JPH02209894A - ムテイン，ｄｎａおよびその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 葭！上例五里匁亙 本発明は、塩基性線維芽細胞増殖因子（以下、ｂＦＣ；
Ｆと略称することもある。）のムティン、該ムティンを
フードする組換えＤＮＡおよびその用途に関する。

従来の技術 ｂＦＧＦは主として下垂体より分泌される分子量約１７
０００の塩基性ポリペプチドホルモンであり、当初ＢＡ
ＬＢ／ｃ３Ｔ３細胞などの線維芽細胞に強い増殖促進作
用を示す因子として分離された［Ｄ、　Ｇｏｓｐｏｄａ
ｒｏｗｉｃｚ；ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）２４９：１
２３（１９７４）］。しかし、その後中胚葉山来の殆ん
ど全ての細胞に対して増殖促進作用を示すことが判明し
た［Ｄ、　Ｇｏｓｐｏｄａｒｏｗｉｃｚ　　ら：ナショ
ナル・キャンサー・インスティテユート・モノグラフ（
Ｎａｔｉｏｎａｌ　　Ｃａｎｃｅｒ　　Ｉｎｓｔｉｔｕ
ｔｅＭｏｎｏｇｒａｐｈ）１旦；１０９（１９７８）］
。中でもｂＦＧＦの血管新生作用は細胞増殖促進作用と
相まって損傷の治療薬および血栓症、動脈硬化症などの
予防治療薬としての可能性を示すものである。

ウシのｂＦＧＦは、プロシーデングス・オブ・ザ・ナシ
ョナル・アカデミ−・オブ・ザ・ユナイテッド・ステー
ブ・オブ・アメリカ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ　ｌ。

＾ｃａｄ、　　Ｓｃｉ、　　Ｕ　Ｓ　Ａ）、第８２巻　
第６５０７６５１１頁（１９８５年）に発表され、また
、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２３３．５４５（１９
８６）には、ウシｂＦＧＦのｃＤＮＡをクローン化し、
これから推測されるウシｂＦＧＦの構成アミノ酸が示さ
れている。

ヒトｂＦＧＦについては、バイオケミカル・アンド・バ
イオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ（Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　　ａｎｄ　　Ｂｉｏｐｈｙｓｉ
ｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈ　　Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏ
ｎｓ）、第１３５巻、５４１頁（１９８６年）には、人
の脳からヒトｂＦＧＦを抽出したことを報告している。

また、ＥＭＢＯジャーナル（ＥｕｒｏｐｅａｎＭｏｌｅ
ｃｕｌａｒ　　Ｂｉｏｌｏｇｙ　　Ｏｒｇａｎｉｚａｔ
ｉｏｎ　　Ｊｏｕｒｎａｌ）第５巻、２５２３頁（１９
８６年）およびＰＣＴ国際公開Ｎｏ、ＷＯ／８７１０１
７２８には、牛のｂＦＧＦをプローブとして用い、ヒト
ｂＦＧＦのｃ、ＤＮＡをクローン化し、これよりヒトｂ
ＦＧＦの構成アミノ酸を推定している。

さらに、フエブス・レターズ（ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒ
ｓ）　２上３．！　８９（１９８７）には、ヒトｂＦＧ
ＦのｃＤＮＡをクローン化し、形質転換体の培養により
ヒトｂＦＧＦを製造することが記載されている。

ヒトｂＦＧＦは、ウシｂＦＧＦと比較すると、１１２位
がヒトのそれはＴｈｒでありウシのそれはＳｅｔである
。また１２８位はヒトのそれはＳｅｒでありウシのそれ
はＰｒｏである。（位置の番号は、Ｎ末端のＭｅｔは数
えないとした場合のそれを示す。）発明が解決しようと
する課題 本発明者らは、アミノ酸配列を修飾することによって、
ｂＦＧＦの安定性、細胞における産生能。

分子当りの細胞増殖促進活性の上昇、さらに未知の生物
活性の賦活化がなされるであろうと考えた。

特にｂＦＧＦは動物細胞で過剰に発現させたりあるいは
異なる蛋白質のシグナル配列を付加して発現させた場合
、細胞に悪性化細胞様変化を誘導することがあることが
知られている（Ｒ，５ａｓａｄａ：Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ
　　ａｎｄ　　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　　Ｂｉｏｌｏｇｙ　
８：５８８（１９８８）、　　Ｓ、　Ｒｏｇｅｌｊ：　
Ｎａｔｕｒｅ　３３１：１７３（１９８８）］。

ｂＦＧＦを医薬品などに応用する場合、このような性質
を持たないｂＦＧＦムティンの創製が望まれている。

そこで本発明者らは、種々のｂＦＧＦムティンを検討し
た結果、特にアミノ酸欠損型ムティンが有効であろうと
考えた。

さらに、組換えＤＮＡ技術によって微生物学的につくら
れる生物学的に活性な蛋白質は、システィン残基を含有
しており、それらは活性に本質的なものではないが、分
子間または分子内の望ましくない結合を形成することが
ある。

組換えＤＮＡ技術によってｂＦＧＦをつくる過程で高濃
度のｂＦＧＦを含有する大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａ　　ｃｏｌｔ）抽出物中に、複数のヘテロなコンフォ
メーションが見い出された。これらはランダムな分子内
ジサルファイド架橋形成のためと考えられ、ｂＦＧＦの
精製を難しくし、回収率を低下させる原因となっている
。

そこで本発明者らは、組換え型ｂＦＧＦのように微生物
学的につ（られ生物活性のある蛋白質を、その活性に悪
影響を及ぼさないが蛋白質が望ましくない三次構造（例
えば蛋白質の活性を低下させるようなフンフォメーショ
ン）を取る結果になるような分子間架橋や分子内結合の
形成能力を減少ないし排除する形で改変することを考え
た。

課題を解決するための　段 本発明者らは、組み換えＤＮＡ技術および特定部位指向
性変異（Ｓｉｔｅｄｉｒｅｃｔｅｄ　　ｍｕｔａｇｅｎ
ｅｓｉｓ）により、構成アミノ酸の欠損されたｂＦＧＦ
のムティンを構築し、安定性の向上、細胞内での産生能
。

活性の上昇および生物活性の変化につき鋭意研究したと
ころ、これらの目的に叶うムティン特に悪性化細胞様変
化の誘導能や酸性条件化での安定性に優れたムティンを
見い出し、これらの知見に基いてさらに研究した結果、
本発明を完成した。

本発明は、（１）、ｂＦ　Ｇ　Ｆのカルボキシル末端側
の７個〜４６個のアミノ酸残基が欠損しているムティン
； （２）、さらに１個以上の構成アミノ酸が別のアミノ酸
で置換されていてもよ（、アミン末端に１個以上のアミ
ノ酸が付加していてもよい上記（１）項Ｊ己載のムティ
ン； （３）、上記（１）または（２）のムティンをコードす
る塩基配列を有するＤＮＡ： （４）、上記（１）または（２）のムティンをコードす
る塩基配列を有する組換えＤＮＡを含むベクターを保持
する形質転換体；および （５）、上記（１）または（２）のムティンをコードす
る塩基配列を有する組換えＤＮＡを含むベクターを保持
する形質転換体を培地に培養し、培養物中に該ムティン
を生成蓄積せしめることを特徴とする該ムティンの製造
法である。

なお、本発明のムティンにおいて、上記置換と付加との
両者が上記（１）項のムティンになされていてもよい。

本発明のムティンにおける変異させる前のｂＦＧＦとし
ては、温血哺乳動物のｂＦＧＦのいずれのものでもよい
。

その代表例としてはたとえば、ヒト、ウシ１ラツトのｂ
ＦＧＦが挙げられる。なかでもヒトのものが好ましい。

さらに具体的には、 Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−［１ｅ−Ｈｉｓ−Ｐ
ｒｏ　＝Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｇ
ｌｙ−Ｖａｌ　−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−５ｅｒ−Ａ
ｓｐ−Ｐｒｏ　　　［１］で示されるアミノ酸配列［１
］を含むポリペプチドが好ましい。

さらに、−数式 ％式％ ［［］ 〔式中、ＸはＴｈｒまたはＳｅｒを示し、ＸがＴｈｒの
ときＹはＳｅｒを、ＸがＳｅｔのときＹはＰｒｏをそれ
ぞれ示す。〕で表わされるポリペプチド［■］が好まし
い。

またさらに、 アミノ酸配列： Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ　　Ｇｌｕ　　Ａｓｐ
−Ｇｌｙ−Ｇ、１ｙ−Ｇ　ｌｙ　−Ａ　ｌａ　−Ｐｈｅ
　−Ｐ　ｒｏ　−Ｐ　ｒｏ−Ｇ　ＩｙＨｉｓ　−Ｐｈｅ
　−Ｌｙｓ　−Ａｓｐ　−Ｐ　ｒｏ　−Ｌｙｓ　−Ａｒ
ｇＬ　ｅｕ−Ｔ　ｙｒ　−Ｃｙｓ　−Ｌ　ｙｓ−Ａｓｎ
　−Ｇ　ｌｙ　−Ｇ　１ｙＰｈｅ　−Ｐｈｅ　−Ｌｅｕ
−Ａｒｇ　−１！ｅ−Ｈｉｓ　−Ｐｒ。

Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｖ
ａｌ　−Ａ　ｒｇ　−Ｇ　ｌｕ　−Ｌ　ｙｓ　−Ｓ　ｅ
ｒ　−Ａ　ｓｐ　−Ｐ　ｒｏ　−Ｈｉｓ　−Ｖａｌ　−
Ｌｙｓ　−Ｌｅｕ−Ｇ　Ｉｎ　−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｌ
ａ　−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ　−Ｇ　１ｙ−Ｖ　ａｔ
　−Ｖ　ａｌ　−Ｓ　ｅｒ　−１１ｅ−１、ｙｓ−Ｇｌ
ｙ−Ｖａｔ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ａｓｎ−、Ａ　ｒｇ　−
Ｔ　ｙｒ　−Ｌ　ｅｕ−ΔＩａ−Ｍｅｔ　−Ｌｙｓ−Ｇ
　ｌｕ　−Δｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ　−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ
−Ａｌａ−３ｅｒ　−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ　−Ｖａｔ−Ｔｈ
ｒ−Ｇ　１ｕ−Ｇ　１ｕ−Ｃｙｓ　−Ｐｈｅ　−Ｐｈｅ
　−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ　−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ　−５
ｅｒ　−Ａ　ｓｎ　−Ａ　ｓｎ　−Ｔ　ｙｒ−Ａ　５ｎ
−Ｔ　ｈｒ　−Ｔ　ｙｒ　−Ａ　ｒｇ　−Ｓ　ｅｔ　−
Ａ　ｒｇ　−Ｌ　ｙｓ　−Ｔ　ｙｒ　−Ｓ　ｅｒ　−Ｓ
　ｅｒ　−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−
Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｇ　１ｙ−Ｇ　１ｎ−Ｔｙｒ
−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇ　１ｙ−３ｅｒ　−Ｌ　ｙｓ　−
Ｔ　ｈｒ　−Ｇ　ｌｙ　−Ｐ　ｒｏ　−Ｇ　ｌｙ　−Ｇ
　Ｉｎ　−Ｌｙｓ−Ａｌａ　−１１ｅ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ
−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ　−ＭｅＬ−３ｅｒ−Ａｌａ−Ｌｙｓ
−３ｅｒ　　　、　　　　　［ＩＩＩコを含有するポリ
ペプチド［１１１］が好ましい。

本発明におけるムティンは、本来、ｂＦＧＦの元のペプ
チドあるいは蛋白質のカルボキシル末端側の７個〜４６
個の構成アミノ酸が欠損したものである。

該欠損の好ましい例としては、 ｒｈｂＦ　Ｇ　Ｆの アミノ酸番号１０２以降のアミノ酸配列〃　　１０６　
　　〃 ／ｌ　　　　　　１１５　　　　　　　　ノＩ！／１１
９１１ 〃　　１２４　　　ｌ／ 〃　　１３０　　　〃 〃　　１３８　　　ｌ／ が挙げられる。

これらのアミノ酸配列は池の１個のアミノ酸と置換され
ていてもよい。

本発明におけるさらに１個以上の構成アミノ酸か別のア
ミノ酸で置換されているムティンにおける置換される前
の構成アミノ酸の例としては、システィン、システィン
以外のものが挙げられる。

システィンが特に好ましい。置換される前の構成アミノ
酸としてシスティン以外のものとしては、アスパラギン
酸、アルギニン、グリシン、バリン、インロイ７ンなど
が挙げられる。

置換される前の構成アミノ酸がシスティンである場合に
は、置換されたアミノ酸としては、たとえば中性アミノ
酸か好ましい。該中性アミノ酸の具体例としては、たと
えば、グリ／ン、バリン、アラニン、ロイ／ン、イソロ
イシン、チロシン、フェニルアラニン７ヒスチジン、ト
リプトファン、セリン。

スレオニン、メチオニンなどが挙げられる。特に、セリ
ン、スレオニンが好ましい。

置換される前の構成アミノ酸がシスティン以外のもので
ある場合には、置換された別のアミノ酸としては、たと
えば、アミノ酸の親水性、疎水性あるいは電荷の点て、
置換される前のアミノ酸とは異なる性質をもつものを選
ぶ。具体的には置換される前のアミノ酸がアスパラギン
酸の場合には、置換されたあとのアミノ酸としてアスパ
ラギン。

スレオニン、バリン、フェニルアラニン、アルギニンな
どが挙げられるが、特にアスパラギン、アルギニンが好
ましい。

置換される前のアミノ酸がアルギニンの場合には置換さ
れたあとのアミノ酸としてグルタミンスレオニン、ロイ
シン、フェニルアラニン、アスパラギン酸が挙げられる
が、特にグルタミンか好ましい。

置換される前の構成アミノ酸がグリシンである場合には
、置換されたあとのアミノ酸としては、スレオニン、ロ
イシン、フェニルアラニン、セリングルタミン酸、アル
ギニンなどが挙げられ、特にスレオニンが好まシイ。

置換される前の構成アミノ酸がセリンである場合には、
置換されたあとのアミノ酸としては、メチオニン、アラ
ニン、ロイシン、システィン、グルタミン、アルギニン
、アスパラギン酸などが挙げられ、特にメチオニンが好
ましい。

置換される前の構成アミノ酸がバリンである場合には、
置換されたあとのアミノ酸としては、セリン、ロイシン
、プロリン、グリシン、リジン、アスパラギン酸などが
挙げられ、特にセリンが好ましい。

置換される前の構成アミノ酸がインロイシンである場合
には、置換されたあとのアミノ酸としては、セリン、グ
リシン、バリン、アラニン、ロイノン。

チロシン、フェニルアラニン、ヒスチジン、トリプトフ
ァン、メチオニンが挙げられるが、特にセリンが好まし
い。

置換される前の元の構成アミノ酸としては、アスパラギ
ン酸、アルギニン、グリシンセリンバリンが好ましい。

置換されたあとのアミノ酸としては、アスパラギン、グ
ルタミン、アルギニン、スレオニン、メチオニン、セリ
ン、ロイシンが好ましい。

置換されたムティンの最も好ましいものとじては、構成
アミノ酸であるシスティンがセリンに置換されたものが
最も好ましい。

本発明のムティンにおけるアミン末端に１個以上のアミ
ノ酸が付加しているムティンにおける１個以上のアミノ
酸としては、ペプチドを発現する際に用いられる開始コ
ドンに基因するメチオニンや、シグナルペプチドは含ま
れないものである。

付加されているアミノ酸の数としては、少なくとも１個
であるが、ｂＦＧＦの特徴を失わない限り何個でもよい
。さらに好ましくは、ｂＦＧＦと相同性（ホモロジー）
が認められており、同様の活性を示すタンパクのアミノ
酸配列の一部あるいはすべてが挙げられる。

該付加されているアミノ酸の例としては、酸性線維芽細
胞増殖因子（ａＦＧＦ）、インターリューキンｌ−α（
ＩＬＩ−α）、インターリューキン１β（ＩＬＩ−β）
、癌遺伝子群における１ｎｔ−２などにコードされるタ
ンパクのアミノ酸配列の一部あるいはすべてが挙げられ
る。

該ａＦＧＦとしては、ヒト由来のもの、ウシ由来のもの
が挙げられる。該ＩＬＩ−α、ＩＬＩβとしては、ヒト
由来のものが挙げられる。

該ウシａＦＧＦのアミノ酸配列としては、ＮＨ！−Ｐｈ
ｅ−Ａｓｎ−１，ｅｕ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓ
ｎ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ　　Ｐｒｏ”Ｌｙｓ　　Ｌ
ｅｕ−Ｌ　ｅｕ　−Ｔ　ｙｒ　−Ｃｙｓ　−Ｓ　ｅｒ−
Ａ　ｓｎ　−Ｇ　ｌｙ　−Ｇ　ｌｙＴ　ｙｒ−Ｐ　ｈｅ
　−Ｌ　ｅｕ−Ａｒｇ　−１ｌｅ　−Ｌ　ｅｕ　−Ｐ　
ｒｏ　−Δ５ｐ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｇ
ｌｙ−′ｒｈｒＬｙｓ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−３ｅｒ−Ａｓ
ｐ−Ｇｉｎ−Ｈｉｓｌ　１ｅ−Ｇ　Ｉｎ　−Ｌｅｕ−Ｇ
　Ｉｎ　−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ　−Ａ　ｌａ　−Ｇｌｕ−８
ｅｒ　−１１ｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−ＴｙｒＩ　
１ｅ−Ｌｙｓ−５ｅｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌ
ｙ−ＧＩｎ　−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ａｓ
ｐ−ＴｈｒＡｓｐ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−
Ｇｌｙ−３ｅｒＧ　Ｉｎ　−Ｔ　ｈｒ−Ｐ　ｒｏ　−Ａ
　５ｎ−Ｇ　Ｉｕ　−Ｇ　ｌｕ　−ＣｙｓＬｅｕ　−Ｐ
ｈｅ　−Ｌｅｕ−Ｇ　ｌｕ　−Ａｒｇ　−Ｌｅｕ−Ｇ　
ＩｕＧ　Ｉｕ　−Ａ　５ｎ−Ｈ１ｓ−Ｔ　ｙｒ　−Ａ　
ｓｎ　−Ｔ　ｈｒ　−Ｔ　ｙｒｌ　１ｅ−３ｅｒ−Ｌｙ
ｓＬＬｙｓ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−ＧｌｕＬｙｓ−Ｈ１ｓ−
Ｔｒｐ　−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−ＬｅｕＬｙｓ−Ｌ
ｙｓ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−５ｅｒ−ＬｙｓＬｅｕ
−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｔｂｒ−Ｈｉｓ−ＰｈｅＧ
ｌｙ−Ｇｉｎ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−１ｉｅ−Ｌｅｕ　　Ｐ
ｈｅ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−３ｅ
ｒ−３ｅｒＡｓｐ−ＣＯＯＨ が挙げられる。

ヒトＩＬＩ−αのアミノ酸配列としては、Ｎ　　Ｈｔ−
Ｍｅｔ　−Ａ　　Ｉａ　−Ｌ　　ｙｓ　−Ｖ’ａｌ　−
Ｐ　　ｒｏ　−ＡｓｐＭｅｔ　−Ｐ　ｈｅ−Ｇ　ｌｕ−
Δ５ｐ−Ｌ　ｅｕ　−Ｌ　ｙｓ　−Ａ　ｓｎ　−Ｃｙｓ
　−Ｔ　ｙｒ　−Ｓ　ｅｒ　−Ｇ　１ｕ−Ａ　ｓｎ　−
Ｇ　Ｉｕ　−Ｇ　ｌｕ　−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−５ｅｒ　−
Ｓｅｒ　−１１ｅ−Ａｓｐ−ＨｉｓＬ　ｅｕ　−Ｓ　ｅ
ｒ　−Ｌ　ｅｕ　−Ａ　ｓｎ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ｌ　ｙｓ
　−Ｓ　ｅｒ　−Ｐ　ｈｅ　−Ｔ　ｙｒ　−Ｈｉｓ　−
Ｖ　ａｌ　−Ｓ　ｅｒ　〜Ｔ　ｙｒ　−Ｇ　Ｉｙ−Ｐ　
ｒｏ　−Ｌｅｕ−Ｈ１ｓ−Ｇ　１ｕ−Ｇ　ｌｙ　−Ｃｙ
ｓ−ＭｅｔＡ　ｓｐ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ｓ　ｅｒ−Ｖ　ａ
ｌ−３ｅｒ　−Ｌ　ｅｕ　−Ｓ　ｅｒｌ　１ｅ−Ｓｅｒ
−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−３ｅｒ　−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ　−５ｅ
ｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ
　−３ｅｒ−ＭｅＬ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｌａ
−Ｔｈｒ　−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ
−Ｌｙｓ−ＬｙｓＡ　ｒｇ　−Ａ、ｒｇ　−Ｌｅｕ−３
ｅｒ−Ｌ　ｅｕ　−Ｓ　ｅｒ−Ｇ　Ｉｎ　−３ｅｒ　−
［１ｅ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ　−ＬｅｕＧ
ｌｕ−Ａｌａ　−１１０，−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−
３ｅｔ　−Ａ　ｒｇ　−Ｓ　ｅｒ　−Ａ　ｌａ　−Ｐ　
ｒｏ　−Ｐ　ｈｅ　−Ｓ　ｅｒ　−Ｐ　ｈｅ　−Ｌ　ｅ
ｕ　−Ｓ　ｅｒ　−Ａ　５ｎ−Ｖ　ａｌ　−Ｌ　ｙｓ　
−Ｔ　ｙｒ　−Ａ　ｓｎ　−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ　−Ａｒｇ
　−１１ｅ　−１１ｅ　−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ　−Ｇ　ｌｕ
　−Ｐｈｅ　−１１ｅ　−Ｌｅｕ　−Ａｓｎ　−Ａｓｐ
　−Ａ　ｌａ　−１、ｃ＝−Ａｓｎ−Ｇｉｎ−Ｓｅｒ　
−１１ｅ　−１１ｅ−Ａｒｇ　−Ａ　ｌａ　−Ａ　ｓｎ
　−Ａ　ｓｐ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ｔ　ｙｒ　−Ｌ　ｅｕ　
−Ｔ　ｈｒ　−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｈｉ
ｓ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ　−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｖａ
ｌ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＡｓｐＭｅｔ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−
Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−３ｅｒ−３ｅｒ　−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−
Ａｓｐ　−Ａ　ｌａ　−Ｌ　ｙｓ−＋　１ｅ　−Ｔ　ｈ
ｒＶａｌ　−１１ｅ　−Ｌｅｕ　−Ａｒｇ−１１ｅ　−
Ｓ　ｅｒ　−Ｌｙｓ”Ｆｈｒ−Ｇｉｎ　−Ｌｅｕ−Ｔｙ
ｒ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−ＡｌａＧｉｎ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−
Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ　−Ｌｅｕ　−Ｌｅｕ
　−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ　−Ｐｒｏ−Ｇｉｕｌ　１
ｅ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ　−１１ｅ−Ｔｈｒ−Ｇｌ
ｙ　−３ｅｒ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｌｅ
ｕ−ＰｈｅＰｈｅ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−
Ｇｌｙ−Ｔｈｒ　−Ｌｙｓ　−Ａｓｎ−］１ｙｒ　−Ｐ
ｈｅ　−Ｔｈｒ　−Ｓ　ｅｒ　−Ｖａｌ　−Ａｌａ−Ｈ
ｉｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ　−１１ｅ　−
Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｔ
ｒＰ−Ｖ　ａｌ　−Ｃｙｓ　−Ｌ　ｅｕ　−Ａ　ｌａ　
−Ｇ　Ｉｙ　−Ｇ　ｌｙ　−Ｐ　ｒ。

Ｐｒｏ−３ｅｒ　−１１ｅ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−
Ｇｌｎ　−１１ｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｇｉｎ−
Ａｌａ−ＣＯＯＨが挙げられる。

ヒトＩＬＩ−βのアミノ酸配列としては、ＮＨ，−Ｍｅ
ｔ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−ＧｌｕＬｅｕ−
Ａｌａ−８ｅｒ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ｍｅｔ−Δ１ａＴ　
ｙｒ　−Ｔ　ｙｒ　−Ｓ　ｅｒ　−Ｇ　ｌｙ　−Ａ　ｓ
ｎ　−Ｇ　ｌｕ　−Ａ　５ｐＡｓｐ　−Ｌｅｕ　−Ｐｈ
ｅ　−Ｐｈｅ−Ｇ　ｌｕ　−Ａ　ｌａ−ＡｓｐＧｌｙ−
Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｇｉｎ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−ＣｙｓＳｅ
ｒ　−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅ
ｕ　−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌ
ｙ　−１１ｅＧｌｎ−Ｌｅｕ　−Δ　ｒｇ　−１１ｅ　
−Ｓ　　ｅｒ−Δ　５ｐ−ＨｉｓＨｉｓ　−Ｔ　ｙｒ　
−３ｅｒ　−Ｌ　ｙｓ　−Ｇ　ｌｙ　−Ｐ　ｈｅ　−Ａ
　ｒｇＧ　Ｉｎ　−Ａ　ｌａ　−Ａ　ｌａ　−Ｓ　ｅｒ
　−Ｖ　ａｌ　−Ｖ　ａｌ　−Ｖ　ａｌＡ　Ｉａ−Ｍｅ
ｔ　−Ａｓｐ　−Ｌｙｓ　−Ｌｅｕ　−Ａ　ｒｇ　−Ｌ
ｙｓ　−Ｍｅｔ　−Ｌｅｕ−Ｖａｌ　−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ
　−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ　−Ｔ　ｈｒ　−Ｐ　ｈｅ　−Ｇ　
Ｉｎ　−Ｇ　ｌｕ　−Ａ　ｓｎ　−Ａ　ｓｐ　−Ｌ　ｅ
ｕＳｅｒ−Ｔｈｒ　−Ｐｈｅ　−Ｐｈｅ　−Ｐｒｏ　−
Ｐｈｅ　−１１ｅ　−Ｐｈｅ−Ｃｒｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌ
ｕ−Ｐｒｏ　−１１ｅ−Ｐｈｅ　−Ｐｈｅ−Ａｓｐ　−
Ｔ　ｈｒ　−Ｔ　ｒｐ−Ａ　ｓｐ　−Ａ　ｓｎ　−Ｇ　
ｌｕＡ’ｌａ、−Ｔｙｒ　−Ｖ　ａｌ　−（−１ｉｓ　
−Ａｓｐ−Ａ　Ｉａ　−Ｐ、ｒｏ　−Ｖ　ａｌ　−Ａ　
ｒｇ　−Ｓ　ｅｒ　−Ｌ　ｅｕ−Ａｓｎ　−Ｃｙｓ　−
Ｔ　ｈｒ　−Ｌ　ｅｕ　−Ａ　ｒｇ　−Ａ　ｓｐ　−Ｓ
　ｅｒ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ｌ　ｙｓ　−３ｅ
ｒ　−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｍｅｔ−３ｅｒ−Ｇｌｙ　−Ｐ
ｒ。

Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｈ
ｉｓＬｅｕ−Ｇｉｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｍｅｔ
−Ｇｌｕ　−Ｇ　ｌｎ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ｖ　ａｌ　−Ｖ
　ａｌ　−Ｐ　ｈｅ　−Ｓ　ｅｒ　−ＭｅｔＳ　ｅｒ　
−Ｐｈｅ　−Ｖａｌ−Ｇ　Ｉｎ−Ｇ　１ｙ−Ｃ１ｕ−Ｇ
　１ｕＳｅｒ−Ａｓｎ−Ａｓｐ　−Ｌｙｓ　−Ｉ　Ｉｓ
　−Ｐｒｏ−ＶａｌＡ　ｌａ　−Ｌｅｕ−Ｇ　ｌｙ　−
Ｌｅｕ　−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ　−Ｌｙｓ　−Ａｓｎ−Ｌｅ
ｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−３ｅｒ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ　−Ｌｅ
ｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ
　−Ｌ　ｅｕ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ｌ　ｅｕ　−Ｇ　ｌｕ　
−Ｓ　ｅｒ　−Ｖ　ａｌ　−Ａ　ｓｐＰ　ｒｏ−Ｌ　ｙ
ｓ　−Ａ　ｓｎ　−Ｔ　ｙｒ　−Ｐ　ｒｏ　−Ｌ　ｙｓ
　−Ｌ　ｙｓ　−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ａ
ｒｇ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ　−Ｐｈｅ　−Ａｓｎ　−Ｌｙｓ
　−１１ｅ−Ｇ　ｌｕ　−１１ｅ　−Ａｓｎ　−Ａｓｎ
　−Ｌｙｓ　−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ　−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−３
ｅｒ　−Ａ　１ａ−Ｇ　Ｉｎ　−Ｐｈｅ　−Ｐ　ｒｏ　
−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒｌ　１ｅ　−Ｓ　ｅｒ−Ｔｈ
ｒ　−Ｓ　ｅｒ−Ｇ　Ｉｎ　−Ａ　Ｉａ−Ｇ　ｌｕ　−
Ａｓｎ−Ｍｅｔ　−Ｐｒｏ−Ｖａｌ　−Ｐｈｅ　−Ｌｅ
ｕ−ＧｌｙＧ　ｌｙ　−Ｔ　ｈｒ　−Ｌ　ｙｓ　−Ｇ　
ｌｙ　−Ｇ　ｌｙ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ａ　ｓｐ　−１１ｅ
−Ｔｈｒ−Ａｓｐ　−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｍｅｔ−Ｇｌｎ
Ｐ　ｈｅ　−Ｖ　ａｌ　−Ｓ　ｅｒ　−Ｓ　ｅｒ　−Ｃ
ＯＯＨが挙げられる。

１ｎＬ−２にコードされるアミノ酸配列としては、Ｎ　
Ｈｔ−Ｍｅｔ−Ｇ　１ｙ−Ｌｅｕ−１１ｅ−Ｔｒｐ　−
ＬｅｕＬｅｕ　−Ｌｅｕ　−Ｌｅｕ　−Ｓ　ｅｒ　−Ｌ
ｅｕ　−Ｌｅｕ−Ｇ　Ｉｕ　−Ｐ　ｒｏ　−Ｓ　ｅｔ　
−Ｔ　ｒｐ　−Ｐ　ｒｏ　−Ｔ　ｈｒ　−Ｔ　ｈｒ　−
Ｇ　ｌｙＰ　ｒｏ　−Ｇ　ｌｙ　−Ｔ　ｈｒ　−Ａ　ｒ
ｇ　−Ｌ　ｅｕ　−Ａ　ｒｇ　−Ａ　ｒｇＡ　ｓｐ　−
Ａ　ｌａ　−Ｇ　ｌｙ　−Ｇ　ｌｙ　−Ａ　ｒｇ　−Ｇ
　ｌｙ　−Ｇ　ｌｙ　−Ｖ　ａｌ　−Ｔ　ｙｒ　−Ｇ　
ｌｕ　−Ｈｉｓ　−Ｌ　ｅｕ　−Ｇ　ｌｙ　−Ｇ　ｌｙ
Ａ　ｌａ　−Ｐ　ｒｏ　−Ａ　ｒｇ　−Ａ　ｒｇ　−Ａ
　ｒｇ　−Ｌ　ｙｓ　−Ｌ　ｅｕＴ　ｙｒ　−Ｃｙｓ　
−Ａ　ｌａ　−Ｔ　ｈｒ　−Ｌ　ｙｓ　−Ｔ　ｙｒ　−
Ｈ１ｓＬｅｕ−Ｇ　Ｉｎ　−Ｌｅｕ・−Ｈｉｓ　−Ｐ　
ｒｏ　−Ｓ　ｅｔ−Ｇ　ｌｙＡ　ｒｇ　−Ｖ　ａｌ　−
Ａ　ｓｎ　−Ｇ　ｌｙ　−Ｓ　ｅｒ　−Ｌ　ｅｕ　−Ｇ
　Ｉｕ　−Ａｓｎ　−Ｓ　ｅｒ　−Ａ　Ｉａ　−Ｔｙｒ
　−Ｓ　ｅｒ　−［１ｅ　−Ｌｅｕ　−Ｇｌｕ−［１ｅ
−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｖａｔ−Ｇｌｙ−
Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｌａ　−１１ｅ−Ｌｙｓ−ＧｌｙＬ
　ｅｕ　−Ｐ　ｈｅ　−Ｓ　ｅｒ　−Ｇ　Ｉｙ　−Ａ　
ｒｇ　−Ｔ　ｙｒ　−Ｌ　ｅｕＡｌａ−Ｍｅｔ−Ａｓｎ
　−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−ＡｒｇＬ　ｅｕ　−Ｔ　
ｙｒ　−Ａ　ｌａ　−Ｓ　ｅｒ　−Ａ　ｓｐ　−Ｈｉｓ
　−Ｔ　ｙｒ　−Ａ　ｓｎ　−Ａ　ｌａ　−Ｇ　ｌｕ　
−Ｃｙｓ　−Ｇ　ｌｕ　−Ｐ　ｈｅ　−Ｖ　ａｌＧｌｕ
−Ａｒｇ　−１１ｅ−Ｈｉｓ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ
Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−８ｅｒ−Ａ
ｒｇＬｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−３ｅｒ
−Ｓｅｒ−Ｇ　ｌｙ　−Ｐ　ｒｏ　−Ｇ　Ｉｙ　−Ａ　
ｌａ　−Ｇ　Ｉｎ−Ａ　ｒｇ　−Ｇ　ＩｎＰ　ｒｏ　−
Ｇ　ｌｙ　−Ａ　ｌａ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ａ　ｒｇ　−Ｐ
　ｒｏ　−Ｔ　ｒｐ　−Ｔ　ｙｒ　−Ｖ　ａｌ　−Ｓ　
ｅｒ　−Ｖ　ａｌ　−Ａ　ｓｎ　−Ｇ　ｌｙ　−Ｌ　ｙ
ｓＧ　ｌｙ　−Ａ　ｒｇ　−Ｐ　ｒｏ　−Ａ　ｒｇ　−
Ａ　ｒｇ　−Ｇ　ｌｙ　−Ｐ　ｈｅＬ　ｙｓ−Ｔ　ｈｒ
　−Ａ　ｒｇ−Δｒｇ−Ｔ　ｈｒ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ｌ　
ｙｓＳ　ｅｒ　−Ｓ　ｅｒ　−Ｌ　ｅｕ　−Ｐ　ｈｅ　
−Ｌ　ｅｕ　−Ｐ　ｒｏ　−Ａ　ｒｇＶａｌ−Ｌｅｕ−
Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ　−Ｇｌｕ−
Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−ＧｌｎＳ　
ｅｒ　−Ｓ　ｅｒ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ｐ　ｒｏ　−Ａ　ｒ
ｇ−Δ１ａ−Ｐｒｏ−Ｇ　Ｉｙ　−Ｇ　ｌｕ　−Ｇ　Ｉ
ｙ　−Ｓ　ｅｒ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ｐ　ｒｏ　−Ａ　ｒｇ
　−Ｇ　Ｉｎ　−Ａ　ｒｇ　−Ａ　ｒｇ　−Ｇ　Ｉｎ　
−Ｌ　ｙｓ　−Ｌ　ｙｓ　−Ｇ　ＩｎＳ　ｅｔ　−Ｐ　
ｒｏ　−Ｇ　Ｉｙ　−Ａ　ｓｐ　−Ｈｉｓ　−Ｇ　ｌｙ
　−Ｌ　ｙｓＭｅｔ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ　−Ｌｅｕ　−Ｓ
ｅｒ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ａ　ｌａ　−Ｔ　ｈｒ　−Ｐ　
ｒｏ　−Ｓ　ｅｒ　−Ｔ　ｈｒ　−Ｇ　ｉｎ　−Ｌ　ｅ
ｕ　−Ｈｉｓ　−Ｔ　ｈｒ　−Ｇ　ｌｙ　−Ｇ　Ｉｙ　
−Ｌ　ｅｕ　−Ａ　Ｉａ　−Ｖ　ａｌ　−Δ１ａ−ＣＯ
ＯＨ が挙げられる。

本発明のムティンを製造するためには、従来の組換えＤ
ＮＡ技術に加え、特定部位指向性変異誘発技術（Ｓｉｔ
ｅｄｉｒｅｃＬｅｄ　　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）が採
用される。該技術は周知であり、アール・エフ・レイサ
−（Ｌａｔｈｅｒ、　Ｒ，Ｆ、　）及びジェイ・ピー・
レコック（Ｌｅｃｏｑ、　Ｊ、　Ｐ、　）、ジエネティ
ック・エンジニアリング（Ｇｅｎｅｔｉｃ　　Ｅｎｇｉ
ｎｅｅｒｉｎｇ）、アカデミツクブレス社（１９８３年
）第３１−５０頁、に示されている。オリゴヌクレオチ
ドに指示された変異誘発はエム・スミス（Ｓｍｉｔｈ、
　　Ｍ、　）及びニス・ギラム（Ｇｉｌｌａｓ＋＋　　
Ｓ、　）、ジェネティック・エンジニアリング：原理と
方法、プレナムプレス社（１９８１年）３巻　１−３２
頁に示されている。

本発明のムティンをコードする構造遺伝子を製造するた
めには、たとえば、 （ａ）ｂＦＧＦの構造遺伝子の１本鎖からなる１本鎖Ｄ
ＮＡを突然変異オリゴヌクレオチドブライマーと雑種形
成させる、 （ｂ）ＤＮＡポリメラーゼによりブライマーを伸長させ
、突然変異性へテロニ量体（ｈｅｔｅｒｏｄｕｐｌｅｘ
）を形成させる、及び （ｃ）この突然変異性へテロニ量体をＦＩ製する。

オリゴヌクレオチドブライマーの大きさは、突然変異を
導入すべき遺伝子領域へのブライマーの安定な雑種形成
に必要な条件により、また現在利用可能なオリゴヌクレ
オチド合成法の限界によって決まる。オリゴヌクレオチ
ドで指示される突然変異誘発に使用するオリゴヌクレオ
チドを設計するに当たって、考慮すべき因子（例えば全
体の大きさ、突然変異サイトを迂回する部分の大きさ）
は、エム・スミス及びニス・ギラム（前掲）によって記
述されている。概して、オリゴヌクレオチドの全長は、
突然変異サイトでの安定でユニークな雑種形成を最適化
するような長さであり、突然変異サイトから５′及び３
′末端までの伸長部分（θｘｔｅｎｓ　１ｏｎｓ）は、
ＤＮＡポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性による突
然変異の修復をさけるのに十分な大きさとする。本発明
に従って突然変異誘発に使用されるオリゴヌクレオチド
は、通常、約１２個ないし約２４個の塩基、好ましくは
約１４個ないし約２０個の塩基、更に好ましくは約１４
個ないし約１８個の塩基を含有する。これらは通常、変
更されるコドンの少なくとも約３個の塩基３′側を含有
する。

たとえば、アミノ酸が付加されているムティンを得る目
的の場合における変異ｂＦＧＦ遺伝子を作る方法として
は、付加するアミノ酸配列をコードする遺伝子を合成あ
るいは、制限酵素消化による断片とし、これをｂＦＧＦ
遺伝子の適当な箇所にＤＮＡリガーゼにより挿入あるい
は付加する。

またｂＦＧＦ遺伝子に適当な制限酵素の認識部位が存在
しない場合には、前述の特定部位指向性変異法により制
限酵素認識部位を新たに生成すればよい。

カルボキシル末端側のアミノ酸配列を欠損させる場合に
は、欠損させたい配列のアミノ末端側のアミノ酸をコー
ドする遺伝子のコドンを特定部位指向性変異によってス
トップコドンに変更すればよい。

置換については、たとえば、構成アミノ酸がシスティン
であってこれを置換したムティンを得る目的の場合にお
いて、変更ｂＦＧＦ遺伝子をつ（る方法は、たとえば、
ｃｙｓを発現するコドンを消失させるか、又はそれが別
のアミノ酸を暗号化するように変更さ且る合成ヌクレオ
チドブライマーを使用して、Ｃｙｓを発現させるコドン
ＴＧＣまたは′「Ｇ　Ｔに特定部位指向性変異誘発を行
なわせるものである。たとえば、ヒトｂＦＧＦのシステ
ィン（２６位）をセリンに変えるために、ブライマーを
ＦＧＦ遺伝子のセンス鎖と雑種形成させる。たとえば、
好ましいヌクレオチドブライマーとしては ５’　　−ＣＧＴＴＣＴＴＧＣＴＧＴ八Ｇ八〇〇Ｃ０Ｃ
Ｔ−３へ がへげられる（下線は変更されたコドンを示す）。

システィン（７０位）をセリンに変えるときの好ましい
ブライマーとしては ５’　−ＡＡＣＧＡＴＴＡＧＣ，ＧＣＴＣＡＣＴＣ３′ が挙げられる。（下線は変更されたコドンを示す）。

システィン（８８位）をセリンに変えるときの好ましい
ブライマーとしては ５’　−ＧＴΔＡＣΔＧＡＣＴＴＡＧＡＡＧＣＴＡＧＴ
−３’ が挙げられる。（下線は変更されたコドンを示す）。

システィン（９３位）をセリンに変えるときの好ましい
ブライマーとしては ５’　−ＴＣＧＡＡＧＡＡＧΔΔＡ　Ｇ　Ａ　ＣＴ　Ｃ
Ａ　ＴＣＣ−３’ が挙げられる。（下線は変更されたコドンを示す）。

Ｃｙｓ（２６位）で第一塩基のＴ→Ａの転位により、シ
スティンからセリンへの変化が起る。さらにＣｙｓ（７
０位）では第１塩基のＴ−Ａ、第２塩基のＴ−＋Ｃ転位
、Ｃｙｓ（８８位、９３位）では第２塩基のＧ　−ｗ　
Ｃ転位によりシスティンからセリンへの変化が起る。

特定部位指向性変異によりｂＦＧＦムティン蛋白質を産
生させる時に、ＤＮＡ配列に複数個の変異を行ってもよ
いこと、すなわち、アミノ酸に対応しているＤＮＡのコ
ドンは縮退していることを認識しておかなければならな
い。

たとえば、もＷ成アミノ酸がシスティン以外のアミノ酸
であってこれを他のアミノ酸に置換したムティンを得る
目的の場合における変異ｂＦＧＦｊｌｔ伝子を作る方法
としては、／スティンの場合と同様にして、オリゴヌク
レオチドブライマーによるコドンの変更を行う。

ただしオリゴヌクレオチドブライマーのデザインはどの
アミノ酸を変更するかで異なることは云うまでもない。

ブライマーは、ｂＦＧＦ遺伝子の１本鎖がクローン化さ
れたＭ　Ｉ　３　［Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｒ、　
　Ｃ，。

Ｖｉｅｉｒａ、　　Ｊ、　Ｍｅｓｓｉｎｇ、ジーン（Ｇ
ｅｎｅ）、　３３　１０３１１９（１９８５）、Ｍｅｓ
ｓｉｎｇ　　Ｊ　　メソノズ・イン争エンジーモロジー
（Ｍｅｔｈｏｄｓ　　ｉｎ　　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）
、上立土　２Ｏ−７８（１９８３））。

ｒｄ　ＣＲ，）−（ｅｒｒｍａｎ　　ｅｔ　　ａｌ、モ
レキュラー・アンド・ジェネラル・ジエネティック（Ｍ
ｏ１．　　ＧｅｎＧｅｎｅｔ、）、１７７　２３１（１
９８０））、又はφＸ１７４　ＣＭ、　Ｓｍ１Ｌｈ　　
ａｎｄ　　Ｓ、　　Ｇｉｌｌａｍ、ジェネテイック・エ
ンジニアリング（Ｇｅｎｅｔｉｃ　　Ｅｎｇｉｎｅｅｒ
ｉｎｇ）。

Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ、Ｖｏｌ、３．ｐｐＩ　　３
２（１９８１））のような１本鎖ファージへ雑種形成さ
れる。ファージが遺伝子のセンス鎖、アンチセンス鎖の
いずれでも運搬できることは認められる。ファージがア
ンチセンス鎖を運搬する時には、別のアミノ酸を暗号づ
けたトリブレットを決定するこのコドンとの不一致以外
にもブライマーは突然変異させるコドンを含有するセン
ス鎖の領域とコドンの縮退のために同一でない場合があ
ってもよい。同様にファージがセンス鎖を運搬する時に
は、欠損させるコドンと対合をつくるトリプレ、ト中の
適当な不一致以外は、突然変異させるコドンを含有する
・センス鎖の領域に対して相捕的でない場合があっても
よい。雑種形成に使用される条件はエム・スミス及びニ
ス・ギラム（前掲）によって記述されている。

温度は通常、約０’Ｃないし７０°Ｃ１もつと一般的に
は約１０″Ｃないし５０°Ｃの範囲にある。雑種形成後
、ブライマーは大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ１１Ｔ４ＤＮ
Ａポリメラーゼ、逆転写酵素又は他の適当なりＮＡポリ
メラーゼとの反応によってファージＤＮＡ上で伸長され
る。生ずるｄｓＤＮＡは、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼのよう
なりＮＡリガーゼでの処理によって閉鎖環ｄ’ｓ　Ｄ　
Ｎ　Ａへ変換される。１本鎖領域を含有するＤＮＡ分子
はＳ１エンドヌクレアーゼ処理によって破壊できる。

生ずる突然変異形成へテロニ量体は、彼感染能力をもつ
宿主生物又は細胞を形質転換するのに使用される。宿主
によるヘテロニ量体の？Ｓ！ｉｌでは、双方の鎖から子
孫ができる。複製に続いて、突然変異株の鎖の子孫から
突然変異株遺伝子を＊Ｉ４＋、、適当なベクターへ挿入
し、このベクターを適当な宿主生物又は細胞の形質転換
に使用する。

次に、突然変異化された遺伝子を運搬するファージＤＮ
Ａを単離し、プラスミドへ組み込む。

ＤＮＡを組み込むプラスミドとしては、たとえば大腸菌
由来のｐＢＲ３２２［ジーン（ｇｅｎｅ）、　２　。

９５（１９７７）］、ｐＢＲ３２５［ジーン、４．１２
１（１９７８）］、ｐＵＣｌ　２［ジーン、１９，２５
９（１９８２）］、ｐＵｃ　１３［ジーン、１９．２５
９（１９８２）］、枯枯草由由のＩ）ＵＢｌｌｏ［バイ
オケミカル・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケ
ーション（Ｂ　ｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　　ａｎｄ　　Ｂ
　１ｏｐｈｙｓｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈ　　Ｃｏｍｍ
ｕｎｉｃａｔｉｏｎ）、土１２，６７８（１９８３）］
などが挙げられるが、その他のものであっても、宿主内
で複製保持されるものであれば、いずれをも用いること
ができる。

プラスミドに組み込む方法としては、たとえば、ＴｌＭ
ａｎｉａｔｉｓ　　らモレキュラー・クローニング（Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ　　Ｃｔｏｎｉｎｇ）　　コールド・
スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ　　　
Ｓ　ｐｒｉｎｇ）−１ａｒｂｏｒ　　Ｌ　ａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ）、第２３９頁（１９８２）に記載の方法などが
挙げられる。

クローン化された遺伝子は、発現に適したビークル（ベ
クター）中のプロモーターの下流に連結して発現型ベク
ターを得ることができる。

ベクターとしては、上記の大腸菌由来のプラスミド（例
、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵｃ１２゜ｐＵｃＩ
３）、枯草菌由来プラスミド（例、ｐＵＩ３１１０、ｐ
ＴＰ５．ｐＣｌ　９４）、酵母由来プラスミド（例、ｐ
Ｓ　Ｈ］　９．ｐＳ　Ｈｌ　５）、あるいはλファージ
などのバタテリオファージおよびレトロウィルス。

ワタシニアウ、イルスなどの動物ウィルス、あるいは昆
虫ウィルスなどがあげられる。

該遺伝子はその５末ｙ：Ｍに翻訳開始コドンとしてのＡ
ＴＧを有し、また３末端には翻訳終止コドンとしてのＴ
ＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよい。さらに
該遺伝子を発現させるにはその上流にプロモーターを接
続する。本発明で用いられるプロモーターとしては、遺
伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーター
であればいかなるものでもよい。

また、形質転換する際の宿主がエシェリキア属菌である
場合は、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒ
ｅｃＡプロモーター、λＰＬ　　プロモーターｆｆｐｐ
プロモーター、Ｔ７プロモーターなどが、宿主がバチル
ス属菌である場合は、５ＰＯＩプロモーター、５ｐｏ２
プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなど、宿主が酵母
である場合は、ＰＨ０５プロモーター、ＰＣＫプロモー
ター、ＧＡＰプロモーターＡＩ）　）！プロモーターな
どが好ましい。とりわけ宿主が工／エリキア属菌でプロ
モーターがｔｒｐプロモーターまたはＴ７プロモーター
であることが好ましい。

宿主が動物細胞である場合には、５Ｖ４Ｑ由来ノプロモ
ーター、レトロウィルスのプロモーターなどが挙げられ
、とりわけ５Ｖ４Ｑ由来のプロモーターが好ましい。

このようにして構築されたムティンをコードする塩基配
列を有する組換えＤＮＡを含むベクターを用いて、該ベ
クターを保持する形質転換体を製造する。

宿主としては、たとえばエシェリキア属菌、バチルス属
菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞などが挙げられる。

上記エシェリキア属菌の例としては、エシェリキア・フ
リ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌｉ）Ｋ　ｌ　２
　ＤＨ１［Ｐｒｏｃ、　　　Ｎａｔｌ、　　Ａｃａｄ、
　　Ｓｃｉ、　　ＵＳＡ、６０゜１６０（１９６８）］
１１ＭＩＯ３［ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ、　
（Ｎ　ｕｃｌｅｉｃ　　Ａ　ａｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ
）旦、３０９（１９８１）］、ＪＡ２２１［ジャーナル
・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ　ｏｕｒｎａ
ｌ　　ｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒ　　Ｂ　ｉｏｌｏｇｙ）
　１２０　＋５１７（１９７８）］、ＨＢ　１．０１［
ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー、ｓ」
、４５９（１９６９）コ、Ｃ６００［ジェネティックス
（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、　３旦、４４０（１９５４）］
、ＭＭ２９４［Ｐｒｏｃ、　Ｎａ１１．　Ａｃａｄ、　
Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　　７３＋４１７４（１９７６）］な
どが挙げられる。

上記バチルス属菌としては、たとえばバチルス・サチル
ス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　　５ｕｂｔｉｌｉｓ）　Ｍ　
１１１４［（ジー７．２４，２５５（１９８３月、２ｏ
７２１［ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ　
ｏｕｒｎａｌ　　ｏｆ　　Ｂ　１ｏｃｈｅｎｉｓｔｒｙ
）１旦、８７（１９８４）］などが挙げられる。

上記酵母としては、たとえばサツ力ロマイセスセレビシ
アエ（Ｓ　ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　　ｃｅｒｅｖｉ
ｓｉａｅ）ＡＨ２２Ｒ−、ＮＡ３７−１１Ａ、ＤＫＤ−
５Ｄなどが挙げられる。

動物細胞としては、たとえばサル細胞ＣＯ５−７＋　Ｖ
　ｅｒｏ、チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ，マウス
Ｌ細胞、ヒトＦＬ細胞などが挙げられる。

上記エシェリキア属菌を形質転換するには、たとえばＰ
ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　　Ａｃａｄ、　　Ｓ’ｃｉ、　
　ＵＳＡ、（３９゜２１１０（１９７２）、ジーン、１
７，１０７（１９８２）などに記載の方法に従って行な
われる。

バチルス属菌を形質転換するには、たとえばモレキュラ
ー・アンド・ジェネラル・ジェネティックス（Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ　　＆　　Ｇ　ｅｎｅｒａｌ　　Ｇ　ｅｎｅ
ｍｉｅｓ）。

１６８．１１１（１９７９）などに記載の方法に従って
行なわれる。

酵母を形質転換するには、たとえばＰ　ｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａ’ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　　７５
；１９２９（１９７８）に記載の方法に従って行なわれ
る。

動物細胞を形質転換するには、たとえばグイロロジー（
Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）５２，４５６（１９７３）に記載の
方法に従って行なわれる。

このようにして、ムティンをコードする塩基配列を有す
る組換えＤＮＡを含むベクターを保持する形質転換体が
得られる。

該形質転換体を培地に培養することにより、ムティンを
産生させる。

宿主がエシェリキア属菌、バチルス属菌である形質転換
体を培養する際、培養に使用される培地としては液体培
地が適当であり、その中には該形質転換体の生育に必要
な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せしめられる。

炭素源としては、たとえばグルコース、デキストリン、
可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源としては、たとえばア
ンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、
１ブトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽
出液などの無機または有機物質、無機物としてはたとえ
ば塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグ
ネシウムなどがあげられる。また、酵母、ビタミン類、
生長促進因子などを添加してもよい。

培地のｐＨは約６〜８が望ましい。

エシェリキア属菌を培養する際の培地としては、例えば
グルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地［Ｍｉｌｌｅｒ
、ジャーナル・オブ・エクスペリメンツ・イン・モレキ
ュラー・ジェネティソクス（Ｊ　ｏｕｒｎａｌ　　ｏｆ
　　Ｅ　ｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　　ｉｎ　　Ｍｏ１ｅｃ
ｕｌａｒＧｅｎｅｔｉｃｓ）、４３１　４３３．Ｃｏ１
ｄ　　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　　Ｌ　ａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ、　　Ｎ　ｅｗ　　Ｙ　ｏｒｋ　　１９７２）］
が好ましい。ここに必要によりプロモーターを効率よ（
働かせるために、たとえば３β−インドリル　アクリル
酸のような薬剤を加えることができる。

宿主がエシェリキア属菌の場合、培養は通常約１５〜４
３°Ｃで約３〜２４時間行い、必要により、通気や撹拌
を加えることもできる。

宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約３０〜４０″
Ｃで約６〜２４時間行ない、必要により通気や撹拌を加
えることもできる。

宿主が酵母である形質転換体を培養する際、培地として
は、たとえばパークホールダー（Ｂ　ｕｒｋｈｏｌｄｅ
ｒ）最小培地［Ｂｏｓｔｉａｎ、　　Ｋ、　　Ｌ、ら。

Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ、　　
ＵＳＡ、７７゜４５０５（１９８０）］が挙げられる。

培地のｐＨは約５〜８に調整するのが好ましい。培養は
通常約２０°Ｃ〜３５°Ｃで約２４〜７２時間行い、必
要に応じて通気や撹拌を加える。

宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地と
しては、たとえば約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥ
Ｍ培地［サイエンス（Ｓ　ｃｉｅｎｃｅ）上ｌじし５０
１　（１９５２）］、　ＤＭＥＭ培地［つ゛イロロジー
（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）、８，３９６（１９５９）］、Ｒ
ＰＭ＋　１６４０培地［ジャーナル・オブ・ザ・アメリ
カン・メディカル・アソシエーション（ＴｈｅＪｏｕｒ
ｎａｌ　　ｏｆｔｈｅ　　Ａｍｅｒｉｃａｎ　　Ｍｅｄ
ｉｃａｌＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）　　１９９，５１９
（１９６７）］。

１９９培地［プロシーディング・オブ・ザ・ソサイエテ
ィ・フォー・ザ・バイオロジカル・メデイスン（Ｐ　ｒ
ｏｃｅｅｄｉｎｇ　　ｏｒ　　ｔｈｅ　　Ｓ　ｏｃｉｅ
ｔｙ　　ｆｏｒｔｈｅ　　Ｂｉｏｌｏｇｃａｌ　　Ｍｅ
ｄｉｃｉｎｅ）７３．１（１９５０）］などが挙げられ
る。ｐＨは約６〜８であるのが好ましい。培養は通常約
３０〜４０°Ｃ１培養時間は約１５〜６０時間行い、必
要に応じて通気や撹拌を加える。

上記培養物からムティンを分離精製するには、例えば下
記の方法により行うことができる。

ムティンを培養菌体あるいは細胞から抽出するに際して
は、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、こ
れを塩酸グアニジンなどの蛋白質変性剤を含む緩衝液に
懸濁して菌体外に目的の蛋白を溶出させる方法、フレン
チプレス、超音波、リゾチームおよび（または）凍結融
解によって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離
によりムティンを得る方法などが適宜用い得る。とりわ
け、リゾチームと超音波処理を併用する方法が好ましい
。

上記上澄液からムティンを精製するには、自体公知の分
離・精製法を適切に組み合わせて行なうことができる。

これらの公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱
法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、
ゲルろ過法、および５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、イ
オン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する
方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的
親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィ
ーなどの疎水性の差を利用する方法、等重点電気泳動法
などの等電点の差を利用する方法などが挙げられる。

さらに具体的には、上記上澄液をＤＥＡＥセルロースな
どを担体としたイオン交換クロマトグラフィーにかける
ことにより、夾雑する核酸や酸性蛋白質等を除くことが
できる。たとえば、中性附近のトリスなどの緩衝液で平
衡化したＤＥＡＥセルロースカラムに上澄液をかけ、素
通り画分を集めることは有効で゛ある。また、さらにＣ
Ｍセルロースなどを担体としたイオン交換クロマトグラ
フィーにかけることにより、ムティンを担体に吸着させ
、塩溶液を用いてこれを溶出させることができる。これ
らの溶出液は透析後、凍結乾燥することができる。

ＣＭセファデックス等の酸性樹脂のカラムクロマトグラ
フィーにより、菌体抽出液から直接、ｂＦＧＦムティン
を精製することもできる。たとえば、上清液を、弱酸性
緩衝液（例、リン酸緩衝液）で平衡化したＣＭ−セルロ
ースカラムにかけることにより、効率良く行なうことが
できる。カラムを同じ緩衝液で洗浄後、カラムを、塩（
例、Ｎ　ａＣ１）をさらに含有する緩衝液を用いて溶出
することにより、ｂＦＧＦムティンを溶出させることが
できる。これらの溶出液は透析後、凍結乾燥することが
できる。

また、ヘパリン−セファロースを担体としたアフィニテ
ィークロマトグラフィー法を、ｂＦＧＦムティンの精製
法として、抽出液中のｂＦ　Ｇ　Ｆ　ムティン蛋白質に
も適用すると好都合である。たとえば中性附近のトリス
、リン酸などの緩衝液で平衡化したヘパリン・セファロ
ースカラムに、上記溶出液をかけ、十分洗った後、Ｎ　
ａｃ＆などの直線勾配溶出を行うことによりｂＦＧＦム
ティン蛋白質を精製することができる。

特に、高速液体クロマトグラフィー用に開発されたヘパ
リンカラム（たとえばＳ　ｈｏｄｅｘ　Ａ　Ｆ　−ｐａ
ｋＨＲ・８９４．昭和電工製など）は有効である。

上記ヘパリンセファロースカラムと同様に、中性附近の
緩衝液でサンプルをかけ、十分洗ったのちＮａＣｌ２な
どの直線勾配溶出を行うと、ｂＦＧＦムティンはほぼ均
一な標品として回収することができる。

この様にして得られた標品は透析、凍結乾燥を行い、乾
燥粉末とすることらできる。さらに、担体として血清ア
ルブミンなどを添加して保存することは、標品の容器へ
の吸１１を防くことができ好適である。

また、精製過程、あるいは保存過程での微量の還元剤の
共存は、該標品の酸化を防ぐのに好適である。還元剤と
してはβ−メルカプトエタノール。

ジチオスレイトール、グルタチオンなどが挙げられる。

このようにして、実質的にパイロジエンもエンドトキシ
ンも含まない、実質的に純粋なりＦＧＦムティンが得ら
れる。該実質的に純粋なりＦＧＦムティンとしては、蛋
白質含量としてｂＦＧＦムティンを９５％（ｗ／ｗ）以
上であるもの、さらに好ましくはｈｂＦＧＦを９８％ｈ
／ｗ）以上であるものが挙げられる。

上記の方法により得られるｂＦＧＦムティンは線維芽細
胞の増殖を促進させる作用、血管内皮細胞の増殖を促進
させる作用、血管を新生させる作用を有し、安定性が高
く、毒性は低いので火傷。

創ｆ帽術後組織なとの治癒促進剤、あるいは血管新生作
用による血栓症や動脈硬化症などの治療薬として用いる
ことができる。また、細胞培養を促進させるための試薬
として用いることができる。特に、構成システィンのう
ち少なくとも一つがセリンに置換されたものは、安定性
が高いので好ましい。

本発明のムティンを医薬として用いるには、そのまま粉
末として、または他の薬理学的に許容されうる担体、賦
形剤、希釈剤とともに医薬組成物（例、注射剤１錠剤、
カプセル剤、液剤、軟膏）として、温血動物（例、ヒト
、マウス、ラット、ハムスターウサギ、犬、ネコ）に対
して非経口的または経口的に安全に投与することができ
る。

注射剤の製剤化はたとえば生理良塩水またはブドウ糖や
その他の補助薬を含む水溶液を用い、常法に従って行な
われる。錠済す、カプセル剤等の医薬組成物も常法に従
って調製しうる。

本発明のムティンを上記した医薬として用いる場合には
、たとえば上記した温血動物に、投与ルート、症状など
を考慮して、１日Ｍ約１ｎｇないし１００μｇ／ｋｇの
中から適当量を選んで投与される。

ま、た、本発明のムティンを細胞培養を促進させるため
の試薬として用いる場合、培地ｌＱあたり約０．０１〜
１０μｇ、さらに好ましくは約０．１〜ＩＯμｇとなる
ように培地に加えることが好ましい。

本発明明細書および図面において、塩基やアミノ酸など
を略号で表示する場合、　ＩＵＰＡＣＩ　Ｕ　Ｂ　　Ｃ
ｏｍｍｉｓｉｏｎ　　ｏｎ　　Ｂ　ｉｏｃｈｅｍｉｃａ
ｌＮ　ｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅによる略号あるいは当該
分野における慣用略号に基づくものであり、その例を下
記する。また、アミノ酸に関し光学異性体がありうる場
合は、特に明示しなければＬ一体を示すものとする。

ＮＡ ＤＮＡ ＮＡ ｄΔ′ＦＰ （ＩＴＴＰ ＧＴＰ ＣＴＰ ＴＰ ：デオキシリボ核酸 二手ロ浦的デオキシリボ核酸 ：アデニン ：チミン グアニン ：シトジン ：リボ核酸 ：デオキシアデノシン三リン酸 ：デオキシチミジン三リン酸 ：デオキシグア７シン三リン酸 ・デオキシシチジン三リン酸 ；アゾ／シン三リン酸 Ｔｄｒ ＥＤＴＡ ＤＳ ｌｙ ｌａ ａｌ ｅｕ １ｅ ｅｒ ′Ｆｈｒ ｙｓ Ｍｅｔ ｌｕ ｓｐ ｙｓ Δｒｇ ｉｓ ｈｅ ｙｒ ｒｐ ：チミジン ：エチレンジアミン四酢酸 ニドデシル硫酸ナトリウム ニゲリシン ；アラニン ：バリン ・ロイシン ：イソロイシン ：セリン ・スレオニン ：システイン メチオニン グルタミン酸 アスパラギン酸 、リシン アルキニン ヒスチジン ；フェニールアラニン ：チロシン コトリプトファン Ｐｒｏ　　　　ニブロリン Ａｓｎ　　　　：アスパラギン Ｇｌｎ　　　　：グルタミン 本明細書および図面において、ヒトｂＦＧＦの構成アミ
ノ酸の番号は、前述のアミノ酸配列［［］のＮ末端にＭ
ｅｔが付加したアミノ酸配列において、該Ｍｅｔを第１
番目として数えるものとする。

以下の参考例、実施例で用いられるプラスミドｐ”ｒ　
Ｂ　６６９を保持する形質転換体Ｅ、　ｃｏｌｉ　Ｋ　
１２ＭＭ２９４／ｐＴＢ６６９．以下の参考例で得られ
た形質転換体Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＭＭ２９４／ｐＴ！３７
６２、以下の実施例で用いられたプラスミドｐＴＢ　Ｆ
３４８を保持する形質転換体Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＤＨＩ／
ｐ′ｒＢ８４８は、財団法人発酵研究所（１’Ｆｏ）お
よび通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所（ＦＲ
ｌ）に寄託されている。それらの受託番号および受託臼
を次の第１表に示す。なお、第１表において、ＦＥＲＭ
　　Ｐ番号とＦＥＲＭ　　ＢＰ層番号が併記されている
ものは、当初国内寄託がなされＦＥＲＭ　　Ｐ番号で示
される受託番号が付され、該寄託はブダペスト条約に基
づく寄託に切換えられて、ＦＥＲＭ　　ＢＰ層番号示さ
れる受託番号が付され、同研究所（ＦＲＩ）に保管され
ている。

（以 下 余 白） 後述の実施例で得られた次の第２表に示す形質転換体は
、ＩＦＯおよびＦＲＩに寄託されている。

それらの受託番号および受託臼を第２表に示す。

（以下余白） 後述の実施例２（３）において得られたマウスハイブリ
ドーマＨｂＦ５２およびマウスハイブリドーマＨｂＦ７
８は、それぞれ昭和６２年８月１７日からＩＦＯに次の
受託番号として寄託されている。

マウス）（ｂＦ５２細胞： ＩＦＯ５０１４３ マウスＨｂＦ７８細胞 ＩＦＯ５０１４４ 参考例１　（ムティンをコードする塩基配列を有する組
換えＤＮＡの製造） （１）、ヒトｂＦＧＦ遺伝子のＭ１３ベクターのクロー
ニング： ヨーロッパ特許出願公開第２３７，９６６号公報実施例
３で得られたプラスミドｐ’ｒ　Ｂ　６６９を制限酵素
ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで消化させた。ファージベク
ター・Ｍ１３ｍｐ８１ニジエイ・メッシング（Ｊ。

Ｍｅｓｓｉｎｇ）、メ７　ッ；”　’イア　−ｘ　７シ
ーＥ＝　’、；　−↓旦」、２０〜７８（１：ｌ！８３
））複製型（ＲＦ）ＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＢ
ａｍＨＩで消化させ、予めＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで
消化させてあったｐＴ　８６６９由来のヒトｂＦＧＦ　
　ＤＮΔ断片と混合した。次に混合物をＴ４ＤＮＡリガ
ーゼで連結させ、連結ＤＮＡを大腸菌−ＪＭ１０５閑株
の被感染能力のある菌体中へ形質転換させ、Ｘｇａｌを
指示極とするプレート上に播き〔ジェイ・メソシング等
、ニュークレイツク・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ　　Ａｃ１ｄｓ　　Ｒｅｓ、　）　（１９８１）９
巻３０９−３２１頁〕、組換えファージを含有するプラ
ーク（白いプラーク）を拾い上げ、組み換え部分の塩基
配列をジデオキシヌクレオチド合成鎖停止法［Ｊ、　Ｍ
ｅｓｓｉｎｇ　　ら、ヌクレイツク・アシッズ・リサー
チ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　　Ａｃ１ｄｓ　　Ｒｅｓ、　）　
９　＋　　３０９（１９８１）］によって決定して、・
ヒトｂＦ　Ｇ　ＦＤＮＡが正確に挿入されていることを
確認した。

このＭ１３−ＰＯツクーンから１本鎖ファージＤＮＡを
精製し、合成オリゴヌクレオチドを使用する特定部位指
向性変異誘発の鋳型として用いた。

（２）サイト特異的突然変異誘発 ０．１ｍＭアデノシン三燐酸（ＡＴ、Ｐ）、５０ｍＭヒ
ドロキシメチルアミノメタン塩酸塩（トリスＨＣ１）ｐ
Ｈ８，０、ｌ　ＯｍＭ　　ＭｇＣＬ、５ｍＭジチオスレ
イトール（ＤＴＴ）及びＴ４キナーゼ９単位の存在下に
、５０μＱ中で合成オリゴヌクレオチド ５’＞ＣＧＴ　　　　ＴＣＴ　　　　ＴＧＣＴＧＴ　　
　　ＡＧＡＧＣＣＧＣＴ　　　＜３’ ［Ｃｙｓ２６をＳｅｔに変更するためのブライマー（制
限酵素Ｒｓａ　Ｉの認識配列が消失する。）］４０ピコ
モルをＴ４キナーゼにより３７°Ｃで１時間処理した。

５０ｍＭ　　ＮａＣｌ、１．ｏａ＋Ｍ）リス−ＨＣｌ、
ｐｌ−１８、０、１０ｍＭ　　ＭｇＣＬ及びｌｏｍＭ　
　β−メルカプトエタノールを含有する混合物５０μｅ
中で、このキナーゼ処理されたブライマー（１２ピコモ
ル）を６７°Ｃで５分、及び４２℃で２５分加熱するこ
とによって１本鎖（ｓｓ）Ｍ２Ｓ−ＰＯＤＮＡ５μｇに
雑種形成させた。アニーリングした混合物を次に水上で
冷却し、０．５ＩＩＩＭ各デオキシヌクレオチド三燐酸
（ｄＮＴＰ）、８０１１Ｍトリス−ＨＣｌ、　ｐＨ７，
４，８ｍＭ　　ＭｇＣＬ、１００ｍＭ　　ＮａＣ１、Ｄ
ＮＡポリメラーゼｌ　　Ｋｌｅｎｏｗ断片９単位、０．
５ｎ＋Ｍ　　ＡＴＰ及びＴ４ＤＮＡリカーゼ２単位を含
有する反応混合物５０μＱに添加し、３７°Ｃで３時間
及び２５℃で２時間反応し、０゛、２ｍＭ　　ＥＤＴＡ
２μｇを加え反応を停止した。

被感染能力のあるＪＭ１０５細胞の形質転換に使用し、
菌を一夜成育させ、培養基上澄液から５ｓＤＮＡを単離
した。この５ｓＤＮＡをブライマー伸長の第二サイクル
に鋳型として使用し、ゲル精製されたＲＦ型ＤＮＡを被
感染能力のあるＪＭ１０５細胞中へ形質転換させ、寒天
プレート上に播き、−夜培養するとファージプラークが
得られた。

（３）特定部位指向性変異誘発： 上の（２）項の操作をくり返すが、但し使用の合成オリ
ゴヌクレオチドブライマーは、システィン７０を暗号づ
けるものからセリンを暗号づけるもので ５’＞ＡＡＣＧＡＴ　　ＴＡＧ　　ＣＧＣＴＣＡ　　Ｃ
ＴＣＣ＜３’ とする。（制限酵素Ｈａｅｌｌの認識配列が生成される
）（４）特定部位指向性変異誘発： 上の（２）項の操作をくり返すが、但し使用の合成オリ
ゴヌクレオチドブライマーは、システィン８８を暗号づ
けるものからセリンを暗号づけるもので ５’＞ＧＴＡ　　ＡＣＡ　　ＧＡＣＴＴＡ　　　　ＧＡ
Ａ　　ＧＣＴ　　ＡＧＴ　　＜３’ とする。（制限酵素Ａｌｕｌの認識配列が生成される） （５）特定部位指向性変異誘発； 上の（２）項の操作をくり返すが、但し使用の合成オリ
ゴヌクレオチドブライマーは、システィン９３を暗号づ
けるものからセリンを暗号づけるもので ５’＞ＴＣＣ；　　ＡＡＧ　　ＡＡＧ　　ＡＡＡ　　Ｇ
ＡＣＴＣＡ　　ＴＣＣ＜３’ とする。（制限酵素Ｈｉｎｆ　Ｉの認識配列が生成され
る） （６）突然変異誘発厚化されたプラークのふるい分けと
同定： 突然変異させたＭ２Ｓ−ＰＯプラークの入ったプレート
類（上記（１）項）並びに突然変異しないＭ２Ｓ−ＰＯ
ファージプラークの入った２枚のプレートを４°Ｃに冷
却し、各プレートからのプラークを２枚のニトロセルロ
ース円形フィルター上へ、第一フィルターの場合には乾
燥フィルターを寒天プレート上へ５分重ね、第二フィル
ターの場合は１５分重ねて移した。次に０．２Ｎ　　Ｎ
ａＯＨ。

１．５Ｍ　　ＮａＣ１及び０．２％トリトンＸ−１００
に５分浸した厚手のろ紙上へフィルター類を置き、次に
０．５Ｍ）リス−ＨＣｌ、ｐＨ７，５、及び１，５Ｍ　
　ＮａＣｌに浸したろ紙上へ更に５分重ねて中和した。

フィルター類を同様なやり方で２ＸＳＳＣ（標準クエン
酸塩）に浸したフィルター上で２回洗い、乾燥し、真空
乾燥炉内で８０°Ｃで２時間乾燥させた。重複フィルタ
ー類をフィルター当たり１０ｄのＤＮＡ雑種形成緩衝液
（５ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｃ）、ｐＨ７，０，４Ｘデンハード液
（ポリビニルピロリドン。

フィコール及び牛血清アルブミン、ｌＸ４０．０２％）
、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（Ｓ　Ｄ　Ｓ　）。

５０ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７，０及びｌＯＯ
μｇ／ｄの、変性サケ精子ＤＮＡにより、５５°Ｃで４
時間、事前雑種形成させた。オリゴヌクレオチドブライ
マーをｌ　Ｏ’ｃｐｍ／　ｔｔｆｌに４２°Ｃで２４時
間雑種形成させた。０，１％ＳＤＳと２×ＳＳＣを含有
する洗浄用緩衝液中でそれぞれ３０分、５０’Ｃでフィ
ルター類を洗った。フィルター類を、初めに２ＸＳＳＣ
を含んだ緩衝液で洗い、突然変異化されないＭＩ３−Ｐ
Ｏプラークを含有する対照フィルターはガイが一計数管
を用いて放ｑ４能の存在について検査した。ＳＳＣ濃度
を段階的に低下させ、未突然変異Ｍ１３−ＰＯプラーク
をもつ対照フィルター上に検出可能な放射能が残らなく
なるまでフィルター類を洗った。ＳＳＣの使用最低濃度
はＱ、ｌＸ５ｓｃであった。フィルターを空気乾燥し、
−７０°Ｃで２〜３日露光してオートラジオグラフをと
った。突然変異したＭ２Ｓ−ＰＯのプラーク１００００
個と突然変異されない対照プラーク１００個をキナーゼ
処理したオリゴヌクレオチドプローブによってふるい分
けた。

対照プラークではプローブと雑種形成したものが全（存
在せず、一方突然変異されたＭＩ３−ＰＯプラーク３〜
１０個がプローブと雑種を形成した。

突然変異Ｍ１３−ＰＯプラークの１個を取り上げ、ＪＭ
１０５培養基へ接種した。上澄液から５ｓＤＮＡをつく
り、菌体ペレットから２本鎖（ｄｓ）ＤＮＡをつくった
。適当なオリゴヌクレオチドブライマーと５ｓＤＮＡを
使用して塩基配列を解析した。

その結果、ＴＧＣ（Ｃｙｓ２６）コドンがＴ　ＣＴ（Ｓ
　ｅｒ）　：ｌトンへ変換されたこと、ＴＧＴ（Ｃｙｓ
７０）コドンがＡＧＣ（Ｓｅｒ）コドンへ変換されたこ
と、ＴＧＴ（Ｃｙｓ８８）コドンが、ＴＣＴ（Ｓｅｒ）
コドンへ変換されたこと、ＴＧＴ（Ｃｙｓ９３）コドン
がＴ　ＣＴ　（Ｓ　ｅｒ）コドンへ変換されたことがそ
れぞれ確認された。

変異したＭｌｌ−ＰＯファージのうち、コドンＣｙｓ−
２６がＳｅｒになったものをＭ２Ｓ−Ｐｉ。

：＋トンＣｙｓ−７０がＳｅｔになったものをＭ１３ｐ
２．コドンＣｙｓ−８８がＳｅｔになったものをＭ２Ｓ
−Ｐ３．コドンＣｙｓ−９３がＳｅｔになったものをＭ
２Ｓ−Ｐ４とした。

参考例２　（突然変異誘発厚化されたプラークのふるい
分けと同定） 参考例Ｉで得られた突然変異させたＭ２Ｓ−Ｐ２ファー
ジプラークの入ったプレート類並びに参考例１で得られ
た突然変異しないＭ　ｌ　３−　Ｐ　２フアージプラー
クの入った２枚のプレートを４°Ｃに冷却し、各プレー
トからのプラークを２枚のニトロセルロース円形フィル
ター上へ、第一フィルターの場合には乾燥フィルターを
寒天プレート上へ５分重ね、第二フィルターの場合は１
５分重ねて移した。次に０．２Ｎ　　ＮａＯＨ，１，５
Ｍ　　ＮａＣ！及び０．２％トリトンＸ−１００に５分
浸した厚手のろ紙上へフィルター類を置き、次に０．５
Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７，５、及び１．５Ｍ　　Ｎａ
Ｃ！に浸したろ紙上へ更に５分重ねて中和した。フィル
ター類を同様なやり方で２ＸＳＳＣ（標準クエン酸塩）
に浸したフィルター上で２回洗い、乾燥し、真空乾燥炉
内で８０℃で２時間乾燥させた。

重複フィルター類をフィルター当たり１０威のＤＮＡ雑
種形成緩衝液（５ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｃ）、ｐＨ７，０，４Ｘ
デンハード液（ポリビニルピロリドン、フィコール及び
牛血清アルブミン、１Ｘ４０．０２％）。

０９１％ドデシル硫酸ナトリウム（Ｓ　Ｄ　Ｓ　）、　
５０ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液、ＰＨ７，０及び　１０
０μｇ／成の、変性サケ精子ＤＮＡにより、５５°Ｃで
４時間、事前雑種形成させた。オリゴヌクレオチドブラ
イマーを１０　’ｃｐｍ／　ｔｎｌに４２°Ｃで２４時
間雑種形成させた。０Ｎ％ＳＤＳと２ＸＳＳＣを含有す
る洗浄用緩衝液中でそれぞれ３０分、５０′Ｃでフィル
ター類を洗った。フィルター類を、初めに２ＸＳＳＣを
含んだ緩衝液で洗い、突然変異化されないＭ２Ｓ−Ｐ２
プラークを含有する対照フィルターはガイガー計数管を
用いて放射能の存在について検査した。５ｓｃ７ａ度を
段階的に低下させ、未突然変異Ｍ１３−Ｐ２プラークを
もつ対照フィルター上に検出可能な放射能が残らなくな
るまでフィルター類を洗った。ＳＳＣの使用最低濃度は
Ｑ、１ｘｓｓｃであった。フィルターを空気乾燥し、−
７０’Ｃで２〜３日露光してオートラジオグラフをとっ
た。突然変異したＭ２Ｓ−Ｐ２のプラークｔｏｏｏｏ個
と突然変異されない対照プラーク１００個をキナーゼ処
理したオリゴヌクレオチドプローブによってふるい分け
た。対照プラークではプローブと雑種形成したものが全
（存在せず、一方突然変異されたＭ２Ｓ−Ｐ２プラーク
３〜１０個がプローブと雑種を形成した。

突然変異Ｍ１３−Ｐ２プラークの１個を取り上げ、ＪＭ
１０５培養基へ接種した。上澄液から５ｓＤＮＡをつく
り、１体ペレットから２本鎖（ｄｓ）ＤＮＡをつくった
。適当なオリゴヌクレオチドブライマーと５ｓＤＮＡを
使用して塩基配列を解析した。

その結果、ＴＧＣ（Ｃｙｓ２６）コドンが１’　Ｃ′ｒ
（Ｓｅｔ）コドンへ変換されたこと、ＴＧＴ（Ｃｙｓ８
８）コドンがＴ　ＣＴ　（Ｓ　ｅｔ）コドンヘ変換され
たこと、ＴＧＴ（Ｃｙｓ９３）−１トンがＴ　ＣＴ　（
Ｓ　ｅｔ）コドンへ変換されたことがそれぞれ確認され
た。

変異したＭ２Ｓ−Ｐ２ファージのうち、コドンＣｙｓ−
２６および−７０がＳｅｒになったものをＭｌｌ−ＰＩ
３．コドンＣｙｓ−７０および−８８がＳｅｔになった
ものをＭ２Ｓ−Ｐ２３．）トンＣｙｓ−７０および−９
３がＳｅｔになったものをＭ１３Ｐ２４とした。

参考例３　（ヒトｂＦＧＦのムティンをコードする遺伝
子の大腸菌における発現） （１）　　ヒトｂＦＧＦのムチ４フ発現用プラスミドｐ
Ｔ　Ｂ　７６２の構築 前記参考例２て得られたＭ２Ｓ−Ｐ２３のレプリカティ
ブフォーム（ＲＦ）を制限酵素ＥｃｏＲ１およびＰｓｔ
ｌで切断し、ヒトｂＦＧＦのムティンをコードする領域
を含む約０　、５　Ｋ　ｂ　　Ｉ）　Ｎ　、Ａ断片を得
た。

一方、ｔｒｐプロモーターを有するプラスミドｐＬｒｐ
７８１　　［Ｋｕｒｏｋａｗａ、　　Ｔ　　らニューク
レイツク゛アシノズ・リサーチ（Ｎ　ｕｃｌｅｉｃ　　
Ａ　ｃｉｄｓ　　Ｒｅｓ、）よｊ、　　３０７７−３０
８５（１９８３））ＤＮＡをＥｃｏＲ１−Ｐｓｔ　Ｉで
切断して、ｔｒｐプロモーター、テトラサイタリン耐性
遺伝子およびプラスミド複製開始部位を含む約３．２Ｋ
ｂ　　ＤＮＡ断片を分離した。ヒトｂＦＧＦのムティン
をコードする遺伝子領域を含む前記０．５Ｋｂ　　Ｅｃ
ｏＲＩ−ＰｓｔＩ　　ＤＮＡ断片と、この３．２Ｋｂ　
　ＤＮＡ断片をＴ４ＤＮΔリガーゼ反応により結合させ
、ヒｈｂＦＧＦのムティン発現用プラスミドｐＴ　Ｂ　
７６２を構築した。

このプラスミドｐＴＢ７６２を用いて大腸菌ＭＭ２９４
を形質転換させることによりヒトｂＦＧＦの７０位およ
び８８位のＣｙｓがＳｅｔに置換されたｒｈｂＦ　Ｇ　
Ｆムティンｃｓ２３をコードする遺伝子を含有するプラ
スミドｐＴＢ　７６２を含む菌株Ｅｓｃｌ＋ａｒｉｃｈ
ｉａ　　ｃｏｌｉ　　ＭＭ２９４／ｐＴＢ７６２（ＩＦ
Ｏ１４６１３，ＦＥＲＭ　　ＢＰ−１６４５）を得た。

（２）菌体抽出液の調整 前記形質転換体を、後述の実施例２（２）と同様の方法
で培養し、上清を得、菌体抽出液とした。

（３）菌体抽出液のヒトｂＦＧＦ活性 マウスＢＡＬＢ／１ｃ３Ｔ３細胞を５％仔牛血清を含む
Ｉ；）ＭＥＭ培地でタンク９６穴マイクロタイタープレ
ート（平底）に１穴あたり２Ｘ１０３個を０．２Ｍｌの
培地にて播種して、培養し、翌日０．５％仔牛血清を含
むＤＭＥＭ培地に交換した。

３日間培養したのち０．５％ＢＳＡを含むＤＭＥ培地で
５倍ずつ段階的に希釈した菌体抽出液を１穴あたり１０
μＱ添加して、培養し、２０時間後（こ’Ｈ−Ｔｄｒ（
５Ｃｉ／ｍｍｏｌ、０．５ｍＣ１／！　　ＲＣＣＡ　ｍ
ｅｒｓｈａｍ）を各式に２μρずつ加えた。６時間後に
細胞を０．２％トリプシン−０，０２％Ｅ　Ｄ　ＴＡを
含むリン酸緩衝液（ＰＢＳ）処理ではがし、タイターチ
ックセルハーベスタ−を用いて、グラスフィルター上に
細胞を捕集し細胞に取り込まれた月１Ｔｄｒｆｆｉをシ
ンチレーションカウンターにて測定した。

その結果、Ｅ、　ｃｏｌｉ　　ＤＨＩ　／ｐ”ＦＢ　７
６２の菌体抽出液は、ＦＧＦ活性を示した。

このようにして、ヒトｂＦＧＦの７０位および８８位の
ＣｙｓかＳｅｒに置換されたｒｈｂＦ　Ｇ　Ｆムティン
Ｃ３２３が得られた。

実施例１　（ヒトｂＦ　Ｇ　Ｆ　ｃＤ　Ｎ　Ａのデレー
ジョン反応とミュータントの構築およびヒト ｂＦＧＦムティン発現型プラスミドの 構築） ヨーロッパ特許出願公開第２３７，９６６号公報実施例
３で得られたプラスミドｐＴ　８６６９より、ヒトｂＦ
ＧＦ　ｃＤＮＡ相当部分を制限酵素ＥｃｏＲＩとＢｇｌ
Ｕにより分離し、プラスミドｐＴＢ　８９１　　［ｐＵ
Ｃ１１８（Ｖｉｅｉｒａ、　Ｊ、　ａｎｄ　Ｍｅｓｓｉ
ｎｇＪ、　ＭｅＬｈｏｄｓ　　ｉｎ　　Ｅｎｚｙｍｏｌ
ｏｇｙ準備中）（宝酒造株式会社製）のマルチクローニ
ングサイトのＨｉｎｄＩ１１部位をＢ　ｇ（２ＩＩリン
カ−（ＣＡＧＡＴＣＴＧ）［宝酒造株式会社製］を用い
てＢ　ｇ（！　ＩＴ部位に変換したプラスミド。〕のＥ
ｃｏＲＩとＢａｍＨ１部位に組み込んでプラスミドｐＴ
　Ｂ　９０４を構築した。このプラスミドｐＴＢ　９０
４をＸｂａｌ、ＰｓＬＩの２種類の制限酵素で切断し、
Ｅｘｏｌｌｌヌクレアーセ反応とマングビーンヌクレア
ーゼ反応をキロシーフェンス用デレージョンキット（宝
酒造株式会社製）を用いて行い、さらにＮ　ｈｅ　Ｉス
トップリンカ−（二ニーイングランド　バイオラブズ社
製（米国乃をライゲージリンして大腸菌Ｅ、　ｃｏｌｉ
　　ＭＶ　１１８４を形質転換したく第２図参照）。

得られたミュータントをＤＮＡの塩基配列決定によりス
クリーニングし、ヒトｂＦＧＦのＣ末端をコードする部
分が適当に修飾された形のミュータントを選んだ。これ
らのプラスミドをｐＴ　８９０５〜９１６とし、それぞ
れのｂＦ　Ｇ　Ｆ　ｃＤ　Ｎ　Ａ部分とそこにフードさ
れるｂＦＧＦムティンを第３〜９図に示した。プラスミ
ドｐＴＢ　９０５は、ヒ）ｂＦＧＦの第１０２〜１４７
位のアミノ酸が欠損したｒｈｂＦ　Ｇ　ＦムティンＣ１
ｏｔをフードする（第３図参照）。プラスミドｐ’ｒ　
Ｂ　９０６は、ヒトｂＦＧＦの第１０６〜′１４７位の
アミノ酸が欠損したｒｈｂＦ　Ｇ　ＦムティンＣｌＯ３
をコードする（第４図参照）。プラスミドｐ’ｒ　Ｂ　
９０７は、ヒトｂＦＧＦの第１１５〜１４７位のアミノ
酸が欠損したｒｈｂＦ　Ｇ　ＦムティンＣ１１４をコー
ドする（第５図参照）。プラスミドｐ’ｒ　Ｂ　９０８
は、ヒトｂＦＧＦの第１１９〜１４７位のアミノ酸が欠
損したｒｈｂＦＧＦムティンＣ１１８をコードする（第
６図参照）。プラスミドｐＴＢ　９０９は、ヒトｂＦＧ
Ｆの第１２４〜１４７位のアミノ酸が欠損したｒｈｂ　
ＦＧ　ＦムティンＣｌ２３をコードする（第７図参照）
。

プラスミドｐＴＢ９１０は、ヒトｂＦＧＦの第１３０〜
１４７位のアミノ酸が欠損したｒｈｂＦＧＦムティンＣ
ｌ２９をコードする（第８図参照）。ブラスミＦｐＴＢ
９１１は、ヒトｂＦＧＦの第１３９〜１４７位のアミノ
酸が欠損し、１３８位のイソロインンがセリンに置換さ
れたｒｈｂＦ　ＣＦムティンＣ１３７をコードする（第
９図参照）。さらにプラスミドｐＴＢ９０５〜９１１の
それぞれをＥｃｏＲｌ−８ｇ１２［１で切断しｂＦＧＦ
　ｃＤＮＡ（修飾型）部分を単離した。

一方、ヨーロッパ特許出願公開公報筒２７２゜８９４号
公報実施例６で得られたプラスミドｐＴ８８４８よりリ
ンホトキシンをコードするＤＮＡを含むｌ　、　２　ｋ
ｂｐのＢｇＩ２■断片を切り出し、Ｔ４ＤＮＡポリメラ
ーゼ反応により平滑末端とした後、プラスミドｐ（Ｊｃ
　　１９　（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ、　Ｃら、
（１９８５）Ｇｅｎｅ　３３１０３−１１９゜Ｍｅｓｓ
ｉｎｇ　Ｊ、　（１９８３）　Ｍｅｔｈｏｄｓ　　ｉｎ
　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙｌｏ　１．２Ｏ−７８）（ファ
ルマシア社（スエーデン）製）のＰｖｕＩ［部位に挿入
してプラスミドｐＴＢ８６１をつくった（第１１図）。

上記で得たヒ）ｂＦＧＦ　ｃＤＮＡ（１１飾型）部分を
それぞれ、上記で得たプラスミドｐＴＢ８６１をＥｃｍ
Ｒｌ　−Ｂａｍ１ｌ　Ｉで切断した発現用ベクターに組
み込んで、プラスミドｐＴＢ８９３．　　ｐＴＢ８９４
、　　ｐＴＢ８９５．　　ｐＴＢ８９６．　　ｐＴＢ８
９７、　　ｐＴＢ８９８．　　ｐＴＢ８９９をそれぞれ
得（第２図）、これらを用いて大腸菌Ｅ、　ｃｏｌｉ　
　ＭＭ２９４を形質転換し、ヒトｂＦＧＦの第１０２〜
１、４７位を欠損したｒｈｂ　Ｆ　Ｇ　Ｆ　ｔ、ティン
ＣｌＯ２をコードする遺伝子を含有するプラスミドｐＴ
Ｂ８９３を含む菌株Ｅ、　ｃｏｌｉ　　ＭＭ２９４／Ｐ
ＴＢ８９３（ＩＦＯ１４７７２，ＦＥＲＭ　　ＢＰ−２
００９）、ヒトｂＦＧＦの第１０６〜１４７位を欠損し
たｒｈｂＦ　Ｇ　ＦムティンＣｌＯ３をコードする遺伝
子を含有するプラスミドｐＴＢ　　８９４を含む菌株Ｅ
、ｃｏｌｉ　　ＭＭ２９４／ｐＴＢ８９４．ヒトｂＦＧ
Ｆの第１１５〜１４７位を欠損したｒｈｂＦＧＦムティ
ンＣ１１４をコードする遺伝子を含有するプラスミドｐ
ＴＢ８９５を含む菌株Ｅ、　ｃｏｌｉＭＭ２９４／ｐＴ
　Ｂ　８９５．ヒト　ｂＦ　Ｇ　Ｆの第１１９〜１４７
位を欠損したｒｈｂＦ　Ｇ　ＦムティンＣ１１８をコー
ドする遺伝子を含有するプラスミドｐＴ　Ｂ　８９６を
含む菌株Ｅ、ｃｏｌｉ　　ＭＭ２９４／ｐＴＢ８９６．
ヒ１−ｂＦＧＦの第１２４〜１４７位を欠損したｒｈｂ
Ｆ　Ｇ　ＦムティンＣ１２３をフードする遺伝子を含有
するプラスミドｐ’ｒ　Ｂ　８９７を含む菌株Ｅ、ｃｏ
ｌｉ　　ＭＭ２９４／ｐＴＢ８９７．ヒトｂＦＧＦの第
１３０〜１４７位を欠損したｒｈｂ　ＦＧＦムティンＣ
１２９をコードする遺伝子を含有するプラスミドｐ”ｒ
　Ｂ　８９８を含む菌株Ｅ、　ｃｏｌｉＭＭ、２９４／
ｐＴＢ８９８（Ｉ　ＦＯ１４７７３゜ＦＥＲＭ　　ＢＰ
−２０１０）、ヒトｂＦＧＦの第１３９〜１４６位を欠
損し、第１３８位のインロイシンがセリンに置換された
ｒｈｂＦ　Ｇ　ＦムティンＣ１３７をコードする遺伝子
を含有するプラスミドｐＴ　Ｂ　８９９を含む菌株Ｅ、
　ｃｏｌｉ　　ＭＭ２９４／ｐＴＢ８９９（ＩＦＯ１４
７７４，ＦＥＲＭＢＰ−２０１１）をそれぞれ得た。

実施例２　（ヒトＦＧＦのムティンをコードする遺伝子
の大腸菌における発現） （１）　　ヒトｂＦＧＦのムティン発現用プラスミドｐ
Ｔ　Ｂ　８５６の構築： ヨーロッパ特許出願公開第２３７，９６６号公報実施例
３で得られたプラスミドｐＴＢ　６６９のＤＮＡを制限
酵素Ｂａｍｆ（Ｉで部分的に切断し、ｂＦＧＦ遺伝子遺
伝島内ＢａｍＨＩ認識部位のみを切断した。切断部位を
ｄＡ　Ｔ　Ｐ、ｄＣＴ　Ｐ、ｄＧ　Ｔ　Ｐ。

ｄＴＴＰ存在下で大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩを用いて
平滑末端とし、Ｎｈｅｌリンカ−ｐ（５’　−ＣＴ八へ
ＣＴＡＧＣＴＡＧ−３’）を７４ＤＮＡリガ一ゼ反応に
より結合させた。制限酵素Ｎ　ｈｅ　Ｉで処理して、さ
らにＴ４ＤＮＡリガーゼ反応により切断部位を結合させ
、ヒトｂＦＧＦのムティン発現用プラスミドｐ’ｒ　Ｂ
　８５６を構築したく第１０図）。

このプラスミドｐ”ｒ　Ｂ　８５６を用いて大腸［１Ｍ
Ｍ２９４を形質転換させることにより、ヒ１−ｂＦＧＦ
の第１３０〜１４７位のアミノ酸が欠損したｒｈｂＦ　
Ｇ　ＦムティンＣ１２９をコードする遺伝子を含有する
プラスミドｐ’ｒ　Ｂ　８５６を含む菌株Ｅｃｏｌｉ　
　ＭＭ２９４／ｐＴＢ８５６を得た。

（２）菌体抽出液の調製： 前記形質転換体を、それぞれ１％グルコース。

０．４％カザミノ酸、８μｇ／ｍｌテトラサイクリンを
含むＭ９培地で培養し、Ｋ　１ｅｆｔ値が約２００の時
点で、３βインドリ−ルアクリル酸を２５μｇ／Ｉｎ１
．になるように添加し、さらに４時間培養した。

培養後、菌体を集め、ｌ／２０量の２０ｍＭＴｒｉｓ−
ＨＣＩ、ｐＨ７，６，１０％シュークロース溶液に懸濁
した。この懸濁液にフェニルメチルスルホニルフルオラ
イド（ＰＭＳＦ）をｌ＋Ｍ。

ＥＤＴＡを１０ｍＭ、ＮａＣ１をＯ，１Ｍ、　　スペル
ミジン塩酸塩をｌ０ｍＭ、リゾチームを１００μｇ／−
（いずれも最終濃度）となるように添加し、ｏ’ｃ。

４５分放置後、３０秒間超音波処理を加えた。

この溶液を１８００　Ｏｒｐｍ（サーバル遠心機、５Ｓ
３４０−ター）３０分間遠心して上１６を得、菌体抽出
液とした。

（３）上記（２）で得られた菌体抽出液につき、以下の
（ａ）〜（ｊ）に示すモノクローナル抗体を用いる酵素
免疫測定法（ＥＩＡ）（サンドイツチ法）を行った。そ
の結果、菌体抽出液中にＦＧＦの存在が認められた。こ
のようにして、Ｌｙｓ１３０以降のアミノ酸を欠損した
ｒｈｂＦ　Ｇ　ＦムティンＣｌ２９が得られた。

（ａ）　　免疫 ＢＡＬＢ／ｃマウス（♀４ｉＡ令）に対しフロイント完
全アジュバント（Ｄｉｒｃｏ社製）０．４−に溶解させ
たＩＯμｇの抗原ヒトｂＦＧＦ（ヨーロッパ特許出願公
開第２３７，９６６号公報に記載の方法で得られたもの
。）を腹腔に注射した。３週間後に、フロインド不完全
アジュバント０４−にとかも。

た１０μｇの抗原ｈｂＦＧＦを腹腔に再投与した。

さらに３週間後に同様の追加免疫を行い、その２週間後
に生理食塩水に溶かしたＩＯμｇのヒＩ−ｂＦＧＦを腹
腔内に接種した。

（ｂ）　　細胞融合 上記（ａ）で示した免疫マウスより、抗原最終投与の４
１」後牌臓を摘出し、細胞融合に用いる細胞を得た。こ
の細胞は、イスコツ培地とハムＦ−１２培地をＩＩの比
率で混合した培地（以下Ｉ　Ｈ培地と略す）に懸濁した
。

マウスミエローマ細胞Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ・８［ＪＩは
、１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭ　１１６４０培地で
５％炭酸ガス、９５％空気の条件で継代培養した。

細胞融合は、ケーラーおよびミルスタインらが確立した
方法［ケーラー、Ｇ、およびミルスタイン。

Ｃ１；ネイチ＋−（Ｎａｔｕｒｅ）　　２５６．　４９
５（１９７５）］に準じて行った。上記ミエローマ細胞
２．９ＸＩＯ’個と上述した方法で得られた免疫された
リンパ球１．５ＸＩＯ’個を混合、遠沈し、０４３顧の
Ｉ　Ｈ培地に溶解した４５％ポリエチレングリコール６
０００（以下ＰＥＧ６０００）を滴下した。ＰＥＧ（３
ＱＱＱ溶液は、予め３７°Ｃに諷め、ゆっくりと滴下し
た。５分後３７°Ｃに予湿したＩＨ培地１分間に０　、
５　ｎｌずつ加え１０１ｆｌとした後、室温で６００回
転１５分遠心し土浦を除去した。この細胞沈殿物を２０
％仔牛血清を含むＩＨ培地２００成に懸濁し、２４穴マ
イクロプレート（リンプロ社）に２戒ずつ植えつけた。

１日後、ＨＡＴ（１：、ボキサンチ：／ｌＸｌ０−’Ｍ
、アミ／プテリン４ＸｌＯ−’Ｍ、チミジン１．６８　
Ｉ　Ｏ−’Ｍ）を含んだＩ　Ｈ培地（２０％仔牛血清含
有）（以下１（ΔＴ培地と称する。）を各ウェルに１鑓
ずつ添加し、さらに３日後、培地の１／２量を１（Δ′
Ｆ培地と交換した。このようにして生育した細胞は雑種
細胞である。

（ｃ）　　抗体産生細胞の検索 予め、ヒトｂＦＧＦを固定したポリスチレン製９６穴マ
イクロタイタープレートに、雑種細胞培養土浦を１００
μρずつ加え室温で２時間インキュベートした。培養上
清を除去、洗浄後２次抗体として西洋ワサビペルオキシ
ダーゼ（ＨＲＰ　）　Ｌ９　識抗マウスＩｇＧヤギ抗体
（マイルス社、米国）を加え室温で２時間インキュベー
トした。２次抗体を除去し、よくウェルを洗浄した後、
反応基質を加えた呈色反応を行った（ＥＩＡ法）。この
方法により３つのウェルに強い結合価が観察された。

（ｄ）　　雑種細胞のクローニング これらのウェル中の細胞を、１ウエルあたり０．５個と
なるように、予め１０゛個／ウェルのマウス胸腺細胞を
栄養細胞としてまいておいた９６穴マイクロタイタープ
レートにまき、クローニングを行い、マウスハイブリド
ーマＩ（ｂＦ５２（ＩＦｏ　　５０１４３）、およびマ
ウスハイブリドーマｌ４ｂＦＧＦ７８（１”Ｉ”　０　
５０１　ｌｉ　ｌｌ　）を得た。

（ｅ）　　雑種細胞の腹水化 マウスハイブリドーマ１ｌｂＦ５２およびマウスハイブ
リドーマｌ−１ｂＦ７８の２ＸＩＯ８個をそれぞれ予め
ミネラルオイルを腹腔内投与しておいたマウスに接種し
た。１０日後２威／匹の腹水を採取し、モノクローナ賢
し抗体ＭｏΔｂ５２およびモノクローナル抗体ＭｏΔｂ
７８をそれぞれ得た。

（「）モノクローナル抗体ＭｏＡｂ７８を腹水からＳ　
ｔａｅｈｅｌｉｎ、　Ｔらの方法〔ザ・ジャーナル・オ
ブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｔ　ｈｅ　Ｊ　ｏ
ｕｒｎａｌｏｆ　　Ｂ　ｉｏｌｏｇｉｃａｌ　　Ｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ）、　　２５６巻９７５０−９７５４頁、
１９８１年〕に記載の方法により精製した。このように
して得られた抗体を２　ｍｇ／　ｒｐｄ１以上になるよ
うに濃縮し、次いで溶媒を０．２Ｍリン酸バッファー（
ｐＨ７，０）になるよう透析した。２．８ｍｇ／ｄのモ
ノクローナル抗体ＭｏΔｂ７８　１．／Ｉｎｄｌに対し
、１１．５　ｍｇ／　ｒｒｆｌとなるようＮＮ’−ジメ
チルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解したＳ−アセチルメ
ルカプトサクシニックアンヒドリド（Ａ　１ｄｒｉｃｈ
社、米国）を５０μＱ加えた。

反応器の空気を窒素ガスに置換し、密栓後、室温で一時
間撹拌し、Ｓ　Ｉ−（基を導入した。未反応のＳ−アセ
チルメルカプトサクシニックアンヒドリドをｔ３０μＲ
の０．２ＭＴｒｉｓ−Ｈ（ｊ！（ｐ）１７．０）。

１３μＱの０．２Ｍ　　ＥＤＴＡ、１３０μρの２Ｍヒ
ドロキシアミン（ｐＨ７，０）を加え室温１０分処理し
、不活化した。モノクローナル抗体ＭｏＡｂ７８は、セ
ファデックスＧ−２５（径１　ｃＩＩ＋Ｘ　３　Ｑ　ａ
ｍ。

ファルマシア社）を充填したゲルろ過カラムにより分取
したく流速２０旋／ｈ）。

（ｇ）　　西洋ワサビパーオキシダーゼ（以下ＨＲＰと
称する。ベーリンガーマンハイム社、西ドイツ。

Ｇｒａｄｅ　　Ｉ　Ｎ　Ｏｍｇを１．４Ｍｌの０．１Ｍ
リン酸バッファー（ｐＨ６，８）に溶解した。Ｎ−（４
−力ルホキジシクロヘキシルメチル）マレイミドのＮ−
ヒドロキシスクシンイミドエステル（Ｎ Ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ　　ｅｓｔｅｒ
　ｏｆ　　Ｎ　−（４−ｃａｒｂｏｘｙｃｙｃｌｏｈｅ
ｘｙｌ　　ｍｅｔｈｙｌ）ｍａｌｅｉｍｉｄｅ）　　］
　４　ｍｇを３３５μｇのＤＭＦに溶解し、このうち１
００μＱをＨＲＰ溶液に加えた。反応器の空気を窒素置
換し、密栓後、室温で１時間撹拌した。この後、セファ
デックスＧ−２５を充填したゲルろ過カラム（前出）に
より、Ｓ　Ｈ基を導入したモノクローナル抗体ＭｏＡｂ
７８画分を分取した。

（ｈ）　　上記（「）においてＳＨ基を導入した抗体Ｍ
。

Ａｂ７８画分６ｄと上記（ｇ）においてマレイミド基を
導入したＨ　ＲＰ画分２滅を混合し、コロジオンバッグ
（ザルトリウス社製、西ドイツ）を用いて減圧下、１戒
に濃縮し、４°Ｃｌ２Ｏ時間反応させた。

反応後、ＨＲＰか導入された抗体をウルトロゲルＡｃＡ
４４（ＬＫＢ社製、スエーデン、径１　ｃｍＸ　８０ｃ
ｍ）にかけ分離した（流速１０ｄ／ｈ）。溶出ピーク画
分のうち抗体１分子あたりのＨＲＰ数が最も多い両分は
、２．４０　ＲＩ）／抗体であった。これを次の（ｉ）
のＥＲＡに使用した。

（ｉ）　　モノクローナル抗体ＭｏＡｂ５２を上記（ｆ
）と同様の方法により精製した。モノクローナル抗体Ｍ
ｏＡｂ５２をＩ　Ｏ１１ｇ／　ｔａ又は２０　ｐ　ｇ／
　ｒｒ＆となるようＰＢＳで希釈し、イムノプレート（
ヌンク社。

デンマーク）に１００μＱ／穴注入し、４°Ｃ１−夜装
置することにより吸着させた。吸着しなかった抗体を除
去した後、ＰＢＳで３回洗浄し、０．０１％メルチオレ
ート、１％ｌト「［１を青アル）゛ミン（ＢＳＡ）を含
むＰＢＳを２００μＱ／穴加え４°Ｃ−夜装置した。

（ｊ）　　上記（２）で得たムティンＣ１２９ａ有抽出
液を０１％ＢＳΔ゛を含むＰＢＳで希釈した。（ｉ）で
作製したプレートよりＢ　ＳΔ温溶液取り除き、ＰＢＳ
で４回洗浄後、希釈したムティンＣｌ２９含有抽出液を
１００μσ／穴加え、４°Ｃ−夜吸着を行った。未反応
のムティンＣ１２９を除去後、Ｐｒ３Ｓで４回洗浄し、
（ｈ）で作製したＨＲＰ結合抗体（ｔ（ＲＰ−ＭｏＡｂ
　　７８）をＯ用％ＢＳＡを含むＰＢＳで１／３００希
釈し、１００μＱ／穴加え、室温４時間反応させた。抗
体を除去後、ＰＢＳで６回洗浄し、パーオキシダーゼ基
’１（ＢｉｏＲａｄ′ｆ：１．米国）を１００ｕＣ／穴
加えた。４１５ｎｍの吸光度を測定することにより、定
量したところ、微ｍのｒｈｂＦ　Ｇ　ＦムティンＣ１２
９が生成していることが確認された。

実施例３ （１）発現プラスミドの構築・ ２８ｂｐよりなるＴｒｐ　　Δ転写ターミネーター（フ
ァルマシア社製） 後、Ｂ　ｇＱ　ＩＩで消化し、実施例１において製造さ
れたプラスミドｐＴＢ８６１のＢｇｏ、１１部位に、Ｔ
　４ＤＮＡリガーゼを用いて挿入してプラスミドｐＴＢ
　８６３を構築した。一方、参考例３において得られた
プラスミ＋；ｐ”ｒ　Ｂ　７６２よりｒｂｂ　Ｆ　Ｇ　
ＦムティンＣ３２３をコードするＥｃｏＲＩ−Ｐｓｔ　
Ｉ断片を切り出し、プラスミドｐＴＢ　８６３のＥｃｏ
ＲＩ−ＰｓｔＩ間に挿入してプラスミドｐ’Ｆ［３９２
１を構築した。このプラスミドｐＴＢ９２１をＢａｍＨ
Ｉで切断して、大腸菌のＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノ
ー酵素）反応によりｑ１鎖部分を二重鎖にし、翻訳停止
リンカ− 結合させた。次にこのＤ　Ｎ　ＡをＮｈｅｌでトリミン
グし、Ｔ４　　ＤＮＡリガーセで環状にしてプラスミド
ｐＴＢ９２２を構築した（第１１図参照）。これを用い
て大腸菌ＩＥ、ｃｏｌｉ　ＭＭ２９４を形質転換し、Ｅ
、ｃｏｌｉ　ＭＭ２９４／ｐＴＢ９２２（Ｉ　ＦＯ１４
７７５、ＦＥＲＭ　　ＢＰ−２０１２）を得た。

この発現プラスミドｐＴ　Ｂ　９２２はｒｈｂＦＧＦム
テインＣ３２３型であると同時にＣ末端１３０１４７番
目のアミノ酸残基を欠＜　ｒｈｂＦ　Ｇ　ＦムティンＣ
Ｓ２３ＣＩ２９を発現する。

（２）菌体抽出液の調製： 前記（１）に記載の形質転換体を、１％グルフース、０
．４％カザミノ酸、８μｇ／ｌｎｌテトラサイクリンを
含むＭ９培地で培養し、Ｋｌｅｔｔ値が約２０（ｊの時
点で、３βインドリ−ルアクリル酸を２５μ、、／戒に
なるように添加し、さらに４時間培養した。培養後、菌
体を集め、培養液の量の１／２０項の２０ｍＭ　　Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣＩ、ｐｉ（７，６，ｌ　０％７ユークロース
溶液に懸濁した。この懸濁液にフェニルメチルスルホニ
ルフルオライド（ＰＭＳＦ）を１ｍＭ、ＥＤＴＡをｌ０
ｍＭ、ＮａＣ１を０．１Ｍ、スペルミジン塩酸塩をｌ０
ｍＭ、リゾチームを１００μｇ／Ｍｌ（いずれも最終濃
度）となるように添加し、０°Ｃ８４５分放置後、３０
秒間超音波処理を加えた。この溶液を１８００Ｏｒｐｍ
（サーバル遠心機、５ｓ３４０−ター）３０分間遠心し
て上清を得、菌体抽出液とした。

（３）細胞抽出液中のｒｈｂＦ　Ｇ　Ｆムティンの検出
二上記（２）で得られた細胞抽出液から、実施例２と同
様の方法でヒトｂＦＧＦに対するモノクローナル抗体を
用い、ｒｈｂＦ　Ｇ　Ｆムティンｃｓ２３ｃ１２′９を
検出した。

実施例４ （１）　　発現プラスミドｐＴ　Ｂ　９２３の構築：実
施例３で得られたプラスミドｐＴＢ９２１をＥｃｏＲＩ
およびＢａｍＨＩでｔ白化し、０．４１ｋｂのＥｃｏＲ
Ｉ　−ＢａｍＨＩ断片を得、これをＣ末端１３８−１４
７番目のアミノ酸残基を欠き第１３８番目のインロイシ
ンがセリンに置換されたｒｈｂＦＧＦＣ１３７ムテイン
を発現するプラスミドｐＴＢ８９９のＥｃｏＲＩ　−Ｂ
ａｍＨ１部位に挿入してプラスミドｐＴ　Ｂ　９２３を
構築した（第１２図参照）。

これを用いて大腸菌Ｅ、ｃｏｌｉ　ＭＭ２９４を形質転
換し、　Ｅ、ｃｏｌｉ　ＭＭ２９４／ｐＴＢ９２３（Ｉ
　ＦＯｌ、４７７６、ＦＥＲＭ　　ＢＰ−２０１３）を
得た。

このプラスミドｐＴＢ９２３はムティンｃｓ２３型であ
ると同時にＣ末端１３８−１４７番目のアミ／酸残基を
欠き第１３８番目のインロイシンがセリンに置換された
ｒｈｂＦ　Ｇ　Ｆムティンｃｓ２３Ｃ１３７を発現する
。

（２）菌体抽出液の調製： 前記（１）に記載の形質転換体を、１％グルコース、０
．４％カザミノ酸、８μｇ／ｄテトラサイクリンを含む
Ｍ９培地で培養し、Ｋ　１ｅｔＬ値が約２００の時点で
、３βインドリ−ルアクリル酸を２５μｇ／ｄになるよ
うに添加し、さらに４時間培養した。培養後、菌体を集
め、培養液の量の１／２０ｍの２０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−
ＨＣＩ、ＰＨ７，６，１０％／ニークロース溶液に懸濁
した。この懸濁液にフェニルメチルスルホニルフルオラ
イド（ＰＭＳＦ）をＩｎ＋Ｍ、ＥＤＴＡを１０ｍＭ、Ｎ
ａＣｌを０１１Ｍ、スペルミジン塩酸塩を１０ｍＭ、リ
ゾチームをｌＯＯμｇ／成（いずれも最終濃度）となる
ように添加し、０°Ｃ２４５分放置後、３０秒間超音波
処理を加えた。この溶液を１８００　Ｏｒｐｍ’（サー
バル遠心機、５ｓ３４０−ター）３０分間遠心して上清
を得、菌体抽出液とした。

（３）細胞抽出液中のｒｈｂＦ　Ｇ　Ｆムティンの検出
上記（２）で得られた細胞抽出液から、実施例２ト同様
の方法でヒトｂＦＧＦに対するモノクローナル抗体を用
い、ｒｈｂＦ　Ｇ　ＦムティンＣ８２３Ｃ１３７を検出
した。

実施例５　　（ｒｈｂＦ　Ｇ　ＦムティンＣ１２９の生
物活性） 実施例２（２）で得られたＥ　、−ｃｏｌ　ｉ　ＭＭ　
２９４　／ｐＴ　Ｂ　８５６の菌体抽出液につき、参考
例３（３）に記載した方法を用いてＦＧＦ活性を測定し
た。

菌体抽出液添加は、静止状態のＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３細胞
に対して明らかに［３Ｈ］−チミジンの取り込みを促進
した。

菌体抽出液からヘパリンアフィニティークロマトグラフ
ィーにより精製した標品を用いて同様の方法によりＦＧ
Ｆ活性を測定した。ＦＧＦによる活性を１とすると、ｒ
ｈｂＦ　Ｇ　ＦムティンＣ１２９の活性は０．０２〜０
．１であった。

同標品を用いてＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３細胞の増殖に対する
効果を調べた。２４穴プレートにＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３細
胞１０’個／穴を５％ＦＣ３を含むＤＭＥＭ培地で播種
し、翌日、０，６％ＦＣ３を含むＤＭＥＭ培地に交換し
、同時に上記標品を添加した。３日間培養後、細胞数を
コールタ−カウンターを用いて計測した。結果を第３表
に示す。

第３表 第３表に示したようにｒｈｂＦ　Ｇ　ＦムティンＣ１２
９は５〜２５　ｎｇ／−の濃度で細胞数を２〜２．５倍
に増加させた。またｂＦＧＦは０．５〜１、Ｏｎｇ／−
以上の濃度ではＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３細胞に対して顕著な
形態変化を引き起すが、ｒｈｂ　ＦＧＦムチイアＣ１２
９を２５ｎｇ／ｄ添加してもＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３細胞ま
形態変化は認められなかった。

実施例６　（ヒトｂＦＧＦのＣ末端欠損型ムティンＣ１
２９のＴ７プロモーターによる産 生） （１）　　実施例１で得られたｒｈｂＦ　Ｇ　Ｆムティ
ンＣ１２９をコードする遺伝子を含有するプラスミドｐ
’ｒ　Ｂ　８９８のＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩで消化
り、、ＤＮＡの末端をムングビーンヌクレアーゼ処理に
より一本鎖部分を消化して平滑末端とし、さらに制限酵
素Ｂｇｌ■により切断して、ｒｈｂＦ　Ｇ　Ｆムティン
Ｃ１２９をコードする断片を得た。

一方、Ｔ７プロモーターをもつ発現用ベクターＰ　Ｅ　
Ｔ　−３ｃ　［Ａｌａｎ　Ｉｌ、　Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ
ら、　　Ｇｅｎｅ　５６（＋９８７）ｐｐ　１２５−１
３５記載］のＤＮＡを制限酵素、Ｎｄｅｌで消化し、Ｄ
ＮＡの末端をムングビーンヌクレアーゼ処理により一本
鎖部分を消化して平滑末端とし、さらにＢａｍＨＩで消
化して、この部分に上述の断片をＴ４ＤＮΔリガーゼに
より組込んだｒｈｂＦ　Ｇ　Ｆムチ４フ０１２９発現型
プラスミドｐＴ　Ｂ　９５６を構築した（第１５図参照
）。

このプラスミドを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬ
ｙｓＳ　［Ｆ、　Ｗｉｌｌｉａｍ　　５ｔｕｄｉｅｒ　
　ａｎｄ　　１３ａｒｂａｒａＡ、　ＭｏｆＴａｔｔ、
ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ、
　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　）（１９８６）　１８９　、
　１１３−１３０］を形質転換させることにより、ｒｈ
ｂＦＧＦムティンＣ１２９をコードする遺伝子を含有す
るプラスミドｐ”ｒ　Ｂ　９５６を含む菌株Ｅ。

ｃｏｌｉ　ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ／ｐＴＢ９５
６（Ｉ　Ｆｏ　　１４８０５、ＦＥＲＭ　　ＢＰ−２２
０２）を得た。

（２）菌体抽出液の調製： 前記形質転換体を１０μｇ／ｄクロラムフェニコールお
よび３５μｇ／−アンピシリンを含むＬＢ培地で培養し
、ＫｌｅＬｔ値が１８０の時点でイソプロピル−β−Ｄ
−チオガラクトンド（Ｉ　ＰＴＧ）を０．５ｍＭとなる
ように加えて、さらに３時間培養した。培養後集菌し、
培養液の量の１／２０ｆｆｉの２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｈ
ＣＩ　ｐＨ７，６，１０％シュークロースｍＨに懸濁し
た。この懸濁液にフェニルメチルスルホニルフルオライ
ド（ＰＭＳ　Ｆ）を１ｍＭ。

ＥＤＴＡを１０ｎＭ、ＮａＣ１を０．１Ｍ、　　スペル
ミジン塩酸塩を１０ｍＭ、リゾチームを１００μｇ／−
（いずれも終濃度）となるように添加し、０℃。

４５分放置後３０秒間超音波処理を加えた。この溶液を
１８００　ｒｐａ＋（サーバル遠心機、５ｓ−３４０−
ター）３０秒間遠心して上清を得、菌体抽出液とした。

（３）上記（２）で得られた菌体抽出液につき、実施例
２の（ａ）〜（ｊ）に示すモノクローナル抗体を用いる
酵素免疫測定法（Ｅ　Ｉ　Ａ）（サンドイツチ法）を行
った。その結果、菌体抽出液中にＦＣ￥の存在が認めら
れた。このようにして、ｒｈｂＦ　Ｇ　ＦムティンＣ１
２９が得られた。

実施例７　（ヒトｂＦＧＦムティンＣＳ２３ＣＩ２９の
”ｒ７プロモーターによる産生） （１）参考例３で得られたｒｈｂＦ　Ｇ　ＦムティンＣ
３２３を発現するプラスミドｐＴ　Ｂ　７６２のＤＮＡ
を制限酵素ＡｏａｌとＢａｍＨＩで消化し、ｒｈｂＦＧ
Ｆムテイ：／Ｃ３２３の５ｅｒ７０，５ｅｒ８８を含む
部分を得た。

さらに前記実施例６で得られたプラスミドｐＴ８９５６
のＤＮＡを制限酵素Ａｏａｌと５ａｌｌで消化してＴ７
プロモーターを含む断片を得た。一方、ｐＴＢ　９５６
のＤＮＡを制限酵素５ａｌｌとＢａｍＨＩで消化してア
ンピシリン耐性遺伝子を含む部分の断片を得た。

ここで得られた３本のＤＮＡ断片をＴ４　ＤＮＡリガー
ゼにより結合してｒｈｂＦ　Ｇ　Ｆムチ４フ０８２３０
１２９発現型プラスミドｐＴ　Ｂ　９５８を構築した（
第１６図）。

このプラスミドを用いて大腸菌ＢＬ２］（ＤＥ３）ｐＬ
ｙｓＳを形質転換させることにより、ｒｈｂＦＧＦムテ
ィンＣ３２３ＣＩ２９をコードする遺伝子を含有するプ
ラスミドｐＴ８９５８を含む菌株Ｅｃｏｌｉ　Ｂ　Ｌ２
１（ＤＥ　３）ｐＬｙｓＳ／ｐＴ　Ｂ　９５８（Ｉ　Ｆ
ｏ　　１４８０６、ＦＥＲＭ　　ＢＰ−２２０３）を得
た。

（２）菌体抽出液の調製。

前記形質転換体を１０μｇ／ｒＪクロラムフェニコール
および３５μｇ／ｙｔ、１アンピ／リンを含むＬＢ培地
で培養し、ＫｌｅＬＬ値が１８０の時点でイソプロピル
−β−Ｄ−チオガラクトシド（Ｉ　ＰＴＧ）を０．５ｍ
Ｍとなるように加えて、さらに３時間培養した。培養後
集菌し、培養液の量の１／２０量の２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ
−ＨＣＩ　ｐＨ７，６，１０％シュークロース溶液に懸
濁した。この懸濁液にフェニルメチルスルホニルフルオ
ライド（ＰＭＳ　Ｆ）ｔ−１ｍＭ、ＥＤＴＡをｌｏｍＭ
、ＮａＣ１をＯ，１Ｍ、　　スペルミジン塩酸塩をｌｏ
ｍＭ、リゾチームを１００μｇ／成（いずれも終濃度）
となるように添加し、０°Ｃ９４５分放置ｉＵ　３０秒
間超音波処理を加えた。

この溶液を１８００　ｒｐｍ（サーバル遠心機、５Ｓ−
３４０−ター）３０分間遠心して上清を得、菌体抽出液
とした。

（３）上記（２）で得られた菌体抽出液につき、実施例
２の（ａ）〜（ｊ）に示すモノクローナル抗体を用いる
酵素免疫測定法（ＣＩＡ）（サンドイツチ法）を行った
。その結果、菌体抽出液中にＦＧＦの存在が認められた
。このようにして、ｒｈｂＦ　Ｇ　ＦムティンＣ５２３
Ｃ１２９が得られた。

発明の効果 本発明のムティンは優れた線維芽細胞増殖促進作用、血
管内皮細胞増殖促進作用、血管新生作用を有しており、
また安定性か高い。その上、生体細胞に対する安定性が
高い。さらに、構成アミノ酸がシステインであるものを
別のアミノ酸に置換されたものは、安定性が向上する。

したがって、本発明のムティンは火傷なとの治癒促進剤
、血栓症。

動脈硬化症などの治療薬として、また細胞培養促進剤と
して有利に用いることができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ヒトｂＦＧＦをコードする塩基配列と、それ
から推測されるアミノ酸配列とを示す。 第２図は、実施例１で得られたプラスミドｐＴ８９０５
〜９１１の構築図を示す。 第３図は、実施例１で得られたプラスミドｐ′ＦＢ９０
５および８９３か保持するｒｈｂＦ　Ｇ　ＦムティンＣ
ｌＯ２をコードする塩基配列と、それがコードするｒｈ
ｂＦ　Ｇ　ＦムティンＣｌＯ２のアミノ酸配列を示す。 第４図は、実施例１で得られたプラスミドｐＴＢ９０６
および８９４が保持するｒｈｂＦ　Ｇ　ＦムティンＣｌ
Ｏ３をコードする塩基配列と、それがコードするｒｈｂ
Ｆ　Ｇ　ＦムティンＣｌＯ３のアミノ酸配列を示す。 第５図は、実施例！で得られたプラスミドｐ′ＦＢ９０
７および８９５が保持するｒｈｂＦ　Ｇ　ＦムティンＣ
１１４をコードする塩基配列と、それがコードするｒｈ
ｂＦＧＦムティンＣ１１４のアミノ酸配列を示す。 第６図は、実施例１で得られたプラスミドｐＴＢ９０８
および８９６が保持するｒｈｂＦＧＦムティンＣ１１８
をコードする塩基配列と、それがコードするｒｈｂＦ　
Ｇ　ＦムティンＣ１１８のアミノ酸配列を示す。 第７図は、実施例１で得られたプラスミドｐＴＢ９０９
および８９７が保持するｒｈｂＦ　Ｇ　ＦムティンＣ１
２３をコードする塩基配列と、それがコードするｒｈｂ
ｂＦ　Ｇ　ＦムティンＣ１２３のアミノ酸配列を示す。 第８図は、実施例１で得られたプラスミドｐＴＢ９１０
および８９８が保持するｒｈｂＦ　Ｇ　ＦムティンＣ１
２９をコードする塩基配列と、それがコ−ドするｒｈｂ
Ｆ　Ｇ　ＦムティンＣ１２９のアミノ酸配列を示す。 第９図は、実施例１で得られたプラスミドｐＴＢ９１１
および８９９が保持するｒｈｂＦ　Ｇ　ＦムティンＣ１
３７をコードする塩基配列と、それがコードするｒｈｂ
Ｆ　Ｇ　ＦムティンＣ１３７のアミノ酸配列を示す。 第１０図は、実施例２におけるプラスミドｐＴＢ８５６
の構築図を示す。 第１１図は、実施例１におけるプラスミドｐ′ＦＢ８６
１および実施例３におけるプラスミドｐＴＢ９２２の構
築図を示す。 第１２図は、実施例４におけるプラスミドｐＴＢ９２３
の構築図を示す。 第１３図は、実施例３で得られたプラスミドｐＴＢ９２
２が保持するｒｈｂＦ　Ｇ　ＦムティンＣ３２３Ｃｌ　
２９をコードする塩基配列と、それがコードするｒｈｂ
ＦＧＦムティンＣ３２３ＣＩ２９のアミノ酸配列を示す
。変異した塩基に下線を付し、変換されたアミノ酸を含
む領域を四角で囲む。 第１４図は、実施例４で得られたプラスミドｐＴＢ９２
３が保持するｒｈｂＦ　Ｇ　ＦムティンＣ８２３Ｃ１３
７をコードする塩基配列と、それがコードするｒｈｂＦ
　Ｇ　ＦムティンＣ３２３Ｃ１３７のアミノ酸配列を示
す。変異した塩基に下線を付し、変換されたアミノ酸を
含む領域を四角で囲む。 第１５図は、実施例６で得られた、ｒｈｂＦ　Ｇ　Ｆム
ティンＣｌ２９をコードするプラスミドｐＴＢ９５６の
構築図を示す。 第１６図は、実施例７で得られた、ｒｈｂＦ　Ｇ　Ｆム
ティンＣ３２３Ｃ１２９をコードするプラスミドｐＴ８
９５８の構築図を示す。 代理人　　弁理士　岩　１）　　弘 竿 図 ｄｉｑｅｓｔｒｏｎ ５’ＣＴＡＧＣＴＡＧＣＴＡＧ３’）

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. （１）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）のカル
   ボキシル末端側の７個〜４６個のアミノ酸残基が欠損し
   ているムテイン。
2. （２）、さらに１個以上の構成アミノ酸が別のアミノ酸
   で置換されていてもよく、アミノ末端に１個以上のアミ
   ノ酸が付加していてもよい請求項１記載のムテイン。
3. （３）、ｂＦＧＦが、アミノ酸配列： Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｐ
   ｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｇｌ
   ｙ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ
   −Ｐｒｏを含むポリペプチドである請求項１記載のムテ
   イン。
4. （４）、ｂＦＧＦがヒトｂＦＧＦである請求項１または
   ２記載のムテイン。
5. （５）、ヒトｂＦＧＦが第１図の第２〜１４７番のアミ
   ノ酸配列を有する請求項４記載のムテイン。
6. （６）、カルボキシル末端側の１８個のアミノ酸残基が
   欠損している請求項１または２記載のムテイン。
7. （７）、カルボキシル末端側の１０個のアミノ酸残基が
   欠損している請求項１または２記載のムテイン。
8. （８）、置換される前の構成アミノ酸がシステインであ
   る請求項２記載のムテイン。
9. （９）、置換された後の別のアミノ酸が中性アミノ酸で
   ある請求項２記載のムテイン。
10. （１０）、中性アミノ酸がセリンまたはスレオニンであ
    る請求項９記載のムテイン。
11. （１１）、請求項１または２記載のムテインをコードす
    る塩基配列を有する組換えＤＮＡ。
12. （１２）、請求項１または２記載のムテインをコードす
    る塩基配列を有する組換えＤＮＡを含むベクターで形質
    転換された形質転換体。
13. （１３）、請求項１または２記載のムテインをコードす
    る塩基配列を有する組換えＤＮＡを含むベクターで形質
    転換された形質転換体を培地に培養し、培養物中に請求
    項１または２記載のムテインを生成蓄積せしめ、これを
    採取することを特徴とする該ムテインの製造法。