JPH0472520B2 - - Google Patents
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- JPH0472520B2 JPH0472520B2 JP58147350A JP14735083A JPH0472520B2 JP H0472520 B2 JPH0472520 B2 JP H0472520B2 JP 58147350 A JP58147350 A JP 58147350A JP 14735083 A JP14735083 A JP 14735083A JP H0472520 B2 JPH0472520 B2 JP H0472520B2
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- JP
- Japan
- Prior art keywords
- ammonia
- sample
- hydrogen peroxide
- reaction
- enzyme
- Prior art date
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
- C12Q1/32—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving dehydrogenase
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- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
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- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
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- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analyzing Non-Biological Materials By The Use Of Chemical Means (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
発明の背景
技術分野
本発明は、新規な酵素法によるアンモニアの定
量法に関するものである。
量法に関するものである。
血中のアンモニアの定量は、肝性昏垂の鑑別の
重要な手段とされ、非代償性肝硬変、劇症肝炎、
肝脳症候群などの診断および経過観察に必要な検
査とされている。
重要な手段とされ、非代償性肝硬変、劇症肝炎、
肝脳症候群などの診断および経過観察に必要な検
査とされている。
一方、血中の尿素の定量、腎機能検査の重要な
指標とされているが、その測定法としては、試料
にウレアーゼを作用させてアンモニアを生成さ
せ、そのアンモニアをインドフエノール反応によ
つて定量する方法が最も信頼度の高い方法の一つ
として行われている。また、血清中のクレアチニ
ン濃度の定量は、腎排泄機能の指標として日常検
査に利用されており、従来のJafｅ′反応に代るク
レアチニンの酵素的定量法の一つとして、クレア
チニンにクレアチニンデイミナーゼを作用させ、
生成するアンモニアを測定する方法も知られてい
る。このようにアミノ化合物もくはアミノ化合物
（以下「アンモニア生成基質」という）に、それ
らを基質として作用してアンモニアを遊離させる
酵素（以下「アンモニア生成」という）を作用さ
せて、生成するアンモニアを定量することによ
り、基質化合物あるいはアンモニア生成酵素の酵
素活性を測定することができる。従つて、アンモ
ニアの定量は種々の臨床検査法に応用できる可能
性を有している。
指標とされているが、その測定法としては、試料
にウレアーゼを作用させてアンモニアを生成さ
せ、そのアンモニアをインドフエノール反応によ
つて定量する方法が最も信頼度の高い方法の一つ
として行われている。また、血清中のクレアチニ
ン濃度の定量は、腎排泄機能の指標として日常検
査に利用されており、従来のJafｅ′反応に代るク
レアチニンの酵素的定量法の一つとして、クレア
チニンにクレアチニンデイミナーゼを作用させ、
生成するアンモニアを測定する方法も知られてい
る。このようにアミノ化合物もくはアミノ化合物
（以下「アンモニア生成基質」という）に、それ
らを基質として作用してアンモニアを遊離させる
酵素（以下「アンモニア生成」という）を作用さ
せて、生成するアンモニアを定量することによ
り、基質化合物あるいはアンモニア生成酵素の酵
素活性を測定することができる。従つて、アンモ
ニアの定量は種々の臨床検査法に応用できる可能
性を有している。
先行技術
従来、アンモニアの定量法としては種々の方法
が知られているが、現在臨床検の分野において
は、主として酵素法、イオン交換法、直接比色法
などが繁用されている。これらのうち、酵素法
は、アンモニアにNAD(P)Ｈおよびα−ケトグル
タール酸（以下「α−KG」という）の存在下に
Ｌ−グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（以下
「GLDH」という）を作用させて、NAD(P)Ｈの
340nmの吸光度の減少を測定する方法（とえば、
J.Lab.Clin.Med.Vol.66，p526（1965）、特公昭57
−21995号公報参照）であつて、測定試料の除蛋
白処理の必要がない上、アンモニアに対する特異
性が高く、感度も高いなどの利点を有している。
しかしながら、この方法も分光学的方法である故
の測定感度の限界を有し、またNDA(P)Ｈの副反
応に伴なう測定誤差の問題を有していた。
が知られているが、現在臨床検の分野において
は、主として酵素法、イオン交換法、直接比色法
などが繁用されている。これらのうち、酵素法
は、アンモニアにNAD(P)Ｈおよびα−ケトグル
タール酸（以下「α−KG」という）の存在下に
Ｌ−グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（以下
「GLDH」という）を作用させて、NAD(P)Ｈの
340nmの吸光度の減少を測定する方法（とえば、
J.Lab.Clin.Med.Vol.66，p526（1965）、特公昭57
−21995号公報参照）であつて、測定試料の除蛋
白処理の必要がない上、アンモニアに対する特異
性が高く、感度も高いなどの利点を有している。
しかしながら、この方法も分光学的方法である故
の測定感度の限界を有し、またNDA(P)Ｈの副反
応に伴なう測定誤差の問題を有していた。
発明の概要
要 旨
本発明は上記の問題を解決することを目的と
し、試料を酵素的に処理して含有アンモニアを過
酸化水素の信号により定量することによつてこの
目的を達成しようとするものである。
し、試料を酵素的に処理して含有アンモニアを過
酸化水素の信号により定量することによつてこの
目的を達成しようとするものである。
従つて、本発明によるアンモニアの定量法は、
下記の工程からなり、工程(A)および工程(B)を、そ
れぞれの酵素の固定化酵素を直列に配置してなる
リアクターに試料を通液することによつて行なう
ことを特徴とするものである。
下記の工程からなり、工程(A)および工程(B)を、そ
れぞれの酵素の固定化酵素を直列に配置してなる
リアクターに試料を通液することによつて行なう
ことを特徴とするものである。
(A) アンモニアを定量すべき試料に、NAD(P)Ｈ
およびα−KG酸の存在下、GLDHを作用させ
て、試料中のアンモニア量に対応する量のグル
タミン酸を生成させる工程、 (B) この試料に、酸素の存在下、グルタミン酸オ
キシターゼ（以下「GLXD」という）を作用
させて、試料中のグルタミン酸量に対応して過
酸化水素を生成させる工程、 (C) 過酸化水素の生成量もしくは生成速度を測定
する工程、 (D) 測定された過酸化水素の生成量もしくは生成
速度からアンモニア量を算出する工程。
およびα−KG酸の存在下、GLDHを作用させ
て、試料中のアンモニア量に対応する量のグル
タミン酸を生成させる工程、 (B) この試料に、酸素の存在下、グルタミン酸オ
キシターゼ（以下「GLXD」という）を作用
させて、試料中のグルタミン酸量に対応して過
酸化水素を生成させる工程、 (C) 過酸化水素の生成量もしくは生成速度を測定
する工程、 (D) 測定された過酸化水素の生成量もしくは生成
速度からアンモニア量を算出する工程。
上記において、「NAD(P)Ｈ」は、NADHおよ
びNADPHのいずれかを示すものである。
びNADPHのいずれかを示すものである。
本発明方法で実施される酵素反応式を示せば、
次のとおである。
次のとおである。
(1) NH4 5＋NAD(P)Ｈ＋ａ−KGGLDH
―――→
Ｌ−グルタミン酸＋H2O＋O2NAD(P)Ｈ＋
(2) Ｌ−グルタミン酸＋H2O＋O2GLXH
―――→
GLXH
→ NH3＋α−KG＋H2O2 効 果 このように、本発明方法、アンモニアを
GLDHによりＬ−グルタミン酸に変換し、この
Ｌ−グルタミン酸をGLXにより過酸化水素に変
換することにより、アンモニアを過酸化水素の信
号により定量することに特徴を有するものであ
る。
→ NH3＋α−KG＋H2O2 効 果 このように、本発明方法、アンモニアを
GLDHによりＬ−グルタミン酸に変換し、この
Ｌ−グルタミン酸をGLXにより過酸化水素に変
換することにより、アンモニアを過酸化水素の信
号により定量することに特徴を有するものであ
る。
過酸化水素を信号とすることによつて、従来の
分光学的方法に加えて、蛍光法、化学発光法、電
極法などの定量操作が容易で、かつ高感度の定量
が可能な検出系を、アンモニアの定量に応用する
ことが可能となつた。従来、アンモニアを過酸化
水素の信号により定量する方法は知られておら
ず、本発明によつてはじめてこのような方法が確
立されたのである。
分光学的方法に加えて、蛍光法、化学発光法、電
極法などの定量操作が容易で、かつ高感度の定量
が可能な検出系を、アンモニアの定量に応用する
ことが可能となつた。従来、アンモニアを過酸化
水素の信号により定量する方法は知られておら
ず、本発明によつてはじめてこのような方法が確
立されたのである。
本発明方法は固定化酵素からなるリアクターを
用いた連続自動分析システムを採用して実施する
ことができ、従つて本発明によればこのような連
続自動分析システムによつてアンモニアを高感度
かつ短時間に定量することが可能となる。
用いた連続自動分析システムを採用して実施する
ことができ、従つて本発明によればこのような連
続自動分析システムによつてアンモニアを高感度
かつ短時間に定量することが可能となる。
発明の具体的説明
分析対象試料
本発明方法において分析対象試料とされるもの
は、定量すべきアンモニアを含有する水性試料で
ある。そのアンモニアとしては、試料中に元来含
有されているものに加え、アンモニア生成酵素の
作用により生成されたアンモニアをも包含するも
のとする。しかして、本発明は、試料中のアンモ
ニアの存在ないし含量を測定することに加え、ア
ンモニア生成系酵素反応と結合させることによ
り、アンモニア生成基質の検出ないし定量あるい
はアンモニア生成酵素の酵素活性の測定を行なう
ことも包含するものである。
は、定量すべきアンモニアを含有する水性試料で
ある。そのアンモニアとしては、試料中に元来含
有されているものに加え、アンモニア生成酵素の
作用により生成されたアンモニアをも包含するも
のとする。しかして、本発明は、試料中のアンモ
ニアの存在ないし含量を測定することに加え、ア
ンモニア生成系酵素反応と結合させることによ
り、アンモニア生成基質の検出ないし定量あるい
はアンモニア生成酵素の酵素活性の測定を行なう
ことも包含するものである。
このようなアンモニア生成基質とアンモニア生
成酵素の系としては、たとえば、尿素／ウレアー
ゼ、クレアチニン／クレアチニンデイミナーゼ、
アミノ酸／アミノ酸デヒドロゲナーゼ、アミン／
アミンデヒドロゲナーゼ、アミノ酸／アンモニア
リアーゼ、ヘキソースおよびホスホルアミデー
ト／ホスホルアミデート−ヘキソースホスホトラ
ンスフエラーゼ、ADPおよびカルバモイルホス
フエート／カルバミン酸キナーゼ、酸アミド／ア
ミドヒドロラーゼ、核酸塩基（アデニン、シトシ
ン、グアニン）、スクレオシド、スクレオチド／
デアミナーゼなどが挙げられる。
成酵素の系としては、たとえば、尿素／ウレアー
ゼ、クレアチニン／クレアチニンデイミナーゼ、
アミノ酸／アミノ酸デヒドロゲナーゼ、アミン／
アミンデヒドロゲナーゼ、アミノ酸／アンモニア
リアーゼ、ヘキソースおよびホスホルアミデー
ト／ホスホルアミデート−ヘキソースホスホトラ
ンスフエラーゼ、ADPおよびカルバモイルホス
フエート／カルバミン酸キナーゼ、酸アミド／ア
ミドヒドロラーゼ、核酸塩基（アデニン、シトシ
ン、グアニン）、スクレオシド、スクレオチド／
デアミナーゼなどが挙げられる。
さらに、本発明の対象試料としては、上記のよ
うなアンモニア生成酵素系と連結しうる単一もし
くは複数の工程からなる反応系における反応基質
もしくは反応試薬の測定を目的とするものも含ま
れる。
うなアンモニア生成酵素系と連結しうる単一もし
くは複数の工程からなる反応系における反応基質
もしくは反応試薬の測定を目的とするものも含ま
れる。
本発明によるアンモニアの測定操作前のアンモ
ニア生成系の酵素反応などの工程操作は、それぞ
れの反応系に適した方法ないし条件を採用して行
なうことができる。また、これらの反応系が本発
明の第一工程におけるGLDHの反応を妨害しな
い場合には、第一工程と同時に並行的に反応を進
行させる構成を採用することもできる。
ニア生成系の酵素反応などの工程操作は、それぞ
れの反応系に適した方法ないし条件を採用して行
なうことができる。また、これらの反応系が本発
明の第一工程におけるGLDHの反応を妨害しな
い場合には、第一工程と同時に並行的に反応を進
行させる構成を採用することもできる。
GLDH反応
本発明における第一工程であるGLDHによる
アンモニアに対応するＬ−グルタミン酸の生成反
応は、それ自体公知の反応であつて、本発明への
応用において次のGLXD反応に対する技術的配
慮を加える以外には特に特別な方法ないし条件は
要求されない。この反応については、公知の成書
および総説などの記載、たとえば、H.U.
Bergmeyer著、“Methods of Enzymatic
Analysis”，2nd，English、Edition，Volume
４，p1802−1806，Academic Press，Inc.
（1974）、特公昭57−21995号公報などの記載を参
照することができる。
アンモニアに対応するＬ−グルタミン酸の生成反
応は、それ自体公知の反応であつて、本発明への
応用において次のGLXD反応に対する技術的配
慮を加える以外には特に特別な方法ないし条件は
要求されない。この反応については、公知の成書
および総説などの記載、たとえば、H.U.
Bergmeyer著、“Methods of Enzymatic
Analysis”，2nd，English、Edition，Volume
４，p1802−1806，Academic Press，Inc.
（1974）、特公昭57−21995号公報などの記載を参
照することができる。
すなわち、GLDHとしては、特にその起源な
いし由来に制限はなく、系統名Ｌ−グルタミン
酸：NAD+オキシドレダクターゼ（デアミネーテ
イング）（EC 1.4.1.2）、Ｌ−グルタミン酸：
NAD(P)+オキシドレダクターゼ（デアミネーテイ
ング）（EC 1.4.1.3）、Ｌ−グルタミン酸：
NADP+オキシドレダクターゼ（デアミネーテイ
ング）（EC 1.4.1.4）の酵素が用いられうる。
いし由来に制限はなく、系統名Ｌ−グルタミン
酸：NAD+オキシドレダクターゼ（デアミネーテ
イング）（EC 1.4.1.2）、Ｌ−グルタミン酸：
NAD(P)+オキシドレダクターゼ（デアミネーテイ
ング）（EC 1.4.1.3）、Ｌ−グルタミン酸：
NADP+オキシドレダクターゼ（デアミネーテイ
ング）（EC 1.4.1.4）の酵素が用いられうる。
補酵素としてのNADH（還元型ニコチンアミド
−アデニン−ジヌクレオチド）もしくは
NADPH（還元型ニコチンアミド−アデニン−ジ
ヌクレオチドホスフエート）および反応基質とし
てのα−KGは過剰モル用いられるが、その最適
使用量は反応条件、酵素量などに応じて実験的に
容易に定めることができる。
−アデニン−ジヌクレオチド）もしくは
NADPH（還元型ニコチンアミド−アデニン−ジ
ヌクレオチドホスフエート）および反応基質とし
てのα−KGは過剰モル用いられるが、その最適
使用量は反応条件、酵素量などに応じて実験的に
容易に定めることができる。
反応は、通常PH７〜9.5で、緩衝液としてりん
酸緩衝液、トリス緩衝液、トリエタノールアミン
緩衝液などを用いて行なわれる。EC1.4.1.3の酵
素を使用する場合には、酵素の活性化のために
ADPを存在させてもよい。
酸緩衝液、トリス緩衝液、トリエタノールアミン
緩衝液などを用いて行なわれる。EC1.4.1.3の酵
素を使用する場合には、酵素の活性化のために
ADPを存在させてもよい。
GLXD反応
本発明における第二工程であるGLXDによる
Ｌ−グルタミン酸に対応する過酸化水素の生成反
応は公知である（昭和58年３月10日、社団法人日
本濃芸化学会発行、講演要旨集（昭和58年度大
会）、第184頁、2L−１参照）。さらに詳細には、
特開昭59−42896号明細書を参照することができ
る。
Ｌ−グルタミン酸に対応する過酸化水素の生成反
応は公知である（昭和58年３月10日、社団法人日
本濃芸化学会発行、講演要旨集（昭和58年度大
会）、第184頁、2L−１参照）。さらに詳細には、
特開昭59−42896号明細書を参照することができ
る。
すなわち、GLXDとしては、Ｌ−グルタミン
酸に基質特異性の高いものがより好適に用いられ
る。GLXDとしては、従来ストレプトマイセ
ス・バイオレツセンスの生産するもの（特開昭57
−43685号公報参照）と、ストプトマイセス・エ
スピーＸ−119−６（微工研菌寄第6560号、
ATCC39343）の生産するもの（Agric.Biol.
Chem.，Vol.47，No.６，1323〜1328（1983））が知
られている。後者の方が前者に比べ基質特異性、
安定性、特にGLDHの至適PHにおけるPH安定性
などにおいてすぐれており、本発明においては後
者酵素の使用がより好ましく、以下後者酵素をも
つてGLXDと称する。この酵素の調製法は、後
述する参考例に示されている。
酸に基質特異性の高いものがより好適に用いられ
る。GLXDとしては、従来ストレプトマイセ
ス・バイオレツセンスの生産するもの（特開昭57
−43685号公報参照）と、ストプトマイセス・エ
スピーＸ−119−６（微工研菌寄第6560号、
ATCC39343）の生産するもの（Agric.Biol.
Chem.，Vol.47，No.６，1323〜1328（1983））が知
られている。後者の方が前者に比べ基質特異性、
安定性、特にGLDHの至適PHにおけるPH安定性
などにおいてすぐれており、本発明においては後
者酵素の使用がより好ましく、以下後者酵素をも
つてGLXDと称する。この酵素の調製法は、後
述する参考例に示されている。
GLXDの酵素反応は、通常PH５〜10において
適当な緩衝液中で行なわれる。
適当な緩衝液中で行なわれる。
過酸化水素の測定
過酸化水素の生成量もしくは速度の測定法とし
ては、化学発光分析法、電気化学的分析法、けい
光分析法、分光学的分析法などが知られている。
（たとえば、有機合成化学協会誌、第39巻、第７
号、p659−666（1981）参照）。本発明において
は、そのうずれもが適用可能であるが、本発明の
目的から迅速かつ高感度に過酸化水素を検出する
システムを採用することが好ましい。
ては、化学発光分析法、電気化学的分析法、けい
光分析法、分光学的分析法などが知られている。
（たとえば、有機合成化学協会誌、第39巻、第７
号、p659−666（1981）参照）。本発明において
は、そのうずれもが適用可能であるが、本発明の
目的から迅速かつ高感度に過酸化水素を検出する
システムを採用することが好ましい。
代表的な過酸化水素の測定法をいくつか列挙す
れば下記の通りである。
れば下記の通りである。
まず、化学発光分析法としては、ルミノールを
赤血塩の存在下で過酸化水素と反応させて、酸化
に伴なう発光量を測定する方法が挙げられる。ル
ミノールの代りにイソルミノール、ピロガロー
ル、ビス（２，４，６−トリクロロフエニル）オ
キサレートを、赤血塩の代りにパーオキシダー
ゼ、ヘマチン、ヘミンまたは塩化コバルトを使用
する方法も知られている。
赤血塩の存在下で過酸化水素と反応させて、酸化
に伴なう発光量を測定する方法が挙げられる。ル
ミノールの代りにイソルミノール、ピロガロー
ル、ビス（２，４，６−トリクロロフエニル）オ
キサレートを、赤血塩の代りにパーオキシダー
ゼ、ヘマチン、ヘミンまたは塩化コバルトを使用
する方法も知られている。
電気化学的分析法としては、クラーク型過酸化
水素電極を用いる方法が一般的である。過酸化水
素をパーオキシダーゼもしくはモリブデン酸塩な
どの触媒存在下でヨウ素イオンと反応させてヨウ
素イオン電極で測定する方法も使用できる。
水素電極を用いる方法が一般的である。過酸化水
素をパーオキシダーゼもしくはモリブデン酸塩な
どの触媒存在下でヨウ素イオンと反応させてヨウ
素イオン電極で測定する方法も使用できる。
けい光分析法としては、ホモバニリン酸をパー
オキシダーゼの存在下で過酸化水素と反応させ、
生成する２，2′−ジヒドロキシ−３，3′−ジメト
キシビフエニル−５，5′−ジ酢酸のけい光強度を
測定する方法が挙げられる。ホモバニリン酸の代
りにｐ−ヒドロキシフエニル酢酸、ジアセチルフ
ルオレスシン誘導体（ジアセチルフルオレスシ
ン、ジアセチルジクロロフルオレスシンなど）な
どを用いることもできる。
オキシダーゼの存在下で過酸化水素と反応させ、
生成する２，2′−ジヒドロキシ−３，3′−ジメト
キシビフエニル−５，5′−ジ酢酸のけい光強度を
測定する方法が挙げられる。ホモバニリン酸の代
りにｐ−ヒドロキシフエニル酢酸、ジアセチルフ
ルオレスシン誘導体（ジアセチルフルオレスシ
ン、ジアセチルジクロロフルオレスシンなど）な
どを用いることもできる。
分光学的分析法としては、パーオキシダーゼ
法、カタラーゼ法などが一般的である。パーオキ
シダーゼ法は、被酸化性発色剤をパーオキシダー
ゼの存在下で過酸化水素と反応させ、生成する色
素を比色定量する方法である。発色剤としては、
たとえばｏ−ジアニシジン、４−メトキシ−１−
ナフトール、２，2′−アジノ−ビス（３−エチル
ベンゾチアゾリン）−６−スルホン酸などの単独
試薬、４−アミノアンチピリンとフエノール系化
合物（たとえば、フエノール、ｐ−クロロフエノ
ール、２，４，６−トリブロモフエノールなど）、
アニリン系化合物（たとえばＮ，Ｎ−ジメチルア
ニリン、Ｎ，Ｎ−ジエチルアニリンなど）または
トルイジン系化合物（たとえば、Ｎ，Ｎ−ジエチ
ル−ｍ−トルイジンなど）との組み合わせ試薬、
３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾン
とＮ，Ｎ−ジメチルアニリンとの組み合わせ試
薬、などを使用することができる。カタラーゼ法
としては、過酸化水素をカタラーゼの存在下でア
ルコール（メタノールなど）と反応させ、生成す
るアルデヒドを発色系に導いて色素の吸度測定を
行なうか、アルデヒドをアルデヒドデヒドロゲナ
ーゼを利用して定量する方法が挙げられる。
法、カタラーゼ法などが一般的である。パーオキ
シダーゼ法は、被酸化性発色剤をパーオキシダー
ゼの存在下で過酸化水素と反応させ、生成する色
素を比色定量する方法である。発色剤としては、
たとえばｏ−ジアニシジン、４−メトキシ−１−
ナフトール、２，2′−アジノ−ビス（３−エチル
ベンゾチアゾリン）−６−スルホン酸などの単独
試薬、４−アミノアンチピリンとフエノール系化
合物（たとえば、フエノール、ｐ−クロロフエノ
ール、２，４，６−トリブロモフエノールなど）、
アニリン系化合物（たとえばＮ，Ｎ−ジメチルア
ニリン、Ｎ，Ｎ−ジエチルアニリンなど）または
トルイジン系化合物（たとえば、Ｎ，Ｎ−ジエチ
ル−ｍ−トルイジンなど）との組み合わせ試薬、
３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾン
とＮ，Ｎ−ジメチルアニリンとの組み合わせ試
薬、などを使用することができる。カタラーゼ法
としては、過酸化水素をカタラーゼの存在下でア
ルコール（メタノールなど）と反応させ、生成す
るアルデヒドを発色系に導いて色素の吸度測定を
行なうか、アルデヒドをアルデヒドデヒドロゲナ
ーゼを利用して定量する方法が挙げられる。
これらの過酸化水素の検出系はいずれも公知の
方法であり、その実施にあたつてはそれぞれ公知
の操作、条件を参照すればよい。
方法であり、その実施にあたつてはそれぞれ公知
の操作、条件を参照すればよい。
定量システム
本発明は、基本的には、GLDH反応、GLXD
反応および過酸化水素検出の３工程からなる。こ
れらの工程操作を各工程毎に独立して回分的操作
にて行なうこともできるが、固定化酵素からなる
リアクターを用いた連続自動分析システムを採用
して行なうとより効率的、短時間に定量を行なう
ことができる。
反応および過酸化水素検出の３工程からなる。こ
れらの工程操作を各工程毎に独立して回分的操作
にて行なうこともできるが、固定化酵素からなる
リアクターを用いた連続自動分析システムを採用
して行なうとより効率的、短時間に定量を行なう
ことができる。
酵素の固定化法には、大別して吸着法、共有結
合法、マトリツク法、マイクロカプセル法などの
方法が知られているが、固定化方法、固定化担体
などの選択は、採用する自動分析システムに応じ
て成書（たとえば、千畑一郎（編）、昭和50年３
月20日、(株)講談社発行「固定化酵素」、
Mosbach，K.（ed）「Method in Enzymology」、
Vol.XLIV，Immobilied Enzymes，Academic
Press，New York，1976など）または総説（た
とえば、昭和57年４月20日、(株)南江堂発行、「バ
イオマテリアルサイエンス」第１集（化学の領域
増刊134号）p55−67、p69−79など）を参照して
行なうことができる。また自動分析システムにつ
いて成書（Guilbaut，G.G.著「HANDBOOK
OF ENZYMATIC METHODS OF
ANALYSIS」、p445−612，Marcel Dekker，
Inc.，New York，1976、「Methods in
Enzymology」（前出）など）を参照することが
できる。
合法、マトリツク法、マイクロカプセル法などの
方法が知られているが、固定化方法、固定化担体
などの選択は、採用する自動分析システムに応じ
て成書（たとえば、千畑一郎（編）、昭和50年３
月20日、(株)講談社発行「固定化酵素」、
Mosbach，K.（ed）「Method in Enzymology」、
Vol.XLIV，Immobilied Enzymes，Academic
Press，New York，1976など）または総説（た
とえば、昭和57年４月20日、(株)南江堂発行、「バ
イオマテリアルサイエンス」第１集（化学の領域
増刊134号）p55−67、p69−79など）を参照して
行なうことができる。また自動分析システムにつ
いて成書（Guilbaut，G.G.著「HANDBOOK
OF ENZYMATIC METHODS OF
ANALYSIS」、p445−612，Marcel Dekker，
Inc.，New York，1976、「Methods in
Enzymology」（前出）など）を参照することが
できる。
本発明の実施に好適な自動分析システムとし
て、特開昭58−47484号公報に開示された方式が
例示できる。本システムによれば、アンモニアの
定量またはアンモニア生成物の定量もしくはアン
モニア生成酵素の活性測定を十数秒というごく短
時間に行なうことができる。
て、特開昭58−47484号公報に開示された方式が
例示できる。本システムによれば、アンモニアの
定量またはアンモニア生成物の定量もしくはアン
モニア生成酵素の活性測定を十数秒というごく短
時間に行なうことができる。
本システムは、被験試料を固定化酵素カラムに
供給し、酵素反応により生成した過酸化水素を含
むカラム通過液にルミノール−赤血塩系発光剤を
混合し、化学発光させてフローセルに導びき、セ
ルからの化学発光量を受光器を介したフオトンカ
ウンターまたはフオトマルチプライアーによつて
積算する方式である。その基本的な装置構成を第
１図に示す。第１図において、被験試料供給路１
は、基質溶液供給路２、該供給路２に付設された
試料導入口３および固定化酵素カラム４から構成
されている。一方、発光剤供給流路５は、並設さ
れたルミノール溶液供給路６および赤血塩供給路
７ならびに両流６，７を合流する螺旋管状ミキシ
ングコイル８から構成されている。緩衝液供給路
２、ルミノール溶液供給路６および赤血塩供給路
７は、ペリスタルテイツクポンプ９によつてそれ
ぞれ所定流量で供給できるように調整されてい
る。被験試料供給流路１と発光剤供給路５は両溶
液が迅速かつ均一に混合するような手段の配慮の
もとに連結され、フローセル１０に接続してい
る。フローゼルは、受光面を介してフオトマルチ
プライアー１１に接続している。本発明において
は、固定化酵素カラムは、少なくもGLDHと
GLXDの固定化酵素カラムを連結したものから
なり、さらにアンモニア生成系酵素反応によるア
ンモニア生成基質の定量の場合にはアンモニア生
成酵素の固定化酵素カラムが連結される。このと
きの各固定化酵素の量は、実験的に定めればよ
い。アンモニア生成系反応に反応基質や補酵素な
どが必要な場合には、適宜にそれらの供給路を付
設すればよい。
供給し、酵素反応により生成した過酸化水素を含
むカラム通過液にルミノール−赤血塩系発光剤を
混合し、化学発光させてフローセルに導びき、セ
ルからの化学発光量を受光器を介したフオトンカ
ウンターまたはフオトマルチプライアーによつて
積算する方式である。その基本的な装置構成を第
１図に示す。第１図において、被験試料供給路１
は、基質溶液供給路２、該供給路２に付設された
試料導入口３および固定化酵素カラム４から構成
されている。一方、発光剤供給流路５は、並設さ
れたルミノール溶液供給路６および赤血塩供給路
７ならびに両流６，７を合流する螺旋管状ミキシ
ングコイル８から構成されている。緩衝液供給路
２、ルミノール溶液供給路６および赤血塩供給路
７は、ペリスタルテイツクポンプ９によつてそれ
ぞれ所定流量で供給できるように調整されてい
る。被験試料供給流路１と発光剤供給路５は両溶
液が迅速かつ均一に混合するような手段の配慮の
もとに連結され、フローセル１０に接続してい
る。フローゼルは、受光面を介してフオトマルチ
プライアー１１に接続している。本発明において
は、固定化酵素カラムは、少なくもGLDHと
GLXDの固定化酵素カラムを連結したものから
なり、さらにアンモニア生成系酵素反応によるア
ンモニア生成基質の定量の場合にはアンモニア生
成酵素の固定化酵素カラムが連結される。このと
きの各固定化酵素の量は、実験的に定めればよ
い。アンモニア生成系反応に反応基質や補酵素な
どが必要な場合には、適宜にそれらの供給路を付
設すればよい。
実施例
以下、本発明のより具体的な実施態様の一例を
挙げて、より詳細な説明とする。ただし、これら
は、実施の態様を示すものであつて、本発明の技
術思想を限定するものではない。
挙げて、より詳細な説明とする。ただし、これら
は、実施の態様を示すものであつて、本発明の技
術思想を限定するものではない。
実施例 １
（アンモニアの定量）
第１図に示したような構成の自動分析装置を作
製して、アンモニアの定量を行なつた。
製して、アンモニアの定量を行なつた。
(1) 固定化酵素カラムの調製
酵素の固定化はWeetallの法に準じて行なつ
た。すなわち、多孔性アルキルアミンガラス粒
子（孔径500Å、粒子サイズ80−120メツシユ、
ピアス社）200mgに2.5％グルタルアルデヒド溶
液３mlを加え、脱気後、室温大気圧下で30〜60
分間反応を進行させる。グルタルアルデヒド液
を除去し、蒸留水で数回洗浄する。これに、
GLDH酵素液（8500U、東洋紡）1.0mlまたは
GLXD酵素液（130U、後述参考例参照）2.0ml
を加えて、４℃で一晩反応させる。反応液を除
去し、適当な緩衝液で３回以上洗浄し、1M塩
化ナトリウム水溶液で洗浄する。
た。すなわち、多孔性アルキルアミンガラス粒
子（孔径500Å、粒子サイズ80−120メツシユ、
ピアス社）200mgに2.5％グルタルアルデヒド溶
液３mlを加え、脱気後、室温大気圧下で30〜60
分間反応を進行させる。グルタルアルデヒド液
を除去し、蒸留水で数回洗浄する。これに、
GLDH酵素液（8500U、東洋紡）1.0mlまたは
GLXD酵素液（130U、後述参考例参照）2.0ml
を加えて、４℃で一晩反応させる。反応液を除
去し、適当な緩衝液で３回以上洗浄し、1M塩
化ナトリウム水溶液で洗浄する。
得られた固定化酵素をそれぞれアクリル樹脂
製カラム（内径１mm）に詰めて、固定化酵素カ
ラムを調製する。GLDHカラムの長さは20mm、
GLXDカラムの長さは８mmとし、その順に連
結して装置に組み入れた。
製カラム（内径１mm）に詰めて、固定化酵素カ
ラムを調製する。GLDHカラムの長さは20mm、
GLXDカラムの長さは８mmとし、その順に連
結して装置に組み入れた。
(2) 試薬の調製
ルミノール溶液（ルミノール７×10-4M、水
酸化カリウム0.1M、ホウ酸0.1M）、 フエリシアン化カリウム溶液（２×10-2M） 基質緩衝液（PH7.5、10mMりん配緩衝液、
α−KG 1.4mM、NADPH0.33mM、EDTA・
2Na0.53mM含有） (3) 定量操作 既知濃度のアンモニア水溶液1μlを試料液と
してマイクロシリンジで注入して測定を行なつ
た。ルミノール溶液、フエリシアン化カリウム
溶液、基質緩衝液の送りは、ペリスタルテイツ
クポンプを用いて0.6ml／分で行なつた。
酸化カリウム0.1M、ホウ酸0.1M）、 フエリシアン化カリウム溶液（２×10-2M） 基質緩衝液（PH7.5、10mMりん配緩衝液、
α−KG 1.4mM、NADPH0.33mM、EDTA・
2Na0.53mM含有） (3) 定量操作 既知濃度のアンモニア水溶液1μlを試料液と
してマイクロシリンジで注入して測定を行なつ
た。ルミノール溶液、フエリシアン化カリウム
溶液、基質緩衝液の送りは、ペリスタルテイツ
クポンプを用いて0.6ml／分で行なつた。
アンモニア濃度と化学発光量の関係は、第２
図に示した検量線のとおりであつた。
図に示した検量線のとおりであつた。
なお、この系においてα−KGおよび
NADPHの至適濃度を検討したところ、アン
モニア濃度が０〜30mg／ｌの範囲でα−KGは
５mg／dl以上、NADPHは15mg／dl以上の濃
度で直線的な検量線を得ることができた。
NADPHの至適濃度を検討したところ、アン
モニア濃度が０〜30mg／ｌの範囲でα−KGは
５mg／dl以上、NADPHは15mg／dl以上の濃
度で直線的な検量線を得ることができた。
実施例 ２
（尿素の定量）
ウレアーゼ（約200単／mg、東洋紡）10mgを用
いて実施例１と同様にしてウレアーゼの固定化カ
ラム（0.1×２mm）を調製し、実施例１の第１図
装置にウレアーゼ−GLHD−GLXDの順になる
ように固定化酵素カラムを連結して組み入れた。
いて実施例１と同様にしてウレアーゼの固定化カ
ラム（0.1×２mm）を調製し、実施例１の第１図
装置にウレアーゼ−GLHD−GLXDの順になる
ように固定化酵素カラムを連結して組み入れた。
以下、既知濃度の尿素溶液を用いて実施例１と
同様に操作して尿素を定量した。
同様に操作して尿素を定量した。
尿素濃度と化学発光量の関係は、第３図のとお
りであつた。
りであつた。
さらに血清試料を用いて血中尿素窒素を測定し
た。同一試料について従来の血中尿素窒素測定用
自動分析機（ウレアーゼ−インドフエノール法、
日立726型）によつて得られた測定値との相関は
第４図に示したとおりであり、良好な相関が認め
られた（ｎ＝63、相関係数ｒ＝0.997、回帰直線
ｙ＝1.06x−0.36）。
た。同一試料について従来の血中尿素窒素測定用
自動分析機（ウレアーゼ−インドフエノール法、
日立726型）によつて得られた測定値との相関は
第４図に示したとおりであり、良好な相関が認め
られた（ｎ＝63、相関係数ｒ＝0.997、回帰直線
ｙ＝1.06x−0.36）。
実施例 ３
（血中尿素窒素の定量）
第５図に示したフローダイアグラムのように尿
素窒素定量のための連続流動型自動分析システム
を作製した。第５図中、１２は試料供給路、１３
は基質溶液供給路、１４は３インチ透析器、１５
はウレアーゼ−GLDH（１：２）の固定化酵素カ
ラム（1.5×10mm）、１６はジメチルアニリン溶液
供給路、１７はダブル混合コイル、１８は４−ア
ミノアンチピリン供給路、１９はGLXD固定化
酵素カラム（1.5×10mm）、２０はフローセル（15
mm、590nm比色計）、２１は記録計を示す。
素窒素定量のための連続流動型自動分析システム
を作製した。第５図中、１２は試料供給路、１３
は基質溶液供給路、１４は３インチ透析器、１５
はウレアーゼ−GLDH（１：２）の固定化酵素カ
ラム（1.5×10mm）、１６はジメチルアニリン溶液
供給路、１７はダブル混合コイル、１８は４−ア
ミノアンチピリン供給路、１９はGLXD固定化
酵素カラム（1.5×10mm）、２０はフローセル（15
mm、590nm比色計）、２１は記録計を示す。
固定化酵素カラムは、実施例１と同様にして調
製した。定量用試薬の調製は次のととおりであ
る。
製した。定量用試薬の調製は次のととおりであ
る。
基質溶液（PH7.5，50mMりん酸緩衝液、パー
オキシダーゼ60U／dl、α−KG ５mg／dl、
NADPH 30mg／dl含有） ４−アミノアンチピリン溶液（41.3mg／dl、
0.05Mり酸緩衝液、PH5.5）、 ジメチルアニリン溶液（108.8μl／dl、0.3N酢
酸溶液） 定量操作は、試料溶液供給路から血清試料を
0.1ml／分、生理食塩水を0.8ml／分、空気を0.6
ml／分の供給量で、基質溶液供給路から基質溶液
を1.0ml／分、空気を0.8ml／分の供給量で、ジメ
チルアニリン溶液供給路からジメチルアニリン溶
液を0.16ml／分の供給量で、４−アミノアンチピ
リン溶液供給路から４−アミノアンチピリンを
0.16ml／分の供給量で分析システムに送液して、
行なつた。ダブル混合コイルは、48℃に保つた。
オキシダーゼ60U／dl、α−KG ５mg／dl、
NADPH 30mg／dl含有） ４−アミノアンチピリン溶液（41.3mg／dl、
0.05Mり酸緩衝液、PH5.5）、 ジメチルアニリン溶液（108.8μl／dl、0.3N酢
酸溶液） 定量操作は、試料溶液供給路から血清試料を
0.1ml／分、生理食塩水を0.8ml／分、空気を0.6
ml／分の供給量で、基質溶液供給路から基質溶液
を1.0ml／分、空気を0.8ml／分の供給量で、ジメ
チルアニリン溶液供給路からジメチルアニリン溶
液を0.16ml／分の供給量で、４−アミノアンチピ
リン溶液供給路から４−アミノアンチピリンを
0.16ml／分の供給量で分析システムに送液して、
行なつた。ダブル混合コイルは、48℃に保つた。
かくして得られた血中尿素窒素の測定値と、従
来のウレアーゼ−インドフエノール法による自動
分析機（日立726型）によつて得られた測定値と
の相関を第６図に示した。両法の間に良好な相関
が得られた（ｎ＝69、相関係数ｒ＝0.988、回帰
直線ｙ＝1.1x−0.5）。
来のウレアーゼ−インドフエノール法による自動
分析機（日立726型）によつて得られた測定値と
の相関を第６図に示した。両法の間に良好な相関
が得られた（ｎ＝69、相関係数ｒ＝0.988、回帰
直線ｙ＝1.1x−0.5）。
実施例 ４
（クレアチニンの定量）
クレアチニンデイミナーゼ、GLDH、GLXD
の固定化酵素を実施例１と同様に調製し、それぞ
れ1.2×20mm、1.2×14mm、1.2×10mmのカラムとし
て、重層した。これを第１図の装置に装置し、以
下既知濃度のクレアチニン溶液を用いて実施例１
と同様にしてクレアチニンの定量を行なつた。基
質溶液としては、α−KG 0.14mM、NADPH
0.044mM含有10mMりん酸緩衝液（PH7.5）を用
いた。
の固定化酵素を実施例１と同様に調製し、それぞ
れ1.2×20mm、1.2×14mm、1.2×10mmのカラムとし
て、重層した。これを第１図の装置に装置し、以
下既知濃度のクレアチニン溶液を用いて実施例１
と同様にしてクレアチニンの定量を行なつた。基
質溶液としては、α−KG 0.14mM、NADPH
0.044mM含有10mMりん酸緩衝液（PH7.5）を用
いた。
クレアチニン濃度と化学発光量の関係は第７図
のとおりであり、直線的な検量線が得られた。
のとおりであり、直線的な検量線が得られた。
参考例
50ml容三角フラスコにフラスコ20gおよび水16
mlを入れ、120℃、30分間加圧減菌し、これにス
トレプトマイセス・エスピーX119−６（微工研菌
寄第6560号）を植菌し、28℃、７日間培養して種
菌を調製した。
mlを入れ、120℃、30分間加圧減菌し、これにス
トレプトマイセス・エスピーX119−６（微工研菌
寄第6560号）を植菌し、28℃、７日間培養して種
菌を調製した。
５リツトル容三角フラスコ25本にそれぞれフス
マ200gおよび160mlを入れ、120℃で30分間加圧
減菌した後、前記の種菌を無菌的に接種し、28℃
２日間培養後、温度を20℃にしてさに２週間培養
した。
マ200gおよび160mlを入れ、120℃で30分間加圧
減菌した後、前記の種菌を無菌的に接種し、28℃
２日間培養後、温度を20℃にしてさに２週間培養
した。
得られた培養物を水37.5リツトルに浸漬し、
過後、けいそう土過して粗酵素液約34リツトル
を得た。粗酵素液に硫酸アンモニウムを50％飽和
まで加え、生成した沈澱を採取して0.2M酢酸緩
衝液（PH5.5）3.9リツトルに溶解させ、57℃で30
分間加熱処理した。５℃以下に冷却した後、２倍
量の冷エタノールを加え、生成した沈澱を採取し
て0.02Mりん酸緩衝液（PH7.4）２リツトルに溶
解し、同一緩衝液で一夜透析した。透析中に生成
した沈澱を除去し、上清液0.02Mりん酸緩衝液
（PH7.4）で平衡化したDEAE−セルロースカラム
（3.5×50cm）に負荷し、0.35M塩化ナトリウム含
有0.02Mりん酸緩衝液で溶出した。溶出活性画分
を集め、0.05M塩化ナトリウム含有0.05M酢酸緩
衝液（PH5.5）で一夜透析した。この透析内液を
同一緩衝液で平衡化したDEAE−セフアローズ
CL−6Bカラム（２×10cm）に負荷し、0.05〜
0.75M塩化ナトリウム溶液で直線勾配法により溶
出した。溶出された活性画分を集め、透析濃縮
後、セフアデツクスＧ−200カラム（2.5×120cm）
を用いてゲル過を行なつた。活性画分を集めて
濃縮後、0.02Mりん酸カリウムリアクター（PH
7.4）で透析し、透析内液を遠心分離して上清液
を精密過した後、凍結乾燥してGLXD精製標
品（比活性55.1U／mg蛋白、収率18.4％）30mgを
得た。
過後、けいそう土過して粗酵素液約34リツトル
を得た。粗酵素液に硫酸アンモニウムを50％飽和
まで加え、生成した沈澱を採取して0.2M酢酸緩
衝液（PH5.5）3.9リツトルに溶解させ、57℃で30
分間加熱処理した。５℃以下に冷却した後、２倍
量の冷エタノールを加え、生成した沈澱を採取し
て0.02Mりん酸緩衝液（PH7.4）２リツトルに溶
解し、同一緩衝液で一夜透析した。透析中に生成
した沈澱を除去し、上清液0.02Mりん酸緩衝液
（PH7.4）で平衡化したDEAE−セルロースカラム
（3.5×50cm）に負荷し、0.35M塩化ナトリウム含
有0.02Mりん酸緩衝液で溶出した。溶出活性画分
を集め、0.05M塩化ナトリウム含有0.05M酢酸緩
衝液（PH5.5）で一夜透析した。この透析内液を
同一緩衝液で平衡化したDEAE−セフアローズ
CL−6Bカラム（２×10cm）に負荷し、0.05〜
0.75M塩化ナトリウム溶液で直線勾配法により溶
出した。溶出された活性画分を集め、透析濃縮
後、セフアデツクスＧ−200カラム（2.5×120cm）
を用いてゲル過を行なつた。活性画分を集めて
濃縮後、0.02Mりん酸カリウムリアクター（PH
7.4）で透析し、透析内液を遠心分離して上清液
を精密過した後、凍結乾燥してGLXD精製標
品（比活性55.1U／mg蛋白、収率18.4％）30mgを
得た。
第１図は、本発明を好適に実施するための連続
自動分析システムの装置構成例を示す。第２図
は、本発明の実施例において得られたアンモニア
の検量線を示し、第３図は同じく尿素の検量線を
示す。第４図は本発明方法と従来法の血中尿素窒
素の測定値の相関を示す。第５図は、本発明の実
施例において使用された血中尿素窒素定量用の連
続流動型自動分析システムのフローダイアグラム
であり、第６図はそのシステムと従来法の血中尿
素窒素の測定値の相関を示す。第７図は本発明実
施例において得られたクレアチニンの検量線であ
る。 １……被験試料供給路、２……基質溶液供給
路、３……試料導入口、４……固定化酵素カラ
ム、５……発剤供給流路、６……ルミノール溶液
供給路、７……赤血塩供給路、８……螺旋管状ミ
キシングコイル、９……ペリスタルテイツクポン
プ、１０……フローセル、１１……フオトマルチ
プライアー、１２……試料供給路、１３……基質
溶液供給路、１４……３インチ透析器、１５……
ウレアーゼ−GLDH固定化酵素カラム、１６…
…ジメチルアニリン溶液供給路、１７……ダブル
混合コイル、１８……４−アミノアンチピリン供
給路、１９……GLXD固定化酵素カラム、２０
……フローセル、２１……記録計。
自動分析システムの装置構成例を示す。第２図
は、本発明の実施例において得られたアンモニア
の検量線を示し、第３図は同じく尿素の検量線を
示す。第４図は本発明方法と従来法の血中尿素窒
素の測定値の相関を示す。第５図は、本発明の実
施例において使用された血中尿素窒素定量用の連
続流動型自動分析システムのフローダイアグラム
であり、第６図はそのシステムと従来法の血中尿
素窒素の測定値の相関を示す。第７図は本発明実
施例において得られたクレアチニンの検量線であ
る。 １……被験試料供給路、２……基質溶液供給
路、３……試料導入口、４……固定化酵素カラ
ム、５……発剤供給流路、６……ルミノール溶液
供給路、７……赤血塩供給路、８……螺旋管状ミ
キシングコイル、９……ペリスタルテイツクポン
プ、１０……フローセル、１１……フオトマルチ
プライアー、１２……試料供給路、１３……基質
溶液供給路、１４……３インチ透析器、１５……
ウレアーゼ−GLDH固定化酵素カラム、１６…
…ジメチルアニリン溶液供給路、１７……ダブル
混合コイル、１８……４−アミノアンチピリン供
給路、１９……GLXD固定化酵素カラム、２０
……フローセル、２１……記録計。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 下記の工程からなり、工程(A)および工程(B)
を、それぞれの酵素の固定化酵素を直列に配置し
てなるリアクターに試料を通液することによつて
行なうことを特徴とする、アンモニアの定量法。 (A) アンモニアを定量すべき試料に、NAD(P)Ｈ
およびα−ケトグルタール酸の存在下、グルタ
ミン酸デヒドロゲナーゼを作用させて、試料中
のアンモニア量に対応する量のグルタミン酸を
生成させる工程、 (B) この試料に、酸素の存在下、グルタミン酸オ
キシターゼを作用させて、試料中のグルタミン
酸量に対応して過酸化水素を生成させる工程、 (C) 過酸化水素の生成量もしくは生成速度を測定
する工程、 (D) 測定された過酸化水素の生成量もしくは生成
速度からアンモニア量を算出する工程。
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58147350A JPS6041500A (ja) | 1983-08-12 | 1983-08-12 | アンモニアの定量法 |
| AT84109133T ATE54942T1 (de) | 1983-08-12 | 1984-08-01 | Verfahren zur bestimmung von ammoniak. |
| EP84109133A EP0135092B1 (en) | 1983-08-12 | 1984-08-01 | Method for determination of ammonia |
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