JPH0240987B2 - - Google Patents
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- JPH0240987B2 JPH0240987B2 JP63065867A JP6586788A JPH0240987B2 JP H0240987 B2 JPH0240987 B2 JP H0240987B2 JP 63065867 A JP63065867 A JP 63065867A JP 6586788 A JP6586788 A JP 6586788A JP H0240987 B2 JPH0240987 B2 JP H0240987B2
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/576—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for hepatitis
- G01N33/5761—Hepatitis B
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
- C12N2730/00011—Details
- C12N2730/10011—Hepadnaviridae
- C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
- C12N2730/10122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は肝炎Be抗体を単離する方法に関する。
本発明の精製された肝炎Be抗体（HBeAb）のた
めの出発物質はＢ型肝炎表層抗原（HBsAg）を
含有し且つ補体結合によつて測定されたHBsAg
力価が128以下であるヒトの生物学的液体である。
ヒト生物学的液体中にHBsAgが存在することは
検定の結果がHBeAgまたはHBeAbの存在に対
してマイナスの反応を示した場合でもHBeAgま
たはHBeAbの存在を示す標識として役立つ。生
物学的液体はHBsAgを含有するいかなるヒト生
物学的液体であつてもよく、たとえば、血漿また
は経血が使用しうる。最も容易に入手しうる生物
学的液体は血漿である。血漿は常用方法たとえば
遠心器により血球と血漿とを分離する操作を含む
いわゆるプラズマフオレシス（plasmaphoresis）
により得られる。ヒト生物学的液体中のHBsAg
のレベルは公知方法により任意適当な手段を用い
て、例えば反転受動血漿凝集反応または補体結合
によつて測定することができる。生物学的液体が
血漿である場合は、血漿をCaCl2で処理してフイ
ブリンを凝結させ、これを次に遠心分離により除
去する。転化された血漿を次に硫酸アンモニウム
で沈殿させるとグロブリンに富んだ留分が得られ
る。このグロブリン沈殿物を遠心分離により集め
そして生理食塩液に溶解しそして生理食塩液に対
して透析して硫酸アンモニウムの大部分を除去す
る。ヒトの生物学的液体のHBeAgまたは
HBeAbは等密度バンデイング（isopycnic
banding）のステツプと速度帯域別バンデイング
（rate zonal banding）のステツプによつて単離
される。
本発明の精製された肝炎Be抗体（HBeAb）のた
めの出発物質はＢ型肝炎表層抗原（HBsAg）を
含有し且つ補体結合によつて測定されたHBsAg
力価が128以下であるヒトの生物学的液体である。
ヒト生物学的液体中にHBsAgが存在することは
検定の結果がHBeAgまたはHBeAbの存在に対
してマイナスの反応を示した場合でもHBeAgま
たはHBeAbの存在を示す標識として役立つ。生
物学的液体はHBsAgを含有するいかなるヒト生
物学的液体であつてもよく、たとえば、血漿また
は経血が使用しうる。最も容易に入手しうる生物
学的液体は血漿である。血漿は常用方法たとえば
遠心器により血球と血漿とを分離する操作を含む
いわゆるプラズマフオレシス（plasmaphoresis）
により得られる。ヒト生物学的液体中のHBsAg
のレベルは公知方法により任意適当な手段を用い
て、例えば反転受動血漿凝集反応または補体結合
によつて測定することができる。生物学的液体が
血漿である場合は、血漿をCaCl2で処理してフイ
ブリンを凝結させ、これを次に遠心分離により除
去する。転化された血漿を次に硫酸アンモニウム
で沈殿させるとグロブリンに富んだ留分が得られ
る。このグロブリン沈殿物を遠心分離により集め
そして生理食塩液に溶解しそして生理食塩液に対
して透析して硫酸アンモニウムの大部分を除去す
る。ヒトの生物学的液体のHBeAgまたは
HBeAbは等密度バンデイング（isopycnic
banding）のステツプと速度帯域別バンデイング
（rate zonal banding）のステツプによつて単離
される。
本発明者は、HBeAbは補体結合によつて測定
されたHBsAg力価が128以下のヒト生物学的液体
から回収することができるということを発見し、
本発明に想到した。力価が256以上のヒト生物学
的液体はHBeAbを含むことも出来るが、それは
商業的に取り出すような多量ではない。
されたHBsAg力価が128以下のヒト生物学的液体
から回収することができるということを発見し、
本発明に想到した。力価が256以上のヒト生物学
的液体はHBeAbを含むことも出来るが、それは
商業的に取り出すような多量ではない。
すなわち本発明は、Ｂ型肝炎表層抗原を含有し
且つ補体結合によつて測定されたHBsAg力価が
128以下であるヒトの生物学的液体を、等密度バ
ンデイングにかけ、密度範囲が約1.04乃至
1.15g／c.c.である留分を回収し、回収された留分
を透析しそして濃縮する段階よりなることを特徴
とする肝炎Be抗体の単離法である。
且つ補体結合によつて測定されたHBsAg力価が
128以下であるヒトの生物学的液体を、等密度バ
ンデイングにかけ、密度範囲が約1.04乃至
1.15g／c.c.である留分を回収し、回収された留分
を透析しそして濃縮する段階よりなることを特徴
とする肝炎Be抗体の単離法である。
また本発明は、Ｂ型肝炎表層抗原を含有し且つ
補体結合によつて測定されたHBsAg力価が128以
下であるヒトの生物学的液体を、等密度バンデイ
ングにかけ、密度範囲が約1.04乃至1.15g／c.c.で
ある第１の留分を回収し、密度範囲が約1.17乃至
1.22g／c.c.である第２の留分を回収し、その第２
の留分を透析し濃縮し、その濃縮した第２留分を
速度帯域別バンデイングにかけ、密度範囲が約
1.04乃至1.15g／c.c.である第３の留分を回収し、
第１の留分と第３の留分とを合体しそして合体し
た留分を透析且つ濃縮することを特徴とする肝炎
Be抗体の単離法である。
補体結合によつて測定されたHBsAg力価が128以
下であるヒトの生物学的液体を、等密度バンデイ
ングにかけ、密度範囲が約1.04乃至1.15g／c.c.で
ある第１の留分を回収し、密度範囲が約1.17乃至
1.22g／c.c.である第２の留分を回収し、その第２
の留分を透析し濃縮し、その濃縮した第２留分を
速度帯域別バンデイングにかけ、密度範囲が約
1.04乃至1.15g／c.c.である第３の留分を回収し、
第１の留分と第３の留分とを合体しそして合体し
た留分を透析且つ濃縮することを特徴とする肝炎
Be抗体の単離法である。
等密度バンデイングにおいては、すでに幾分か
精製された濃縮物が、単離される特定物質の密度
を含むある１つの密度勾配をその中に有する液体
媒質と接触せしめられる。この液体媒質は次に超
遠心分離にかけられ漿液の各成分がその個々の密
度に従つて密度勾配の全体に亘つて平衡分配され
る。この媒質の順次留分を移動させそして所望の
抗体を含む留分すなわち約1.04乃至1.15g／c.c.の
密度を有する留分を分離する。上記勾配を形成す
る各溶液の濃度は約1.0から約1.41g／c.c.までの密
度を包含するように選択される。この液体媒質は
線形勾配のものでも段階勾配のものでも使用しう
る。しかし、その固有分別能がより高い理由から
して段階勾配の形態のものを使用するのが好まし
い。
精製された濃縮物が、単離される特定物質の密度
を含むある１つの密度勾配をその中に有する液体
媒質と接触せしめられる。この液体媒質は次に超
遠心分離にかけられ漿液の各成分がその個々の密
度に従つて密度勾配の全体に亘つて平衡分配され
る。この媒質の順次留分を移動させそして所望の
抗体を含む留分すなわち約1.04乃至1.15g／c.c.の
密度を有する留分を分離する。上記勾配を形成す
る各溶液の濃度は約1.0から約1.41g／c.c.までの密
度を包含するように選択される。この液体媒質は
線形勾配のものでも段階勾配のものでも使用しう
る。しかし、その固有分別能がより高い理由から
して段階勾配の形態のものを使用するのが好まし
い。
速度帯域別バンデイングにおいては、上記等密
度バンデイング段階で得られた1.20〜1.22密度範
囲の留分がその中に密度勾配を有する液体媒質と
接触せしめられて超遠心分離にかけられる。ただ
し、この時には速度帯域別バンデイングの技術が
用いられる。すなわち、その速度および時間にお
いては平衡に到達せず、HBeAbおよび他の残留
漿液成分がその媒質中でのそれらの沈降係数に従
つてその媒質中に分配されるような速度ならびに
時間で超遠心分離される。この際の段階勾配を形
成する各溶液の濃度は約1.0から約1.28g／c.c.の密
度範囲を包含するよう選択される。この速度帯域
別バンデイングの工程はHBeAbが1.04乃至
1.15g／c.c.の密度領域に到達するまで実施される。
この時点で、そのHBeAbがHBsAgおよび血漿の
高分子マクログロブリン成分から分離される。
度バンデイング段階で得られた1.20〜1.22密度範
囲の留分がその中に密度勾配を有する液体媒質と
接触せしめられて超遠心分離にかけられる。ただ
し、この時には速度帯域別バンデイングの技術が
用いられる。すなわち、その速度および時間にお
いては平衡に到達せず、HBeAbおよび他の残留
漿液成分がその媒質中でのそれらの沈降係数に従
つてその媒質中に分配されるような速度ならびに
時間で超遠心分離される。この際の段階勾配を形
成する各溶液の濃度は約1.0から約1.28g／c.c.の密
度範囲を包含するよう選択される。この速度帯域
別バンデイングの工程はHBeAbが1.04乃至
1.15g／c.c.の密度領域に到達するまで実施される。
この時点で、そのHBeAbがHBsAgおよび血漿の
高分子マクログロブリン成分から分離される。
等密度バンデイングおよび速度帯域別バンデイ
ングの段階で使用れれる液体媒質は適当範囲内の
いかなる密度勾配であつてもよい。かかる溶液の
ための従来技術による溶質を例示すればスクロー
ス、臭化カリウム、塩化セシウム、酒石酸カリウ
ム等である。
ングの段階で使用れれる液体媒質は適当範囲内の
いかなる密度勾配であつてもよい。かかる溶液の
ための従来技術による溶質を例示すればスクロー
ス、臭化カリウム、塩化セシウム、酒石酸カリウ
ム等である。
上記等密度バンデイング工程は遠心器たとえば
エレクトロヌクレオニクス―Ｋ （Electronucleonics―Ｋ）中で、その定置ロ
ータに生理食塩液を充填し、そして段階勾配が形
成されるまで順次その生理食塩液を各液体媒質溶
液分の密度の増加の順に上方に移動させることに
よつて実施するのが好都合である。生物学的液体
は底からいくつかの最高密度溶液を引き出しなが
らロータの頂部に導入される。典型的には生物学
的液体の量は段階勾配の液体の約15乃至40％であ
る。遠心器はプログラムされた速度制御装置を通
じて初期再配向位相の間の混合を防止するような
速度に制御される。平衡に到達しそしてその産物
がその適当密度点となつた時にロータの速度を同
じ速度制御装置を介してスピードダウンさせて元
の配置に再配向される時の混合を防止する。その
あと、勾配液を下から抜き出しそして適当密度留
分を捕集する。同じような操作が速度帯域別バン
デイングにおいても使用される。
エレクトロヌクレオニクス―Ｋ （Electronucleonics―Ｋ）中で、その定置ロ
ータに生理食塩液を充填し、そして段階勾配が形
成されるまで順次その生理食塩液を各液体媒質溶
液分の密度の増加の順に上方に移動させることに
よつて実施するのが好都合である。生物学的液体
は底からいくつかの最高密度溶液を引き出しなが
らロータの頂部に導入される。典型的には生物学
的液体の量は段階勾配の液体の約15乃至40％であ
る。遠心器はプログラムされた速度制御装置を通
じて初期再配向位相の間の混合を防止するような
速度に制御される。平衡に到達しそしてその産物
がその適当密度点となつた時にロータの速度を同
じ速度制御装置を介してスピードダウンさせて元
の配置に再配向される時の混合を防止する。その
あと、勾配液を下から抜き出しそして適当密度留
分を捕集する。同じような操作が速度帯域別バン
デイングにおいても使用される。
等密度バンデイング段階（NaBr）からと速度
帯域別バンデイング段階（スクロース）からとの
1.04〜1.15密度範囲留分は１つに合体される。こ
のHBeAb留分は透析されそして典型的には約４
倍濃度に濃縮される。この透析および濃縮作業の
ためにはアミコン中空繊維装置（Amicon
hollow fiber equipment）が有効である。
帯域別バンデイング段階（スクロース）からとの
1.04〜1.15密度範囲留分は１つに合体される。こ
のHBeAb留分は透析されそして典型的には約４
倍濃度に濃縮される。この透析および濃縮作業の
ためにはアミコン中空繊維装置（Amicon
hollow fiber equipment）が有効である。
本発明の１つの実施態様によれば、多重負荷技
術の使用いかんにかかわらず、勾配は臭化ナトリ
ウムを用いて形成される。従来使用されてきた物
質に比較して、臭化ナトリウムはいくつかの顕著
な利点を有する。臭化ナトリウムの溶解性は冷蔵
庫温度（２〜６℃）において勾配形成に各種高密
度溶液を使用することを可能ならしめる。臭化ナ
トリウムを使用することは塩化セシウムのような
塩を使用するよりも明らかに経済的に有利である
ばかりでなく残存するセシウムイオンおよび
HBeAgと結合したセシウムイオンにより生じる
被素の問題がないという利点を持つ。臭化ナトリ
ウム勾配液中においては、生物理学的特性の故に
HBeAgに結合させたイオンはナトリウム塩の形
態であり、これはヒトの生物学的系と非常に親和
性があり、毒性の問題は生じない。
術の使用いかんにかかわらず、勾配は臭化ナトリ
ウムを用いて形成される。従来使用されてきた物
質に比較して、臭化ナトリウムはいくつかの顕著
な利点を有する。臭化ナトリウムの溶解性は冷蔵
庫温度（２〜６℃）において勾配形成に各種高密
度溶液を使用することを可能ならしめる。臭化ナ
トリウムを使用することは塩化セシウムのような
塩を使用するよりも明らかに経済的に有利である
ばかりでなく残存するセシウムイオンおよび
HBeAgと結合したセシウムイオンにより生じる
被素の問題がないという利点を持つ。臭化ナトリ
ウム勾配液中においては、生物理学的特性の故に
HBeAgに結合させたイオンはナトリウム塩の形
態であり、これはヒトの生物学的系と非常に親和
性があり、毒性の問題は生じない。
KBrに関して見た低温時のNaBrのすぐれた溶
解性は生物学的物質の安定性にとつてより有益な
低温の使用を可能ならしめる。線形勾配よりも段
階勾配の使用が好ましいのは次の理由による。す
なわち、段階勾配ではその段階境界に不純物が堆
積され、したがつて単一の勾配中で大量の血漿を
処理することが可能であるからである。
解性は生物学的物質の安定性にとつてより有益な
低温の使用を可能ならしめる。線形勾配よりも段
階勾配の使用が好ましいのは次の理由による。す
なわち、段階勾配ではその段階境界に不純物が堆
積され、したがつて単一の勾配中で大量の血漿を
処理することが可能であるからである。
以下に本発明の実施例を記す。これは本発明を
限定するものではない。
限定するものではない。
なお、実施例１および３〜７は参考例である。
実施例 １
補体結合によつて測定したHBsAg力価が256
である血漿20lを2.77％のCaCl2の2.2lと混合しそ
して複数の大きい遠心器に移した。37℃（H2O
浴）に２時間保持したのち、凝結した血漿を遠心
分離して転化血清を清澄化した。その上澄み液を
等量の硫酸アンモニウム溶液（450mg／ml）と混
合しそして５℃で一晩貯蔵した。形成された沈殿
をJA―10ロータ（１バツチ当りの容量3l）を用
いて３分間、7000gでバツチ遠心分離して捕集し
た。遠心分離後のペレツトを約2.25lの生理食塩
液に懸濁した。この濃縮懸濁物を次に生理食塩液
40lに対して透析して硫酸アンモニウムを除去し
た。
である血漿20lを2.77％のCaCl2の2.2lと混合しそ
して複数の大きい遠心器に移した。37℃（H2O
浴）に２時間保持したのち、凝結した血漿を遠心
分離して転化血清を清澄化した。その上澄み液を
等量の硫酸アンモニウム溶液（450mg／ml）と混
合しそして５℃で一晩貯蔵した。形成された沈殿
をJA―10ロータ（１バツチ当りの容量3l）を用
いて３分間、7000gでバツチ遠心分離して捕集し
た。遠心分離後のペレツトを約2.25lの生理食塩
液に懸濁した。この濃縮懸濁物を次に生理食塩液
40lに対して透析して硫酸アンモニウムを除去し
た。
遠心器、エレクレロヌクレニクス―Ｋのロータ
にリン酸塩緩衝液8400mlを充填した。装置のガス
抜きのためロータを10000rpmまでランニングさ
せたのち、その定置ロータの底に下記の段階勾配
液を送入した。
にリン酸塩緩衝液8400mlを充填した。装置のガス
抜きのためロータを10000rpmまでランニングさ
せたのち、その定置ロータの底に下記の段階勾配
液を送入した。
１ 10％NaBr2000ml、ｄ＝1.08
２ 20％NaBr1000ml、ｄ＝1.17
３ 30％NaBr1500ml、ｄ＝1.28
４ 40％NaBr3900ml、ｄ＝1.41
透析した上記懸濁物2250mlをロータの底から40
％NaBrの2250mlを送り出しながら定置ロータの
頂部に導入した。このロータを30000rpmまで加
速しそしてこの速度で18時間運転を続けた。ロー
タを停止させたのち、1.05〜1.15g／c.c.密度範囲
にあるHBeAgに富んだ物質1000mlを集めた。
％NaBrの2250mlを送り出しながら定置ロータの
頂部に導入した。このロータを30000rpmまで加
速しそしてこの速度で18時間運転を続けた。ロー
タを停止させたのち、1.05〜1.15g／c.c.密度範囲
にあるHBeAgに富んだ物質1000mlを集めた。
さらに高い1.17〜1.22g／c.c.の密度範囲の物質
を２番目に捕集した（3000ml）。HBsAgに富むこ
の物質をリン酸塩緩衝生理食塩液（PBS）に対
して透析しそして1000mlまで濃縮した。この作業
にはアミコン中空繊維装置を使用した。
を２番目に捕集した（3000ml）。HBsAgに富むこ
の物質をリン酸塩緩衝生理食塩液（PBS）に対
して透析しそして1000mlまで濃縮した。この作業
にはアミコン中空繊維装置を使用した。
次いでそのロータにリン酸緩衝液を充填し、上
記と同様にガス抜きし、そして定置ロータの底部
へ下記の段階勾配液を送入した。
記と同様にガス抜きし、そして定置ロータの底部
へ下記の段階勾配液を送入した。
１ ５％スクロース2000ml、ｄ＝1.02
２ 15％スクロ―ス1650ml、ｄ＝1.06
３ 25％スクロース1750ml、ｄ＝1.10
４ 50％スクロース4300ml、ｄ＝1.23
前記NaBr等密度バンデイング工程で得られた
第２番目の高密度範囲物質1000mlをロータの頂部
にロータ底部から50％スクロース1000mlを送出し
ながら導入した。このあと、ロータを28000rpm
の速度で18時間運転した。ロータを停止させたの
ち、1.05〜1.15g／c.c.密度範囲のHBeAgに富んだ
物質1000mlを集めた。
第２番目の高密度範囲物質1000mlをロータの頂部
にロータ底部から50％スクロース1000mlを送出し
ながら導入した。このあと、ロータを28000rpm
の速度で18時間運転した。ロータを停止させたの
ち、1.05〜1.15g／c.c.密度範囲のHBeAgに富んだ
物質1000mlを集めた。
上記等密度バンデイング工程（NaBr）と速度
帯域別バンデイング工程（スクロース）とから得
られた1.05〜1.15密度の各留分を１つに合体した
（約2l）。このHBeAg留分をPBSに対して透析し
そして500mlまで４倍に濃縮した。この透析と濃
縮との作業にはアミコン中空繊維装置が使用され
る。
帯域別バンデイング工程（スクロース）とから得
られた1.05〜1.15密度の各留分を１つに合体した
（約2l）。このHBeAg留分をPBSに対して透析し
そして500mlまで４倍に濃縮した。この透析と濃
縮との作業にはアミコン中空繊維装置が使用され
る。
実施例 ２
補体結合による測定でHBsAg力価が128であ
る血漿20lを2.77％CaCl2の2.2lと混合しそして複
数の大型遠心器に移した。37℃（H2O浴）に２
時間保持したのち、凝結した血漿を遠心分離にか
けて転化血清を清澄化した。その上澄み液を等量
の硫酸アンモニウム溶液（450mg／ml）と混合し
そして一晩５℃で貯蔵した。生じた沈殿をJA―
10ロータ（１バツチ当りの容積3l）を用いて30分
間7000gでバツチ遠心分離して捕集した。遠心分
離後のペレツトを約2.25lの生理食塩液に懸濁し
た。この濃縮懸濁物を次に40lの生理食塩液に対
して透析して硫酸アンモニウムを除去した。
る血漿20lを2.77％CaCl2の2.2lと混合しそして複
数の大型遠心器に移した。37℃（H2O浴）に２
時間保持したのち、凝結した血漿を遠心分離にか
けて転化血清を清澄化した。その上澄み液を等量
の硫酸アンモニウム溶液（450mg／ml）と混合し
そして一晩５℃で貯蔵した。生じた沈殿をJA―
10ロータ（１バツチ当りの容積3l）を用いて30分
間7000gでバツチ遠心分離して捕集した。遠心分
離後のペレツトを約2.25lの生理食塩液に懸濁し
た。この濃縮懸濁物を次に40lの生理食塩液に対
して透析して硫酸アンモニウムを除去した。
遠心器、エレクロヌクレオニクス―Ｋのロータ
にリン酸塩緩衝液8400mlを充填した。装置のガス
抜きのためロータを10000rpmまでランニングさ
せたのち、その定置ロータの底部へ下部の段階勾
配液を送入した。
にリン酸塩緩衝液8400mlを充填した。装置のガス
抜きのためロータを10000rpmまでランニングさ
せたのち、その定置ロータの底部へ下部の段階勾
配液を送入した。
１ 10％NaBr2000ml、ｄ＝1.08
２ 20％NaBr1000ml、ｄ＝1.17
３ 30％NaBr1500ml、ｄ＝1.28
４ 40％NaBr3900ml、ｄ＝1.41
上記の透析した懸濁物2250mlを定置ロータの頂
部へ、底部から40％NaBrの2250mlを定置しなが
ら導入した。しかるのち、ロータ速度を3000rpm
まで加速しそしてこの速度で18時間運転を継続し
た。ロータを停止したのち、1.04〜1.15g／c.c.の
密度範囲にあるHBeAbに富んだ物質1500mlを集
めた。
部へ、底部から40％NaBrの2250mlを定置しなが
ら導入した。しかるのち、ロータ速度を3000rpm
まで加速しそしてこの速度で18時間運転を継続し
た。ロータを停止したのち、1.04〜1.15g／c.c.の
密度範囲にあるHBeAbに富んだ物質1500mlを集
めた。
第２番目の捕集（3000ml）を密度がより高い
1.17〜1.22g／c.c.の範囲の物質について行なつた。
HBsAgに富むこの物質をPBSに対して透析しそ
して1000mlまで濃縮した。この操作にはアミコン
中空繊維装置が使用された。
1.17〜1.22g／c.c.の範囲の物質について行なつた。
HBsAgに富むこの物質をPBSに対して透析しそ
して1000mlまで濃縮した。この操作にはアミコン
中空繊維装置が使用された。
次にロータにリン酸塩緩衝液を充填し、上記と
同様にガス抜きしそして定置ロータの底部へ下記
の段階勾配液を送入した。
同様にガス抜きしそして定置ロータの底部へ下記
の段階勾配液を送入した。
１ ５％スクロース2000ml、ｄ＝1.02
２ 15％スクロース1650ml、ｄ＝1.06
３ 25％スクロース1750ml、ｄ＝1.10
４ 50％スクロース4300ml、ｄ＝1.23
前記NaBr等密度バンデイング工程から得られ
た第２番目の高い密度範囲留分1000mlをロータの
頂部へ、底部から50％スクロースの100mlを送出
しながら導入した。このあとロータを28000rpm
の速度で18時間運転した。ロータを停止した後
に、1.04〜1.15g／c.c.密度範囲のHBeAbに富む留
分1500mlを捕集した。
た第２番目の高い密度範囲留分1000mlをロータの
頂部へ、底部から50％スクロースの100mlを送出
しながら導入した。このあとロータを28000rpm
の速度で18時間運転した。ロータを停止した後
に、1.04〜1.15g／c.c.密度範囲のHBeAbに富む留
分1500mlを捕集した。
等密度バンデイング工程（NaBr）ならびに速
度帯域別バンデイング工程（スクロース）からの
1.04〜1.15密度範囲の留分を１つにまとめた（約
3l）。このHBeAb留分をPBSに対して透析しそし
て500mlまで６倍に濃縮した。この透析と濃縮の
操作にはアミコン中空繊維装置が使用された。
度帯域別バンデイング工程（スクロース）からの
1.04〜1.15密度範囲の留分を１つにまとめた（約
3l）。このHBeAb留分をPBSに対して透析しそし
て500mlまで６倍に濃縮した。この透析と濃縮の
操作にはアミコン中空繊維装置が使用された。
尚、前記等密度バンデイング工程（NaBr）で
得られた1.04〜1.15g／c.c.密度範囲にあるHBeAb
に富んだ物質を直接に、上記と同様にPBSに対
し透析し、そして濃縮し、HBeAbを得ることも
できる。更に、前記速度帯域別バンデイング工程
（スクロース）から得られた1.04〜1.15g／c.c.密度
範囲にあるHBeAbに富んだ留分を直接に、上記
と同様にPBSに対し透析し、そして濃縮し、
HBeAbを得ることもできる。
得られた1.04〜1.15g／c.c.密度範囲にあるHBeAb
に富んだ物質を直接に、上記と同様にPBSに対
し透析し、そして濃縮し、HBeAbを得ることも
できる。更に、前記速度帯域別バンデイング工程
（スクロース）から得られた1.04〜1.15g／c.c.密度
範囲にあるHBeAbに富んだ留分を直接に、上記
と同様にPBSに対し透析し、そして濃縮し、
HBeAbを得ることもできる。
実施例 ３
0.8％アガロースレオフオレシス（Agarose
Rheophoresis）プレート（Abbott Labs製）を
用いて免疫拡散判定試験を実施した。プレートか
らプラスチツクリングを慎重にはずしそして寒天
が無傷のままであるかどうかをチエツクするため
トラフにトリス緩衝液を充填した。そして６個の
外側の穴にHBeAbの有無の判定を受ける被検血
漿各50μlを充填した。実施例１のNaBrによる分
離段階で得られたHBeAgに富んだ物質の一部を
PBSに対して透析しそして４倍に濃縮した。こ
の濃縮物質の20μlを中央の穴に充填した。このレ
オフオレシスプレートを調湿したプラスチツクの
箱に入れて室温で培養させた。培養７日目にその
結果を記録した。沈殿が形成されたことで被験血
漿中にHBeAbの存在することが確認された。結
果を最終的に記録するため、その培養プレートを
写真にとつた。
Rheophoresis）プレート（Abbott Labs製）を
用いて免疫拡散判定試験を実施した。プレートか
らプラスチツクリングを慎重にはずしそして寒天
が無傷のままであるかどうかをチエツクするため
トラフにトリス緩衝液を充填した。そして６個の
外側の穴にHBeAbの有無の判定を受ける被検血
漿各50μlを充填した。実施例１のNaBrによる分
離段階で得られたHBeAgに富んだ物質の一部を
PBSに対して透析しそして４倍に濃縮した。こ
の濃縮物質の20μlを中央の穴に充填した。このレ
オフオレシスプレートを調湿したプラスチツクの
箱に入れて室温で培養させた。培養７日目にその
結果を記録した。沈殿が形成されたことで被験血
漿中にHBeAbの存在することが確認された。結
果を最終的に記録するため、その培養プレートを
写真にとつた。
実施例 ４
実施例３と同様に0.8％アガロースレオフオレ
シスプレート（Abbott Labs製）を用いて免疫拡
散判定試験を行なつた。プレートからプラスチツ
クリングを慎重にはずしそして寒天が無傷のまま
であるかをチエツクするためトリス緩衝液をトラ
フに充填した。外側の６個の穴にHBeAgの存在
を判定する被検血漿を各50μlずつ充填した。実施
例２のNaBrによる分離段階で得られたHBeAb
に富む物質の一部をPBSに対して透析しそして
５倍に濃縮した。この濃縮物質の20μlを中央の穴
に入れた。このレオフオレシスプレートを調湿さ
れたプラスチツク箱に入れて室温で培養させた。
培養７日目にその結果を記録した。被検血漿中の
HBeAｇの存在が沈殿が生じることにより確認さ
れた。結果の最終的記録として培養プレートの写
真をとつた。
シスプレート（Abbott Labs製）を用いて免疫拡
散判定試験を行なつた。プレートからプラスチツ
クリングを慎重にはずしそして寒天が無傷のまま
であるかをチエツクするためトリス緩衝液をトラ
フに充填した。外側の６個の穴にHBeAgの存在
を判定する被検血漿を各50μlずつ充填した。実施
例２のNaBrによる分離段階で得られたHBeAb
に富む物質の一部をPBSに対して透析しそして
５倍に濃縮した。この濃縮物質の20μlを中央の穴
に入れた。このレオフオレシスプレートを調湿さ
れたプラスチツク箱に入れて室温で培養させた。
培養７日目にその結果を記録した。被検血漿中の
HBeAｇの存在が沈殿が生じることにより確認さ
れた。結果の最終的記録として培養プレートの写
真をとつた。
実施例 ５
NaBrによる分離段階で得られたHBeAbに富
んだ物質の代りにスクロースによる分離段階で得
られたHBeAbに富む物質を用いて実施例４の試
験をくり返した。被験血漿中のHBeAgの存在が
沈殿の形成により確認された。
んだ物質の代りにスクロースによる分離段階で得
られたHBeAbに富む物質を用いて実施例４の試
験をくり返した。被験血漿中のHBeAgの存在が
沈殿の形成により確認された。
実施例 ６
実施例１の最終段階で得られた合体した
HBeAg留分の20μlを中央の穴に充填した点のみ
を相違点として実施例３の試験を反復した。沈殿
の存在が被験血漿中のHBeAgの存在を確認させ
た。
HBeAg留分の20μlを中央の穴に充填した点のみ
を相違点として実施例３の試験を反復した。沈殿
の存在が被験血漿中のHBeAgの存在を確認させ
た。
実施例 ７
実施例２の最終段階で得られた合体した
HBeAg留分を中央の穴に充填したことをのみを
相違点として実施例４の操作を反復した。沈殿の
形成により被験血漿中のHBeAgの存在が確認さ
れた。
HBeAg留分を中央の穴に充填したことをのみを
相違点として実施例４の操作を反復した。沈殿の
形成により被験血漿中のHBeAgの存在が確認さ
れた。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ Ｂ型肝炎表層抗原を含有し且つ補体結合によ
つて測定されたHBsAg力価が128以下であるヒト
の生物学的液体を、等密度バンデイングにかけ、
密度範囲が約1.04乃至1.15g／c.c.である留分を回
収し、回収された留分を透析しそして濃縮する段
階よりなることを特徴とする肝炎Be抗体の単離
法。 ２ 濃縮段階で分子量が約100000以下である物質
を除去する特許請求の範囲第１項の方法 ３ 上記ヒトの生物学的液体が清澄化された血漿
である特許請求の範囲第１項の方法。 ４ 等密度バンデイングがNaBrの水溶液中で実
施される特許請求の範囲第１項の方法。 ５ Ｂ型肝炎表層抗原を含有し且つ補体結合によ
つて測定されたHBsAg力価が128以下であるヒト
の生物学的液体を、等密度バンデイングにかけ、
密度範囲が約1.04乃至1.15g／c.c.である第１の留
分を回収し、密度範囲が約1.17乃至1.22g／c.c.で
ある第２の留分を回収し、その第２の留分を透析
し濃縮し、その濃縮した第２留分を速度帯域別バ
ンデイングにかけ、密度範囲が約1.04乃至
1.15g／c.c.である第３の留分を回収し、第１と第
３の留分とを合体しそして合体した留分を透析且
つ濃縮することを特徴とする肝炎Be抗体の単離
法。 ６ 上記ヒトの生物学的液体が清澄化した血漿で
ある特許請求の範囲第５項の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US05/968,896 US4204989A (en) | 1978-12-13 | 1978-12-13 | Isolation of hepatitis B e antigen |
| US968,896 | 1992-10-30 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63264499A JPS63264499A (ja) | 1988-11-01 |
| JPH0240987B2 true JPH0240987B2 (ja) | 1990-09-14 |
Family
ID=25514908
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP16215579A Granted JPS5583714A (en) | 1978-12-13 | 1979-12-13 | Isolation of hepatitis be antigen |
| JP63065867A Granted JPS63264499A (ja) | 1978-12-13 | 1988-03-22 | 肝炎Ｂｅ抗体の単離法 |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP16215579A Granted JPS5583714A (en) | 1978-12-13 | 1979-12-13 | Isolation of hepatitis be antigen |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4204989A (ja) |
| EP (1) | EP0012686B1 (ja) |
| JP (2) | JPS5583714A (ja) |
| AT (1) | ATE2048T1 (ja) |
| CA (1) | CA1129768A (ja) |
| DE (1) | DE2964390D1 (ja) |
| DK (1) | DK528279A (ja) |
| IE (1) | IE48665B1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0660773U (ja) * | 1993-01-25 | 1994-08-23 | 株式会社中川水力 | 電動サ−ボモ−タ方式電気調速機 |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2470795A1 (fr) * | 1979-12-07 | 1981-06-12 | Pasteur Institut | Procede de purification de particules d'origine biologique, notamment de l'antigene de surface du virus de l'hepatite b (aghbs) et les produits obtenus |
| US4349539A (en) * | 1980-08-15 | 1982-09-14 | Merck & Co., Inc. | Separation of hepatitis B surface antigen |
| JPH0625069B2 (ja) * | 1981-01-29 | 1994-04-06 | ブリティッシュ・テクノロジー・グループ・リミテッド | Ｂ型肝炎ワクチン製造方法 |
| AU8746582A (en) * | 1981-09-02 | 1983-03-10 | Biogen N.V. | Hepatitis b virus e type antigen |
| CA1232849A (en) * | 1983-12-01 | 1988-02-16 | The Washington University | Circulating antigens of dirofilaria immitis, monoclonal antibodies specific therefor and methods of preparing such antibodies and detecting such antigens |
| US5101018A (en) * | 1989-06-12 | 1992-03-31 | International Minerals & Chemical Corp. | Method for recovering recombinant proteins |
| US5047511A (en) * | 1989-08-28 | 1991-09-10 | Pitman-Moore, Inc. | Method for recovering recombinant proteins |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3636191A (en) * | 1969-10-08 | 1972-01-18 | Cancer Res Inst | Vaccine against viral hepatitis and process |
| US3887697A (en) * | 1971-08-09 | 1975-06-03 | Us Health | Hemagglutination method for australia antigen and antibody thereto |
| GB1356413A (en) * | 1971-09-09 | 1974-06-12 | Pfizer Ltd | Method of obtaining purified australia antigen from blood serum |
| US3994870A (en) * | 1974-01-31 | 1976-11-30 | The Community Blood Council Of Greater New York, Inc. | Purification of hepatitis B surface antigen |
| US3992517A (en) * | 1975-02-19 | 1976-11-16 | Pfizer Inc. | Detection of hepatitis B surface antigen by latex agglutination |
| US4024243A (en) * | 1975-06-16 | 1977-05-17 | Merck & Co., Inc. | Process for isolating hepatitis B antigen |
| FR2336141A1 (fr) * | 1975-12-23 | 1977-07-22 | Trepo Christian | Nouveau medicament permettant de traiter les infections aigues ou chroniques dues au virus de l'hepatite b |
| US4088748A (en) * | 1976-11-02 | 1978-05-09 | Merck & Co., Inc. | Hepatitis B surface antigen |
| US4118477A (en) * | 1977-02-14 | 1978-10-03 | Merck & Co., Inc. | Hepatitis B antigen |
| US4102996A (en) * | 1977-04-20 | 1978-07-25 | Merck & Co., Inc. | Method of preparing hepatitis B core antigen |
-
1978
- 1978-12-13 US US05/968,896 patent/US4204989A/en not_active Expired - Lifetime
-
1979
- 1979-12-06 CA CA341,330A patent/CA1129768A/en not_active Expired
- 1979-12-10 DE DE7979400996T patent/DE2964390D1/de not_active Expired
- 1979-12-10 AT AT79400996T patent/ATE2048T1/de not_active IP Right Cessation
- 1979-12-10 EP EP79400996A patent/EP0012686B1/en not_active Expired
- 1979-12-11 IE IE2390/79A patent/IE48665B1/en not_active IP Right Cessation
- 1979-12-12 DK DK528279A patent/DK528279A/da not_active Application Discontinuation
- 1979-12-13 JP JP16215579A patent/JPS5583714A/ja active Granted
-
1988
- 1988-03-22 JP JP63065867A patent/JPS63264499A/ja active Granted
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0660773U (ja) * | 1993-01-25 | 1994-08-23 | 株式会社中川水力 | 電動サ−ボモ−タ方式電気調速機 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS5583714A (en) | 1980-06-24 |
| DK528279A (da) | 1980-06-14 |
| JPS6361624B2 (ja) | 1988-11-29 |
| US4204989A (en) | 1980-05-27 |
| EP0012686B1 (en) | 1982-12-22 |
| CA1129768A (en) | 1982-08-17 |
| DE2964390D1 (en) | 1983-01-27 |
| IE792390L (en) | 1980-06-13 |
| JPS63264499A (ja) | 1988-11-01 |
| EP0012686A1 (en) | 1980-06-25 |
| IE48665B1 (en) | 1985-04-03 |
| ATE2048T1 (de) | 1983-01-15 |
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