、心筋層中に、かつ特別血管化器官
中に位置するムコ多糖類は凝固性止血に代表とし
て派遣されるが故に、それらの天然構造を変えず
に保存しながら、上記器管からそれらを抽出する
のに適した本発明方法の如き方法は特に重要であ
る。 本発明に依る方法は、蛋白質分解酵素により55
℃でムコ多糖類を解き放つ反応を避け、又、蛋白
質を凝固させるため100℃に加熱することを避け、
かつ更に又、第四アンモニウム塩による錯体化を
避ける。 従つて、実際上、上記物質を、これらの化合物
の微妙な構造を変性する処理に付する上記工程が
避けられる。 （問題点を解決するための手段） 本発明に依る、大動脈、心筋層および特別血管
化器官からの動物組織のプロテオグリカン類の混
合物から実質上、純粋形の天然ヘパラン硫酸およ
びデルマタン硫酸を製造する方法は下記の諸工程
を含む： − 尿素、グアニジン、チオ尿素及びチオシアン
酸カリからなる群から選ばれた一つの化合物の
溶液で処理して上記プロテオグリカン類を上記
組織から超微粉砕形状で抽出し； − 溶液を濾過し透明にして、かつ尿素、グアニ
ジン、チオ尿素及びチオシアン酸カリからなる
群から選ばれた一つの化合物を除去し； − 得られたプロテオグリカン類のムコ多糖類と
蛋白質との間の結合を分離し； − 蛋白質を沈殿させて過し； − 核酸の微量を除去し； − ムコ多糖類を沈殿させ； − ヘパラン硫酸およびデルマタン硫酸を分別
し、それらを精製する、諸工程。 本発明方法およびこれから得られる生成物の上
記およびその他の特徴は、本方法を実施するため
の好ましい方法および薬理学試験に関する、以後
の詳細な説明から一層、明らかになるであろう。 本方法は下記の二つの操作サイクルからなつて
いる：第１サイクルにおいては、原料から出発し
て、ムコ多糖類の混合物からなる粗生成物が生成
され；第２サイクルにおいてはこれを分別し、個
別のムコ多糖類を精製する。 本方法において使用される原料は、超微粉砕の
大動脈、心筋層および特別血管化器官からなる豚
の組織である。 別に、酢酸ナトリウム0.5ないし２重量％、
EDTAのナトリウム塩0.5ないし１重量％および
尿素20ないし35重量％を含有する脱イオン水溶液
を作り、この溶液中に、上記の微粉砕物を溶液対
微粉砕物の２：４重量比で懸濁させる。 プロテオグリカン類の抽出物を得るため、上に
得た懸濁液を室温で15ないし50時間、かきまぜ
る。 代りに、グアニジン、チオ尿素およびチオシア
ン酸カリを尿素の代りに使用できる。 上記懸濁液を回転過器で過して乳白色の液
体を得、尿素を部分除去するため、上記液体を管
状膜を通して限外過する。 溶液を脱イオン水で繰返し洗浄し、尿素含有率
が５重量％よりも低くなるまで限外過する。 ついで、この液を、最終NaCl濃度が1.5ないし
2.5Mとなる如き量の、8.7ないし14.5重量％の濃
度の塩化ナトリウム溶液で処理する。 ムコ多糖類と蛋白質の間の結合を分離すること
を目的としているこの処理は、周囲温度で５ない
し15時間、撹拌下に行なわれる。 ついで蛋白質を３ないし６重量％の濃度のトリ
クロル酢酸を加えて沈殿させ、ついでフイルター
プレスによる過により分離する。 ついで核酸の微量を、溶液に対して２ないし５
重量％の量の活性土で、３ないし４のPHで、撹拌
下に、周囲温度で２時間、処理して除去する。 固体をフイルタープレスによる過で分離し、
PHをNaOH溶液を加えて５ないし６に調整し、
ついでムコ多糖類を、溶液に対して0.8：１ない
し1.2：１の容量比の、アルコール又はケトン、
例えばメタノール、エタノール又はアセトンを加
えて沈殿させる。 過の際、乾燥基準で下記の平均組成をもつム
コ多糖類からなる粗生成物が得られる： コンドロイチン硫酸Ａ 15重量％ デルマタン硫酸 20重量％ ヘパラン硫酸 65重量％ 個別のムコ多糖類の粗生成物分別および精製は
下記の操作により行なわれる： 粗生成物を１ないし３重量％の溶液を与える如
き量の脱イオン水に溶解し、かくして得た溶液を
カチオン樹脂で処理し、ついで水酸化カルシウム
を加えて中和する。アセトンを加えて、下記の仕
方で個別のムコ多糖類の分別沈殿を行なう；30容
量％のアセトン濃度でデルマタン硫酸が沈殿し、
過により分離され；溶液中のアセトン濃度を更
に50容量％まで増すと、ヘパラン硫酸が沈殿す
る。 この二つの沈殿を、各々、別個に、溶液中、３
ないし７重量％の濃度となる如き量の2M塩化ナ
トリウム溶液中に再溶解する。 得た溶液を過して透明にし、それぞれのムコ
多糖類を溶液に対して0.8ないし２の容量比のメ
タノールで沈殿させる。 得た生成物を最後に凍結乾燥する。 本発明方法により得た生成物は下記の特性を持
つている： ヘパラン硫酸 − 分子量：5000ないし30000ダルトンの範囲内
（ムコ多糖標準に対しゲル過により定量）； − 硫酸化度：平均1.2SO4 =／ヘキソサミン（重
量法による定量）； − イズロン酸化度：30−40％（カルバゾール対
オルシノールの比で計算）； − 電気泳動；Rfが1.90−1.96cmである単一帯。
Cappellettl等の方法、Ana Lyt.Biochem.
（1979）99，311。実験時間：第１実験＝３分、
第２実験＝15分、第３実験＝20分。 デルマタン硫酸 − 分子量：20000ないし45000ダルトンの範囲内
（ムコ多糖標準に対しゲル過により定量）； − 硫酸化度：1.1−1.2SO4 =／ヘキソサミン（重
量法により定量）； − イズロン酸化度：45−65％（カルバゾール対
オルシノールの比で計算）； − 電気泳動；Rfが2.15−2.20cmである単一帯。
Cappelletti等の方法、Analyt.Biochem.
（1979）、99、311。実験時間：第１実験＝３分、
第２実験＝15分、第３実験＝20分。 これらの生成物は、トロンボゲン状態に罹患し
ている人間に経口又は非経口で投与した時、下記
の主な薬力学特性を示す； ヘパラン硫酸 − 抗凝固活性の欠除（ヘパト―クイツク；
PTTA）； − Xa因子に対し低活性； − アンチトロンビンの活性を誘発する； − 著しい線維素溶解作用を生ずる（通常の条件
下及び静脈静止後のオイグロブリン溶解）。 デルマタン硫酸 − 低抗凝固活性（ヘパト―クイツク；
PTTA）； − Xa因子に対する阻止作用； − アンチトロンビン血漿水準の低下を誘発す
る； − 著しい線維素溶解作用； − ヘパラン硫酸の線維素溶解作用を活性化しそ
れに協力する性質を有する。 薬理学試験 本発明方法により得たヘパラン硫酸およびデル
マタン硫酸の薬理学面及び上記両物質間の薬理学
的相互作用を、静脈性のトロンボゲン病（血栓性
静脈炎、静脈瘤性静脈炎、等）および動脈性のそ
れ（細管異常）にかかつている45ないし70才の両
性の篤志患者について生体内で評価した。 上記生成物を種々の投与水準で、単一の投与に
おいて、経口及び非経口の両者で投与し、かつ凝
固性及び線維素溶解プロセスについての相互作用
を種々の時間において評価した。 上記生成物が非経口及び経口投与の両者に対し
て定性的に同一の投与量依存薬理学面を持つこと
に留意した上で、下記に示すデータは、個別の化
合物間の相互作用又はそれらの連合、及ぼ凝固性
及び線維素溶解のプロセスの特性化を最も善く可
能にする最高の、試験筋肉内投与量に対して得ら
れたデータである。 個別の生成物、即ちヘパラン硫酸及びデルマタ
ン硫酸、及びヘパラン硫酸とデルマタン硫酸の等
重量の連合を用いた試験を行なつた。 ヘパラン硫酸とデルマタン硫酸の、等重量にお
ける連合が選ばれた理由は、かかる連合が、上記
両物質間のプラスの相互作用（凝固に対する補足
作用及びヘパラン硫酸の、デルマタン硫酸による
線維素溶解作用の活性化）を最も善く明示したこ
とを予備試験が既に示していたからである。 投与の詳細及び得られた結果を下記の表に示し
てある。
【表】
【表】
【表】
【表】 上記のデータは、純粋なヘパラン硫酸及びデル
マタン硫酸が、強力な処理無しに、従つて上記二
つの多糖類の天然構造を保持できる本発明方法に
依り得られた時、下記の薬理学性状をもつことを
示している： ａ ヘパラン硫酸又はデルマタン硫酸のいずれも
ヘパト―クイツク（Hepato−Quick）時間、
部分的トロンボプラスチン活性化時間又はトロ
ンビン時間を著しく改変することはできない。
上記両化合物の連合も同様に挙動する（第１
表）； ｂ デルマタン硫酸は著しいXa因子の抑制を行
なう；ヘパラン硫酸は著しい作用を示さない；
上記連合はデルマタン硫酸単独について得られ
た抑制値に均等のそれを持つ（第２表）； ｃ デルマタン硫酸投与は血漿抗トロンビン含
有量を実質上、減少する；ヘパラン硫酸はほん
の僅かであるがそれを増加する；上記連合は作
用をもたない（第２表）； ｄ ヘパラン硫酸は著しい線維素溶解作用を持
て、しかるにこの作用はデルマタン硫酸の場合
には低い；上記連合は上記作用の首尾一貫した
相乗作用及び時間の予測を示しており、ヘパラ
ン硫酸自身の線維素溶解作用と比べてデルマタ
ン硫酸により誘発された活性化を明らかに示し
ている（第３及び４表）。 それ故、本発明に依り得られたヘパラン硫酸は
デルマタン硫酸の薬理学性状に干渉されることな
く、実質上、線維素溶解及び抗トロンビン活性
化の性状を持つと言うことができる。 この後者は、凝固時間を著しく変えることな
く、驚ろくべきことにはヘパラン硫酸の線維素溶
解作用を活性化しながら（多分、ヘパリン共因子
の活性化を経て）Xa因子を抑制する際に著し
いはたらきをする。 75ないし600mg／日の投与量で経口で、及び50
ないし400mg／日の投与量で筋肉内での両者によ
る予備繰返し処置試験は上記の結果を確実にし、
かつ特に、著しい副作用の欠除のみならず、下記
の作用の存在を証明している： − デルマタン硫酸単独の場合、特に静脈血栓症
の防止における顕著な結果： − ヘパラン硫酸単独の場合、静脈及び動脈のト
ロボゲン形態の処置における顕著な結果； − ヘパラン硫酸／デルマタン硫酸連合の場合、
静脈及び動脈のトロンボゲン形態の、及びアテ
ローム性動脈硬化症発現の防止及び処置におい
て顕著な結果が得られている。 ヘパラン硫酸及びデルマタン硫酸の調製の下記
の実施例が本発明方法の非限定例示として記載さ
れる。 実施例 １ 喃乳動物由来の大動脈、心筋層組織及び相当、
血管化した器官1000Kgを超微粉砕し、脱イオン水
2000、酢酸ナトリウム20Kg、ECTAナトリウム
塩10Kg及び尿素700Kgから作つた溶液で24時間、
撹拌下に、周囲温度で処理した。 得た混合物を回転過器で過し、透明液を管
状膜で限外過し、約200に濃縮した。 ついで液を脱イオン水200で希釈し、ついで
限外過し、200に濃縮した。この脱イオン水
による希釈、限外過及び濃縮を更に２回繰返し
て尿素含有率が５重量％より低い溶液を得た。塩
化ナトリウムの2Mの濃度になるように加え、混
合物を撹拌下に８時間、周囲温度に保つた。20重
量％のトリクロル酢酸溶液40を加え、沈殿した
蛋白質をフイルタープレスで別した。 活性土６Kgを加え、PHを４に調整し、混合物を
撹拌下に２時間、周囲温度に保ち、ついでフイル
タープレスで過した。 KOHを加えて溶液のPHを5.5に調整し、同様な
容量部のメタノールを加えて、下記の平均組成を
もつムコ多糖混合物0.500Kgを沈殿させた： コンドロイチン硫酸Ａ 13.5重量％ デルマタン硫酸 22.0重量％ ヘパラン硫酸 64.6重量％ この混合物を、２重量％の濃度の溶液を与える
如き量の脱イオン水に溶解し、この溶液をカチオ
ン樹脂で処理し、水酸化カルシウムで中和し、そ
の後、30容量％の濃度になるようにアセトンを加
えた。 デルマタン硫酸がこの仕方で沈殿し、傾斜と
過により回収した。 アセトンを液に更に加えて、50容量％の濃度と
なし、ヘパラン硫酸を沈殿させ、傾斜と過によ
り回収した。 上記の二つの生成物を各々別個に下記の仕方で
更に処理した： それらを、上記二つの生成物の５重量％の溶液
を与える如き量の2Mの塩化ナトリウム溶液に再
溶解し、溶液を過し、上記二つの生成物を、溶
液に対して１：２の容量比のメタノールで処理し
て再沈殿させた。 上記二つの生成物を最後に凍結乾燥し、かくし
て凍結乾燥状のヘパラン硫酸240ｇとデルマタン
硫酸150ｇを得た。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １ 下記の諸工程を特徴とする、大動脈、心筋層
    および特別血管化器官からの動物組織のプロテオ
    グリカン類の混合物から事実上、純枠形の天然ヘ
    パラン硫酸およびデルマタン硫酸を製造する方
    法： − 尿素、グアニジン、チオ尿素及びチオシアン
    酸カリからなる群から選ばれた一つの化合物の
    溶液で処理して上記プロテオグリカン類を上記
    組織から超微粉砕形状で抽出し； − 溶液を濾過し透明にして、かつ尿素、グアニ
    ジン、チオ尿素及びチオシアン酸カリからなる
    群から選ばれた一つの化合物を除去し； − 得られたプロテオグリカン類のムコ多糖類と
    蛋白質との間の結合を分離し； − 蛋白質を沈殿させて濾過し； − 核酸の微量を除去し； − ムコ多糖類を沈殿させ； − ヘパラン硫酸およびデルマタン硫酸を分別
    し、それらを精製する、諸工程。 ２ 上記の組織を、溶液対組織の重量比が２ない
    し４である、0.5ないし２重量％の酢酸ナトリウ
    ム、0.2ないし重量％のEDTAのナトリウム塩及
    び20ないし30重量％の尿素を含有する脱イオン水
    の溶液で、攪拌下に、周囲温度で、15ないし50時
    間の時間の間、処理して、上記のプロテオグリカ
    ン抽出を行なうことを特徴とする、特許請求の範
    囲第１項に記載の方法。 ３ 上記の尿素、グアニジン、チオ尿素及びチオ
    シアン酸カリからなる群から選ばれた一つの化合
    物の除去が、脱イオン水による希釈及び限外濾過
    による濃縮の繰返しにより行なわれ、この繰返し
    は、５重量％より低い尿素、グアニジン、チオ尿
    素及びチオシアン酸カリからなる群から選ばれた
    一つの化合物の含有率を持つ溶液が得られるまで
    続けられることを特徴とする、特許請求の範囲第
    １項に記載の方法。 ４ 上記のムコ多糖類と蛋白質との間の結合の分
    離が、先行工程の液体を、1.5ないし2.5Mの最終
    NaCl濃度を与える如き量の、8.7ないし14.5重量
    ％の濃度の塩化ナトリウム溶液で、周囲温度で、
    ５ないし15時間の時間の間、処理することにより
    行なわれることを特徴とする、特許請求の範囲第
    １項に記載の方法。 ５ 上記の蛋白質沈殿が、３ないし６重量％の濃
    度のトリクロル酢酸による処理により行なわれる
    ことを特徴とする、特許請求の範囲第１項に記載
    の方法。 ６ 上記の核酸除去が、溶液に対して２ないし５
    重量％の量の活性土で、３ないし４のPHで、攪拌
    化に、周囲温度で、２時間、処理することにより
    行なわれることを特徴とする、特許請求の範囲第
    １項に記載の方法。 ７ 上記のムコ多糖類沈殿が、溶液に対して
    0.8：１ないし1.2：１の容量比の、メタノール、
    エタノール及びアセトンからなる群から選ばれた
    一つの化合物で、５ないし６のPHで処理すること
    により行なわれることを特徴とする、特許請求の
    範囲第１項に記載の方法。 ８ 上記のヘパラン硫酸及びデルマタン硫酸の分
    別が、それらを含有する粗生成物を１ないし３重
    量％の程度になるように脱イオン水に溶解し、カ
    チオン樹脂で処理し、水酸化カルシウムで中和
    し、かつアセトンを先ず30容量％の濃度になるま
    で、ついで50容量％の濃度になるまで加えて分別
    沈殿を行なうことにより、行なわれることを特徴
    とする、特許請求の範囲第１項に記載の方法。 ９ 上記のヘパラン硫酸及びデルマタン硫酸の精
    製が、上記の二つの粗生成物を、各々、別個に、
    溶液中の濃度が３ないし７重量％に達する如き量
    の、2Mの塩化ナトリウム溶液中に再溶解し、濾
    過し、ついで溶液に対して0.8：２ないし1.2：２
    の容量比のメタノールを加えて純粋生成物を再沈
    殿させることにより行なわれることを特徴とす
    る、特許請求の範囲第１項に記載の方法。
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