JPH0242998A - 造血促進因子タンパク質及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 背景技術 本発明は、一般に、造血促進因子及びかかる因子をコー
ドするポリヌクレオチドに関する。本出願は、詳しくは
、哺乳動物の多分化能性コロニ刺激因子、特にヒト多分
化能性顆粒球コロニー刺激因子（ｈｐＧ−Ｃ３Ｆ）、そ
の断片及びポリペプチド類縁体、並びにそれらをコード
するポリヌクレオチドに関する。

ヒト血液生成（造血）系は、様々な白血球（好中球、マ
クロファージ及び好塩基球／肥満細胞を含む）、赤血球
（エリスロサイト）及び凝血形成細胞（巨核球／血小板
）を補充する。平均的ヒト男性の造血系は毎年４．５ｘ
　１０１１のオーダーの顆粒球及び赤血球を産生ずると
推測されていたが、これは１年間で全体重に相当する。

デキスターら、バイオエッセイズ、第２巻、第１５４〜
１５８頁、１９８５年（Ｄ　ｅｘｔｅｒ　ｅｔ　ａｌ、
、　　Ｅ３１ｏＥｓｓａｙｓ、　　２．１５４−１５８
　（１９８５））。

少量の特定の造血促進因子は、少数の前駆体゛幹細胞″
の各種血液細胞系への分化、これらの系の著しい増殖及
びこれらの系からの成熟血液細胞の最終的分化の原因を
なすと考えられている。

造血促進因子は極端に少ωで存在しているため、これら
因子の検出及び同定は分析の仕方にかかつていたが、今
までは人為的条件下での培養細胞に対する刺激効果に基
づき様々な因子の中から区別できるにすぎなかった。そ
の結果、多数の名称が極めて少数の因子を表示するため
に考え出されてきた。かかる混同が生じた例として、Ｉ
　Ｌ　−３゜ＢＰＡ、マルチ−Ｃ８Ｒ１ＨＣＧＦ、ＭＣ
ＧＦ及びＰＳＦという語は、ずべて現在では同一のマウ
ス造血促進因子に該当すると考えられている頭字詔であ
る。メトカーフ、サイエンス、第２２９巻、第１６〜２
２頁、１９８５年（ｌｙｌ　ｅｔｃａｌ（３ｃｉｅｎｃ
ｅ、　　２２９゜１６−２２　（１９８５））。更に、
各種マウスの成長調節糖タンパク質に関する、バージニ
スら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミス１〜
リー、第２５２巻、第１９８８頁、１９７７年（Ｂｕｒ
ｇｅｓｓ、　　ｅｔ　ａｌ、、　　ＪＢｉｏｌ、　　Ｃ
ｈｅｍ、、　　２５２．１９８８　（１９７７）　）　
、ゲスら、ブラッド、第５８巻、第６００頁：　１９８
０年（Ｄ　ａｓ。

ｅｔ　ａｔ、、　Ｂ　１ｏａｄ、　５８．６００　（１
９８０））　；イーレら、ジャーナル・オブ・イムノロ
ジー、第１２９巻、第２４３１頁、１９８２年（Ｉｈｌ
ｅ、ｅｔａｌ、　　　Ｊ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　１２９．２４３１　（１９８２）
　）　、ニコラら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル
・ケミストリ、第　２５８巻、第９０１７頁、１９８３
年（Ｎ　１ｃｏｌａ、　　ｅｔａｔ、、　　Ｊ、　Ｂｉ
ｏｌ、ＣｈｅＩｌｌ、、　　２５８．９０１７　（１９
８３）　）、メトカーフら、インターナショナル・ジャ
ーナル・オブ・キャンサー、第３０巻、第７７３頁、１
９８２年（Ｍｅｔｃａｌｆ、　　ｅｔ　ａｌ、、　　Ｉ
ｎｔ、　　Ｊ、　　Ｃａｎｃｅｒ、　　３０゜７７３　
（１９８２））　；及び、バージニスら、インターナシ
ョナル・ジャーナル・オブ・キャンサー、第２６巻、第
　６４７頁、１９８０年（３ｕｒｇｅｓｓ、　　ｅｔ　
ａｌ、、　　ｌ　ｎｔ。

Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ、　　２６．６４７　（１９８０）
）参照。

組換え遺伝子技術の利用はこの混乱の中から一定の秩序
をもたらした。例えば、赤血球産生を促進するヒトエリ
スロボエチンのアミノ酸及びＤＮＡ配列が得られた（１
９８５年６月２０日に公開されたリン（Ｌ　ｉｎ）のＰ
ＣＴ出願公開第８５１０２６１０号明細書参照。〕。組
換え方法は、ヒト顆粒球−マクロファージコロニー刺激
因子のｃＤＮＡの単離に関しても利用された。リ−ら、
プロシーデインゲス・オブ・ナショナル・アカデミ−・
オブ・サイエンス（ｔＪｓＡ）第８２巻、第４３６０〜
４３６４頁、１９８５年（ｌｅｅｅｔａｌ、、　　Ｐｒ
ｏｃ、　　ＮａａｌＣａｄ３ｃｉ、　（ＵＳＡ）　、　
８２．４３６０−４３６４　（１９８５）　）及びウォ
ンら、サイエンス、第２２８巻、第８１０〜８１４頁、
１９８５年（Ｗｏｎｇ　ｅｔ　ａｌ、、　　５ｃｉｅｎ
ｃｅ、　　２２８゜８１０−８１４　（１９８５））。

更に、マウス遺伝子のクローニングに関する、ヨコタら
、プロシーデインゲス・オブ・ナショナル・アカデミ−
・オブ・サイエンス（ＵＳＡ）　、第８１巻、第１０７
０頁、１９８４年（”ｙ’ｏｋｏｔａ、　ｅｔａｌ、、
　　ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔｌ、　　ＡｃａｄＳｃｉ、　
　（ＵＳＡ）　、　８１．１０７０　（１９８４）　）
　、ファングら、ネーチャー、第３０７巻、第２３３頁
、１９８４年（Ｆｕｎｇ、　ｅｔ　ａｌ、、　３０７．
２３３　（１９８４））及び、ゴーフら、ネーチャー、
第３０９巻、第７６３頁、１９８４年（Ｇｏｕｏｈ、　
ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ、　３０９　、７６３（
１９８４））、並びにヒトＭ−Ｃ３Ｆに関するカワサキ
ら、サイエンス、第２３０巻、第２９１頁、１９８５年
（にａｗａｓａｋｅｔ　ａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ、　
２３０　、２９１　（１９８５））参照。

ヒト多分化能性コロニー刺激因子（ｈｐｃｓＦ）又はプ
ルリボエチンと称されるヒ１−造血促進因子は、ヒト膀
胱癌細胞系の培養液中に存在していることが示された。

この細胞系は５６３７と呼ばれて、米国菌寄託機関（Ａ
ｍ８ｒｉＣａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅＣａｆｆｅ
ｃｔｉｏｎ）、ロックビル、メリーランドにおいて制限
条件付でＡＴＣＣ寄託番号第ＨＴＢ　−９号として寄託
されている。この細胞系から精製されたｈｐＣＳＦは、
ヒト骨髄前駆体細胞を用いた分析において、すべての主
な血液細胞系の産生につながるような多分化能性前駆ａ
Ｘの増殖及び分化を促進することが報告された。ウェル
トら、プロシーデインゲス・オブ・ナショナル・アカデ
ミ−・オブ・サイエンス（ＵＳＡ）　、第８２巻、第１
５２６〜１５３０頁、１９８５年（Ｗｅｌｔｅ　ｅｔ　
ａｔ、、　　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　　Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ、　　（ＵＳＡ）
、　８２．１５２６−１５３０　（１９８５）　）。ｈ
ｏｃｓＦの精製には、（ＮＨ）　Ｓ０４沈降、陰イオン
交換クロマトグラフィー（ＤＥＡＥセルロース、ＤＥ５
２）、ゲル濾過（ＡｃＡ５４カラム）、及び０１８逆相
高性能液体クロマトグラフィーを利用していた。０１８
逆相ＨＰＬＣ画分において２つの活性ピークの２番目に
溶出するｈｐＣ３Ｆとして確認されたタンパク質は、銀
染色を用いるドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ポリ
アクリルアミド電気泳動＜ＰＡＧＥ）ｔ”（７）測定ニ
ヨレハ、分子Ｉ　（ＭＷ）１８．０００を有す、ると報
告された。ｈｐｃｓＦは、等電点５．５を有し〔ウェル
トら、ジャーナル・オブ・セル・バイオケミストリー、
増刊第９Ａ号、第１１６頁、１９８５年（Ｗｅｌｔｅ、
　ｅｔ　ａｔ、、　　Ｊ、　　ＣｅＢｉｏｃｈｅｍ、、
　　５ｕｐｐ　　９Ａ、　１１６　（１９８５））　）
　、？ウス骨髄単球性白血病細胞系ＷＥ＋−（１−３８
Ｄ＋に対して高分化能を有する（ウェルトら、分子及び
細胞生物学のＵＣＬＡ討論会、ゲールら編集、ニューシ
リーズ、第２８巻、１９８５年（Ｗｅｌｔｅ、員ａｔ、
、　　ＵＣＬＡ　　Ｓｙｍｐｏｓｉａｏｎ　　Ｍｏ１ｅ
ｃｕｌａｒａｎｄＣｅｌｌｕｌａｒ　　Ｂ　１ｏｌｏａ
ｙ、　　Ｇａ１ｅ、ｅｔ　　ａｔ、、ｅｄｓ、、Ｎｅｗ
Ｓｅｒｉｅｓ、　　２８　（１９８５）））ことが早期
に報告された。

予備研究では、ｈｐｃｓ＋”と確認された因子はヒトＣ
ＦＵ−ＧＭ分析において最初の７日間に顕著な顆粒球コ
ロニー刺激活性を有することを示している。

ヒトＣ３Ｆ−βと称されるもう　１つの因子も、ヒト膀
胱癌細胞系５６３７から単離されたが、未標識マウスＧ
−ＣＳＦの場合と同一の用岳応答関係においてＷＥＨＩ
−３Ｂ　　Ｄ＋細胞との結合性に関しマウス　　Ｉ−標
識顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）の競合体とし
て記載されていた〔ニコラら、ネーチャー、第３１４巻
、第６２５〜６２８頁、１９８５年（Ｎ　１ｃｏｌａ、
　　ｅｔ　ａｌ、、Ｎ　ａｔｕｒｅ、　　３１４．。

６２５−６２８　　（１９８５）　）　）。この用遣応
答関係は、以前、未標識マウスＧ−Ｃ３Ｆに独特であっ
て、Ｍ−Ｃ３Ｆ、ＧＭ−ＣＳＦ又はマルチ−〇ＳＦのよ
うな因子には見られないと報告されていた〔ニコラら、
プロシーデインゲス・オブ・ナショナル・アカデミ−・
オブ・サイエンス（ＵＳＡ）　、第８１巻、第３７６５
〜３７６９頁、１９８４年（Ｎ　１ｃｏｌａ、　　ｅｔ
　ａｌｌ）ｒｏｃ、Ｎａｔｌ、　　Ａｃａｄ、　　Ｓｃ
ｉ、　　（ＵＳＡ＞、　８１３７６５−３７６９　（１
９８４）））。Ｃ３Ｆ−β及びＧ−Ｃ３Ｆはともに、そ
れらがＷＥＨＩ−３８Ｄ＋細胞の分化を誘導する高い能
力を有している点において、ＣＳＦ類の中では独特であ
るにコラら、イムノロジー・トウデー、第５巻、第７６
〜８０頁、１９８４年（Ｎ　１ｃｏｌａ、　ｅｔ　ａｔ
、、　　（ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　Ｔｏｄａｙ。

５、７６−８０　（１９８４））　）。高濃度でＧ−Ｃ
ＳＦは混合顆粒球／マクロファージコロニー形成細胞を
刺激するがにコラら、１９８４年、同上）、このことは
、ヒト骨髄培養物及びｈｐＣＳＦの１４日間のインキュ
ベー１−後に顆粒球性、単球性、混合顆粒球／単球性及
び好酸球性のコロニー（ｃＦＵ−ＧＥＭＭ）の出現を示
す予備実験結果と一致する。

Ｃ３Ｆ−〇もマウス骨髄細胞使用分析において好中球性
、顆粒球性のコロニー形成を促進すると記載されていた
が、この性質は因子をＧ−ＣＳＦとして同定するための
基準とされた。これらの類似性から、ヒトＣ３Ｆ−βは
Ｇ−ＣＳＦ（顆粒球コロニー刺激因子）と同一視された
〈ニコラら、ネーチャー、第　３１４巻、第６２５〜６
２８頁、１９８５年（Ｎｉｃｏｌａ、　ａｔ　ａｔ、、
　　Ｎａｔｕｒｅ、　　３１４　、６２５−６２８（１
９８５））　）。

これらの共通の性質に基づけば、ニコラら、同上のヒト
Ｃ３Ｆ−β及びウェルトら、同上のｈｐｃｓＦは、適切
にはヒト多分化能性顆粒球コロニー刺激因子（ｈｐＧ−
ＣＳＦ）と称される同一の因子であると思われる。ｈｐ
Ｇ−ＣＳＦの特徴づけ及び組換え産生は、イン・ビトロ
ＷＥＨ［−３８０＋白血病細胞数を゛全く正常な濃度″
で完全に抑制するマウスＧ−ＣＳＦの報告されている能
力、並びに、マウスで確立された移植骨髄白血病を抑制
する粗製マウスＧ−ＣＳＦ注射製剤の報告されている能
力からみて、特に望ましいであろう。メトカーフ、サイ
エンス、第２２９巻　　第１６〜２２頁、１９８５年（
ＭｅｔｃａｌｆＳｃｉｅｎｃｅ、　２２９．１６−２２
　（１９８５）　）参照。更に、サックス、サイエンテ
ィフィック・アメリカン、第２８４巻、第１号、第４０
〜４７頁、１９８６年（３ａｃｈｓ３ｃｉｅｎｔｉｆｉ
ｃ　Ａｍｅｒｉｃａｎ、　　２８４８　（１）、　　４
Ｏ−４７（１９８６）　）参照。

ｈｏＧ−ＣＳＦが治療上重要であるとわかり、したがっ
て市販規模吊の入手が必要となる限り、細胞培養物から
の単離では、十分な物質源を提供することは困難である
。たとえば、ウェルトら（１９８５年、同」−）により
天然ＭＣＳＦ’＄ｉ離物源として報告されたヒト膀胱癌
細胞系５６３７　（Ａ　Ｔ　ＣＣＨＴＢ９）等のヒト腫
瘍バンク細胞の商業的使用に対して制約が存在している
ことは、注目される。

発明の要旨 本発明によれば、ｈｐＧ−ＣＳＦの全部又は−部をコー
ドするＤＮＡ配列が提供される。このような配列は、選
択された非哺乳動物宿主による発現に“好ましい″コド
ンの組込み、制限エンドヌクレアーゼ酵素による切断部
位の供与、及び、簡易的発現ベクターの組立てを容易に
する前端、後端又は中間部へのＤＮＡ配列の付加的供与
を含むことができる。本発明は更に、１以上のアミノ酸
残基の同−性又は位置に関して天然型と異なり、しかも
天然型の性質の一部又は全部を保有している、ｈ　ｐＧ
　−ＣＳＦのポリペプチド類縁体又は誘導体く即ち、ｈ
ｌ）Ｇ−Ｃ３Ｆに特異的な残基のすべてまでは含有して
いない削除類縁体、１以上の特異的残基が他の残基で置
換されている（　Ｓ　ｅｒ１７〕ｈｐＧ−ＣＳＦのよう
な置換類縁体、及び、１以上のアミノ酸残基がポリペプ
チドの末端又は中間部分に付加している付加類縁体）の
微生物発現をコードするＤＮＡ配列を提供する。

本発明の新規ＤＮＡ配列は、天然多分化能性顆粒球コロ
ニー刺激因子における一次構造配列の少なくとも一部及
び生物学的性質の１以上を有するポリペプチド産物の原
核もしくは真核宿主細胞での発現を確実化するために使
用される配列を含有している。本発明のＤＮＡ配列は、
特に、（ａ）表■及び表ＶＩＩに示されたＤＮＡ配列又
はそれらの相補鎖、（ｂ）表■のＤＮＡ配列又はその断
片と（水用１０書記載のようなハイブリッド形成条件下
又はより厳格な条件下で）ハイブリッド形成するＤＮＡ
配列、又は　（ｃ、）Ｎ伝コードの縮重がなければ表Ｖ
ｌのＤＮＡ配列とハイブリッド形成し得るＤＮＡ配列を
も含むものである。特に　（ｂ）に包含されるものとし
ては、ｈ　ｐＧ　−ＣＳＦの対立変異型及び／又は他の
哺乳動物種の多分化能性顆粒球コロニー刺激因子をコー
ドするゲノムＤＮＡ配列がある。

特に　（ｃ）に包含されるものとしては、ｈｐＧ−Ｃ３
Ｆ、ｈｐＧ−ＣＳＦの断片及びｈ　ｐＧ　−Ｃ３Ｆ類縁
体をコードする人工ＤＮＡ配列があるが、このＤＮＡ配
列には微生物宿主でのメツセンジャーＲＮＡの翻訳を促
進するコドンを組込むことができる。このような人工配
列は、アルドン（Ａ　１ｔｏｎ）らのＰＣＴ出願公開第
ＷＯ３３１０４０５３号の方法により容易に組立てるこ
とができる。

更に本発明に包含されるものとしては、本明細書の表■
又は表■の上部鎖ヒトＣＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ配列に
相補的なりＮＡの一部によりコードされたポリペプチド
類、即ちトラモンタノら、ヌクレイツク・アシッズ・リ
サーチ、第１２巻、第５０４９〜５０５９頁、１９８４
年（ＴｒａｍＯｎｔａｎＯｅｔ　ａｌＮ　ｕｃｌｅｉｃ
　　Ａ　ｃｏｄｓ　　Ｒｅｓ、、　　１２．　５０４９
−５０５９（１９８４））に記載された゛相補的転化タ
ンパク質″がある。

本発明は、対立変異体を含む天然ｈｐＧＣ３Ｆ１．：お
ける一次構造配列（即も、アミノ酸残基の連続配列）の
一部もしくは全部、生物学的性質（例えば１．免疫学的
性質及びイン・ビトロ生物学的活性）の１以上、及び物
性（例えば、分子量）を有する精製単離ポリペプチド産
物を提供する。

これらのポリペプチドは、化学合成操作又はゲノムもし
くはｃＤＮＡのクローニングもしくは遺伝子合成により
得られる外来性ＤＮＡ配列の原核もしくは真核宿主発現
（例えば、細菌、酵母菌、高等植物、昆虫及び哺乳動物
細胞の培養による）の産物である、ということによって
も特徴づけられる。典型的な１ｍ菌〔例えばサツカロマ
イセス・セレビシアエ（Ｓ　ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）　）又は原核生物（例えば、
エシェリキア・コリ（Ｅ　５ｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏ
ｌｉ））宿主細胞の産物は、いずれの哺乳動物タンパク
質とも会合していない。を推動物（例えば、非ヒト哺乳
動物及び鳥類）細胞における微生物発現産物は、いずれ
のヒトタンパク質とも会合していない。用いられた宿主
に応じて、本発明のポリペプチドは、哺乳動物その他の
真核生物の炭水化物でグリコシル化していてもよいし、
非グリコシル化のままでもよい。本発明のポリペプチド
は、（−１位に）最初のメチオニンアミノ酸残基を有す
ることもできる。

更に本発明に包含されるものとしては、有効量の本発明
のポリペプチド産物と一緒に適切な希釈剤、アジュバン
ト及び／又は担体を含有する、ｈｐＧ−ＣＳＦ療法に使
用される医薬組成物がある。

本発明のポリペプチド産物は、固体組織及び血液もしく
は尿等の液体試料中におけるヒトｈ　ｐＧ　−ＣＳＦの
検出及び定量に使用される試薬を提供するために、検出
可能なマーカー物質と結合させることにより゛標識″す
る（例えば、１２５Ｉで放射線標識する）ことができる
。

本発明のＤＮＡ産物は、検出可能なマーカー（例えば、
放射線標識及びビオチンのような非アイソトープ標識）
で標識することもでき、しかも染色体地図上のヒトｈｐ
Ｇ−Ｃ３Ｆ遺伝子の位置及び／又はその関連遺伝子群の
位置をつきとめるためのＤＮＡハイブリッド形成操作に
用いることができる。それらはＤＮＡレベルでのヒトｈ
ｌ）ＧＣ３Ｆ遺伝子の異常を確認するためにも使用され
、隣接遺伝子及びそれらの異常を確認するための遺伝子
マーカーとして使用することもできる。

本発明のポリペプチド産物は、再生不良性貧血のような
造血障害の治療のために、中独で又は他の造血因子もし
くは薬物と一緒に使用される。それらは化学療法又は放
射線療法による造血障害の治療にも使用される。青髄移
植の成功率は、例えばｈｐＧ−Ｃ３Ｆの使用により高め
られるであろう。創傷冶症熱傷治療及び細菌性炎症治療
にもｈｌ）Ｇ−ＣＳＦが有効である。更に、ｈｐＧ−Ｃ
３Ｆは、白血病細胞を分化させると報告されている能力
に基づき、白血病の治療にも使用される。

ウェルトら、プロシーデインゲス・オブ・ナショナル・
アカデミ−・オプ・サイエンス（ＵＳＡ）、第８２巻、
第１５２６〜１５３０頁、１９８５年（Ｗｅｌｔｃ、　
　ｅｔａｌ、　　　Ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔｌ、　　Ａｃ
ａｄ、　　Ｓｃｉ、（ＵＳＡ）　。

８２　１５２６−１５３０　（１９８５））及びサック
ス（Ｓ　ａｃｈｓ）、同上参照。

本発明の多数の側面及び長所は、現在の好ましい態様た
る本発明の実例について説明した以下の詳細な説明を旧
約することにより、当業者であれば明らかになるであろ
う。

詳細な説明 本発明によって、ｈ　ｐＧ　−ＣＳＦのポリペプチド配
列の一部又は全部をコードするＤＮＡ配列が単離されか
つ特徴づけられた。

下記の諸例は本発明の説明のために示されたものであっ
て、特に、ｈｐＧ−ＣＳＦ　　ｃＤＮＡ及びゲノムクロ
ーンの同定に先立ち行なわれる操作、かかる同定方法、
並びに、配列決定、ｃＤＮＡ、ゲノム及び人工遺伝子に
基づく発現系の開発、及びかかる系での発現ｈｐＧ−Ｃ
３Ｆ及び類縁体産物の同定に関する。

更に詳しくは、例１はｈｐＧ−Ｃ３Ｆのアミノ酸配列決
定に関する。例２はコロニーハイブリッド形成スクリー
ニング用ＣＤＮＡライブラリーの製造に関する。例３は
ハイブリッド形成プローブの組立てに関する。例４は、
ハイブリッド形成スクリーニング、陽性クローンの同定
、陽性ｃＤＮＡクローンのＤＮＡ配列決定及びポリペプ
チド−次構造配列（アミノ酸配列）情報め作成に関する
。例５はｈｐＧ−ＣＳＦをコードするゲノムクローンの
同定及び配列決定に関する。例６は、大腸菌優先（ｐｒ
ｅｆｅｒｅｎｃｅ）コドンが用いられたｈｐＧ−ＣＳＦ
をコードする人工遺伝子の組立てに関する。

例７は、ｈｐＧ−ＣＳＦをコードするＤＮＡを組込んだ
大腸菌形質転換ベクターの組立て方法、ｈｐＧ−ＣＳＦ
の原核生物発現におけるベクターの使用、及び本発明の
組換え産物の特性分析に関する。例８は、システィン残
基がｈｐＧ−ＣＳＦをコードするＤＮＡでの変異誘発に
より別の適切なアミノ酸残塁で置換されたｈｐＧ−Ｃ３
Ｆ類縁体の産生方法に関する。例９は、陽性ｃ　Ｄ　Ｎ
−Ａクローンから得たｈｐＧ−ＣＳＦ類縁体をコードす
るＤＮＡを組込んだベクターの組立て方法、ＣＯ３−１
細胞形質転換のためのベクターの使用、及び形質転換細
胞の培養増殖に関する。例１０は、本発明の組換えポリ
ペプチド産物の物理的及び生物学的性質に関する。

例　　　　１ ｈｌ）Ｇ−Ｃ３Ｆ試料（３〜４μ３、ＳＯ８銀染色−Ｐ
ＡＧＥ純度８５〜９０％〉は、ウェルトら、プロシーデ
インゲス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイ
エンス（ＵＳＡ）　、第８２巻、第１５２６〜１５３０
頁、１９８５年（Ｗｅｌｔｃ、　　ｅｔ　ａｌ、、　　
ＰｒｏｃＮａｔｌ、Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ、　　（ＵＳ
Ａ）、　８２．１５２６１５３０　（１９８５）　）に
従い単離精製したものと同様であって、スローン・ケタ
リング・インスティテユ−ト（３１ｏａｎ　　Ｋｅｔｔ
ｅｒｉｎｇ　　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ）　、ニュ−ヨーク
、ニューヨーク州から入手した。

このｈｐＧ−ＣＳＦ試料のＮ末端アミノ酸配列を、ＡＢ
４０７Ａ気相分析装置（アプライド・バイオシステムズ
＜　Ａ　１）ｐｌ　ｉｅｄ　　ｔ３１ｏｓｙｓｔｅ＋＋
＋ｓ）、フォスター市、カリフォルニア〕を用いたミク
ロ配列分析により１号操作（Ｒｕｎｔｌ）で決定し、下
記人工に掲示された配列情報を得た。表Ｉ−ＴＶでは、
単一文字コードが用いられており、ＩＩ　Ｘ　Ｎは明確
に決定されなかった残基を示し、括弧内の残基は単に択
−的又は推定的に示されたものである。

表１ １、　　　　５　　　　　１０　　　　　　　　　１５
ＫＬｐ−Ｌ−Ｇ−Ｐ−Ａ−Ｓ−に−Ｌ−に−Ｑ−（Ｇ、
Ｖ、５）−Ｇ−Ｌ−Ｘ−Ｘ−Ｘくの汚染成分を有するこ
とを示していた。配列を単に参照用として保存した。

２号操作（Ｒｕｎ１２）では、第２試料（５〜６μり、
純度９５％以下）は１号操作と同様にスローン・ケタリ
ングから入手し、配列決定操作は１号操作と同様にして
実施した。この試料は、ウェルトら、プロシーデインゲ
ス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス
（ｔＪｓＡ）、第８２巻、第１５２６〜１５３０頁、１
９８５年の図４を作成するために用いら゛れた物質の同
一ロットから得たものである。

結果は、表■に示されている。

表■ 高いバックグランドが操作サイクル毎に存在しだが、そ
の結果は人工に報告されており、このことは試料がおそ
らく精製時の化学的残留物たる多更に多くの残基が同定
されたが、２号操作では、適当数のプローブをｈｐＧ−
ＣＳＦ　　ＤＮＡ調査用に組立て得るほど十分に長い明
確な配列は得られなかった。表■の配列に基づきＣＤＮ
Δの単離を行なうためには、少なくとも１５３６種類の
プローブが必要であろうと計算された。再度、試料の汚
染が問題視された。

このため、第３試料（３〜５μＪ、純度４０％以下）を
上記のようにスローン・ケタリングから入手した。この
調製物は、更に精製するために、５Ｏ８−ＰＡＧＥによ
る分離後、電気プロット（ｅｌｅｃｔｒｏｂｌｏｔ）に
付した。この試料の配列分析ではデータが得られなかっ
た。

（Ｂ）　修正方法により得られた物質の配列決定十分Ｍ
の純粋物質を得て適切な最終的アミノ酸配列分析を実施
するため、スローン・ケタリングで産生されるものと同
様の膀胱癌細胞系５６３７の細胞（サブクローンＩＡ６
）をイー・ブラツツアー博士＜Ｏｒ、　　Ｅ、　Ｐｌａ
ｔｚｅｒ）から入手した。細胞を最初にフラスコ中のア
イコブ（Ｉ　５ｃｏｖｅ’ｓ）培地〔ギブコ（Ｇ　Ｉ　
ＢＣＯ）　、グランドアイランド、ニューヨーク〕で培
養し、集密化させた。集密化時、培養物をトリプシン処
理し、ローラーボトル中に播種したが（１，５フラスコ
／ボトル）、各ボトルは５％ＣＯ２下で予め条件が整え
られたアイコブ培地２５ｄを含有していた。細胞を３７
℃、　０．３ｒｐｍで一夜増殖させた。

サイトデックスー１　（ｃＶｔｏｄｅｘ−１）ビーズ〔
ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）　、つ７サラ、ス
ウェーデン〕を洗浄し、下記操作により滅菌した。ビー
ズ８ｇをボトルに加え、ＰＢ８４００ｄを加えた。

ビーズを３時間静かに撹拌して懸濁さ吐た。ビーズを静
置させた後、ＰＢＳを排出し、ビーズをＰＢＳで洗浄し
、新鮮ＰＢＳを加えた。ビーズを１５分間オートクレー
ブで処理した。使用前に、ビーズを、新鮮培地＋１０％
牛脂児血清（Ｆｅ２）添加前にアイコブ培地＋１０％Ｆ
Ｃ８中で洗浄し、処理ビーズを得た。

各ローラーボトルから３０ｄを除くすべての培地を除去
した後、新鮮培地＋１０％Ｆ　Ｃ８３０ｍ及び処理ビー
ズ４０ｄをボトルに加えた。ボトルを５％Ｃ○２処理し
、すべての泡を吸引除去した。ボトルを、速度０．・３
ｒｐ１ｍに低下させる前、ローラー台に３ｒｐＩ１１で
０．５時間載置した。３時間後、別のフラスコ内容物を
トリプシン処理し、ビーズ含有の各ローラーボトルに加
えた。

集密度４０〜５０％の時点でローラーボトル培養物をＰ
　Ｂ　Ｓ　５０ｒｄで洗浄し、ＰＢＳ除去前１０分間回
転させた。細胞を培地Ａ　（０，２％ＦＣ８，１０−８
Ｍヒドロコルチゾン、２ｍＭグルタミン、１００単位／
ｄペニシリン及び１００μｇ／ｄストレプトマイシン含
有アイコブ培地）中で４８時間培養した。次いで、培養
上澄を３０００ｒｐｍで１５分間遠心分離して集、め、
−７０℃で貯蔵した。培養物に１０％ＦＣ８含有培地Ａ
を再度加え、４８時間培養した。培地を捨てた後、細胞
を上記のようにＰＢＳで洗浄し、培地Ａ中で４８時間培
養した。上澄を再度集め、上記のように処理した。

ＩＡ６細胞の培養培地約３０リツトルを、１０．０００
Ｍ、Ｗ、遮断装置をもつ２個のカセットを備えたミリボ
ア・ベリコン（Ｍ　１ｌｌｉｐｏｒｅ　　ｐｅｌｌｉｃ
ｏｎ）ユニットにより、濾過速度的２００ｉ／ｍｉｎ及
び保持速度的１０００ｄ／ｍｉｎで約２リツトルまで濃
縮した。

濃縮物を同−装置及び同一流速により５０ｍＭ１−リス
（ｐＨ７，８）約１０リツトルで透析濾過した。透析濾
過濃縮物を５０ｍＭトリス（１）８７．８）で平衡化さ
れた１リツトルＤ　Ｅ　ｔルロース力ラムに４０ｍ１！
　／ｍ　ｉ　ｎで添加した。添加後、カラムを５０ｍＭ
　ｌ−リス（ｐＨ７，８）１リツトル、次いテ５０ｍＨ
ＮａＣ，Ｑ含有５０ｎ＋Ｈトリス（ｐＨ７，８）２リツ
トルにより同一速度で洗浄した。カラムを次いでＮａＣ
ｊｉｊ１度が７５ｍＭ、　１００ｍＭ、　１２５ｍＭ、
　　１５０ｍＭ、　　２００ｍＭ及び３００ｍＭの６種
の５０ｍｔＨ−リス（１！７．５）１リツトルで連続的
に溶出させた。両分（５０ｄ　）を集め、活性画分をプ
ールし、ＹＭ５膜装備アミコン（Ａ　ｍ１ｃｏｎ）限外
濾過撹拌セルユニットで６５ｄに濃縮した。この濃縮物
をＰＢＳで平衡化された２リツトルのＡＣＡ５４ゲル濾
過カラムに添加した。

カラムを８０ｍ１／　ｈｒで操作し、１０ｄ画分を集め
た。

活性画分をプールし、Ｃ４高性能液体クロマトグラフィ
ー（ＨＰＬＣ）カラムに直接添加した。

容量１２５〜８５０　＃ｌｉ！で、タンパク質１〜８ｇ
ｔｇを含有し、その約１０％がｈｐＧ−ＣＳＦである試
別を、流速１〜４　ｒｄ／ｍｉｎでカラムに添加した。

添加後、流速１ｄ／ｍｉｎで８０％２−プロパツール中
の０．１Ｍ酢酸アンモニウム（ｐＨ６゜０〜７．Ｏ）に
より洗浄した。１１ｒｄ１画分を集め、タンパク質につ
いて２２０ｎｓ、２６０ｎｌ及び２８０ｒｖでモニター
した。

Ｍ製した結果、Ｍ）Ｇ−ＣＳＦ含有画分を他のタンパク
質含有画分から（８０の画分中７２及び７３番目の画分
として）明確に分離した。ｈｐＧ−Ｃ３Ｆは純度的８０
±５％及び収率的５０％で単離された（１５０〜３００
μｇ）。この精製物質９μ９を４号操作（Ｒｕｒ１４）
アミノ酸配列分析に使用し、タンパク質試料を非ポリブ
レンＴＦＡ活性ガラス繊維板に付着させた。配列分析は
、ヘライックら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・
ケミストリ、第２５６巻、第７９９０〜７９９７頁、１
９８１年（Ｈｅｗｉｃｋ。

ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　　Ｃｈｅｍ、、　
２５６．　７９９０−７９９７（１９８１）　）及びラ
イ、アナリティ力・キミ力・アクタ、第　１６３巻、第
　２４３〜２４８頁、１９８４年（ｌａｉ’。

Ａｎａｌ、　　Ｃｈｉｍ、　　Ａｃｔａ、　　１６３　
、２４３−２４８　（１９８４））の方法に従い、ＡＢ
４７０Ａ分析装置で実施した。

４号操作の結果は表■に示されている。

表■ Ｇｉｎ　−Ｓｅｒ　−Ｐｈｅ　−Ｌｅｕ　−Ｌｅｕ　−
Ｌｙｓ　−（Ｌｙｓ）　−Ｌｅｕ　−（Ｇｌｕ）　−Ｇ
ｌｕ−２５３゜ Ｖａｌ　−Ａｒｇ　−Ｌｙｓ−工１ｅ　−（Ｇｉｎ）　
−Ｇｌｙ　−Ｖａｌ　−Ｇｌｙ　−Ａｌａ　−Ａｌａ−
Ｌｅｕ　　−Ｘ ４号操作では、（表■の残基３１に相当する）第３１サ
イクルより先において、更に重要な配列情報は得られな
かった。長い明確な配列を得るために、５号操作（Ｒｕ
ｎ１５）においては、条件調整培地から精製されたｈｌ
）Ｇ−ＣＳＦ１４μ９を４５℃で１時間β−メルカプト
エタノール１０ｄで還元し、次いで減圧下で完全に乾燥
した。、タンパク質残基を次いで、ポリブレン化ガラス
１１雑板に付着させる前に５％ギ酸に再溶解した。配列
分析は上記４号操作と同様にして実施した。５号操作の
結果は表■に示されている。

表■のアミノ酸配列は、下記ｈｐＧ−ＣＳＦＴｈｒ　−
Ｐｒｏ　−Ｌｅｕ　−Ｇｌｙ　−Ｐｒｏ　−Ａｌａ　−
Ｓｅｔ　−Ｓｅｒ　−Ｌｅｕ　−Ｐｒｏ　−Ｇｌｎ　−
Ｓｅｒ　−Ｐｈｅ　−Ｌｅｕ　−Ｌｅｕ　−Ｌｙｓ　−
Ｃｙｓ　−Ｌｅｕ　−Ｇｌｕ　−ＧＬｎ−ｃＤＮＡを得
るためのブＯ−ブを組立てる上で、十分に長＜（４４残
基）かつ明確であった。

例　　　　２ Ｖａｌ　−Ａｒｇ　−Ｌｙｓ　７１１ｅ　−Ｇｉｎ　−
、Ｇｌｙ　−Ａｓｐ　−Ｇａｙ　−Ａｈａ　−Ａｌａ　
−Ｌｅｕ　−Ｇｉｎ　−Ｐｈｅ　−Ｌｙｓ　−Ｌｅｕ　
−Ｇｌｙ　−Ａｌａ　−Ｔｈｒ　−Ｔｙｒ　−ＩＪＹＳ
　−Ｖａｌ　　−Ｐｈｅ　　−Ｓｅｒ　　−Ｔｈｒ　　
−（Ａｒｇ）　　−（Ｐｈｅ）　　−（Ｍｅヒ）　−Ｘ
−目的のｃＤＮＡ配列を単離するための標準的操作の中
には、標的遺伝子の発現に基づき選択されたドナー細胞
中に豊富に存在するｍＲＮＡの逆転写から得られるプラ
スミド担持ｃＤＮＡ　’“ライブラリー“の調製が含ま
れる。ポリペプチドのアミノ酸配列の実質的部分が公知
である場合には、“標的５ＣＤＮＡ中での存在が推定さ
れる配列を複製した標識−重鎮ＤＮＡプローブ配列が、
重鎖型に変性されたｃＤＮＡのクローンコピーに対して
実施されるＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッド形成操作におい
て使用され得る。ワイスマン（Ｗ　ｅｉｓｓｍａｎ）ら
、米国特許筒４．３９１１．４４３号明１ａ、ウォレス
ら、ヌクレイツク・アシツズ・リサーチ、第６巻、第３
５４３〜３５５７頁、１９７９年（Ｗａｌｌａｃｅ。

ｅｔ　ａｔ、、　　Ｎｕｃｌｅｉｃ　　Ａｃ１ｄｓ　　
Ｒｅｓ、、　　６．　　３５４３−３５５７　（１９７
９）　）　、レイスら、プロシーデインゲス・オブ・ナ
ショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス（ＵＳＡ）　
、第７９巻、第３２７０〜３２７４頁、１９８２年（Ｒ
ｅｙｅｓ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔｌ
、　　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　（Ｕ　Ｓ　Ａ　）　、　７９．３２７０−３
２７４　（１９８２））　、及びジエイ（Ｊ　ａｙｇ）
ら、ヌクレイツク・アシツズ・リサーサ、第１１巻、第
２３２５〜２３３５．１９８３年参照。

更に、診断実施時におけるＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッド
形成操作に関するファルコー（Ｆ　ａｌｋｏｗ）らの米
国特許第４．３５８．５３５号明細書、及びコロニ及び
プラークハイブリッド形成技術に関するデービスら、゛
遺伝子工学、高等細菌遺伝学のマニュアル”、コールド
・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−（［）ａｖｉｓ
、　ｅｔ　ａｔ、、　　”△　Ｍａｎｕａｌ　ｆｏｒＧ
ｅｎｅｔｉｃ　　ｌ：ｎｇｉｎｃｅｒｉｎｇ、　Ａｄｖ
ａｎｃｅｄ　Ｂａｃｔｅｒ＋ａＱｅｎｅｔｒｃｓ　　”
　、　　Ｃｏ１ｄ　　５ｐｒｉｎａ　　Ｈａｒｂｏｒｌ
　ａｂｏｒａｔｏｒｙ　）・コールド・スプリング・ハ
ーバ−、ニューヨーク、１９８０年、第５５〜５８頁及
び第１７４〜１７６頁参照。

完全ＲＮＡの定量的単離のためのグアニジニウムチオシ
アネート操作〔チャーブウィンら、バイオケミストリー
、第１８巻、第５２９４〜５２９９頁、１９７９年（ｃ
ｈｉｒｇｗｉｎ、　ｅｔａｌ、、　　３ｉｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ、　　１８゜５２９４−５２９９　（１９７９
））　）により、全ＲＮＡを膀胱癌細胞系５６３７　（
Ｉ　Ａ　６　）細胞的１ｇから抽出した。

無菌ＲＮＡ水溶液はＩＡ６細胞由来の全ＲＮＡを含有し
ていた。全ＲＮ△溶液からメツセンジャーＲＮＡのみを
得るため、溶液をオリゴデオキシチミジレート〔オリゴ
（ｄＴ））（コラボレーティブ・リサーチ社（ｃｏｌｌ
ａｂｏｒａｔｉｖｅ　　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ■ｎｃ、）、
ウォルサム、マサチューセッツ〕含有カラムに通した。

メツセンジャーＲＮＡに特有のポリアデニル化（ポリＡ
”　）尾部はカラムに付着するが、リポソームＲＮＡは
溶出する。かかる操作の結果、ポリアデニル化メツセン
ジャーＲＮＡ（ポリＡ”　ｍＲＮＡ）約９０μ７を単離
した。単離されたポリへ“メツセンジャーＲＮＡを、ｃ
ＤＮＡ反応で使用する前に、最終濃度４ｍＨで５分間室
温で水酸化メチル水銀〔アルファ・ペントロン（Ａ　１
ｐｈａ　　Ｖ　ｅｎｔｒｏｎ）　、デンバーズ、マサチ
ューセッツ）により前処理した。水酸化メチル水銀処理
は、翻訳を阻害するメツセンジャーＲＮＡ自体の相互反
応及びそれと汚染分子との相互反応を抑制させた。ベイ
バーら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミスト
リー、第２５８巻、第７６３６〜７６４２頁、１９７９
年（Ｐａｙｖａｒ、　　ｅｔ　ａｌ、、　　Ｊ、　　Ｂ
ｉ。

Ｃｈｅｍ、、　　２５８．７６３６−７６４２　（１９
７９））参照。

オカヤマ操作法〔オカヤマら、モレキュラー・アンド・
セルラー・バイオロジー　第２巻、第１６１〜１７０頁
、１９８２年（Ｑｋａｙａｍａ、　ｅｔ　ａｔＩｖｌｏ
ｌｃｕｌａｒ　　＆　　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　　３ｉｏ１
ｏｇｙ、　　　２，１６１−１７０（１９８’２）））
に従い、ｃＤＮＡバンクをｒＡ６細胞から得たｍＲＮＡ
により［した。ｃＤＮＡを次いでインキュベートして増
幅用宿主微生物大腸菌に一１２株ＨＢ１ｏｉに組込んだ
。

例　　　　３ 表■のｈｐＧ−Ｃ３Ｆアミノ末端配列に基づき考え出さ
れたハイブリッド形成プローブは、各々が長さ２３塩基
で３個のイノシン残基を有する２４組のオリゴヌクレオ
チドから構成されていた。プローブオリゴヌクレオチド
をカルザースら、ジエネティック・エンジニアリング、
第４巻、第１〜１８頁、１９８２年（（ｃａｒｕｔ、ｈ
ｅｒｓ、　　ｅｔ　ａｌ、、　　ＱｅｎｅｔｉｃＥ　ｎ
ｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、　　４．１−１８（１９８２）　
）の操作に従イＭ造し、ポリヌクレオチドキナーゼでリ
ン酸化（Ｋ　１ｎａｓｉｎａ）することによりｒ−３２
Ｐ　　ＡＴＰで！識した。表■の配列中残基２３〜３０
のメツセンジャーＲＮＡに対応するプローブオリゴヌク
レオチドは、表Ｖに示されている。

表Ｖ ｈｐＧ−ＣＳＦプローブ ”ＧＣＣＣＣＩＣＣ畿ＣＩＣ！：とＴＧ貸ＡＴ石Ｔ’ｒ
”中立性を■に付与したのは、タカハシら、プロシーデ
インゲス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイ
エンス（ＵＳＡ）、第８２＠、第１９３１〜１９３５頁
、１９８５年（Ｔａｋａｈａｓｈｉ、　ｅｔ　ａｌ、　
　ＰｒｏｃＮａｔｌ、　　Ａｃａｄ、　　ｓｃ＋、　　
（ＵＳＡ）、　８２．１９３１−１９３５　（１９８５
）　）及びオーツカら、ジャーナル・オブ・バイオロジ
カル・ケミストリー、第２６０巻、第２６０５〜２６０
８頁、１９８５年（Ｏｈｔｓｕｋａ　　ｅｔ　ａＪ、　
Ｂｉｏｌ、　　Ｃｈｅｍ、、　　２６０．２６０５−２
６０８　（１９８５））の研究公表に基づいていた。し
かしながら、イノシンはＧ又はＴと塩基対形成した場合
には膜安定化効果を有する。タカハシらの場合では、イ
ノシンは、それらが−群として平均化してほぼ中立化す
るに到ることから、中立効果を有するようである（例え
ば、３個はＣと好ましく対形成したが、２個はＴと対形
成し好ましくなかった）。

ＧとのＩ塩基対形成効果を試験するため、コントロール
実験をＮ　−ｍｙｃ遺伝子配列及びクローンを用いて計
画した。Ｎ　−ｍｙｃ　遺伝子から得た配列は、ｈｐＧ
−Ｃ３Ｆプローブで規定されたものと同一の全体的Ｇ及
びＣ含有率を、各コドンの最初の２つの位置で有してい
た。したがって、Ｎ−ｍｙｃ試験プローブは、ｈｐＧ−
Ｃ３Ｆプローブと比較し、同一の長さであり、同一の相
対的仲買にＩを含有し、しかも潜在的に同一の平均Ｔｍ
（６２〜６６℃、３又は４個のイノシン残塁を含有して
いるためではない）を有していた。

２組のＮ　−ｍｙｃ試験プローブを前記力ルザースらの
操作に従い組立てた。表■に示された第１組は、以下の
ものを含んでいた；１．完全対合体の２３ｆｆｉ体；２
．３個の３位置が、■を加えた場合に最悪のケースを生
じるように■で置換されている；３．４個の３位が１で
置換されている。第２組の試験プローブは、全体的な中
立的塩基対形成効果を与え得るイノシン塩基対のよりラ
ンダムな配置を表わすために考え出された。表■に示さ
れた第２！ｌは以下のものを含んでいた；４．Ｃと塩基
対形成する２個のＩ及びＧ塩基対形成する１個の■を有
する：５．Ｉ：Ｇ塩基対たるもう１個のＩを有する４と
同一である。

表■ Ｎ−ｍｙｃ試験ブロー、ブ １、　　”’ＣＡＣＭＣＴＡＴ　ＧＣＣＧＣＣＣＣＣＴ
ＣＣＣＣ”２．５°ＣＡＣＭＣＴＡＴ　ＧＣＩ　ＧＣＣ
ＣＣ工ＴＣ工ＣＣ”３．５“ＣＡ工ＭＣＴＡＴ　ＧＣＣ
ＣＣＣＣＣ工ＴＣ工ＣＣ３′４、　　”ＡＡＣＧＡＧ　
ＣＴＧ　ＴＧＩ　ＧＧＣＡＧＩ　ＣＣＩ　ＧＣ”５、　
　”’ＡＡＩ　ＧＡＧ　ＣＴＧ　ＴＧＩ　ＧＧＣＡＧＧ
ＣＣＩ　ＧＣ”Ｎ−１１ＶＣＤＮＡ配列及びニワトリ成
長ホルモンＤＮＡ配列（陰性コントロール）を含有する
５個のレプリカフィルターを、ハイブリッド形成前に、
減圧オーブン中８０℃で２時間焼いた。すべてのフィル
ターは、ハイブリッド形成時間が６時間のみであること
以外、ｈｐＧ−Ｃ３Ｆプローブに関して例４で記載され
たように、ハイブリッド形成した。フィルターを室温で
３回しかる後４５℃で１回各々１０分間洗浄した。フィ
ルターをガイガーカウンターでモニターした。

Ｎ　−ｎ＋ｙｃプローブ３のフィルターは他の４個のプ
ローブフィルターと比較して非常に弱いシグナルを発し
たため、それ以上洗浄しなかった。５０℃で１０分間洗
浄後、ガイガーカウンターは、プローブ１を１００％標
準として、下記％シグナルを表示したニブローブ２．２
０％；プローブ３（４５℃）、２％；プローブ４．９２
％；及びプローブ５．７５％。

５５℃での洗浄後は、％がニブローブ２．１６％ニブロ
ーブ４．１００％：及びプローブ５．８０％であった。

６０℃での最終洗浄では下記％を表示したニブローブ２
．１，６％；プローブ４．９０％；及びプローブ５．７
０％。

このように、プローブ２及び４のように３個の■が存在
する場合では、シグナルにおいて６０倍までの差違が、
理論的Ｔｍ（Ｉは計算に含まれていない）は〔最悪のｌ
塩基対形成例（プローブ２）及び比較的中立なｌ塩基対
形成例（プローブ４）に関して〕近いにもかかわらず観
察される。

Ｎ　−ｍｙｃ試験ハイブリッド形成により得られた標準
化情報は、より厳格でない洗浄による結果が許容され得
る信頼度を測定するために、下記のように洗浄及びｈｐ
Ｇ−ＣＳＦハイブリツド形成のモニターに際して利用さ
れた。

例　　　　４ ハナハンら、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオ
ロジー、第１６６巻、第５５１〜５８０頁、１９８３年
（）−１ａｎａｈａｎ、　　ｅｔ　ａｌ、、　　Ｊ、　
　Ｍｏ１．　３ｉ。

１６６　５５７−５８０　（１９８３））の操作に従い
、例２で産生されたｃＤＮＡインサート（１ｎｓｅｒｔ
）との組換え体を含む細菌を、寒天プレート上に載置さ
れた２４個のニトロセルロースフィルター（ミリボア（
Ｍ　１ｌｌｉｐｏｒｅ）　、ベツドフォード、マサチュ
ーセッツ〕に拡散した。プレートを次いでインキュベー
トして約１５０．０００個のコロニーを得たが、これを
２４個の他のニトロセルロースフィルターに移してレプ
リカ培養した。レプリカを明瞭なコロニが出現するまで
インキュベートした。フィルター上の細菌を、１０分間
水酸化ナトリウム（０，５Ｍ　＞でわずかに飽和され、
しかる後２分間トリス（１Ｍ）テプロットされ、次イテ
１０分間Ｎ　ａ　ＣＪ　（１，５Ｍ　）含有トリス（０
，５Ｍ　）でプロットされたワットマン３８Ｈ紙上で溶
菌させた。フィルターがほぼ乾燥した後、それらを核酸
ハイブリッド形成前に減圧オーブン中８０℃で２時間焼
いた。ウアールら、プロシーデインゲス・ナショナル・
アカデミ−・オブ・サイエンス（ＵＳＡ）、第７６巻、
第３６８３〜３６８７頁、１９７９年（Ｗａｈｌ、　　
ｅｔ　ａｌ、、　　ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ、　　（ＵＳＡ）　、　７６、３
６８３−３６８７（１９７９））　、及びマニアティス
ら、セル、第８１巻、第１６３〜１８２頁、１９７６年
（！ｙｌａｎｉａｔｉｓ、　ｅｔ　ａｌ。

Ｃｅ１ｌ　　８１．１６３−１８２　（１９７６））。

フィルターを１０×デンハード（Ｄ　ｅｎｈａｒｄｔ）
　０．２％ＳＤＳ及ヒ６Ｘｓｓｃ　７５０ｄ中６５℃で
２時間、前ハイブリッド形成させた。フィルターを６ｘ
ｓｓｃで洗浄し、次いで４つをバッグに入れ、６ＸＳＳ
Ｃ及びＩＯＸデンハード中で１４時間ハイブリッド形成
させた。５０Ｘ　１０　　ＣｐＨｌの３２Ｐ〜標識プロ
ーブ（オリゴヌクレオチド）を有するバッグ当たり、溶
液約１５ｍが入っていた。

ハイブリッド形成後、フィルターを６ＸＳＳＣ（１リツ
トル／洗浄）中で３回室温で各々１０分間洗浄した。フ
ィルターを次いで６ＸＳＳＣ１リツトルにより、４５℃
１５分間で１回洗浄した。フィルターを増強スクリーン
及びコダックＸＡＲ−２フィルムにより一７０℃で２時
間オートラジオグラフイーに付した。このオートラジオ
グラフでは、５個の非常に強いシグナルを含む４０〜５
０個の陽性シグナルが検出された。

最強の５個のシグナル及び別の５個の陽性シグナルを含
む領域をマスタープレートからこすり落とし、同一条件
下同一プローブ混合物を用いて二次スクリーニングに移
した。洗浄操作は、高温洗浄が５５℃１５分間で各々２
回、及びしかる後の６０℃１５分間で１回からなる点で
異なっていた。例３のＮ　−ｌｌ１ｙｃプローブ研究に
基づき、二次スクリーニングでの最終洗浄温度を上げた
が、２４個の２３間体に関する凝集融解温度がＮ　−ｍ
ｙｃプローブの温度に近似した６０〜６８℃であったた
めである。２回目の５５℃での洗浄後、フィルターを湿
潤させたままにし、オートラジオグラフィーに付した。

このオートラジオグラフィーと、６０℃での最終洗浄温
度じ時間をかけた２回目のオートラジオグラフィーとの
比較では、１０個の被試クローンのうち２個だけが５５
℃〜６０℃以上に昇温させた場合にシグナルの実質的損
失をうけないことが明らかになった。

これら２個のクローンは、はぼ同一の長さ及び制限エン
ドヌクレアーゼパターンであることが後に示された。ｐ
ｐｏ２と称される１個のクローンを配列決定のため選択
した。

上記操作で得られた組換えｈＤＧ−Ｃ５ＦｃＤＮＡクロ
ーンのＰｐｏ２の配列決定は、サンガーら、プロシーデ
インゲス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイ
エンス（ｔＪｓＡ）、第７４巻、第５４６３〜５４６７
頁、１９７７年（３ａｎｇｅｒ、　　ｅｔ　ａｐ　ｒＯ
ｃ、　　Ｎ　ａ口、　　Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ、　　（
ＵＳＡ）　、　７４゜５４６３−５４６７　（１９７７
））のジデオキシ法により達成された。−重鎖ＤＮＡフ
ァージＭ−１３は、二重鎖ｃＤＮへクローンの一重鎮Ｄ
ＮＡ鋳型を供給するためのりＯ−ニングベクターとして
使用した。サンガーらの方法により、表ＶＩＩに示され
ているようなアミノＭ翻訳を伴う配列及びポリペプチド
コード領域の相補鎖が明らかとなった。

表■の下記特徴は顕著である。配列の５′末端には、ポ
リＧｃＤＮＡリンカー配列に相当する塩基が示されてい
る。次いで約５個の塩基（Ｎ”と表示されている）が存
在するが、その配列は前にある多数のＧのためにサンガ
ーらの方法によっては容易に明確に決定することができ
なかった。

その後の配列は、ポリペプチドのリーダー配列と推定さ
れる部分をコードする１２個のコドンを表わず。例１に
記載されたｈｐＧ−ＣＳＦ天然単離物のアミノ末端配列
との対応により、ｈｐＧ−Ｃ３Ｆの推定的゛成熟″型に
おける最初のスレオニン残基は＋１で示されている。成
熟ｈｐＧＣＳＦは、示された如り１７４個の残基を有す
ることがその後爪された。パ停止″コドン（○Ｐコドン
、ＴＧＡ）の後に、約８５６塩基の非翻訳３′配列及び
ポリＡ　１１尾部”の多数の八が続く。唯一のＨａｉＡ
Ｉ及びＡｐａＩ制限エンドヌクレアーゼｍ１部位、並び
に２つの３ｔｕ■部位（原核及び真核細胞発現系の組立
てに関して以下で説明されている）も表■に示されてい
る。ポリペプチド中におけるアスパラギン残基の欠損の
ため、Ｎ−グリコシル化のための明確な部位は存在しな
い。３′非翻訳配列末端近くで下線が引かれた６個の塩
基は、潜在的ポリアデニル化部位を表わす。

合計４５０．０００個のクローンの中から上記ハイブリ
ッド形成操作により同定された２つの他のＣＤＮＡクロ
ーンの各々が、転写開始部位以降の全リーダー配列をコ
ードするＤＮＡを含有していなかったことは、注目に値
する。なるほど、３つすべてのｈｐＧ−Ｃ３Ｆクローン
は正確に同一部位の５′領域で集結しており、このこと
は転写されたｍＲＮＡの二次構造がこの部位より先のＣ
ＤＮＡ形成を著しく阻害することを示唆している。実際
には、したがって、オカヤマら、モレキュラー・アンド
・セルラー・バイオロジー、第３巻、第２８０〜２８９
頁、１９８３年（Ｑ　ｋａｙａｍａ、　ｅｔ　ａｔ、　
。

Ｍｏ１．　ａｎｄ　Ｃｅ１１．　　Ｂｉｏｌ、、　　３
．２８０−２８９　（１９８３））に記載され、しかも
ウォンら、サイエンス、第２２８巻、第８１０〜８１４
頁、１９８５年（Ｗ　ｏｎａ　　ｅｔａｔ、、　　５ｃ
ｉｅｎｃｅ、　　２２８．８１０−８１４　（１９８５
））においてＧＩＶＩ−ＣＳＦを単離するために現実に
利用されたＣＤＮＡ発現スクリーニングは、ｈｐＧ−Ｃ
ＳＦ　　ＤＮＡの単離に簡単に利用することができなか
ったが、その理由は、かかる単離系が通常被験クローン
中における全長のｃＤＮＡ転写体の存否に依存している
からである。

上記配列は、微生物宿主におけるｈｐＧＣ３Ｆの直接的
発現を確実化するには、困難である。かかる発現を確実
にするためｈｐＧ−ＣＳＦコード領域には開始ＡＴＧコ
ドンを加えるべきであり、しかもその配列は適切なプロ
モーター／レギュレーターＤＮＡ配列の１１７御下にあ
る部位で形質転換ベクター中に挿入されるべきである。

例　　　　５ この例では、前記例で単離されるようなｈｐＧＣＳＦコ
ードＣＤＮＡを用いてゲノムクローンをスクリーニング
した。λファージヒト胎児針ゲノムライブラリー（ロー
ンら、セル、第１５巻、第１１５７〜１１７４頁、１９
７８年（ｌ　ａｗｎ、　　ｅｔ　ａｌ、、　　ｃｅｌｌ
。

１５、１１５７−１１７４　（１９７８））の操作に従
い製造され、ティーパマニアティス＜　Ｔ　、　Ｍ　ａ
ｎｉａＮｓ）がら入手した〕を、Ｈｇ１ＡＩ及び３ｔＵ
工で切断単離された２つのｈｐＧ−ＣＳＦ　　ｃＤＮＡ
断片（ＨｇｉＡＩ〜Ｓｔｕ■、６４９塩基対；　Ｓ　ｔ
ｕＩ　〜Ｓ　ｔｕＩ、６３９塩基対）からなるニック（
ｎｉｃｋ）翻訳プローブを用いてスクリーニングした。

合Ｊ１約ｓｏｏ、　ｏｏｏ個のファージを１２個のベト
リ冊（１５ｏａ）で培養し、プラークを取出し、ベント
ン／デビソン（Ｂ　ｅｎｔｏｎ　／Ｄ　ａｖｉｓｏｎ）
操作法〔ベントンら、サイエンス、第１９６巻、第１８
０頁、１９７７年（３ｅｎｔｏｎ、　ｅｔ　ａｔ、。

Ｓ　ｃｉｅｎｃｅ、　　１９６．１８０　（１９７７）
）　）によりプローブとハイブリッド形成させた。合計
１２個の陽性クローンが観察された。二次スクリーニン
グにおけるオートラジオグラフィーで最強シグナルを生
じた３個のクローン（１〜３）を、１リツトル培地中で
増殖させ、放射線標識２４ｒ！１体オリゴヌクレオチド
（γ−Ｐ　　ＡＴＰでキナーゼ処理されている）５’　
ＣＴＧＣＡＣＴＧＴＣＣＡＧＡＧＴＧＣＡＣＴＧＴＧ３
’　を用いて制限酵素切断及びサザーンプロット法（３
ｏｕｔｈｅｒｎ　ｂｌｏｔｔｉｎｇ）により遺伝子地図
を作成した。地図作成結果は、単離体１及び３が同一で
あって、単離体２がｈｐＧ−ＣＳＦ遺伝了の５′に付加
した２０００個の塩基を含有することを示していた。し
たがって、クローン２を更に特徴づけるために使用した
。クローン２のＤＮＡをＥＣ０ＲＩで切断して８５００
塩基対のｈｔ）Ｇ−ＣＳＦ含有断片を得、これを次いで
ｐＢ　Ｒ３２２に組込んでサブクローニングし、更に制
限エンドヌクレアーゼ切断、サザーンプロット法、Ｍ１
３サブクロニング及び配列決定により遺伝子地図を作成
した。得られた配列はＶＩＩに示されたとおりである。

ｈｐＧ−ＣＳＦ３１伝子を含有するゲノムＤＮＡの制限
エンドヌクレアーゼ地図（約３．４キロ塩基対）は図１
で詳細に記されている。図１で示された制限エンドヌク
レアーゼは、ＮＣ０Ｉ　、　Ｎ　：　Ｐｓｔｌ、　Ｐ　
：　ＢａｍＨｌ、　Ｂ　：Ａｐａｌ、　Ａ　：　Ｘｈｏ
ｌ、　Ｘ　：及びＫｐｎ、にである。図の下方の矢印は
、ゲノム配列を得るために利用される配列決定方法を示
す。

ボックス領域はｃＤＮＡクローン中の領域であり、点線
の端部ボックスはｃＤＮＡクローン中に存在しないもの
のｍＲＮＡプロット法により同定された配列を表わす。

エキソン配列たるコード配列の同定をノーザン（Ｎ　ｏ
ｒｔｈｅｒｎ）プロット法により実施した。エキソン１
及び２における推定的スプライス部位にまたがる２４逼
体オリゴヌクレオチドプローブ、５’　ＣＡＧＣＡＧＣ
ＴＧＣＡＧＧＧＣＣＡＴＣＡＧＣＴＴ３’を、ノーザン
ブロツ１−法でｈｐＧ−ＣＳＦ　　ｍＲＮＡとハイブリ
ッド形成させた。得たプロットは、エキソン２のオリゴ
ヌクレオチドプローブの場合と同様のサイズ（１６５０
塩基対以下）のｍＲＮＡを示す。このデータは、表■で
示されるＭｅｔ開始コドンを用いたｐＳＶＧＭ−Ｐｐｏ
１ベクター（例９）によるｈｐＧ−ＣＳＦの直接的発現
能と一緒に考え合わされた場合に、エキソン１に含有さ
れるコード配列を規定する。

エキソン２〜５は、ｈｐＧ−ＣＳＦ遺伝子（表■）のｃ
ＤＮＡクローン（Ｐｐｏ２）において得られるコード配
列により規定される。

例　　　　に の例は、ｈｐＧ−Ｃ３Ｆをコードしかつ大腸菌優先コド
ンを含有する人工遺伝子の製造に関する。

簡潔に述べると、用いられたプロトコールは、全般的に
、参考のため本明細書に包含される共有権者アルドン（
Ａｌｔｏｎ）らのＰＣＴ公同第ＷＯ３３／　０４０５３
号明細書の開示に示されているとおりであった。遺伝子
は、成分オリゴヌクレオチドが多数の二重鎖にまず集合
するように考えられ、二重鎖は次いで３つの別個のセク
ションにまとめられた。これらセクションは簡易な増幅
用として考えられ、増幅系から除去された後に、適切な
発現ベクター中に連続的に又は多数の断片結合を介して
まとめることができた。

セクションＩ、ＩＩ及び■の構造は表ＩＸ　−Ｘ　ＩＶ
に示されている。表ＩＸ及びＸに示されたセクション■
の構造において、オリゴヌクレオチド１〜１４は７本の
二重鎖（１及び８；２及び９；３及び１０；４及び１１
；５及び１２：６及び１３ニア及び１４）にまとめられ
た。７本の二重鎖を次いで結合し、表Ｘに示されるセク
ション■を形成した。表Ｘにおいて、セクションエは増
幅・発現ベクターとの結合及びセクション■との結合の
ために用いられる上流Ｘｂａ■付肴端及び下流３ａｍＨ
Ｉ付着端を含有する表■ ことにも着目されるであろう。

ＥＣｈｐＧ−ＣＳＦＤＮＡセクションエＧＡＴＣＣＣＭ
ＧＡＧＡＡＴＧＡＣＣＣＡＧＣＡＧＴ表ＸＩ及びＸ■に
示されるセクション■の構造において、オリゴヌクレオ
チド１５〜３０は８本の二重鎖（１５及び２３：１６及
び２４；１７及び２５：１８及び２６；１９及び２７；
２０及び２８：２１及び２９；２２及び３０）にまとめ
られた。これら８本の二重鎖を次いで結合し、表Ｘ■に
示されるセクション■を形成した。

表ＸＩＩで更に示されるように、セクション■は増幅ベ
クターとの結合及びセクションエとの結合のために用い
られる上流３ａｍＨＩ付着端及び下流ＥｃｏＲＩ付着端
を有する。その下流端部近くでは、セクション■は最後
の結合セクション■及び■に用いられる下流５ＳｔＩ部
位も有している。

表ＸＩ ＥＣｈｐＧ−Ｃ３ＦＤＮＡセクシジン■ＡＡＴＴＣＴＴ
τＧＡＧＣτＣＴＴＣＣ八ＴＣ’ｌ’Ｇ’Ｉ”ｒＧＣＣ
最後に、セクション■は表Ｘ■及びＸＩＶに示されてい
るように組立てられた。この組立てのために、オリゴヌ
クレオチド３１〜４２は６本の二重鎖（３１及び３７：
３２及び３８；３３及び３９　；　３４及び４０；３５
及び４１　：　３６及び４２）にまとめられた。６本の
二重鎖を次いで結合し、表Ｘ■に示されるセクション■
を形成した。表ＸＩＶでも示されているように、セクシ
ョン■は、増幅ベクター、及び少なくともＥＣ０ＲＩ末
端の場合には発現ベクターとの結合のために用いられる
上流Ｂ　ａｍＨＩ　（”１着端及び下流Ｅ　Ｃ０ＲＪ付
Ｗ　Ｅを含有する。しかもセクション■は、セクション
■及び■のＲ終的結合に用いられる上流５ｓｔＩ部位を
有している。

表Ｘ■ ＥＣｈｐＧ　−Ｃ５ＦＤＮＡセクション■ＡＡＴＴＣＴ
ＡＴ’ｒＡＣＧＧＣＴＧＡＧＣＣＡＧＡＴＧＡＣＧセク
ション■で形成されたＸｂａＩ〜Ｂａ１ｌＨＩ断片を、
ＸｂａＩ及びＢ　ａｍＨＩ　ｔ’開環されたＭ　１３ｍ
ｐＨファージベクターに結合する。ベクターを次いでＢ
ａｆｌｌＨＩ及びＥＣ０ＲＩで切断することにより再開
環し、次いでセクション■で形成されたＢａｍＨＩ〜Ｅ
Ｃ０ＲＩ断片と結合する。この段階で、セクション■及
び■は適切な方向で結合された。次いで別ノＭ　１３１
Ｄ１１ベクターをＢａｍＨＩ　〜ＥｃｏＲＩ切断で１７
ｉ１環し１．シかる後セクション■で形成されたＢａｎ
＋１−ＩＩ　〜ＥｃｏＲＩ断片と結合した。

セクションエ及び■含有ベクターをＸｂａＩ及び３ｓＢ
で切断する。同様に、セクション■含有ベクターをＳＳ
ｔ工及びＥＣ０ＲＩで切断する。各々の切断で得る２つ
の断片のうち小断片の両方を、事前にＸｂａＩ及びＥＣ
０ＲＩで開環されたプラスミドｐＣＦ　Ｍ　１１５６に
結合する。この反応の生成物は表Ｘｖに示される連続Ｄ
ＮＡ配列含有の発現プラスミドであって、そのＤＮＡ配
列は大腸菌翻訳開始用のアミノ末端メチオニンコドン（
ＡＴＧ）をもつ完全ｈｐＧ−ＣＳＦポリペプチドをコー
ドしている。

一〇 コ○　　　：Ｉ−コ○　　　ヘト　　　弓ト　　　≧く
ａｕ−＋　　　ａｓｈ　　　ａｓｈ　　　ｖ＋＜　　　
、−＋ｕ　　　、−１ｃ５−ｃ、＋　　　ｗｕ　　　ｑ
ｃ、＋　　　＜ｏ　　　＜ａ　　　ｏａＱ　　○コ　　
コＣ５＞０　　り０ ０　１−１ａ＋　　　ａｓｈ　　　ｓｖ　　　ｎ＋１−
＋＜　　　　（Ｊ）　　　　−ＣＪ　　　　Ｌｌｌｊ−
（Ｊ醤５３ヨ　Ｆ　　肺 ■目Ｎ目　ぎＩ 〉　　８＝　ニゴ　、＝ミ　　二む く　　　べψ　　　ＱＣＪ　　　工Ｑ　　　ベロリ　　
（Ｇ　　コロ　　為ト　　り０ く　　（−Φθ　　−ロ　　ａｌ？ Ｉ−ＬＬＩＬＩ　　　−ＣＪ　　　（５Ｃ５！（Ｊｏ　
００００句＜　０コ９　ロＩ：０ ＋（Ｊ−ｒ”＋＋（Ｊ　　１７１ａｌｆｉ　　ｒ’−一
＜ＬＩＩＩＬ＋　　　＜ロ　　ｌ−２０口υコ１．５− ａ＋−ベ ーロ　　　く 瞬１−ＩＣ５ −＜（ 平ＯＥ４ レ−に ａ＋Ｕべ Ｃｌ１ｌ−１ｈ 弓−ＷＯＣ５ 一〇　ｒ−＋１．ＩＣＪ ベロ　Ｓ　ｋ　ＣＪ Ｐ−１１−１（：（３ 一−Ｉ−１＜ 〉ロ　　ＱｃＪ コｏ　　　ｍ（−＋ Φｈ　　　、−＋ｕ −ロ　　＜Ｑ −＜　　　　：ＩＣ −１−４ａＩｌ−１ 〉ロ　　　　−０ ０＞ｌ−１ロ明ト Ｖ＋＋ＩＱ　　　ｒｚ＋＋＜ 一〇ロ　−：ｌ８ＣＪ いずれの適切なベクターもこのＤＮＡ発現のために使用
することができるが、発現プラスミドｐＣＦ　Ｍ　１１
５６はプラスミドｐＣＦＭ８３６から容易に組立てるこ
とができ、その溝造は公開欧州特許出願第１３６．４９
０号明細書に記載されているｐＣＦ　Ｍ　８３６をまず
ＮｄｅＩで切断し、次いで両方に存在するＮｃ！ｅＩ部
位が破壊されるようにＰｏ１Ｉでプラント末端化する。

次いで、ベクターをＣｌａ工及び３ａｃ［で切断して、
存在するポリリンカーを除去し、しかる後表Ｘｖ■に示
される代替ポリリンカーに結合する。この代替ポリリン
カーは、前記アルドンらの操作に従い組立てることがで
きる。

なお、プラスミドＣＩＣＦＩＶ＋８３６は、ｐＣＦ　Ｍ
　７３６（後述）をＢａｍｆ−ＩＩで切断し、下記の断
片を挿入することによって得られる。

ＢａｍＨＩ　　５ｓｔＴＩ　　　　　　　　　　Ｂａｍ
Ｈｆ５　’　−ＧＡＴＣＣＧＣＧＧＡＴ八ＡＡＴＡＡＧ
Ｔ八Ａへ−３’３’−へ　　ＧＣＧＣＣＴＡＴＴＴＡＴ
ＴＣＡＴＴＧＣＴＡＧ−５’発現ｐＣＦ　Ｍ　１１５６
ブラスミドにおける発現制御はλＰ、ブロモ−クーによ
るが、これ自体が（大腸菌株に１２△Ｈｔｒｐから得ら
れるような）ＣＩ８５７リブレツサー道伝子の制御下に
ある。

例　　　　７ この例は、（Ｍｅｔ　’）　ｈ　ｐＧ　−ＣＳＦｉｌ−
ドＤＮΔ配列によるｈｐＧ−Ｃ３Ｆポリペプチドの大腸
菌発現に関する。使用された配列は、部分的に合成で、
部分的にｃＤＮＡ由来であった。使用された合成配列は
大腸菌優先コドンであった。

表ＶＩＩに示されたｈ　ｐＧ　−Ｃ３Ｆ遺伝子含有プラ
スミドＰｐｏ２をＨｏ１ＡＩ及び３ｔｕ■で切断して、
約６４５塩基対の断片を得たが、この断片は５′末端の
７個のリーダー配列残基コドン及び３′非コード領域の
約１００塩基対をもつく表Ｖｌに示されるような）成熟
ｈｐＧ−Ｃ３Ｆ遺伝子を含有していた。Ｈｃ＋ｉＡＩ切
断ではＰＳｔＩ切断の場合と同一の５′の４塩基付着端
を残し、５ｔｕＩではプラント末端を残す。これにより
、ｐｓｔｒ及びプラント末端形成制限酵素Ｈｉｎｃ　■
で切断されたＭ　＋３ｍｐ８（Ｒ「）に断片を容易に挿
入することができる。Ｍ２Ｓ中で増幅させた後、ｈｐＧ
−ＣＳＦ　　ＤＮＡをＡｐａＩ及びＢａｍ１−ＩＩで切
断することにより摘出したが、これはそれぞれｈｐＧ−
ＣＳＦにおける＋３〜＋５残基コドン間にまたがるＡｐ
ａＩ部位、及びＭ　１３ｍｐ８制限ポリリンカーにおけ
るＨｉｎｃ　ＩＩ部位の゛下流″のＢａｍＨＩ部位にお
いて切断されたものである。ｈｐＧ−Ｃ３Ｆポリペプチ
ドの大腸菌発現を可能にするため、合成断片を下記衣Ｘ
ＶＩに示されるように製造した。

表Ｘ■ ＡｐａＩ 表Ｘ■の分析から調べ得るように、リンカ−は、ＡＩ）
ａＩ付着端、Ｍ）Ｇ−Ｃ３Ｆ７ミノ末端の最初の３個の
残基を特定するコドン（上記Ｍ１３ＤＮＡのＡｐａＩ消
化で削除されたＴ　ｈｒｌ・、　Ｐｒｏ２１　ｅｕ”指
定コドンを回復させ、かつ大腸菌中で優先的に発現する
コドンを採用）、翻訳開始ＡＴＧ。

リポソーム結合部位を付与する２４塩基対配列、及びＸ
ｂａＩ付＠端を有している。

大腸菌発現用に使用される発現ベクターは、１９８５年
４月１０日に公開されたモリス（Ｍｏｒｒｉｓ　）の欧
州特許出願箱１３６，４９０号明細書においてｔ）　Ｃ
Ｆ　Ｍ　５３６として記載されたベクターである（更に
、ｐＣＦ　Ｍ　５３６含有の大腸菌ＪＭ１０３．ブタペ
スト条約に基づく寄託における受託番号、Ａ　Ｔ　ＣＣ
３’１１９３４参照）。簡単にいえば、まずプラスミド
ＤＣＦＭ５３６をＸｂａ■及びＢ　ａｍＨＩ　ｒ切断し
た。上記ｈ　ｐＧ　−Ｃ３Ｆ断片（ＡＤａＩ／ＢａｍＨ
工）及びリンカ−（ＸｂａＩ／ＡＩ）ａＩ）を次いでそ
れに結合し、プラスミドｐ５３６　Ｐｐｏ２を形成した
。

プラスミドｐ５３６　Ｐｉ）０２を、Ｃｌ８５７”伝子
含有プラスミドｐＭＷ１　（ブタペスト条約に基づく寄
託における受託番号、Ａ　Ｔ　ＣＣＮｏ、３９９３３）
で予め形質転換された大腸菌ＡＭ　７株のファージ耐性
変異体に組込んだ。形質転換は、Ｄ　ＣＦ　Ｍ　５３６
前駆体プラスミドに担持された抗生物質（ａｍｐ＞耐性
マーカー遺伝子に基づき確認した。ＬＢブロス（アンピ
シリン５０μｇ／ｄ）中での細胞培養物を２８°Ｃに維
持し、八〇ｏｏ−０，５の培養細胞増殖時において培養
物を温度４２℃に３時間上げて、ｈｐＧＣＳＦ発現を誘
導した。培養物の最ｎＯＤはＡ　　　＝１．２であった
。

形質転換細胞によるｈ　ｐＧ　−Ｃ３Ｆ発現レベルは、
クマシーブルー色素で染色されたＳＤＳポリアクリルア
ミドゲルにより、総細胞タンパク質３〜５％と評価され
た。

細胞をＪ　Ｓ　−４，２０−ター中３５００ｘびで１０
分間遠心分離して回収した。水中２５％（Ｖ／Ｖ）の細
胞をフレンチ・プレッシャー・セル（Ｆ　ｒｅｎｃｈＰ
ｒｅｓｓｕｒｅ　Ｃｅ１ｌ）に１０，０００ｐｓｉ　　
Ｃ７００に’Ｊ／ｃｉ）で３回通して破壊した。破壊細
胞懸濁液をＪ　Ａ　−２０ローター中１０，０ＯＯＸ　
ｇで１５分間遠心分離した。ベレットを水に再懸濁し、
ｐＨ８，７の１％ラウリン酸５０ｍＨｌ−リス中に総タ
ンパク質濃度約５ｍ！ｇ／ｍｅで溶解させた。溶解ベレ
ット物質を１５，０００ｘびで１０分間遠心分離し、上
澄にＣｕＳＯ４を２０　ｍ　Ｎまで加えた。１時間後、
この試料を、例１（Ｂ）の操作に従い精製するため、容
量及び濃度を調整して、Ｃ４ＨＰＬＣカラムに充填した
。

非右機物含有緩衝液中で調製された更に多聞のｈｐＧ−
Ｃ３Ｆを得るために第二の精製法が開発された。この物
質はイン・ビボ研究に適する。細胞ペースト１５０びを
１ｍＨＤＴＴ約６００−に再懸濁し、約７０００ｐｓｉ
　（４９０／（ｇ／ｃｆｆｌ）でマントン・グアリン（
Ｍａｎｔｏｎ　Ｇｕａｌｉｎ）ホモジナイザーに４回通
した。破壊ｎ胞懸濁液を１０，０ＯＯＸ　ｇで３０分間
遠心分離し、ベレットを１％デオキシコール酸、５＋＋
＋ＨＥＤＴＡ、５ｍＨＤＴＴ及び５０＋＋＋Ｈト’Ｊ　
ス（７）　ＤＨ９（７）４００　ｄに再懸濁した。この
懸濁液を室温で３０分間混合し、１０，０ＯＯｘ　ｇで
３０分間遠心分離した。ベレットを本釣４００ｎ辺に再
懸濁し、１０，０ＯＯｘ　ｇで３０分間遠心分離した。

ベレットを２％ザルコシル及び５０ｍＨトリスｐ１１８
の　１００ｍｘに溶解した。ＣｕＳＯ４を２０μＨまで
加え、混合物を室温で１６時間攪拌し、しかる後、２０
０００Ｘ　９で３０分間遠心分離した。上澄にアセトン
３００ｄをハＵえた。この混合物を氷上に２０分間おき
、しかる後５ｏｏｏｘ　ｙで３０分間遠心分離した。ベ
レッ］−をｐ１１４の６Ｍグアニジン及び４０ｍＭ酢酸
ナトリウムの２５０−に溶解し、平衡化された１２００
ｄのＧ−２５カラムに充填し、ｐｌ＋５．４の２０ｍＭ
酢酸ナトリウムで操作した。ｈｐＧ−ＣＳＦビーク（約
４００ｄ　）をプールし、ｐＨ５，４の２０ｍＭ酢酸ナ
トリウムで平衡化された１５艷の０Ｍセルロースカラム
に加えた。充填後、カラムを６０艷のｐｔ＋５．４の２
０ｍＭ酢酸ナトリウム及び２５ｍＨ塩化ナトリウムで洗
浄し、しかる後カラムを２００ｄのｐＨ５，４の２０ｍ
Ｍ酢酸ナトリウム及び３７ｍＨ塩化ナトリウムで溶出さ
せた。この溶出液１５０ｄを１０７に濃縮し、平衡化さ
れた３００威のＧ−７５カラムに充填し、ｐＨ５，４の
２０ｍＮ酢酸ナトリウム及び１００ｍＨ塩化ナトリウム
で操作した。ピーク画分３５ｄをプールし、フィルター
滅菌した。ｈｐＧ−ＣＳＦの最終濃度は１．５ｆｎ９／
ｉであったが、ゲル分析で測定した場合純度９５％以上
であり、ｈ　ｐＧ　−Ｃ３Ｆ　０．５ｍｇニツき発熱付
物質を０．５ｎｇ以下で含有していた。発熱付物質レベ
ルは、カブ１〜ガニ遁走細胞溶離物（ＬＡＬ）試験キッ
ト〔エム・ニー・バイオプロダクツ（Ｍ。

Ａ　、　Ｂ　１ｏｐｒｏｄｕｃｔｓ）　、ウォーカース
ピル、メリーランド〕により測定した。

例　　　　８ この例は、１７．３６．４２．６４及び７４位に存在す
るシスティン残塁が各々適切なアミノ酸残基で置換され
たｈｐＧ−ＣＳＦ類縁体を産生ずる組換え方法の利用に
関する。

１９８５年２月２８日に公開されたスープ（Ｓｏｕｚａ
）らの公開ＰＣＴ出願第Ｗ○８５１００８１７号明細書
の特定部佼突然変異誘発は、下記表ＸＶＩＩに示された
大きさが２０〜２３塩基の合成オリゴヌクレオチドを用
いて、下記プラスミドｐ５３６　ＰＩ）０２の（ＭＣ！
ｔ−１）コードＤＮＡ上で行なわれた。オリゴヌクレオ
チド１は（Ｓｅｒ１７）　ｈ　ｐＧ−ＣＳＦコード遺伝
子の形成が可能で、オリゴヌクレオチド２は〔５ｅｒ３
６〕ｈＤＧ−Ｃ３Ｆの形成が可能であった。

オリゴヌク レオチド 表Ｘ■ 配　　　　列 ５’−ＣＴＧ　ＣＴＣＡＡＧ　ＴＣＣＴτＡ　ＧＡＧ　
ＣＡＡ　ＧＴデ３１３’−ＧＡＧ　触Ｇ　ＣＴＧ　ＴＣ
Ｔ　ＧＣＣＡｃｅ　ＴＡＣＡ−３’５’−ＴＡＣＡＪＧ
　ＣＴＧ　ＴＣＣＣλＣＣＣＣＧＡＧ−３’５’−ＴＧ
Ａ　　ＧＣＡ　　ＧＣＴ　　ＣＣＣＣＣＡ　　ＧＣＣＡ
Ｇ−３１５’−ＣＴＧ　ＧＣＡ、ＧＧＣＴＣＣＴＴＧ　
ＡＧＣＣＡＡ−３’Ｃｙｓから３ｅｒへの限定的突然変
異誘発は、鋳型としてｐ５３６　ｐｐｏ２から単離され
たＸｂａＩ−Ｂａｍｌ−ＩＩ　　ｈＤＧ−Ｃ３Ｆ断片含
有（７）　Ｍ　１３ｍｐｌＯヲ用いて実施した。ＣｙＳ
　−ｓ　ｅｒ置換体含有の各Ｍ　＋３ｍｐ１０由来のＤ
ＮＡをＸｂａＩ及びＢａｍ）］Ｉで処理した。得た断片
を発現ベクターＤ　ＣＦ　Ｍ　７４６に組込んでクロー
ニングし、発現産物を例７のように単離した。

プラスミドｐＣＦ　Ｍ　７４６は、１９８５年２月２８
日に公開されたモリス（Ｍ　ｏｒｒｉｓ）の公開ＰＣＴ
出願第Ｗ　Ｏ８５１００８２９号明細書に記載されてい
るように、Ｃ１ａＩ及びＢａｍＨＩでプラスミドｐ　Ｃ
Ｆ　Ｍ　７３６を切断し、存在するポリリンカーを除去
し、下記ポリリンカーで置換することにより組立てるこ
とができる。

表ＸＩＸ なお、ｌ）　ＣＦ　Ｍ　７３６は、ｐ　ＣＦ　Ｍ　５３
Ｇ（Ａ　Ｔ　ＣＣ３９９３４）から、次の手順によりｌ
）ＣＦＭｆ３３Ｇを経由し、組立てることができる。ま
ず、Ｉ）　ＣＦ　Ｍ　Ｓ３６をＥＣｏＲＩ部分的切断及
び３ｓｔ■切断することにより、アンピシリン耐性遺伝
子配列及び安定化配列（Ｄａｒ）を欠失させた後、ＥＣ
ｏＲＩ部位は、リンカ−によってＡａｔ■部位に変換す
る。一方、プラスミドＴｎ５（Ｂｅａｋ等のＧｅｎｅ、
　１９．　ｐ　３２７−３３６（１９８２）あるいはＡ
ｕｅｒｓｗａｌｄ等のＣｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇｌｌａｒ
ｂｏｒ　Ｓｙｍｐ、Ｑｕａｎｔ、Ｂｉｏｌ、、４５　Ｄ
１０７−１１３　（１９８１）に全塩基配列が示されて
いる。）から、カナマイシン耐性遺伝子配列を含むＳｍ
ａＩ　／　Ｈｉｎｄ　ｍ断片領域を、３ＳｔＩリンカ−
を３ｍａ■粘着末端に、且つＮｄｅニリンカーをＨｉｎ
ｄ　Ｉｎ粘着末端に付加することにより、５ｓｔＩ／Ｎ
ｄｅＩ断片として得る。また、ｐＳ　Ｃ１０１（受託番
号、ＡＴＣＣ３７０３２）から、ｐａｒ逍伝子を含むｌ
−１ｉｎｃＩ［／△ｖａ工断片領域を、１−ｉｉｎｃＴ
Ｉ部位は最初に３ａｌＩリンカ−で次いでΔａｔ■リン
カーで処理し、また、Ａｖａ■部位は最初にＢａｍ１−
ＩＩリンカ−で次い′Ｃ−ＮｄｅＩリンカ−で処理し、
Ａ　ａｔＩＩ　／　Ｎ　ｄｅｌ断片として得る。

ｐＣＦＭ５３６の大きな断片（ＡａｔＩ［／５ｓｔＩ　
）、カナマイシン耐性遺伝子の断片（ＳｓｔＩ／Ｎｄｅ
Ｉ）およびｐａｒ遺伝子断片（Ａａｔ］Ｉ／ＮｄｃＩ　
）　ｅｌセ合わせて結合し、ｐＣＦＭ６３６が（１られ
る。

ｐＣＦＭ６３６をＡａｔｌｌ及びＸｂａＩにより切断後
、下記のＡａｔＩＩからＸｂａＩまでの断片を挿入し、
ｐＣＦ　Ｍ　７３６を得る。

ＡａｔＩＩ Ｃ１ａｌ　　Ｘｂａｌ 本発明のＣｙｓ−Ｓ　ｅｒ　（ｃｙＳがらｓｃｒヘノ）
類縁体のＮ製操作において、細胞ペースト約１０〜１５
ｇを１　ｍＨＤ　Ｔ　Ｔ　４０＃！！！に再懸濁し、フ
レンチ・プレッシャー・セルに１０，０００ｐｓｉ　（
７００に９／ｃｆｆｌ）　１３回通した。破壊細胞懸濁
液を１００ＯＸ　ｇで３０分間遠心分離した。ペレット
を０１１９の１％００　Ｇ　、　　５ｍＨＥＤＴＡ、　
　５ｍＨＤＴＴ、　５０ｍｔＨ−リスに再懸濁し、室温
で３０分間混合した。混合物を１０，０００ｘ　ｇで３
０分間遠心分離し、Ｈ２Ｏ４０成に再懸濁し、１０．０
ＯＯｘ　ｇで３０分間再遠心分離した。ベレットを１）
＋１８の２％ザルコシル、５０ｍＨＤＴＴ、　５０ｍＨ
ｔ−リスの１０蛇に溶解した。１時間混合後、混合物を
２０．０ＯＯＸ　９で３０分間遠心分離して清澄化し、
しかる後平衡化された３００ｄのＧ−７５カラムに充填
し、ｐＨ８の　１％ザルコシル、５０ｍＨトリスで操作
した。

類縁体含有画分をプールし、少なくとも１日間空気にさ
らして空気酸化さけた。最終濃度は０５〜５ｍ９／威の
範囲であった。

例　　９ この例において、哺乳動物細胞発現系は、ｈｐＧ−Ｃ３
Ｆ　　ＤＮＡの活性ポリペプチド産物がへｌｉ　’ｉ’
ｌ、動物細胞（ｃＯ８−１，ＡＴＣＣＣＲＬ１Ｇ５０）
中で発現されかつそこから分泌されるか否かを（Ｉｇ認
するために、工夫された。この系は、ウォンら、サイエ
ンス、第２２８巻、第８１０〜８１５頁、１９８５年（
Ｗｏｎｇ、　　ｅｔ　ａｌ、、　　３ｃｉｅｎｃｅ２２
８　、８１０−８１５　（１９８５））及びり−ら、プ
ロシーデインゲス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オ
ブ・サイエンス（ＵＳＡ）　、第８２巻、第４３６０〜
４３６４頁、１９８５年（ｌｅｅ、　　ｅｔ　ａｔ、、
　　ｐｒｏｃ、　　Ｎａ口。

Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ、　　（Ｕ　ＳＡ）　、　３２．
４３６０−４３６４（１９８５））におけるヒトＧＭ−
Ｃ３Ｆに屈する残塁配列を有したリーダーポリペプチド
の後に位置して（Ａｌａｌ）　ｈｌ）Ｇ−ＣＳＦをＤ−
ド−ｆる、部分的合成部分的ＣＤＮ八由へ構造体の発現
分泌プロセッシングを介して、ｈ　ｐＧ　−ＣＳＦポリ
ペプチド類縁体を分泌させるように考え出された。

本発明のポリベブヂド産物の予備的発現研究のために使
用される発現ベクターは、ウィルス性プロモーター／レ
ギュレーターＤＮＡ配列の制御下で挿入外来性ＤＮＡを
哺乳動物細胞発現すると共に１４１ｉ乳勅物細胞及び大
腸菌の双方において自律複製するように考え出されたｐ
Ｂ　Ｒ３２２及び５Ｖ４０ＤＮＡの双方を組込んでいる
゛シャトル（５ｈｕｔｔ　ｌｅ）”ベクターであった。

大腸菌Ｈ８１０１に担持されたこのベクターＤＳＶＤＭ
−１９は１９８５年８月２３日にアメリカン・タイプ・
カルチャー・コレクション、１２３０１パークローン・
ドライブ、ロックビル、メリーランドにブタベスト条約
に基づいて寄託され、受託番号ΔＴＣＣ第５３２４１号
が付された。

発現ベクター組立てに必要な具体的操作は下記のとおり
であった。リーダーコードＤＮＡ配列を下記衣ＸＸに示
したように合成した。

表　ＸＸ ３’　−ＡＧＧ　’Ｉ’ＴＧ　ＴＧＧ　ＴＡＣＡＣＣＧ
ＡＣＧＴＣＴＣＧ　ＧＡＣＧＡ、ＣＧＡＧ　ＡＡＣＣＣ
Ｇ　ＴＧＡ　ＣＡＣＣＧＧ　ＡＣＧ　ＴＣＧ　ＴＡＧ　
ＡＧＡ　ＣＧＴ　ＧＧＧ　ＧＡＣ＝５＋梗旦 表ＸＸに示されているように、配列は、Ｈｉｎｄ■及び
Ａｌ）ａＩ付着端、及びヒトＧＭ−Ｃ３Ｆの“リーダー
”に属する１７個のアミノ酸残基のコドンを有している
。アラニン残基、プロリン残基及びロイシン残基を特定
するコドンが続いている。

プロリン及びロイシン残基はＭＧ−ＣＳＦの＋２及び＋
３位に存在するアミノ酸の？Ｕ　製で、一方アラニン残
基はｈｌ）Ｇ−Ｃ３Ｆ以外のＧＭ−Ｃ３Ｆのｊ用始アミ
ノ末端（＋１）残基の複製である。スレオニンのアラニ
ンによる胃換は、ＧＭ−ＣＳＦ分泌プロセッシングに通
常伴う細胞メカニズムによるＧＭ−Ｏ３Ｆリーダーの適
切な宿主細胞パブロセッシング・オフ（ｐｒＯｃ（！５
ＳｉｎＱ　０ｆｆ）　”　＠促進させるために考え出さ
れた。

プラスミドｐＳＶＤＭ−１９をＫｐｎ、Ｔｒ切ｉｂ、そ
の部位をフレノウ酵素でプラント末端化した。次いでＤ
ＮＡ＠Ｈｉｎｄｌｌｌで切断した。得られる大断片を表
■に示されるＨｉｎｄ　ｍ／　ＰＶｕｌＩ断片（Ｈｉｎ
ｄｌＩＩ断片及びＰｖｕ［での部分的切断から１ｑる２
番目に大きな断片としてプラスミドＰＩ）０２から単離
された）とｄ合して結合し、プラスミド０３Ｖ−Ｐｐｏ
ｌを形成した。表ＸＸの人工ＧＭＣ３Ｆリーダー配列断
片を次いで（Ｈｉｎｄ　ｍ及び△ｐａＴｒ切断後の）ｔ
）ＳＶ−ＰＩＩＯＩに結合し、プラスミドＤＳＶＧＭ−
Ｐｐｏｌを１ユた。

プラスミドｐｓＶＧＭ−Ｐｏｏｌ　ＤＮＡのリン酸カル
シウム沈降物（１〜５μｇ）を、ウィグラーら、セル、
第１４巻、第７２５〜７３１頁、１９７８年（Ｗｉｇｌ
ｅｒ、　ｅｔ　ａｌ、、Ｃｅ１ｌ、　　１４．７２５−
７３１　（１９７８））に実質的に記載されているよう
なＣＯ８−１細胞の２個の６０　ｍｍプレートに組込ん
だ。コントロールとして、プラスミドｌ）ＳＶＤＭ−１
９もＣＯ８−１細胞に組込んだ。組織培養上澄を形質転
換後５日月に回収し、ｈ　ｌ）Ｇ　−ＣＳＦ活性につい
て試験した。培養上澄からの（Ａｌａ’　〕ｈｐＧ−Ｃ
ＳＦ収世は、１〜２．５μ７／にであった。

ＣＯ３−１！ＩＩＩ胞における（Ａｌａ’〕ｈｐＧ−Ｃ
ＳＦａ物コードプラスミドｐＳＶＧＭ−ＰＩ）０１の上
首尾な発現の後、ヒトＧＭ　−Ｃ３Ｆリ一ダー配列を含
む一方で、スレオニン残１（ｈｐＧ−ＣＳＦの１位に元
来存在する）のコドンをその位置のアラニンのコドンに
代わって有する他のべり夕−を知立てた。簡単に言えば
、オリゴヌクレオチドが特定部位の突然変異誘発（ＳＤ
Ｍ）用に合成された＜５’　ＣＡＧＣＡＴＣＴＣＴＡＣ
ＡＣＣＴＣＴＧＧＧ）　。ｐｓＶＧｆｖｌ　−Ｐｐｏｌ
におけるＨｉｎｄｌＩ［−ＢａｍＨＩ　　ｈｐＧ−Ｃ３
Ｆ断片をＳＤＭ用にＭ　１３ｍｐ１０と結合した。１位
にＴｈｒコドンを有する新規合成ｈ”ｐｃ−ｃｓＦ＝伝
子をＨｉｎｄ　ｍ及びＥＣ０ＲＩで切断して単離した。

断片を次いで、同一の２つの制限エンドヌクレアーゼに
よる切断から１ｑられたｐＳＶＤＭ−１９に組込んで複
製した。

得られるベクターｐＳＶＧＭ　−ＰＩ）Ｏ（Ｔｈｒ）　
をｃ○Ｓ細胞に組込んで形質転換したが、培養上澄中で
測定されるｈｐＧ−ＣＳＦの収量は１〜５μ９／威の範
囲であった。

最後に、単離法が例５に記載されているゲノム配列を用
いて、ｈＤＧ−Ｃ３Ｆの哺乳動物細胞発現用の発現ベク
ターを形成した。更に詳しくは、ｐＳＶＤＭ−１９をＫ
ｐｎＩ及びＨｉｎｄ　ｍで切断し、大断片を表ＸＸＩに
示されるＨ　ｉｎｃ　Ｉ［［及びＮｃｏＩ粘着端粘着金
含有合成リンカ囲者結合に使用した。

エキラン１含有ＮｃｏＩ　−ＢａｍＨＩ断片はｐＢＲ３
２２（８５００ｈ　ｏ　Ｇ　−ＣＳ　Ｆゲノムサブクロ
ーン）がら単離し、エキラン２〜５含有ＢａｍＨＩ　−
ＫｐｎＩ断片はプラスミドｐＢＲ３２２（８５００ｈ　
ｐＧ−ＣＳＦゲノムサブクローン）から単離した。得ら
れる哺乳動物発現ベクターｐｓＶ／ｑｈＧ−Ｃ３Ｆ＋、
を形質転換ＣＯ８細胞から１〜２．５μ３／成のｈｐＧ
ＣＳＦを産生した。

表ＸＸＩ Ｎｅｏ工 例　　　　１０ この例は、本発明の組換えポリペプチド産物の物理的及
び生物学的性質に関する。

１、分子量 例７に３３ける大腸菌発現の絹換えｈｐＱ−Ｃ３Ｆ産物
はく表Ｖｌの演綾的アミノ酸分析から予測されるように
）還元ＳＤＳ　−ＰＡＧＥで測定した場合の見掛分子量
が１８８キログルトンであったが、一方例１で記載した
ようにしてｙＪ製された天然単離体は見掛の分子量が１
９．６キロダルトンであった。天然単離体と会合したＮ
−グリカン類の存在は、表Ｉ／Ｈのｈｃ＋Ｇ−ＣＳＦ−
次配列中にアスパラギン残基が欠１ｆｌ　ｔ、ているこ
とがら、実際」−無視することができ、したがって、操
作は○−グリカン類が天然単離体及び非グリコシド組換
え産物間の分子子差の原因であるか否かを調べられるよ
うに工夫した。天然中離物質約５μ７をノイラミニダー
ゼ〔カルビオケム（ｃａｌｂｉＯｃｈｅｌｎ）、ラホラ
、カリフォルニア〕で処理し、試料０．５μ９を取出し
、残留物質を０−グリカナーゼ〔エンド−Ｘｎ−アセチ
ルガラクトースアミニダーぜ、ジエンザイム（Ｇ　ｅｎ
ｚｙｍｅ　＞　、ボストン、マサチューセリン）　４ｍ
Ｕと３７℃でインキュベートした。一部をインキュベー
トの０．５．２及び４時間後に取出した。

これら試料を大腸菌由来組換え物質と並べて５ＤＳ−Ｐ
ＡＧＥに付した。ノイラミニダーゼ処理後、単離体の見
掛分子量は１９．６キログルトンから１９．２キロダル
トンに変わったが、このことはシアル酸残基の離脱を示
唆する。Ｏ−グリカナ−ぜ処理の２時間後、分子量は１
８．８キロダルトンに変わったが、これは大腸菌由来物
質の見掛分子量と一致する。ノイラミニダーゼ及びＯ−
グリカナーゼに対する炭水化物構造体の感受性から判断
すると炭水化物成分として下記構造体が示唆される二Ｎ
−アゼチルノイラミン酸−α（２−６）ガラクトースβ
（１−３）　Ｎ−アセチルガラクトサミン−Ｒ（Ｒはセ
リン又はスレオニンである）。

２．３日−チミジン取込み ヒト骨髄細胞の増殖誘導を３Ｈ−チミジンの取込み増加
に基づき分析した。ｎ康ドナー者のヒト骨髄をフィコー
ル−ハイバック（Ｆ　ｉｃ。

ＨＶｐａｑｕｅ）　（１，０７７ｙ　／　ｍｌ　、ファ
ルマシア）による密度分離に付し、低密度細胞を１０％
牛脂児血清及びグルタミンペニシリン・ストレプトマイ
シン含有のイスコブ培地（Ｇｉｂｃｏ　（ギブコ）］に
懸濁した。次いで、ヒト骨髄細胞２Ｘ　１０’個を９６
個の平底ウェルプレート中コントロール培地又は例７の
組換え大腸菌物質と一緒に３７℃空気中５％Ｃ○２で２
日間インキュベートした。試料を単複して分析したが、
）は度は１０，０００倍以上異なっていた。培青物に次
いで　Ｈ、チミジン〔ニュー・イングランド・ヌクレア
（Ｎ　ｅｗ　　Ｅ　ｎｇｌａｎｄ　　Ｎ　ｕｃｌｅａｒ
）、ボスマン、マサチューセリン）０．５μＣｉ／ウェ
ルを加えた。　Ｈ−デミジン取込み母をベンブユアら、
ブラッド、第６１巻、第７８１頁、１９８３年（Ｖｅｎ
ｔｕａ、　ｅｔ　ａｔ、、　　３１ｏｏｄ、　６１．７
８１　（１９８３））−に記載されているように測定し
た。この分析において、ヒトｈ　ｐＧ　−ＣＳＦ１ｍ体
は、コントロール上澄よりも約４〜１０倍高いレベルで
、ヒト骨髄細胞中に　Ｈ−チミジンを取込まゼることが
できる。例７の大腸菌由来のｈ　ｐ　Ｇ　−ＣＳ　Ｆ物
質も同様の性質を有していた。

２回目のヒ１へ骨髄細胞増殖研究は、例って製造された
形質転換Ｃ０８−１細胞の培養培地を用いて実施され、
同様の結果を与えたが、このことはコードされたポリペ
プチド産物が活性物質として培地中に実際に分泌される
ことを意味する。

３、ＷＥＨＩ−３８Ｄ＋分化誘導 マウス骨髄単球性白血病細胞ＷＥＨＩ−３ＢＤ゛の分化
を誘導する組換え大腸菌由来物質の能力を、メトカーフ
、インターナショナル・ジャーナル・オブ・キャンサー
、第２５巻、第２２５差、１９８０年（Ｍｅｔｃａｌ（
［ｎｔ、　　Ｊ、　　Ｃａｎｃｅｒ、　　２５゜２２５
　（１９８０１）に記載されているように、半固体寒天
培地中で分析した。組換えｈ　ｐ　Ｇ　−ＣＳ　Ｆ産物
及び培地コントロールを３０℃空気中５％Ｃ○２で７日
間６０個以下ｆ７）ＷＥＨＩ−３Ｂ　　Ｄ＋細胞／ウェ
ルと一緒にインキュベートした。試料を２４個の平底ウ
ェルプレート中でインキュベー１−シたが、濃度は２０
００倍以上異なっていた。コロニーを未分化、部分的分
化又は全部分化のコロニーに分類し、コロニー数を顕微
鏡で計測した。大腸菌組換え物質は分化をＷ　”１する
ことが判明した。

４、ＣＦＵ−ＧＭ、ＢＦＵ−Ｅ及びＣＦＵ　−ＧＥＭＭ
分析 多分化能性ヒトＧ−ＣＳＦ　（ｈｐＧ−Ｃ３Ｆ）の天然
単離体及び組換え多分化能性ヒトＧＣＳＦ　（ｈｐＧ−
ＣＳＦ）は、ヒト骨髄細胞を増殖かつ分化させることが
判明した。これらの活性は、ＣＦＵ−ＧＭ（ブロックス
マイヤーら、エクスベリメンタル・ヘマトロジー、第５
巻、第８７頁、１９７１年（Ｂｒｏｘｍｅｙｅｒ、　ｅ
ｔ　ａｔ、、　　ＥＸＤ、　　Ｈｅｍａｔｏ１５　　８
７　（１９７１）　　）　　）　　、Ｂ　Ｆ　Ｕ　−Ｅ
、及びＣＦＵＧＥＭＭ試験法（ルーら、ブラッド、第６
１巻、第２５０頁、１９８３年（Ｌ　ｕ、　　ｅｔ　ａ
ｌ、、　　Ｂｌｏｏｄ、　　６１２５０　（１９８３）
）　）により、健康ヒトボランティアの低密度非付着性
骨髄細胞を用いて測定した。各々ＳＯＯ単位ｆ７〕ｈｐ
Ｇ−ＣＳＦ又はｒｈｐＧ−ＣＳＦを用いたＣＦＵ−ＧＭ
、ＢＦＵ−Ｆ及びＣＦＵ−ＧＥＭＭ生物学的活性の比較
は、下記表ＸＸ■に示されている。

すべてのコロニー分析は、低密度非付着性骨髄細胞を用
いて実施した。ヒト骨髄細胞をフィコールハイパツク（
密度１．０７７９／　ｃｍ　３、ファルマシア）による
密度分離に付した。低密度細胞を次いで牛胎児血清含有
のイスコブ腟正ダルベツ−１（Ｄ　ｕｌｂｅｃｃｏ）培
地に再懸濁し、ファルコン組織培養皿（Ｎｏ、３００３
　、ベクトン・デイケンソン（３ｅｃｔｏｎ　［）　１
ｋｅｎｓｏｎ）コッキーズビル、メリーランド〕上に付
着させるために３７℃で１５時間入れておいた。

表ＸＸ■ ＣＦＵ−ＧＭ　　　　ＢＦＵ−Ｅ　　　　ＣＰＵ−ＧＥ
ＭＭ培地　　　　０±０２６±１　０±０ 天然 ｈｐＧ−Ｃ３Ｐ　　８３±５．４　８３±６．７４±０
ｒｈｐＧ二Ｃ３Ｐ　　　８７±５　　　　８１±０．１
　　６　±２培地コントロールは、１０％ＦＣ３，０，
２ｍＨヘミン及び組換えエリスロボエチン１単位含有イ
スコブ修正ダルベツコ培地であった。

ＣＦＵ−ＧＭ分析の場合では、標的細胞は、補充マツコ
イ（ＭｃＣｏｙ）５Ａ培地及び１０％熱不活化生胎児血
清を含有する０、３％寒天培地１ｄ中１×１０５個で培
養した。培養７日目、培養物のコロニー（凝集物塵たり
細胞数４０以上）について＝１数し、形態を観察した。

コロニー数は、４個の同一プレートから測定される平均
±ＳＥＭとして示されている。

ＢＦＵ−Ｅ及びＣＦＵ−ＧＥＭＭ分析の場合では、細胞
（１ｘ１０！ｉ）をイスコブ修正ダルベツコ培地〔ギブ
コ（Ｇｉｂｃｏ））、０．８％メチルセルロース、３０
％牛脂児血清、０．０５ｎＨ２−メルカプトエタノール
、０．２１１１）ｌヘミン及び組換えエリスロボエチン
１単位の混合物１ｄに加えた。皿を５％Ｃ０２及び５％
０２湿気雰囲気中でインキュベートした。

レミング・バイオインスツルメンツ（Ｒｅｍｉｎｇ１３
　ｉｏｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）　（シラキュース（Ｓ
　ｙｒａｃｃｕｓｅ）、ニューヨーク〕の酸素減少器に
より低酸素圧にした。コロニーをインキュベート１４日
後に計測した。

コロニー数は、２個の同一プレートから測定される平均
上Ｓ　Ｅ　ｌｖｌとして示されている。

ＣＦＵ−ＧＭ分析で形成されたコロニーは、すべて、ク
ロロアセテートエステラーゼ陽性でかつ非特異的エステ
ラーゼ（α−ナフチルアセテートエステラーゼ）陰性で
あることが判明し、顆粒球型のコロニーと一致した。天
然ｈ　ｐＧ　−ＣＳＦ及びｒ　ｈ　ｏＧ　−ＣＳＦは双
方とも、ＣＦＵ−ＧＭ分析における連続希釈により分析
した場合、約１Ｘ　１０”　Ｕ　／　ｍ３純粋タンパク
質の特異的活性を有することが判明した。表ＸＸＩ［の
ＢＦＵ−Ｅ及びＣＦ　ｊＪ　−Ｇ　Ｅ　Ｍ　Ｍデータは
、３つの別個の実験を表示しており、天然ｈｐＧ−Ｃ３
Ｆに関し過去（ζ報告されたデータと類似する。ｒｈｐ
Ｇ−ＣＳＦが大腸菌中で産生されていることから、極め
て純粋でありかつ池の潜在的哺乳動物成長因子を含有し
ないことに注目することはｍ要である。このように、ｒ
ｈｐＧ−ＣＳＦは、組換えエリスロボエチンの存在下で
加えられた場合に、混合コロニ形成（ｃＦＵ−ＧＥＭＭ
）及びＢＦＵ−Ｅを補助することができる。

５．１胞結合試験 ＷＥＨＩ　−３８（Ｄ”　）細胞及び新たに診断された
白血病患者のヒト白血球は　　■−標識マウスＧ−Ｃ３
Ｆに結合するが、この結合は未標識Ｇ−Ｃ３Ｆ又はヒト
Ｃ３Ｆ−βの添加により競合させることができる、と過
去に報告された。ヒト及びマウスの白血球に対して　　
Ｉ−ｈｐＧＣ３Ｆの結合に競合する天然ｈｐＧ−ＣＳＦ
及びｒｈｐＧ−ＣＳＦの能力に関し試験した。高度に精
製された天然ｈｌ）Ｇ−ＣＳＦ（純度９５％以上、１μ
９）がヨウ素化（デジエト−ら、アナリティカル・バイ
オケミストリー、第　１２７巻、第　１４３頁、１９８
２年（Ｔｅｊｅｄｏｒ、　　ｅｔ　ａｔ、、　　Ａｎａ
ｌ、　　Ｂｉｏｃｈｅｍ−長！７．　１４３　（１９８
２）））され、ゲル濾過及びイオン交換クロマトグラフ
ィーにより反応物から分離された。天然　　１−ｈｐＧ
−ＣＳＦの比活性は約１００μＣｉ／μ９タンパク質で
あった。マウスＷＥＨＩ　−３８（Ｄ”　）及び２８の
ヒト末梢血骨髄白血病細胞（ＡＮＬＬ、１つはＭ４、伯
はＭ５Ｂとして分類される）を　　Ｉ−ｈｐＧ−ＣＳＦ
との結合能について試験した。

マウス及び新しく１りたヒトの未梢血骨随白血病１胞を
ＰＢＳ／　１％ＢＳＡで３回洗浄した。

ＷＥＨＩ　−３８（Ｄ＋）細胞（５×１０６個）又は新
鮮白血病細胞（３×１０６個）を、各種濃度（容量：１
０、ｃｌ）の未標識ｈ　ＯＧ　−ＣＳ　Ｆ　、　ｒ　ｈ
　ｐ　ＧＣ３Ｆ又はＧＭ−ＣＳＦの存在又は非存在下、
及び　　　Ｉ　−ｈｐＧ−ＣＳＦ　（約１００．０００
ｃｐｍ又は１ｎｇ）の存在下、ＰＢＳ／　１％ＢＳＡ（
１００，ｃｌ　）中０°Ｃ９０分間２連でインキュベー
トシた（総容苗：１２０μ、Ｑ）。細胞を次いで３５０
μｇプラスチック製遠心管中の氷冷ＦＣ８２００μｍに
再懸濁して積層し、遠心分離（１０００ｘり；１分間）
した。ペレットを管端部切断により集め、ペレット及び
上澄を別々にガンマカウンター〔バラカード（ｐ　ａｃ
ｋａｒｄ　）　）で計測した。

特異的結合ｆａ（ｃｐｍ）は、競合物の非存在下におけ
る総結合昂（２連の平均）−１００倍過剰の未標識ｈｐ
Ｇ−ｃｓＦの存在下における結合量（非特異結合ｆｆ１
）　　（ｃＩ）ｍ）として計算した。非特異的結合催は
、最大で、ＷＥＨＩ　−３８（Ｄ＋）細胞の場合が２５
ｏ３ｃｐｍ　、　ＡＮ　Ｌ　Ｌ　（Ｍ４　）の細胞の場
合が１１０７２ｃｐ　、　ＡＮＬＬ　（Ｍ２Ｓ）！胞の
場合が１１２５ｃｐｍであった。実験１及び２は同一の
　　Ｉ−ｈｐＧ−Ｃ３Ｆ調製物を用いて異なる日に実施
したが、ｈ　ｐＧ　−ＣＳＦ２０００単位の場合の阻害
率においては内部的一貫性を示す。得られたデータは下
記衣ＸＸ■に示されている。

表ＸＸＩＩＮで示されているように、　　Ｉ−ｈｌ）Ｇ
−Ｃ３ＦはＷＥＨ＋　−３８（Ｄ”　）白血病細胞との
結合性を示した。結合は、ＧＭ−ＣＳＦではなく未標識
天然ｈｐＧ−Ｃ３Ｆ又はｒｈｐＱ−Ｃ３Ｆにより用Ｕ１
依存的に阻害された。しかも、ヒト骨髄中球性白血病細
胞（八ＮＬＬ、Ｍ４）に対する天然ｈｌ）Ｇ−Ｃ３Ｆの
結合も観察された。

これら細胞への結合性は、液体培養物中の天然ｈｐＧ−
Ｃ３Ｆに応じて、形態学的に判断されるマクロファージ
への分化と比較される。別の患者の単球性白血病細胞（
ＡＮＬＬ、Ｍ２Ｓ）との天然　　１−ｈｐＧ−Ｃ３Ｆの
結合性の欠如は、特定の白血病が特貨的に発現したか、
又はｈｐＧＣ３Ｆに対するレセプターを欠くことを示唆
する。

天然ｈｐＧ−Ｃ３Ｆと同様に天然　　Ｉ−標識−ｈｐＧ
−Ｃ３Ｆの結合に対して競合するｒｈｐＧ−Ｃ３Ｆの能
力は、レセプターが十分等しく両型を認識することを示
唆する。

白血病細胞との天然　　■−標識ｈｐＧＣＳＦの結合性
を証明するこれらの研究は、培養物中で急性前骨髄性白
血病（Ｍ３）の第１息者及び急性骨髄芽球性白血病（Ｍ
２）の第２患者から得た低密度骨髄法の顆粒球及び単球
への分化を誘導する天然ｈｐＧ−Ｃ３Ｆの能力と対比さ
れる。

各患者からの細胞を、培地単独で又はｒｈｐＧ−Ｃ３Ｆ
　　１ｘ１０”単位存在下で、４日間培養した。

培地単独でインキュベ−１へされたＭ３コントロール培
養物からの細胞は前骨髄球のままであったが、一方ｒＭ
Ｇ−Ｃ３Ｆの存在下で培養された細胞は、後骨髄球、巨
大杆状核型−分葉核型好中球及び単球からなる骨髄型成
熟細胞を示した。この患者での現実の分化は、１００個
の細胞について、コントロールの場合が１００％前骨髄
球であり、ｒｈｐＧ−Ｃ３Ｆ処理細胞の場合が２２％芽
球＋前骨髄法、７％骨髄球、３５％後骨髄球、２０％杆
状核型十分葉核型好中球、１４％甲球及び２％マクロフ
ァージであった。注目されるのは、多形核顆：位球の１
つが顕著なアラニル小体をまだ有していたという事実で
あるが、このことは少なくともこの細胞が白血病系のク
ローンに屈する分化細胞であることを示唆する。骨部芽
球性白血病（Ｍ２）の第２息者からの細胞ちｒｈｐＧ−
ｃｓＦの存在又は非存在下で４日間培養した。培地単独
で培養されたＭ２細胞の視覚分析では、大きなパ芽球様
″細胞を示したが、そのうちのいくつかは核小体を有し
ていた。Ｍ２１胞のいくつかは、ｒｈｐＧＣ３Ｆで処即
した場合に、好中球の中心にアラニル小体が残った成熟
分葉咳型好中球に分化したが、このことは白血病系のク
ローンにａする細胞で生じる分化を示唆した。形態学的
に評価された細胞１００１１７１Ｉの実際の分化では、
］ン１〜［１−ル細胞は１００％芽球からなることが示
された。ｒｈｐＧＣＳＦ処理細胞は、４３％芽球、１％
骨髄球、１５％後骨髄球、２８％杆状核型十分葉核型好
中球、２％前単球及び１１％単球からなっていた。白血
病細胞が、また４つの異なる濃度（５ｘ　１０　　、　
１ｘ　１０’２．５ｘ　１０　　及び５×１０４Ｕ／ｄ
、データ示さず）のｒｈｐＧ−ＣＳＦ存在下で分化に関
して試験された。試験されたｒｈｔ）Ｇ−ＣＳＦの最低
′ｆＡ度（５ｘ　１０３ＬＪ　／　ｎｄ！　＞の場合で
あっても、Ｍ３（５０％）及びＭ２（３７％）白血病細
胞の著しい分化が生じた（細胞は骨髄法以上に分化した
）。

６、免疫試験 免疫試験用のポリクローナル抗体を産生するために使用
された抗原は、例１（Ｂ）で調製されたようにしてヒト
膀胱癌細胞系５Ｇ３７　（１△６）から精製された多分
化能性Ｇ−Ｃ３Ｆであった。この物質は、ポリアクリル
アミドゲルの硝酸銀染色に基づぎ、純度８５％と判定さ
れた。６週令［３ａｌｂ／Ｃマウスを抗原の多部位注射
により免疫した。抗原をＰＢＳに再＠濁し、等量の７０
インド（１：　ｒｅｕｎｄ）完全アジュバン１−で乳化
させた。投与俣は抗原５〜７μｇ／マウス／注射であっ
た。追加免疫注射は、等量のフロイント不完全アジュバ
ントで乳化された同ｍの抗原で１８日後に投与した。４
日後、マウス血清を採取し、ヒト多分化能性Ｇ−ＣＳＦ
に特異的な抗体について試験した。

ホルダー中のダイナチック・イムロン■・リムーバウェ
ル（Ｄｙｎａｔｅｃｈ　ｌｎｍｕｌｏｎＴｌＲｅｍｏｖ
ａｗｅｌｌ）ストリップ〔ダイナチック・ラボラトリ−
社（ＤｙｎａｔｅｃｋＬａｂ、、　　Ｉｎｃ、）、アレ
クサントリア、バージニア）をｐＨ９，２の５０ｍＨｒ
Ａ酸−串炭酸緩衝液中のｈｐＧ−ＣＳＦ　５ｘ／−で被
覆した。ウェルを古学５０〃中の０，２５埒で被覆した
。抗原被覆プレートを室温で２時間及び４℃で一夜イン
キュベートした。溶液を捨て、プレートを５％ＢＳ△含
有ＰＢＳ中で３０分間インキュベートして、反応表面を
保護した。この溶液を捨て、希釈された免疫前血清又は
試験血清をウェルに加え、室温で２時間インキュベート
した。血清は１％ＢＳＡ？ａ有のｐｌ＋１０のＰＢＳで
希釈した。血清溶液を捨て、プレートをワラシュ・ツル
ージョン（Ｗａｓｈ　５ｏｌｕｔｉｏｎ）（ＫＰＬ、ゲ
イザースブルグ、メリーランド）で３回洗浄した。ｐＨ
７，０の１％ＢＳＡ含有Ｐ　Ｂ　Ｓ　５０越中のヨウ素
化ウナギ抗マウス［ＱＧ（ＮＥＮ、ボストン、マサチュ
ーセリツ）約２００，０００　ｃｐｍを各々のウェルに
加えた。室温で１．５時間インキュベートした後、溶液
を捨て、プレートをワラシュ・ツルージョンで５回洗浄
した。ウェルをホルダーから取外し、ベックマン５５０
０ガンマカウンターで計測した。高力価マウス血清は、
１：１００希釈時において、相当する免疫前血消よりも
１２倍以上１′：ｓい反応性を示した。

大腸菌由来ｈｌ）Ｇ−Ｃ３Ｆの免疫学的Ｍ買は、吐乳動
物細胞由来ｈｐＧ−ＣＳＦに特異的な高力価マウス血清
に対づる反応性により測定した。純度９０％の大腸菌由
来タンパク買０．２５埒を容量５０成のイムロン用リム
ーバウェルに被晋し、マウス血澗を上記のように分析し
た。

高ノ２価マウス血清は、１　：　１００希釈時において
、相当づる免疫前血清よりＥ、＋２４（ｉ２高い反応性
を大腸菌由来物質に対して示した。

７、セリン類縁体生物学的試験 例８でＩＮ　Ｆされた（Ｓｅｒ１７）　ｈ　ｐＧ−ＣＳ
Ｆ　。

Ｇ （Ｓｃｒ　　〕ｈｐＧ−Ｃ３Ｆ、（Ｓｃｒ４２〕ｈｐＧ
Ｃ３Ｆ、（Ｓｅｒ　　〕ｈｐＧ−Ｃ３Ｆ及び（Ｓ　ｅｒ
７４〕ｈｐＧ−ＣＳＦ産物を、３Ｈ−チミジン取込み、
ＣＦ　Ｕ　−Ｇ　Ｍ及びＷ　Ｅ　＋−１１−３８Ｄ＋分
析によりｈｌ）Ｇ−Ｃ３Ｆ活性に関し分析した。各分析
において、（Ｓ　（！ｒ１７）類縁体は天然構造組換え
分子の活性に匹敵する活性を有していた。他の類縁体は
、３Ｈ−デミジン取込み分析では１／　１００の活性、
ＣＦＵ−ＧＭ分析では１／　２５０の活性、及びＷＥＨ
Ｉ−３８Ｄ＋分析では１／　５００の活性を有していた
。このデータは、３６．４２．６４及び７４位のシステ
ィンが十分な生物学的活性のために必要であるという考
え方を支持する。

８、イン・ビボ生物学的試験 アルゼッ１〜（ＡｌｚｅｔＲ）浸透圧ポンプ〔アルゼッ
１−社（Ａ　１ｚｅｔ　　Ｃｏｒｐ、　）パロ・アルｔ
−（Ｐａｌ。

Δ１［Ｏ）、カリフォルニア；モデル２００１　）を内
在型右傾静脈血管カテーテルに連結し、７匹の訓性シリ
アンゴールデンハムスターの皮下に植込んだ。

４つのポンプは緩衝液（２０ｍＨ酢酸す］〜リウム（ｐ
Ｈ５４）及び３７　ｍ　Ｎ　塩化ナトリウム〕及び大腸
菌由来ｈ　ｐＧ　−ＣＳＦ　　１．５Ｈｇ／ｄを含有し
、３つは緩衝液のみを含有していた。浸透圧ポンプに必
要な排出速度は、７８目までｌｊｊ！／ｈｒであった。

ポンプ植込み後３日日において、４匹の処理ハムスター
の平均顆粒球数は３匹のく緩衝ａ）コントロールの揚台
より６倍高く、顆粒球数増加は縁由血球が４倍増加した
ことに反映されていた。赤血球数は処理により変化しな
かった。これらの結果は、組換え物質が吐乳動物におい
て顆粒球の産生及び／又は放出を特異的に高めることを
示している。

ｈｐＧ−ＣＳＦの天然対立型に加え、本発明ではｈｐＧ
−ＣＳＦのポリペプチド類縁体及びｈｐＧ−Ｃ３Ｆ断片
のような他のＭＵＧ−ＣＳＦ産物も包含する。上記アル
１−ンらの出願公開（Ｗ　Ｏ／　８３／　０４０５３）
の操作に従い、１以上の残塁の同−性又は位置に関し本
明細鶏で記載されたものとはｌ、Ｔ、ｌなる（例えば、
置換、端部及び中間部付加、並びに削除）−次構ｊΔを
もつポリペプチドの微生物での発現をコードする遺伝子
を容易に考えかつ製造することができる。一方、ＣＤＮ
Ａ及びゲノム遺伝子の修正は、周知の特定部位突然変異
誘発法によって容易に実施することができ、しかもそれ
らの類縁体及び誘導体を産生ずるために利用することが
できる。このような産物はｈｐＧ−ＣＳＦの生物学的性
質のうち少なくとも１つを有するが、池の点では異なる
可能性がある。例えば、考えられる本発明の産物として
は、例えば削除により短縮された産物、加水分解に対し
より安定な産物（したがって、天然体よりも顕著な又は
持続性の効果を有する可能性がある）、１以上の潜在的
Ｏ−グリコシル化部位を削除して暉正された産物（酵母
菌産生産物に関しより高い活性を有するようになる）、
１以上のシスティン残塁が削除され又はアラニンもしく
はセリン残基等で置換され、しかち微生物系から活性型
でより容易に単離され得る産物、又は、１以上のチロシ
ン残基がフェニルアラニンで置換され、しかも標的細胞
上のｈｐＧ−Ｃ３Ｆレセプターにいくぶん容易に結合し
得る産物がある。更には、ｈｐＧ−ＣＳＦの連続アミノ
酸配列又は二次構造の一部のみを複製したポリペプチド
断片も包含されるが、この断片は１つの活性（例えば、
レセプター結合性）を有するが、他の活性（例えば、コ
ロニー増殖刺激活性）を有しない可能性がある。本発明
のいずれの１以上の産物が、治療的効用〔ウアイラント
ら、ブルート、第４４巻、第１７３〜１７５頁、１９８
２年（Ｗ　ｅｉ　１ａｎｄ、　ｅｔａｔ、、　Ｂ　ｌｕ
ｔ、　　４４．１７３−１７５　（１９８２））参照〕
又はｈｐＧ−Ｃ３Ｆ拮抗作用分析のような他の関連にお
ける効用をｂつために、活性が必ずしも必要とされない
ことは注目に１１Ｖ１する。競合的拮抗剤は、例えばｈ
ｌ）Ｇ−Ｃ３Ｆの過刺産生時に非常に有用である可能性
がある。

本発明の他の側面によれば、ｈｌ）Ｇ−Ｃ３Ｆポリペプ
チドをコードする本明細書に記載されたＤＮＡ配列は、
天然産物単離体の分析的プロセッシングにもかかわらず
今まで１ｑられていなかったこの哺乳動物タンパク質の
アミノ酸配列に関して、それが情報を提供することから
、価値がある。

ＤＮＡ配列は、様々な組換え技術によるｈｐＧ−ＣＳＦ
の大規模な微生物での合成を実施するために使用される
産物としても著しい価値がある。その他に、本発明によ
り提供されるＤＮＡ配列は、新規かつ有用なウィルス性
または環状プラスミドＤＮＡベクター、新規かつ有用な
形質転換及び感染転換された（ｔｒａｎｓｒｅｃｔｅｄ
）微生物原核及び真核及び真核宿主細胞（細菌、酵母菌
細胞及び哺乳動物の培養細胞を含む）、ｈｐＧ−Ｃ３Ｆ
及びその関連産物の発現が可能なかかる微生物富士細胞
の新規かつ有用な培養増殖方法を開発するために使用さ
れる。本発明のＤＮＡ配ダＪは、ｈｐＧＣＳＦ及び関連
タンパク質をコードするヒトゲノムＤＮＡ並びに伯の吐
乳動物種のＣＤＮＡ及びゲノムＤＮＡ配列を単離するた
めの標識プローブとして使用される、極めて適切な物質
でもある。

ＤＮＡ配列は、（例えば、昆虫細胞中での）タンパク質
合成の様々な代替的方法又はヒト及び他の哺乳動物にお
ける遺伝子療法にも使用することができる。本発明のＤ
ＮＡ配列は、ｈｐＧ−Ｃ３Ｆ及びｈｐＧ−Ｃ３Ｆ産物の
大規模産生用の真核細胞゛宿主”として機能し得る遺伝
子転換哺乳動物種を開発するためにも使用し得る、と期
待されている。−船釣には、パルミターら、ナイエンス
、第２２２巻、第４６２５号、第８０９〜８１４頁、１
９８３年（Ｐａｌｍｉｔｅｒ、　ｅｔ　ａｌ、、　　３
ｃｉｅｎｃｅ、　　２２２（４６２５）８０９−８１４
　（１９８３））参照。

本発明のｈｐＧ−Ｃ３Ｆ断片及びポリペプチド類縁体の
応用例の中には、天然タンパク質、糖タンパク質及び核
タンパク質中に存在するアミノ酸配列を実質的に複製し
た合成ペプチドの免疫学的活性に関する報告がある。更
に詳しくは、比較的低分子母のポリペプチドは、ウィル
ス抗原、ポリベブヂドホルモンその他のような生理学的
に重要なタンパク質の免疫反応と時間及び程度が類似し
た免疫反応に関係することが示された。このようなポリ
ペプチドの免疫反応の中には、免疫学的に活性な動物に
おける特異的抗体産生の試活化が含まれる。例えば、レ
ーナーら、セル、第２３巻、第３０９〜３１０頁、１９
８１年（ｌｅｒｎｅｒ、　ｅｔ　ａｌ。

Ｃｅ１ｌ、　　２３．３０９−３１０　　（１９８１）
　）　、ロスら、ネーヂャー、第２９４巻、第６５４〜
６５６頁、１９８１年（ＲＯ３Ｓ、　　ｅｔ　ａｌ、、
　Ｎａｔｕｒｅ、　２９４．　６５４−６５６（１９８
１）　）　、ワルターら、プロシーデインゲス・オブ・
ナショナル・アカデミ−・オブ・υイエンス（ＵＳＡ）
、第７７巻、第５１９７〜５２００頁、１９８０年（Ｗ
ａｌｔｅｒ、　ｃｔａｌ、、　　ＰｒｏｃＮａｔｌ、　
　ＡｃａｄＳｃｉ、　　（ＵＳＡ）、　　７７　、　５
１９７−５２００　（１９８０）　　）、ラーナーら、
プロシーデインゲス・オブ・ナショナル・アカデミ−・
オブ・サイエンス（ＵＳＡ）、第７８３５、第３４０３
〜３４０７頁、１９８１年、ワルターら、プロシーデイ
ンゲス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエ
ンス（ＵＳＡ）、第７８巻、第４８８２〜４８８６頁、
１９８１年；ウォン（Ｗｏｎｇ）ら、プロシーデインゲ
ス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス
（ＵＳＡ）、第７８巻、第７４１２〜７４１Ｇ頁、１９
８１年；グリーン（Ｑｒｅｅｎ）ら、セル、第２８巻、
第４７７〜４８７頁、１９８２年；ニック（Ｎ　１ｇｇ
１ら、プロシーデインゲス・オブ・プショナル・アカデ
ミ−・オブ・サイエンス（ＵＳＡ）、第７９巻、第５３
２２−５３２６頁、１９８２年；バロン（Ｂ　ａｒｏｎ
）ら、セル、第２８巻、第３９５〜４０４頁、１９８２
年；ドリーズマン（［）　ｒ６ｅｓｍａｎ）ら、ネーチ
ャ、第２９５巻、第１８５〜１６０頁、１９８２年；及
びラーナー、サイエンティフィック・アメリカン、第２
４８巻、第　２号、第６６〜７４頁、１９８３年（Ｌ　
ｅｒｎｅｒＳｃｉｎｔＨｉｃ　　Ａｍｅｒｉｃａｎ、　
２４８．　Ｎｏ、２．６６−７４（１９８３））参照。

更に、ペプチドホルモンの二次構造をほぼ有するものの
それらの一次構造配列を有していない合成ペプチドの生
物学的及び免疫学的活性に関する、カイザーら、サイエ
ンス、第２２３巻、第２４９〜２５５頁、１９８４年（
Ｋ　ａｉｓｅｒ　　ｅｔ　　ａｌＳｃｉｅｎｃｅ、　２
２３．２４９−２５５　（１９８４）　）参照。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ｈｐＧ−ＣＳＦａ仏子の部分的な制限エンド
ヌクレアーゼ地図である。

Claims (44)

【特許請求の範囲】
1. （１）天然多分化能性顆粒球コロニー刺激因子における
   一次構造配列の一部もしくは全部及び生物学的性質の１
   以上を有し、しかも外来性ＤＮＡ配列の原核細胞もしく
   は真核細胞発現産物であることを特徴とする精製単離ポ
   リペプチド。
2. （２）いかなる哺乳動物タンパク質とも会合していない
   、特許請求の範囲第１項記載のポリペプチド。
3. （３）外来性ＤＮＡ配列がｃＤＮＡ配列である、特許請
   求の範囲第１項記載のポリペプチド。
4. （４）外来性ＤＮＡ配列が人工ＤＮＡ配列である、特許
   請求の範囲第１項記載のポリペプチド。
5. （５）外来性ＤＮＡ配列がゲノムＤＮＡ配列である、特
   許請求の範囲第１項記載のポリペプチド。
6. （６）外来性ＤＮＡ配列が自律複製ＤＮＡプラスミド又
   はウィルスベクターに担持されている、特許請求の範囲
   第１項記載のポリペプチド。
7. （７）表VIIに示されるヒト多分化能性顆粒球コロニー
   刺激因子又はそのいずれかの天然対立変異体における一
   次構造配列の一部もしくは全部を有する、特許請求の範
   囲第１項記載のポリペプチド。
8. （８）天然多分化能性顆粒球コロニー刺激因子の免疫学
   的性質を有する、特許請求の範囲第１項記載のポリペプ
   チド。
9. （９）天然多分化能性顆粒球コロニー刺激因子のイン・
   ビトロ生物学的活性を有する、特許請求の範囲第１項記
   載のポリペプチド。
10. （１０）検出可能標識物質と共有結合せしめられた、特
    許請求の範囲第１項記載のポリペプチド。
11. （１１）検出可能標識が放射線標識である、特許請求の
    範囲第１項記載のポリペプチド。
12. （１２）天然多分化能性顆粒球コロニー刺激因子におけ
    る一次構造配列の少なくとも一部及び生物学的性質の１
    以上を有するポリペプチド産物の原核もしくは真核宿主
    細胞中での発現を確実化するために使用されるＤＮＡ配
    列であつて、 （ａ）表VII及びVIIIに示されたＤＮＡ配列又はそれら
    の相補鎖、 （ｂ）（ａ）で規定されたＤＮＡ配列又はそれらの断片
    とハイブリッド形成するＤＮＡ配列、及び（ｃ）遺伝コ
    ードの縮重がなければ（ａ）及び（ｂ）で規定されたＤ
    ＮＡ配列とハイブリッド形成し得るＤＮＡ配列、 の中から選択されることを特徴とするＤＮＡ配列。
13. （１３）宿主細胞にポリペプチド産物を発現させるよう
    に特許請求の範囲第１２項記載のＤＮＡ配列で形質転換
    又は感染転換された原核もしくは真核宿主細胞。
14. （１４）原核もしくは真核細胞宿主における特許請求の
    範囲第１２項記載のＤＮＡ配列の発現のポリペプチド産
    物。
15. （１５）多分化能性顆粒球コロニー刺激因子における一
    次構造配列の一部もしくは全部及び生物学的性質の１以
    上を有するポリペプチドの原核もしくは真核細胞宿主発
    現をコードする精製単離ＤＮＡ配列。
16. （１６）特許請求の範囲第１５項記載のＤＮＡ配列。
17. （１７）特許請求の範囲第１６項記載のゲノムＤＮＡ配
    列。
18. （１８）特許請求の範囲第１５項記載の人工ＤＮＡ配列
    。
19. （１９）大腸菌細胞中での発現に好ましい１以上のコド
    ンを含有する、特許請求の範囲第１８項記載の人工ＤＮ
    Ａ配列。
20. （２０）ヒト多分化能性顆粒球コロニー刺激因子の発現
    をコードする、特許請求の範囲第１８項記載の人工ＤＮ
    Ａ配列。
21. （２１）酵母菌細胞中での発現に好ましい１以上のコド
    ンを含有する、特許請求の範囲第２０項記載の人工ＤＮ
    Ａ配列。
22. （２２）特許請求の範囲第１６、１７又は１８項記載の
    ヒト多分化能性顆粒球コロニー刺激因子をコードするＤ
    ＮＡ配列。
23. （２３）検出可能標識物質と共有結合せしめられた、特
    許請求の範囲第１５項記載のＤＮＡ配列。
24. （２４）検出可能標識が放射線標識である、特許請求の
    範囲第２３項記載のＤＮＡ配列。
25. （２５）特許請求の範囲第２３項記載の一重鎮ＤＮＡ配
    列。
26. （２６）天然多分化能性顆粒球コロニー刺激因子のポリ
    ペプチド断片又はポリペプチド類縁体をコードするＤＮ
    Ａ配列。
27. （２７）〔Ａｌａ＾１〕ｈｐＧ−ＣＳＦをコードするＤ
    ＮＡ配列。
28. （２８）特許請求の範囲第１２、１５又は２６項記載の
    ＤＮＡ配列を有する生物学的機能プラスミド又はウィル
    スＤＮＡベクター。
29. （２９）特許請求の範囲第２８項記載のＤＮＡベクター
    で安定的に形質転換又は感染転換された原核もしくは真
    核宿主細胞。
30. （３０）特許請求の範囲第１５項又は第２６項記載のＤ
    ＮＡ配列の原核もしくは真核宿主細胞における発現のポ
    リペプチド産物。
31. （３１）表VIIに示されたアミノ酸配列の一部もしくは
    全部を有し、かつ天然多分化能性顆粒球コロニー刺激因
    子のイン・ビトロ生物学的活性の１以上を有する合成ポ
    リペプチド。
32. （３２）表VIIに示されたアミノ酸配列の一部もしくは
    全部の二次構造の一部もしくは全部を有し、かつ天然ヒ
    ト多分化能性顆粒球コロニー刺激因子の生物学的活性を
    有する合成ポリペプチド。
33. （３３）天然多分化能性顆粒球コロニー刺激因子におけ
    る一次構造配列の一部もしくは全部及び生物学的性質の
    １以上を有するポリペプチドの産生方法であつて、適切
    な栄養条件下、特許請求の範囲第２８項記載のＤＮＡベ
    クタ−で形質転換又は感染転換された原核もしくは真核
    宿主細胞を増殖させ、上記ベクター中のＤＮＡ配列の発
    現の所望のポリペプチド産物を単離することからなる方
    法。
34. （３４）グリコシル又は非グリコシル型の、いかなるヒ
    トタンパク質とも会合していない精製単離ヒト多分化能
    性顆粒球コロニー刺激因子。
35. （３５）特許請求の範囲第１項又は第３４項記載の有効
    量のポリペプチド及び薬学上許容される希釈剤、アジュ
    バント又は担体からなる医薬組成物。
36. （３６）特許請求の範囲第１項又は第３４項記載のポリ
    ペプチドの有効量を投与することからなる哺乳動物への
    造血治療提供方法。
37. （３７）特許請求の範囲第１項又は第３４項記載のポリ
    ペプチドの有効量を投与することからなる白血病細胞増
    殖抑制方法。
38. （３８）〔Ｓｅｒ＾１＾７〕ｈｐＧ−ＣＳＦをコードす
    るＤＮＡ配列。
39. （３９）特許請求の範囲第３８項記載のＤＮＡ配列の原
    核もしくは真核宿主細胞における発現のポリペプチド産
    物。
40. （４０）特許請求の範囲第３８項記載のＤＮＡ配列を含
    有する生物学的機能プラスミド又はウィルスＤＮＡベク
    ター。
41. （４１）特許請求の範囲第４０項記載のＤＮＡベクター
    で安定的に形質転換又は感染転換された原核もしくは真
    核宿主細胞。
42. （４２）〔ＡＩａ＾１〕ｈｐＧ−ＣＳＦ； 〔Ｓｅｒ＾３＾６〕ｈｐＧ−ＣＳＦ； 〔Ｓｅｒ＾４＾２〕ｈｐＧ−ＣＳＦ； 〔Ｓｅｒ＾６＾４〕ｈｐＧ−ＣＳＦ； 〔Ｓｅｒ＾７＾４〕ｈｐＧ−ＣＳＦ； 〔Ｍｅｔ＾−＾１、Ｓｅｒ＾１＾７〕ｈｐＧ−ＣＳＦ；
    〔Ｍｅｔ＾−＾１、Ｓｅｒ＾３＾６〕ｈｐＧ−ＣＳＦ；
    〔Ｍｅｔ＾−＾１、Ｓｅｒ＾４＾２〕ｈｐＧ−ＣＳＦ；
    〔Ｍｅｔ＾−＾１、Ｓｅｒ＾６＾４〕ｈｐＧ−ＣＳＦ；
    及び〔Ｍｅｔ＾−＾１、Ｓｅｒ＾７＾４〕ｈｐＧ−ＣＳ
    Ｆ；からなる群より選択されるｈｐＧ−ＣＳＦ類縁体を
    コードするＤＮＡ配列。
43. （４３）特許請求の範囲第４２項記載のＤＮＡ配列の原
    核もしくは真核宿主細胞における発現のポリペプチド産
    物。
44. （４４）純度が９５％より大であつて、ｈｐＧ−ＣＳＦ
    ０．５ｍｇにつき発熱性物質を０．５ｎｇ以下で含有す
    る、ｈｐＧ−ＣＳＦ製剤。