JPH02477A - 相同組換えによるキメラ抗体の製造 - Google Patents
相同組換えによるキメラ抗体の製造Info
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- JPH02477A JPH02477A JP63270605A JP27060588A JPH02477A JP H02477 A JPH02477 A JP H02477A JP 63270605 A JP63270605 A JP 63270605A JP 27060588 A JP27060588 A JP 27060588A JP H02477 A JPH02477 A JP H02477A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
１、緒言
本発明は生鉢位で新規組換えＤ Ｎ Ａベクターおよび
ｔ目間組換えを用いるキメラ抗体を生産する方法に関す
る。本発明の組換えＤＮＡ構築物を用い、標的を目間組
換えがトランスフェクト細胞中に生じ、トランスフェク
ト細胞；こよるキメラ抗体分子が生産されるに抗体生産
細胞をトランスフェクトすることができる。
ｔ目間組換えを用いるキメラ抗体を生産する方法に関す
る。本発明の組換えＤＮＡ構築物を用い、標的を目間組
換えがトランスフェクト細胞中に生じ、トランスフェク
ト細胞；こよるキメラ抗体分子が生産されるに抗体生産
細胞をトランスフェクトすることができる。
本発明は、マウス免疫グロブリン重鎖の不変部領域がヒ
）ＩｇＧ１不変部領域により置換され、キメラ重鎖がマ
ウス細胞系により生産されたことを記載する実施例によ
り示される。
）ＩｇＧ１不変部領域により置換され、キメラ重鎖がマ
ウス細胞系により生産されたことを記載する実施例によ
り示される。
２、発明の背景
２．１ キメラ抗体
基クローン性抗体を製造する細胞融合法〔コーラ−ほか
（Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ ！、ｌ１ｌＳｔｅｉｎ）、１
９７５、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ） ２５６ ： ４
９５３の開発以来莫大−−数の基クローン性抗体、その
多く：まこれまでの未知の抗原を規定する、が多くの研
究者により生成された。残念ながら、今日までに作られ
た基クローン性抗体の大部分がマウス系中で生産され、
従って、マウス単クローン性抗体がヒト免疫系により異
質エピトープとして「認識」されず、「中和コされない
ような方向で修飾がなされていなければ、ヒト治療剤と
しての利用性が限定されている。従って、多くの研究者
が異質エピトープとして認識されることが少なく、ヒト
中の基クローン性抗体の使用に関連する問題を克服でき
るヒト単クローン性抗体の開発を試みている。明らかに
、免疫処置マウスを層殺しその膵臓を抗体生産細胞系の
不死化のための後の融合に対するリンパ球源として使用
することを含むコーラ−ほか（Ｋｏｈｌｅｒａｎｄ Ｍ
ｉｌｓｔｅｉｎ） （前掲）により開発されたハイブ
リドーマ技術はヒト中に実施できない。従って、多くの
研究者は彼らの注意を、哺乳動物細胞中へＤＮＡを導入
して免疫グロブリン遺伝子を発現させる分子生物学の分
野の最近の進歩（オイ（Ｏｌ）ほか、１９８３、プロシ
ーデイングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オ
ブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、
Ｓｃ＋、） ＵＳＡ ８０ ： ８２５ ；ボッター（
Ｐｏｔｔｅｒ）ほか、１９８４、プロシーデイングズ・
オフ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オフ・サイエンス
（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、）
ｔｌｓＡ８１ニア１６１）に向け、これらの方法をキメ
ラ抗体の生産に用いた〔モリソン（Ｍｏｒｒ ｉ ｓｏ
ｎ ）ほか、１９８４、プロシーデイングズ・オフ・ヂ
・ナショナル・アカデミ−・オフ・サイエンス（ｐｒｏ
ｃ。
（Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ ！、ｌ１ｌＳｔｅｉｎ）、１
９７５、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ） ２５６ ： ４
９５３の開発以来莫大−−数の基クローン性抗体、その
多く：まこれまでの未知の抗原を規定する、が多くの研
究者により生成された。残念ながら、今日までに作られ
た基クローン性抗体の大部分がマウス系中で生産され、
従って、マウス単クローン性抗体がヒト免疫系により異
質エピトープとして「認識」されず、「中和コされない
ような方向で修飾がなされていなければ、ヒト治療剤と
しての利用性が限定されている。従って、多くの研究者
が異質エピトープとして認識されることが少なく、ヒト
中の基クローン性抗体の使用に関連する問題を克服でき
るヒト単クローン性抗体の開発を試みている。明らかに
、免疫処置マウスを層殺しその膵臓を抗体生産細胞系の
不死化のための後の融合に対するリンパ球源として使用
することを含むコーラ−ほか（Ｋｏｈｌｅｒａｎｄ Ｍ
ｉｌｓｔｅｉｎ） （前掲）により開発されたハイブ
リドーマ技術はヒト中に実施できない。従って、多くの
研究者は彼らの注意を、哺乳動物細胞中へＤＮＡを導入
して免疫グロブリン遺伝子を発現させる分子生物学の分
野の最近の進歩（オイ（Ｏｌ）ほか、１９８３、プロシ
ーデイングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オ
ブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、
Ｓｃ＋、） ＵＳＡ ８０ ： ８２５ ；ボッター（
Ｐｏｔｔｅｒ）ほか、１９８４、プロシーデイングズ・
オフ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オフ・サイエンス
（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、）
ｔｌｓＡ８１ニア１６１）に向け、これらの方法をキメ
ラ抗体の生産に用いた〔モリソン（Ｍｏｒｒ ｉ ｓｏ
ｎ ）ほか、１９８４、プロシーデイングズ・オフ・ヂ
・ナショナル・アカデミ−・オフ・サイエンス（ｐｒｏ
ｃ。
Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、） ＵＳＡ８１：６５
８１；サバガン（Ｓａｈａｇａｎ）ほか、１９８６、ジ
ャーナル・オフ・イムノロジー（Ｊ、 Ｉｍｍｕｎｏｌ
、） ｌ ３７ ： １（１６６ ：サン（Ｓｕｎ）ほ
か、１９８７、プロシーデイングズ・オフ・ザ・ナショ
ナル・アカデミ−・オフ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、 Ｎ
ａｔｌ、 Ａｃａｃｌ、Ｓｃｉ、） ｔｌｓＡ ８４
：２１４〕。
８１；サバガン（Ｓａｈａｇａｎ）ほか、１９８６、ジ
ャーナル・オフ・イムノロジー（Ｊ、 Ｉｍｍｕｎｏｌ
、） ｌ ３７ ： １（１６６ ：サン（Ｓｕｎ）ほ
か、１９８７、プロシーデイングズ・オフ・ザ・ナショ
ナル・アカデミ−・オフ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、 Ｎ
ａｔｌ、 Ａｃａｃｌ、Ｓｃｉ、） ｔｌｓＡ ８４
：２１４〕。
キメラ抗体はヒトおよび非ヒト部分を含む免疫グロブリ
ン分子である。より詳しくは、キメラ抗体の抗原結合領
域（または可変領域）が非ヒト源（例えばマウス）から
誘導され、キメラ抗体の不変部領域（免疫グロブリンに
生物学的エフェクターｔｉ能を与えるンがヒト源から誘
導される。キメラ抗体は非ヒト抗体分子の抗原結合特異
性およびヒト抗体分子により与えられたエフェクター機
能を有する。
ン分子である。より詳しくは、キメラ抗体の抗原結合領
域（または可変領域）が非ヒト源（例えばマウス）から
誘導され、キメラ抗体の不変部領域（免疫グロブリンに
生物学的エフェクターｔｉ能を与えるンがヒト源から誘
導される。キメラ抗体は非ヒト抗体分子の抗原結合特異
性およびヒト抗体分子により与えられたエフェクター機
能を有する。
一般に、これらのキメラ抗体の生産に使用される操作は
次の段階からなる（若干の段階の順序は交換することが
できる）： （ａ） 抗体分子の抗原結合部をエンコードする正し
い遺伝子セグメントを確認およびクローン化する段階；
この遺伝子セグメント〔重鎖に対するＶＤＪ、可変、多
様性および連結領域、または軽鎖に対するＶＪ、可変、
連結領域として（あるいは単にＶまたは可変領域として
）知られる〕はｃＤＮＡまたはゲノム形態であることが
できる； （ｂ） 不変部領域またはその所望部分をエンコード
する遺伝子セグメントをクローン化する段階；（Ｃ）
完全キメラ抗体が転写可能および翻訳可能形態でエン
コードされるように可変領域を不変部領域と連結する段
階： （ｄ） この構築物を、選択可能標識および遺伝子調
節領域例えばプロモーター、エンハンサ−およびポＩＪ
（Ａ）添加シグナルを含むベクター中へ連結する段階； （ｅ） この構築物を細菌中で増幅する段階；（ｆ）
ＤＮＡを直核細胞、最もしばしば哺乳動物リンパ球中へ
導入（トランスフェクション）する段階； （（イ）選択可能標識を発現する細胞について選択する
段階； （５）所望キメラ抗体を発現する細胞をスクリーンする
段階；ふよび （１）抗体を適当な結合特異性およびエフェクター機能
を試験する段階。
次の段階からなる（若干の段階の順序は交換することが
できる）： （ａ） 抗体分子の抗原結合部をエンコードする正し
い遺伝子セグメントを確認およびクローン化する段階；
この遺伝子セグメント〔重鎖に対するＶＤＪ、可変、多
様性および連結領域、または軽鎖に対するＶＪ、可変、
連結領域として（あるいは単にＶまたは可変領域として
）知られる〕はｃＤＮＡまたはゲノム形態であることが
できる； （ｂ） 不変部領域またはその所望部分をエンコード
する遺伝子セグメントをクローン化する段階；（Ｃ）
完全キメラ抗体が転写可能および翻訳可能形態でエン
コードされるように可変領域を不変部領域と連結する段
階： （ｄ） この構築物を、選択可能標識および遺伝子調
節領域例えばプロモーター、エンハンサ−およびポＩＪ
（Ａ）添加シグナルを含むベクター中へ連結する段階； （ｅ） この構築物を細菌中で増幅する段階；（ｆ）
ＤＮＡを直核細胞、最もしばしば哺乳動物リンパ球中へ
導入（トランスフェクション）する段階； （（イ）選択可能標識を発現する細胞について選択する
段階； （５）所望キメラ抗体を発現する細胞をスクリーンする
段階；ふよび （１）抗体を適当な結合特異性およびエフェクター機能
を試験する段階。
若干の明らかな抗原結合特異性の抗体はキメラタンパク
質の生産に関するこれらのプロトルコにより操作されて
いる。〔例えば、抗ＴＮＰ ニブ−リア：／ （Ｂｏｕ
ｌｉａｎｎｅ）ほか、１９８４、ネイチャー（Ｎａｔｕ
ｒｅ） 、ｖｏｗ、 ３１２、ｐ、 ６４３ ；抗腫
瘍抗体：サハガ：／ （Ｓａｈａｇａｎ）ほか、１９８
６−ジャーナル・オフ・イムノロジー（Ｊ、 Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ、）、ｖｏｆ１３７：１（１６６）。同随に、若
干の異なるエフェクター機能が、抗原結合領域をエンコ
ードする配列に新配列を連結することにより達成された
。
質の生産に関するこれらのプロトルコにより操作されて
いる。〔例えば、抗ＴＮＰ ニブ−リア：／ （Ｂｏｕ
ｌｉａｎｎｅ）ほか、１９８４、ネイチャー（Ｎａｔｕ
ｒｅ） 、ｖｏｗ、 ３１２、ｐ、 ６４３ ；抗腫
瘍抗体：サハガ：／ （Ｓａｈａｇａｎ）ほか、１９８
６−ジャーナル・オフ・イムノロジー（Ｊ、 Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ、）、ｖｏｆ１３７：１（１６６）。同随に、若
干の異なるエフェクター機能が、抗原結合領域をエンコ
ードする配列に新配列を連結することにより達成された
。
これらの若干には酵素〔ノイバーガー（Ｎｅｕｂｅｒｇ
ｅｒ）ほか、１９８４、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）
３１２ ：６（１４］、他の種の免疫グロブリンネ変
部領域および他の免疫グロブリン鎖の不変部領域〔シャ
口：／ （Ｓｈａｒｏｎ）ほか、１９８４、ネイチャー
（Ｎａｔｕｒｅ）３０９ ：３６４ ；タフ （Ｔａｎ
）ほか、１９８５、ジャーナル・オフ・イムノロジー（
Ｊ、 ｒｍｍｕ口（１１．）、ｖｏｌ、１３５：３５
６５〜３５６７）が含まれる。
ｅｒ）ほか、１９８４、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）
３１２ ：６（１４］、他の種の免疫グロブリンネ変
部領域および他の免疫グロブリン鎖の不変部領域〔シャ
口：／ （Ｓｈａｒｏｎ）ほか、１９８４、ネイチャー
（Ｎａｔｕｒｅ）３０９ ：３６４ ；タフ （Ｔａｎ
）ほか、１９８５、ジャーナル・オフ・イムノロジー（
Ｊ、 ｒｍｍｕ口（１１．）、ｖｏｌ、１３５：３５
６５〜３５６７）が含まれる。
２．２を目同組換え
分子生物学の分野における他の最近の進歩は、培養哺乳
動物細胞が染色体ＤＮＡ中へ、プラスミド配列に相同性
の配列を含む染色体位置に外因性プラスミドＤＮＡを組
込むことを見出したことである。この事象は相同組換え
として示される〔ホルガー（Ｆｏｌｇｅｒ）ほか、１９
８２、モレキュラル・セルラー・バイオロジー（！、（
ｏｆ、 Ｃｅ１ｌ、 ８ｉｏ１． ）、２．１３７２〜
１３８７；ホルガー（Ｆｏｌｇｅｒ）ほか、１９８４、
シンボシア・オン・クオンティタティブ・バイオロジー
（Ｓｙｍｐ、 Ｑｕａｎｔ、 Ｂｉｏｌ、）、４９．１
２３〜１３８；クチャラバチ（Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔ
ｉ ）ほか、ｌ９８４、プロシーデイングズ・オフ・ザ
・ナショナル・アカテ′ミー・オフ゛・サイエンス（Ｐ
ｒｏｃ、Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、） ＩＳＡ８
Ｌ ３１５ ：３〜３１５７；リン（Ｌｉｎ）ほか、
１９８５、プロシーディングズ・オフ・ザ・ナショナル
・アカデミ−・オフ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔ
ｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、）［ＩＳＡ、８２．１３９
１〜１３９５；ロバート・ド・サン・ビンセント（Ｒｏ
ｂｅｒｔ ｄｅ ５ａｉｎｔＶｉｎｃｅｎｔ）ほか、１
９８３、プロシーデイングズ・オフ・ザ・ナショナル・
アカテ′ミー・才ブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔ
ｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、） ＵＳＡ、 ８０．２０
（１１〜２０（１６；シヤクレ（Ｓｈａｕｌ）ほか、１
９８５、プロシーデイングズ・オフ・ザ・ナショナル・
アカデミ−・オフ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ
、 Ａｃａｄ。
動物細胞が染色体ＤＮＡ中へ、プラスミド配列に相同性
の配列を含む染色体位置に外因性プラスミドＤＮＡを組
込むことを見出したことである。この事象は相同組換え
として示される〔ホルガー（Ｆｏｌｇｅｒ）ほか、１９
８２、モレキュラル・セルラー・バイオロジー（！、（
ｏｆ、 Ｃｅ１ｌ、 ８ｉｏ１． ）、２．１３７２〜
１３８７；ホルガー（Ｆｏｌｇｅｒ）ほか、１９８４、
シンボシア・オン・クオンティタティブ・バイオロジー
（Ｓｙｍｐ、 Ｑｕａｎｔ、 Ｂｉｏｌ、）、４９．１
２３〜１３８；クチャラバチ（Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔ
ｉ ）ほか、ｌ９８４、プロシーデイングズ・オフ・ザ
・ナショナル・アカテ′ミー・オフ゛・サイエンス（Ｐ
ｒｏｃ、Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、） ＩＳＡ８
Ｌ ３１５ ：３〜３１５７；リン（Ｌｉｎ）ほか、
１９８５、プロシーディングズ・オフ・ザ・ナショナル
・アカデミ−・オフ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔ
ｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、）［ＩＳＡ、８２．１３９
１〜１３９５；ロバート・ド・サン・ビンセント（Ｒｏ
ｂｅｒｔ ｄｅ ５ａｉｎｔＶｉｎｃｅｎｔ）ほか、１
９８３、プロシーデイングズ・オフ・ザ・ナショナル・
アカテ′ミー・才ブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔ
ｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、） ＵＳＡ、 ８０．２０
（１１〜２０（１６；シヤクレ（Ｓｈａｕｌ）ほか、１
９８５、プロシーデイングズ・オフ・ザ・ナショナル・
アカデミ−・オフ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ
、 Ａｃａｄ。
Ｓｃｉ、） ［ＪＳＡ 、 ８２．３７８１〜３７８４
）、哺乳動物細胞はまた非相同組換えとして示されるラ
ンダム染色体部位においてプラスミドＤＮＡを取込む酵
素機構を含む。相同組換えの頻度は組換え事象の１／１
００〜ｌ／１０００程度であると報告され、組換えの大
部分は非相同相互作用に由来する〔トー７ ス（Ｔｈｏ
ｍａｓ）ほか、１９８６、セル（Ｃｅｌｌ）、４４：４
１９〜４２８；スミシーズ（Ｓｍｉｔｈｉｅｓ）ほか、
１９８５、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、３１７：２３
０〜２３４；シヤクレ（Ｓｈａｕｌ）ほか、１９８５、
プロシーデイングズ・オフ・ザ・ナショナル・アカデミ
−・オフ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ
、Ｓｃｉ、）［ＩＳＡ 、 ８２．３７８１〜３７８４
；スミス（Ｓｍｉｔｈ）ほか、１９８４、シンボシア・
オン・クオンテイタティブ・バイオロジー（Ｓｙｍｐ、
Ｑｕａｎｔ、Ｂｉｏｌ、）、４９．１７１〜１８１；
サブラフ 二（Ｓｕｂｒａｍａｎ ｉ）ほか、１９８３
、モレキニラル・セルラー・バイオロジー（Ｍｏ１．Ｃ
ｅ１ｌ、 Ｂｉｏｌ、） 、３．１（１４０〜１０５２
］。相同組換えに対する細胞機構の存在は生体位で内因
性遺伝子の修飾を可能にする。
）、哺乳動物細胞はまた非相同組換えとして示されるラ
ンダム染色体部位においてプラスミドＤＮＡを取込む酵
素機構を含む。相同組換えの頻度は組換え事象の１／１
００〜ｌ／１０００程度であると報告され、組換えの大
部分は非相同相互作用に由来する〔トー７ ス（Ｔｈｏ
ｍａｓ）ほか、１９８６、セル（Ｃｅｌｌ）、４４：４
１９〜４２８；スミシーズ（Ｓｍｉｔｈｉｅｓ）ほか、
１９８５、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、３１７：２３
０〜２３４；シヤクレ（Ｓｈａｕｌ）ほか、１９８５、
プロシーデイングズ・オフ・ザ・ナショナル・アカデミ
−・オフ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ
、Ｓｃｉ、）［ＩＳＡ 、 ８２．３７８１〜３７８４
；スミス（Ｓｍｉｔｈ）ほか、１９８４、シンボシア・
オン・クオンテイタティブ・バイオロジー（Ｓｙｍｐ、
Ｑｕａｎｔ、Ｂｉｏｌ、）、４９．１７１〜１８１；
サブラフ 二（Ｓｕｂｒａｍａｎ ｉ）ほか、１９８３
、モレキニラル・セルラー・バイオロジー（Ｍｏ１．Ｃ
ｅ１ｌ、 Ｂｉｏｌ、） 、３．１（１４０〜１０５２
］。相同組換えに対する細胞機構の存在は生体位で内因
性遺伝子の修飾を可能にする。
若干の場合に、標的部位に相同性のＤＮＡのセグメント
および所望修飾を有する新配列のセグメントを含むプラ
スミドＤＮＡを細胞内に導入することにより染色体配列
を修飾できる条件が見出された〔トーマス（Ｔｈｏｍａ
ｓ）ほか、１９８６、セル（（：ｅｌｆ）、４０；４１
９〜４２８；スミシーズ（Ｓ＋ｎ１ｔｈ＋ｅｓ）ほか、
１９８５、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、３１７；２３
０〜２３４；スミス（Ｓｍｉｔｈ） ほか、１９８４：
シンボシア・オン・クオンテイタティブ・バイオロジー
（Ｓｙｍｐ、 Ｑｕａｎｔ、Ｂｉｏｌ、）、４９．１７
１〜１８１〕。哺乳動物染色体ＤＮＡと外因性プラスミ
ドＤＮＡとの間の相同組換えはプラスミドの取込みまた
は相同プラスミド配列を有する染色体配列の若干の置換
を生ずることができる。相同ＤＮＡ配列を置換する方法
は遺伝子変換として示される。取込みおよび変換事象は
ともに内因性標的部位に所望の新配列の配置を生ずるこ
とができる。
および所望修飾を有する新配列のセグメントを含むプラ
スミドＤＮＡを細胞内に導入することにより染色体配列
を修飾できる条件が見出された〔トーマス（Ｔｈｏｍａ
ｓ）ほか、１９８６、セル（（：ｅｌｆ）、４０；４１
９〜４２８；スミシーズ（Ｓ＋ｎ１ｔｈ＋ｅｓ）ほか、
１９８５、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、３１７；２３
０〜２３４；スミス（Ｓｍｉｔｈ） ほか、１９８４：
シンボシア・オン・クオンテイタティブ・バイオロジー
（Ｓｙｍｐ、 Ｑｕａｎｔ、Ｂｉｏｌ、）、４９．１７
１〜１８１〕。哺乳動物染色体ＤＮＡと外因性プラスミ
ドＤＮＡとの間の相同組換えはプラスミドの取込みまた
は相同プラスミド配列を有する染色体配列の若干の置換
を生ずることができる。相同ＤＮＡ配列を置換する方法
は遺伝子変換として示される。取込みおよび変換事象は
ともに内因性標的部位に所望の新配列の配置を生ずるこ
とができる。
しかしながら、相同組換えの方法は大抵はＮＥＯ法やＨ
ＰＲＴ法のような優性選択を提供する遺伝子を用いての
研究であり又それはほんの少数の細胞に対して研究され
ているに過ぎない。〔ソング（Ｓｏｎｇ）ほか、１９８
７、プロシーデイングズ・オフ・ザ・ナショナル・アカ
デミ−・オフ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、
Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、”） ［ＪＳＡ、 ８４ ：６８
２０〜６８２４；ルビ”−７ッほか（Ｒｕｂｉｎｉｔｚ
ａｎｄ Ｓｕｂｒａｍａｎｉ）、１９８６、モレキュラ
ル・セルラー・バイオロジー（！Ｊｏｌ、 Ｃｅ１ｌ、
Ｂ＋ｏｌ、） 、５ ：１６（１８〜１６１４；およ
びリスカイ （Ｌｉｓｋａｙ）；１９８３、セル（Ｃｅ
ｌｌ）、３５；ｌ ５７〜１６４，１゜リンパ球または
骨髄腫細胞がそのような事象を仲介できるかどうか、あ
るいは免疫グロブリン遺伝子をそのような方法により有
効に標的または組換えできるかどうかは測定されなかっ
た。
ＰＲＴ法のような優性選択を提供する遺伝子を用いての
研究であり又それはほんの少数の細胞に対して研究され
ているに過ぎない。〔ソング（Ｓｏｎｇ）ほか、１９８
７、プロシーデイングズ・オフ・ザ・ナショナル・アカ
デミ−・オフ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、
Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、”） ［ＪＳＡ、 ８４ ：６８
２０〜６８２４；ルビ”−７ッほか（Ｒｕｂｉｎｉｔｚ
ａｎｄ Ｓｕｂｒａｍａｎｉ）、１９８６、モレキュラ
ル・セルラー・バイオロジー（！Ｊｏｌ、 Ｃｅ１ｌ、
Ｂ＋ｏｌ、） 、５ ：１６（１８〜１６１４；およ
びリスカイ （Ｌｉｓｋａｙ）；１９８３、セル（Ｃｅ
ｌｌ）、３５；ｌ ５７〜１６４，１゜リンパ球または
骨髄腫細胞がそのような事象を仲介できるかどうか、あ
るいは免疫グロブリン遺伝子をそのような方法により有
効に標的または組換えできるかどうかは測定されなかっ
た。
３、 発明の概要
本発明は抗体分子の修飾並びにキメラ抗体分子を発生お
よび製造する方法を指向し、抗原結合領域が（ａ）所望
特性例えばエフェクター機能、クラス（例ｔｌｆｌ ｇ
Ｇ、Ｅ ｇＡ、Ｉ ｇＭ、ｒ ｇＤまたはＩｇＥ）、由
来（例えばヒトまたは他の種）を与える免疫グロブリン
ネ変部領域またはその若干の部分に；あるいは（ｂ）キ
メラ抗体分子に若干の他の機能を与える他の型の分子（
例えば酵素、毒素、生物活性ペプチド、増殖因子、阻止
因子あるいは薬物、毒素または他の分子に対する結合を
容易にするかリンカ−ペプチドなど）に連結される。
よび製造する方法を指向し、抗原結合領域が（ａ）所望
特性例えばエフェクター機能、クラス（例ｔｌｆｌ ｇ
Ｇ、Ｅ ｇＡ、Ｉ ｇＭ、ｒ ｇＤまたはＩｇＥ）、由
来（例えばヒトまたは他の種）を与える免疫グロブリン
ネ変部領域またはその若干の部分に；あるいは（ｂ）キ
メラ抗体分子に若干の他の機能を与える他の型の分子（
例えば酵素、毒素、生物活性ペプチド、増殖因子、阻止
因子あるいは薬物、毒素または他の分子に対する結合を
容易にするかリンカ−ペプチドなど）に連結される。
本発明は新規な組換えＤＮＡベクターを、（ａ）抗体分
子の抗原結合部位が不変のま＼であるがしかし抗体分子
の不変部領域またはその一部分が置換または改変される
ように所望抗原特異性を有する抗体を生産する細胞系；
あるいは（ｂ）抗体分子の不変部領域が不変のま５であ
るがしかし抗体分子の可変領域またはその一部分が置換
または改変されるように所望エフェクター機能を示すこ
とができる所望のクラスの抗体を生産する細胞系、にお
ける相同組換えにより達成される標的遺伝子修飾の工学
に使用する。
子の抗原結合部位が不変のま＼であるがしかし抗体分子
の不変部領域またはその一部分が置換または改変される
ように所望抗原特異性を有する抗体を生産する細胞系；
あるいは（ｂ）抗体分子の不変部領域が不変のま５であ
るがしかし抗体分子の可変領域またはその一部分が置換
または改変されるように所望エフェクター機能を示すこ
とができる所望のクラスの抗体を生産する細胞系、にお
ける相同組換えにより達成される標的遺伝子修飾の工学
に使用する。
本発明のＩＢ様によれば、新規組換えＤＮＡベクターが
、所望抗原特異性を有する抗体を生産する細胞系のトラ
ンスフェクトに使用される。この新規組換えＤＮＡベク
ターは細胞系中の免疫グロブリンネ変部領をエンコード
する遺伝子のすべてまたは一部分を置換する「置換遺伝
子」 （例えば、置換遺伝子はヒト免疫グロブリン、特
定免疫グロブリンクラス、あるいは酵素、毒素、生物活
性ペプチド、増殖因子、阻止因子、または薬物、毒素も
しくは他の分子に対する結合を容易にするリンカ−ペプ
チドなど）、並びに抗体生産細胞内の相同組換えおよび
標的遺伝子変換を可能にする「標的配列」を含む。本発
明の他の態様において、新規ＤＮＡベクターが所望のエ
フェクター機能を有する抗体を生産する細胞系のトラン
スフェクトに使用され、その場合に新規組換えベクター
中に含まれる置換遺伝子が所望の抗原特異性を有する抗
体分子の領域のすべてまたは一部分をエンコードするこ
とができ、組換えベクター中に含まれる標的配列が抗体
生産細胞内の相同組換えおよび標的遺伝子修飾を可能に
する。いずれのＢｌにおいても、可変または不変部領域
の一部分のみが置換されると、生ずるキメラ抗体が同一
抗原を規定し、および（または）キメラ抗体が一層大き
い抗原特異性、−層大きい親和性結合定数、高いエフェ
クター機能、またはトランスフェクト抗体生産細胞系に
よる高い分泌および生産などを示すことができるように
さらに改変または改良される同一エフェクター機能を有
することができる。実施される態様に関係なく、取込み
ＤＮＡに対する選択（選択可能標識による）、キメラ抗
体生産に対するスクリーニング、および細胞クローン化
の方法を用いてキメラ抗体を生産する細胞のクローンを
得ることができる。
、所望抗原特異性を有する抗体を生産する細胞系のトラ
ンスフェクトに使用される。この新規組換えＤＮＡベク
ターは細胞系中の免疫グロブリンネ変部領をエンコード
する遺伝子のすべてまたは一部分を置換する「置換遺伝
子」 （例えば、置換遺伝子はヒト免疫グロブリン、特
定免疫グロブリンクラス、あるいは酵素、毒素、生物活
性ペプチド、増殖因子、阻止因子、または薬物、毒素も
しくは他の分子に対する結合を容易にするリンカ−ペプ
チドなど）、並びに抗体生産細胞内の相同組換えおよび
標的遺伝子変換を可能にする「標的配列」を含む。本発
明の他の態様において、新規ＤＮＡベクターが所望のエ
フェクター機能を有する抗体を生産する細胞系のトラン
スフェクトに使用され、その場合に新規組換えベクター
中に含まれる置換遺伝子が所望の抗原特異性を有する抗
体分子の領域のすべてまたは一部分をエンコードするこ
とができ、組換えベクター中に含まれる標的配列が抗体
生産細胞内の相同組換えおよび標的遺伝子修飾を可能に
する。いずれのＢｌにおいても、可変または不変部領域
の一部分のみが置換されると、生ずるキメラ抗体が同一
抗原を規定し、および（または）キメラ抗体が一層大き
い抗原特異性、−層大きい親和性結合定数、高いエフェ
クター機能、またはトランスフェクト抗体生産細胞系に
よる高い分泌および生産などを示すことができるように
さらに改変または改良される同一エフェクター機能を有
することができる。実施される態様に関係なく、取込み
ＤＮＡに対する選択（選択可能標識による）、キメラ抗
体生産に対するスクリーニング、および細胞クローン化
の方法を用いてキメラ抗体を生産する細胞のクローンを
得ることができる。
従って、単クローン性抗体に対する修飾をエンコードす
るＤＮＡの片を直接Ｂ細胞またはハイブリドーマ細胞系
内の発現免疫グロブリン遺伝子部位に標的することがで
きる。個々の修飾のためのＤ Ｎ Ａ構築物を用いて任
意の単クローン性細胞系またはハイブリドーマのタンパ
ク質生成物を改変することができる。そのような操作は
有用な抗原特異性を発現するそれぞれのＢ細胞クローン
の重ふよび軽鎖可変領域遺伝子をともにクローン化する
費用および時間のか５る仕事を回避する。可変領域遺伝
子をクローン化する方法の回避に加えて、キメラ抗体の
発現の水準は、遺伝子がランダム位置よりもむしろその
天然染色体位置にあるときに高いであろう。
るＤＮＡの片を直接Ｂ細胞またはハイブリドーマ細胞系
内の発現免疫グロブリン遺伝子部位に標的することがで
きる。個々の修飾のためのＤ Ｎ Ａ構築物を用いて任
意の単クローン性細胞系またはハイブリドーマのタンパ
ク質生成物を改変することができる。そのような操作は
有用な抗原特異性を発現するそれぞれのＢ細胞クローン
の重ふよび軽鎖可変領域遺伝子をともにクローン化する
費用および時間のか５る仕事を回避する。可変領域遺伝
子をクローン化する方法の回避に加えて、キメラ抗体の
発現の水準は、遺伝子がランダム位置よりもむしろその
天然染色体位置にあるときに高いであろう。
３．１定義
単数または複数形態で用いる次の用語は次に示される意
味を有する。
味を有する。
キメラ抗体：
（ａ）不変部領域またはその一部分が改変、置換または
交換され、抗原結合部位（可変領域）が、異なるかまた
は改変されたクラス、エフェクター機能および（または
）種の不変部領域、あるいはキメラ抗体に新しい性質を
与える全く異なる分子、例えば酵素、毒素、ホルモン、
増殖因子、薬物などに連結されたか；あるいはら）可変
領域またはその一部分が、異なるかまたは改変された抗
原特異性を有する可変領域で改変、置換または交換され
た抗体分子。
交換され、抗原結合部位（可変領域）が、異なるかまた
は改変されたクラス、エフェクター機能および（または
）種の不変部領域、あるいはキメラ抗体に新しい性質を
与える全く異なる分子、例えば酵素、毒素、ホルモン、
増殖因子、薬物などに連結されたか；あるいはら）可変
領域またはその一部分が、異なるかまたは改変された抗
原特異性を有する可変領域で改変、置換または交換され
た抗体分子。
置換遺伝子：
抗体分子の不変部領域または可変領域のすべてまたは一
部分を置換してキメラ抗体分子を形成する生成物をエン
コードする遺伝子。置換遺伝子は抗体生産細胞系のトラ
ンスフェクトに使用される本発明の新規組換えＤＮＡ標
的ベクター中に構築される。不変部類域のすべてまたは
一部分の修飾のための本発明の置換遺伝子は特定のエフ
ェクター機能、クラスおよび由来を有する免疫グロブリ
ンネ変部領域（例えば、ヒト免疫グロブリンまたは任意
の他の種のＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤまたは■ｇ
Ｅ不変不変域領域るいは免疫グロブリンの不変部類域の
活性または性質を修飾する不変部類域の一部分；並びに
キメラ抗体分子に若干の新機能を与える他の分子、例え
ばＵ素、毒素、ホルモン、増殖因子、結合可能リンカ−
などをエンコードする遺伝子を含むことができ、しかし
それらに限定されない。可変領域のすべてまたは一部分
の修飾のための本発明の置換遺伝子は、異なる抗原親和
性または特異性を有する異なる可変領域をエンコードす
る免疫グロブリン可変領域、あるいは生ずるキメラ抗体
が抗原に対し一層大きい親和性または高度の特異性を有
するように免疫グロブリンの可変領域の活性または性質
を修飾する可変領域の一部分を含むことができ、しかし
それらに限定されない。
部分を置換してキメラ抗体分子を形成する生成物をエン
コードする遺伝子。置換遺伝子は抗体生産細胞系のトラ
ンスフェクトに使用される本発明の新規組換えＤＮＡ標
的ベクター中に構築される。不変部類域のすべてまたは
一部分の修飾のための本発明の置換遺伝子は特定のエフ
ェクター機能、クラスおよび由来を有する免疫グロブリ
ンネ変部領域（例えば、ヒト免疫グロブリンまたは任意
の他の種のＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤまたは■ｇ
Ｅ不変不変域領域るいは免疫グロブリンの不変部類域の
活性または性質を修飾する不変部類域の一部分；並びに
キメラ抗体分子に若干の新機能を与える他の分子、例え
ばＵ素、毒素、ホルモン、増殖因子、結合可能リンカ−
などをエンコードする遺伝子を含むことができ、しかし
それらに限定されない。可変領域のすべてまたは一部分
の修飾のための本発明の置換遺伝子は、異なる抗原親和
性または特異性を有する異なる可変領域をエンコードす
る免疫グロブリン可変領域、あるいは生ずるキメラ抗体
が抗原に対し一層大きい親和性または高度の特異性を有
するように免疫グロブリンの可変領域の活性または性質
を修飾する可変領域の一部分を含むことができ、しかし
それらに限定されない。
標的配列：
抗体分子を生ずる細胞の染色体中の抗体分子の変換され
る領域にフランクするかまたは隣接して生ずるＤＮＡ配
列に相同性の配列。標的配列は抗体生産細胞系のトラン
スフェクトに使用される本発明の新規組換えＤＮＡベク
ター中に構築される。
る領域にフランクするかまたは隣接して生ずるＤＮＡ配
列に相同性の配列。標的配列は抗体生産細胞系のトラン
スフェクトに使用される本発明の新規組換えＤＮＡベク
ター中に構築される。
不変部類域のすべてまたは一部分の置換またはその中へ
の挿入を指向する重鎖組換えのための標的配列はＶ、Ｄ
ｌＪおよびスイッチ領域（イントロンと称される介在配
列を含む）、並びにトランスフェクトされる抗体生産細
胞系により発現される特定重鎖不変部領域遺伝子に関連
または隣接するフランキング配列のすべてまたは一部分
を含むことができ、しかしそれらに限定されず、また不
変部類域（イントロンを含む）内または下流に位置する
領域を含むことができる。不変部類域のすべてまたは一
部分の置換またはその中への挿入を指向する軽鎖組換え
のための標的配列はＶおよびＪ＠域、それらの上流のフ
ランキング配列、並びにトランスフェクトされる抗体生
産細胞系により発現される軽鎖可変領域遺伝子に関連ま
たは隣接する介在配列（イントロン）を含むことができ
、しかしそれらに限定されず、また不変部類域（イント
ロンを含む）内またはその下流に位置する領域を含むこ
とができる。
の挿入を指向する重鎖組換えのための標的配列はＶ、Ｄ
ｌＪおよびスイッチ領域（イントロンと称される介在配
列を含む）、並びにトランスフェクトされる抗体生産細
胞系により発現される特定重鎖不変部領域遺伝子に関連
または隣接するフランキング配列のすべてまたは一部分
を含むことができ、しかしそれらに限定されず、また不
変部類域（イントロンを含む）内または下流に位置する
領域を含むことができる。不変部類域のすべてまたは一
部分の置換またはその中への挿入を指向する軽鎖組換え
のための標的配列はＶおよびＪ＠域、それらの上流のフ
ランキング配列、並びにトランスフェクトされる抗体生
産細胞系により発現される軽鎖可変領域遺伝子に関連ま
たは隣接する介在配列（イントロン）を含むことができ
、しかしそれらに限定されず、また不変部類域（イント
ロンを含む）内またはその下流に位置する領域を含むこ
とができる。
可変領域のすべてまたは一部分の置換またはその中への
挿入を指向する重鎖組換えのための標的配列はＶＳＤお
よびＪ領域（イントロンを含む）並びにトランスフェク
トされる抗体生産細胞系により発現される特定可変領域
遺伝子に関連またはｌ！Ｊ接するフランキング領域配列
のすべてまたは一部分を含むことができ、しかしそれら
に限定されない。可変領域のすべてまたは一部分の置換
またはその中への挿入を指向する軽鎖組換えのための標
的配列はＶｉ６よびＪ領域（イントロンを含む）並びに
トランスフェクトされる抗体生産細胞系により発現され
る軽鎖可変領域遺伝子に関連するかまたは隣接するフラ
ンキング配列を含むことができ、しかしそれらに限定さ
れない。
挿入を指向する重鎖組換えのための標的配列はＶＳＤお
よびＪ領域（イントロンを含む）並びにトランスフェク
トされる抗体生産細胞系により発現される特定可変領域
遺伝子に関連またはｌ！Ｊ接するフランキング領域配列
のすべてまたは一部分を含むことができ、しかしそれら
に限定されない。可変領域のすべてまたは一部分の置換
またはその中への挿入を指向する軽鎖組換えのための標
的配列はＶｉ６よびＪ領域（イントロンを含む）並びに
トランスフェクトされる抗体生産細胞系により発現され
る軽鎖可変領域遺伝子に関連するかまたは隣接するフラ
ンキング配列を含むことができ、しかしそれらに限定さ
れない。
標的ベクター
標的ベクターでトランスフェクトされた抗体生産細胞に
よるキメラ抗体の生産の工学に使用できる標的配列およ
び置換遺伝子を含む組換えヌクレオチドベクター。標的
ベクターはベクターの標的配列に相同性の配列（類）を
含み、（ａ）所望抗原特異性；（ｂ）所望不変部領域；
または（Ｃ）他の所望特性例えば高分泌水準、大規模培
養適応性など、を有する抗体を生産する細胞系のトラン
スフェクトに使用される。
よるキメラ抗体の生産の工学に使用できる標的配列およ
び置換遺伝子を含む組換えヌクレオチドベクター。標的
ベクターはベクターの標的配列に相同性の配列（類）を
含み、（ａ）所望抗原特異性；（ｂ）所望不変部領域；
または（Ｃ）他の所望特性例えば高分泌水準、大規模培
養適応性など、を有する抗体を生産する細胞系のトラン
スフェクトに使用される。
次の略号は次に示す意味を有する。
ＦＩＴＣ：フルオレセインイソチオシネートＨＲＰ
：西洋ワサビペルオキシダーゼｈｕ：ヒト ｈｕｃｒｌ ：ヒトガンマ免疫グロブリン１の不変部
領域エキソン ｈｕｌｇＧ ：ヒトガンマ免疫グロブリンｍ
：マウス ｍＡＢ ：単クローン性抗体 ｍＩｇＧ：マウスガンマ免疫グロブリン４． 図面の説
明 第１図は本発明の標的ベクターを用いるｔ目間組換えに
よる遺伝子買換の一般化図式を線図的に示す。可変（Ｖ
）、多様性（Ｄ）、連結（Ｊ）、スイッチ（Ｓ）および
不変部（Ｃ）領域が示される。
：西洋ワサビペルオキシダーゼｈｕ：ヒト ｈｕｃｒｌ ：ヒトガンマ免疫グロブリン１の不変部
領域エキソン ｈｕｌｇＧ ：ヒトガンマ免疫グロブリンｍ
：マウス ｍＡＢ ：単クローン性抗体 ｍＩｇＧ：マウスガンマ免疫グロブリン４． 図面の説
明 第１図は本発明の標的ベクターを用いるｔ目間組換えに
よる遺伝子買換の一般化図式を線図的に示す。可変（Ｖ
）、多様性（Ｄ）、連結（Ｊ）、スイッチ（Ｓ）および
不変部（Ｃ）領域が示される。
パネルＡはＶ、Ｄ、Ｊ、ＳおよびＣ領域にわたる任意の
部分に相同性の標的配列を用いる重鎖遺伝子の不変部ま
たは可変領域のすべてまたは一部分の置換を略示する。
部分に相同性の標的配列を用いる重鎖遺伝子の不変部ま
たは可変領域のすべてまたは一部分の置換を略示する。
パネルＢはＶＳＪおよびＣ領域にわたる任意の部分に相
同性の標的配列を用いる軽鎖遺伝子の不変部または可変
領域のすべてまたは一部分の置換を略示する。パネルＣ
は置換される遺伝子にフランクする配列を用いる軽また
は重鎖遺伝子中の可変または不変部領域のすべてまたは
一部分の置換を略示する。
同性の標的配列を用いる軽鎖遺伝子の不変部または可変
領域のすべてまたは一部分の置換を略示する。パネルＣ
は置換される遺伝子にフランクする配列を用いる軽また
は重鎖遺伝子中の可変または不変部領域のすべてまたは
一部分の置換を略示する。
第２図は標的プラスミド９Ｒ８Ｖ−１４０−ｎｅ。
／ＨｕＣ−ガンマ１／ＭｕＪ４／ｅの構築を線図的に示
す。標的配列は第４連結領域（Ｊ４）、ＩｇＨエンハン
サ−（ｅ）およびスイッチ領域に対するイントロン配列
５′を含むマウス免疫グロブリン重鎖（ＩｇＨ）から誘
導された２、 ２ ｋｂ ＨｉｎｄＩＩＩ ７ラグメン
トを含む。標的配列はヒトガンマ１不変部領域を含むヒ
）ＩｇＧ１重鎖部位の７．ＱｋｂＨｉｎｄ ［Ｉ −Ｂ
ａｍ Ｈｒフラグメントを含む置換遺伝子に５′に配置
される。
す。標的配列は第４連結領域（Ｊ４）、ＩｇＨエンハン
サ−（ｅ）およびスイッチ領域に対するイントロン配列
５′を含むマウス免疫グロブリン重鎖（ＩｇＨ）から誘
導された２、 ２ ｋｂ ＨｉｎｄＩＩＩ ７ラグメン
トを含む。標的配列はヒトガンマ１不変部領域を含むヒ
）ＩｇＧ１重鎖部位の７．ＱｋｂＨｉｎｄ ［Ｉ −Ｂ
ａｍ Ｈｒフラグメントを含む置換遺伝子に５′に配置
される。
第３図はヒ）ＩｇＧ１組換えベクターの地図である。ベ
クターはＸｂａ１部位の除去に修飾されたマウス重鎖エ
ンハンサ−を含む２．２ ｋｂ ）ＩｉｎｄＩＩ［フラ
グメント、ヒトガンマ１の不変部領域エヰソン（ｈｕＣ
ｒ ｌ ）を含む３． Ｑ ｋｂ Ｈｉｎｄ ［［／
Ｐｖｕ ＩＩ ７ラグメント、ｎｅｏをエンコードする
ｐ Ｓ Ｖ ２ ／ｎｅｏから誘導された２、 ０ ｋ
ｂ Ｂｇ ｌ ｎ／ＢａｍＨＩ ７ラグメント、ヒトＣ
Ｍ Ｖエンハンサ−およびプロモーターをもつ６６７
ｂｐ Ｂａｊ！Ｉ／５ｓｔＩ７ラグメント、並びに複製
開始点およびアンピシリン耐性遺伝子を含むｐＢＲ３２
２の２．３ ｋｂ ＰｖｕＩＩ／旧ｎｄＩＩ［フラグメ
ントを含む。ＣＭＶを含むＢａ！■／５ｓｔＩフラグメ
ントはｐＥＭＢＬ１８の５ｓｔｒ／ＨｉｎｄＩＩ［部位
中へ転移させ、旧ｎｄＩ［［／５ｓｔＩ）弓グメントと
して除き、ＰｉｃｌＱＲ中の同部位間にクローン化し、
次いでＳｍａＩ／ＢｇｌＩＩフラグメントとして分離し
て構築物中のＰｖｕｌｌおよびＢｇｆ■部位間部位置し
た。同様にヒ）Ｃガンマ１エキソンをもつＨｉｎｄ ｇ
ｌ ／ Ｐｖｕ ｆｆフラグメントはｐｕｃ９の旧ｎｄ
ＩＩＩおよび旧ｎｃ ＩＩ Ｂ位中ヘクローン化し、次
いで旧ｎｄｌＩＩ／ＢａｍＨＩフラグメントとして転移
させた。
クターはＸｂａ１部位の除去に修飾されたマウス重鎖エ
ンハンサ−を含む２．２ ｋｂ ）ＩｉｎｄＩＩ［フラ
グメント、ヒトガンマ１の不変部領域エヰソン（ｈｕＣ
ｒ ｌ ）を含む３． Ｑ ｋｂ Ｈｉｎｄ ［［／
Ｐｖｕ ＩＩ ７ラグメント、ｎｅｏをエンコードする
ｐ Ｓ Ｖ ２ ／ｎｅｏから誘導された２、 ０ ｋ
ｂ Ｂｇ ｌ ｎ／ＢａｍＨＩ ７ラグメント、ヒトＣ
Ｍ Ｖエンハンサ−およびプロモーターをもつ６６７
ｂｐ Ｂａｊ！Ｉ／５ｓｔＩ７ラグメント、並びに複製
開始点およびアンピシリン耐性遺伝子を含むｐＢＲ３２
２の２．３ ｋｂ ＰｖｕＩＩ／旧ｎｄＩＩ［フラグメ
ントを含む。ＣＭＶを含むＢａ！■／５ｓｔＩフラグメ
ントはｐＥＭＢＬ１８の５ｓｔｒ／ＨｉｎｄＩＩ［部位
中へ転移させ、旧ｎｄＩ［［／５ｓｔＩ）弓グメントと
して除き、ＰｉｃｌＱＲ中の同部位間にクローン化し、
次いでＳｍａＩ／ＢｇｌＩＩフラグメントとして分離し
て構築物中のＰｖｕｌｌおよびＢｇｆ■部位間部位置し
た。同様にヒ）Ｃガンマ１エキソンをもつＨｉｎｄ ｇ
ｌ ／ Ｐｖｕ ｆｆフラグメントはｐｕｃ９の旧ｎｄ
ＩＩＩおよび旧ｎｃ ＩＩ Ｂ位中ヘクローン化し、次
いで旧ｎｄｌＩＩ／ＢａｍＨＩフラグメントとして転移
させた。
第４図はヒトｃガンマｌ配列の標的に用いた他のプラス
ミドである。第４Ａおよび４Ｂ図に示すプラスミドは第
３図に示したプラスミドに対する記載と同様であるが、
しかし第４Ａおよび４Ｂ図に示される両プラスミドはｐ
ｓＶ２ｎｅｏ （ジャーナル・オフ・モレキュラル・
アンド・アプライド・シネティックス（Ｊ、 Ｍｏ１ｅ
ｃ、＾ｐｐｌ、 Ｇｅｎｅｔ、） 。
ミドである。第４Ａおよび４Ｂ図に示すプラスミドは第
３図に示したプラスミドに対する記載と同様であるが、
しかし第４Ａおよび４Ｂ図に示される両プラスミドはｐ
ｓＶ２ｎｅｏ （ジャーナル・オフ・モレキュラル・
アンド・アプライド・シネティックス（Ｊ、 Ｍｏ１ｅ
ｃ、＾ｐｐｌ、 Ｇｅｎｅｔ、） 。
Ｉ、３２７〜３４１１９８２］（７）ＳＶ４０工７ハン
サーおよびプロモーターをＣｌ４Ｖプロモーターおよび
エンハンサ−の代りに含む５００ ｂｐ ａｇ ｆＩＩ
／ＰｖｕｌＩを有し、プラスミド４Ｂはヒトガンマｌを
エンコードする７ ｋｂ ＨｉｎｄＩＩＩ／ ＢａｍＨ
Ｉ ７ラグメントを不変部領域エキソンの下流のより大
きい配列とともに有する。
サーおよびプロモーターをＣｌ４Ｖプロモーターおよび
エンハンサ−の代りに含む５００ ｂｐ ａｇ ｆＩＩ
／ＰｖｕｌＩを有し、プラスミド４Ｂはヒトガンマｌを
エンコードする７ ｋｂ ＨｉｎｄＩＩＩ／ ＢａｍＨ
Ｉ ７ラグメントを不変部領域エキソンの下流のより大
きい配列とともに有する。
５、発明の詳細な説明
本発明は生体内相同組換えによりゲノム内の特定位置に
対する所望の配列改変の指向に新規組換えＤ Ｎ Ａベ
クターを用いるキメラ抗体を製造する方法を指向する。
対する所望の配列改変の指向に新規組換えＤ Ｎ Ａベ
クターを用いるキメラ抗体を製造する方法を指向する。
本発明の方法を用いて抗体分子のタンパク質配列を、抗
体生産細胞系を適当な「標的ベクター」でトランスフェ
クトすることにより修飾することができる。本発明の１
態様において、所望の抗原特異性を有する抗体分子を生
産する細胞系を、「置換遺伝子」および「標的配列」を
エンコードする組換えＤ Ｎ Ａ配列を含む本発明の標
的ベクターでトランスフェクトされる。置換遺伝子は細
胞系により発現される抗体分子の不変部領域のすべてま
たは一部分を置換する所望分子をエンコードする。例え
ば置換遺伝子はヒトまたは所望の種のＩｇＧ、ＩｇＡＳ
ＩｇＭ、ＩｇＤまたはＩｇＥ不変不変域領域みしかし
それらに限定されない特定のエフェクター機能、クラス
および（または）由来を有する免疫グロブリンネ変部領
域のすべてまたは一部分をエンコードすることができ；
あるいは置換遺伝子は生ずるキメラ抗体に若干の他の機
能を与えることができる他の型の分子、例えば酵素、毒
素、生物活性ペプチド、増消囚子、阻止因子、結合可能
ペプチドリンカ−などをエンコードすることができる。
体生産細胞系を適当な「標的ベクター」でトランスフェ
クトすることにより修飾することができる。本発明の１
態様において、所望の抗原特異性を有する抗体分子を生
産する細胞系を、「置換遺伝子」および「標的配列」を
エンコードする組換えＤ Ｎ Ａ配列を含む本発明の標
的ベクターでトランスフェクトされる。置換遺伝子は細
胞系により発現される抗体分子の不変部領域のすべてま
たは一部分を置換する所望分子をエンコードする。例え
ば置換遺伝子はヒトまたは所望の種のＩｇＧ、ＩｇＡＳ
ＩｇＭ、ＩｇＤまたはＩｇＥ不変不変域領域みしかし
それらに限定されない特定のエフェクター機能、クラス
および（または）由来を有する免疫グロブリンネ変部領
域のすべてまたは一部分をエンコードすることができ；
あるいは置換遺伝子は生ずるキメラ抗体に若干の他の機
能を与えることができる他の型の分子、例えば酵素、毒
素、生物活性ペプチド、増消囚子、阻止因子、結合可能
ペプチドリンカ−などをエンコードすることができる。
標的ベクターの標的配列はトランスフェクトされる細胞
系により生産される免疫グロブリンの不変部類域に対す
る成熟遺伝子コーディング配列または不変部類域に対す
る成熟コーディング配列の適当な８分の内またはそれに
隣接する染色体中に認められるＤＮＡ配列に相同性であ
る。トランスフェクション後、抗体生産細胞系内に相同
組換えが生じ；これらの組換え事象の若干は置換遺伝子
による免疫グロブリン遺伝子の不変部類域のすべてまた
は一部分の置換、従ってトランスフェクト細胞によるキ
メラ抗体分子の発現を生ずる。
系により生産される免疫グロブリンの不変部類域に対す
る成熟遺伝子コーディング配列または不変部類域に対す
る成熟コーディング配列の適当な８分の内またはそれに
隣接する染色体中に認められるＤＮＡ配列に相同性であ
る。トランスフェクション後、抗体生産細胞系内に相同
組換えが生じ；これらの組換え事象の若干は置換遺伝子
による免疫グロブリン遺伝子の不変部類域のすべてまた
は一部分の置換、従ってトランスフェクト細胞によるキ
メラ抗体分子の発現を生ずる。
本発明の他の態様において、所望不変部領域を有する抗
体分子を生産する細胞系が、所望抗原特異性を有する可
変領域のすべてまたは一部分をエンコードする置換遺伝
子および宿主細胞染色体中の可変コーディング領域のす
べてまたは一部分の遺伝子修飾を指向する標的配列を含
む標的ベクターでトランスフェクトされる。トランスフ
ェクション後、抗体生産細胞系内に相同組換えが生じ、
これらの紐換え事象の若干が置換遺伝子による免疫グロ
ブリン遺伝子の可変領域のすべてまたは一部分の置換、
従ってトランスフェクト細胞によるキメラ抗体分子の発
現を生ずる。
体分子を生産する細胞系が、所望抗原特異性を有する可
変領域のすべてまたは一部分をエンコードする置換遺伝
子および宿主細胞染色体中の可変コーディング領域のす
べてまたは一部分の遺伝子修飾を指向する標的配列を含
む標的ベクターでトランスフェクトされる。トランスフ
ェクション後、抗体生産細胞系内に相同組換えが生じ、
これらの紐換え事象の若干が置換遺伝子による免疫グロ
ブリン遺伝子の可変領域のすべてまたは一部分の置換、
従ってトランスフェクト細胞によるキメラ抗体分子の発
現を生ずる。
キメラ抗体を発現するトランスフェクタントが確認され
れば、本発明の実施はトランスフェクタントの培養およ
び、単クローン性抗体の分離によく知られた方法を用い
る細胞培養上澄みからのキメラ抗体分子の分離を含む。
れば、本発明の実施はトランスフェクタントの培養およ
び、単クローン性抗体の分離によく知られた方法を用い
る細胞培養上澄みからのキメラ抗体分子の分離を含む。
あるいはトランスフェクト細胞を動物中の腹水中で培養
し、単クローン性抗体の分離によく知られた方法を用い
て収集することができる。
し、単クローン性抗体の分離によく知られた方法を用い
て収集することができる。
本発明の種々の観点は以下のサブセクション中に一層詳
細に記載され、マウス／ヒトキメラ免疫グロブリン重鎖
が生産される実施例により示される。論議を明瞭にする
ために、本発明は次のように記載される：（ａ）標的ベ
クター；う）トランスフェクション；および（Ｃ）キメ
ラ抗体分子を生産するトランスフェクタントのスクリー
ニングおよび選択。
細に記載され、マウス／ヒトキメラ免疫グロブリン重鎖
が生産される実施例により示される。論議を明瞭にする
ために、本発明は次のように記載される：（ａ）標的ベ
クター；う）トランスフェクション；および（Ｃ）キメ
ラ抗体分子を生産するトランスフェクタントのスクリー
ニングおよび選択。
５、１ 標的ベクター
前記のように、本発明の標的ベクターは、置換遺伝子お
よび標的配列を含むプラスミド、ファージ、ファゲミド
（ｐｈａｇｅｍｉｄ） 、コスミド、ウィルスなどを含
み、それらに限定されない組換えＤＮＡベクターを含む
。以下により詳細に記載するように、置換遺伝子は所望
の構造生成物をエンコードする多くの遺伝子の任意のも
のを含むことができ、標的配列は変換される抗体分子の
型およびトランスフェクトされる動物細胞型により変動
できる。
よび標的配列を含むプラスミド、ファージ、ファゲミド
（ｐｈａｇｅｍｉｄ） 、コスミド、ウィルスなどを含
み、それらに限定されない組換えＤＮＡベクターを含む
。以下により詳細に記載するように、置換遺伝子は所望
の構造生成物をエンコードする多くの遺伝子の任意のも
のを含むことができ、標的配列は変換される抗体分子の
型およびトランスフェクトされる動物細胞型により変動
できる。
標的配列および置換遺伝子は、遺伝子変換が抗体遺伝子
中への置換遺伝子の部位特異的挿入により達成されるよ
うに標的ベクターによる適当な抗体生産細胞系のトラン
スフェクションが標的されたトロ間組換えを生ずるよう
に標的ベクター中に配置される。
中への置換遺伝子の部位特異的挿入により達成されるよ
うに標的ベクターによる適当な抗体生産細胞系のトラン
スフェクションが標的されたトロ間組換えを生ずるよう
に標的ベクター中に配置される。
本発明の標的ベクターは選択可能標識例えば薬物耐性、
酵素をエンコードしてトランスフェクシントのスクリー
ニングおよび選択を補助する他の遺伝子を含むことがで
き、あるいはそのような標識を共トランスフェクトする
ことができる。組換え事象の発生を増強できる他の配列
を同様に含ませることができる。そのような遺伝子は真
核または原核組換え酵素例えばＲＥＣＡ、トポイソメラ
ーゼ、ＲＥＣｌまたは組換えを高める他のＨＡ配列例え
ばＣＨＩを含むことができ、しかしそれらに限定されな
い。種々のタンパク質、例えば前記遺伝子によりエンコ
ードされるもの、もまた組換え頻度を高めるためにトラ
ンスフェクトすることができる。本発明の方法により使
用できる種々の標的配列、置換遺伝子、および選択可能
標識が以下に記載される。
酵素をエンコードしてトランスフェクシントのスクリー
ニングおよび選択を補助する他の遺伝子を含むことがで
き、あるいはそのような標識を共トランスフェクトする
ことができる。組換え事象の発生を増強できる他の配列
を同様に含ませることができる。そのような遺伝子は真
核または原核組換え酵素例えばＲＥＣＡ、トポイソメラ
ーゼ、ＲＥＣｌまたは組換えを高める他のＨＡ配列例え
ばＣＨＩを含むことができ、しかしそれらに限定されな
い。種々のタンパク質、例えば前記遺伝子によりエンコ
ードされるもの、もまた組換え頻度を高めるためにトラ
ンスフェクトすることができる。本発明の方法により使
用できる種々の標的配列、置換遺伝子、および選択可能
標識が以下に記載される。
５、１． ｌ 標的配列
標的配列の組成は標的プラスミドが軽鎖または重鎖の可
変または不変部類域のすべてまたは一部分の置換に使用
されるかにより、さらに抗体生産宿主細胞の動物種によ
り変動することができる。
変または不変部類域のすべてまたは一部分の置換に使用
されるかにより、さらに抗体生産宿主細胞の動物種によ
り変動することができる。
より詳しくは、標的配列は置換または改変される不変部
または可変領域、あるいはそれらの一部分に対するコー
ディング領域に隣接またはフランクする配列に相同性で
あるべきである。
または可変領域、あるいはそれらの一部分に対するコー
ディング領域に隣接またはフランクする配列に相同性で
あるべきである。
例えば染色体中、成熟重鎖遺伝子はその５′末端におい
てＶＤＪ領域；すなわち可変領域（Ｖ）、多様性領域（
Ｄ）および連結領域（Ｊ）、次いで発現されない残余の
Ｊ領域（Ｊ領域の数は種により変動する）、並びにイン
トロン配列を含む。遺伝子の中心および３′部はそれぞ
れそれ自体の隣接スイッチ領域に関連する種々のクラス
（例えばミュー、デルタ、ガンマ、ニブシロン、アルフ
ァ）の１つであることができる不変部領域エキソン（イ
ントロンおよび非翻訳配列によりフランクおよび散在さ
れる）からなる。従って、抗体生産宿主細胞の重鎖遺伝
子中の相同組換えの標的に使用される標的配列は所望の
改変により抗体遺伝子の任意部分に相同性である領域を
含むことができる。
てＶＤＪ領域；すなわち可変領域（Ｖ）、多様性領域（
Ｄ）および連結領域（Ｊ）、次いで発現されない残余の
Ｊ領域（Ｊ領域の数は種により変動する）、並びにイン
トロン配列を含む。遺伝子の中心および３′部はそれぞ
れそれ自体の隣接スイッチ領域に関連する種々のクラス
（例えばミュー、デルタ、ガンマ、ニブシロン、アルフ
ァ）の１つであることができる不変部領域エキソン（イ
ントロンおよび非翻訳配列によりフランクおよび散在さ
れる）からなる。従って、抗体生産宿主細胞の重鎖遺伝
子中の相同組換えの標的に使用される標的配列は所望の
改変により抗体遺伝子の任意部分に相同性である領域を
含むことができる。
例えば、重鎖不変部領域の置換を指向する標的配列はＶ
、ＤまたはＪで始まるスイッチ領域までの、およびそれ
を含むかまたは排除する任意の領域にわたる配列に相同
性の配列を含むことができ、適宜に標的ベクターの構築
物中に；例えば置換遺伝子のコーディング領域に対する
位置５′に配置されよう。使用できる実際の標的配列は
標的宿主細胞の動物種および標的宿主細胞により発現さ
れる抗体のクラスにより変動できる。
、ＤまたはＪで始まるスイッチ領域までの、およびそれ
を含むかまたは排除する任意の領域にわたる配列に相同
性の配列を含むことができ、適宜に標的ベクターの構築
物中に；例えば置換遺伝子のコーディング領域に対する
位置５′に配置されよう。使用できる実際の標的配列は
標的宿主細胞の動物種および標的宿主細胞により発現さ
れる抗体のクラスにより変動できる。
染色体中の重鎖遺伝子の配列に対比すると、成熟軽鎖遺
伝子はそれらの５′末端のＶＪ領領域イントロン配列、
および単一不変部領域エキソンからなる。従って、抗体
生産宿主細胞の軽鎖遺伝子中の相同組換えの標的に使用
される標的配列は所望の改変により遺伝子の子息の部分
にｔ目間である領域を含むことができる。例えば、軽鎖
可変領域の置換を指向する標的配列は軽鎖の不変部領域
に対するコーディング領域の前の適当なＶおよびＪない
しイントロン配列のすべてまたは一部分にわたる配列に
相同性であることができる。そのような標的配列は標的
プラスミド中に適当に、例えば置換遺伝子のコーディン
グ配列に対する位置５′に配置されよう。再び、標的配
列の実際のヌクレオチド配列は標的宿主抗体生産細胞の
動物種に関して変動することができる。
伝子はそれらの５′末端のＶＪ領領域イントロン配列、
および単一不変部領域エキソンからなる。従って、抗体
生産宿主細胞の軽鎖遺伝子中の相同組換えの標的に使用
される標的配列は所望の改変により遺伝子の子息の部分
にｔ目間である領域を含むことができる。例えば、軽鎖
可変領域の置換を指向する標的配列は軽鎖の不変部領域
に対するコーディング領域の前の適当なＶおよびＪない
しイントロン配列のすべてまたは一部分にわたる配列に
相同性であることができる。そのような標的配列は標的
プラスミド中に適当に、例えば置換遺伝子のコーディン
グ配列に対する位置５′に配置されよう。再び、標的配
列の実際のヌクレオチド配列は標的宿主抗体生産細胞の
動物種に関して変動することができる。
前記配列に加えて、標的配列は不変部重または軽鎖のコ
ーディング領域の５′および（または）３′末端に隣接
する領域に相同性の配列を含むことができ−従って、標
的ベクターの構築中に適当に；すなわち置換遺伝子のコ
ーディング領域に対しそれぞれ位置５′および（または
）３′に、配置される。同様に、重または軽鎖可変領域
の置換を指向する標的配列は可変領域にフランクする適
当な領域のすべてまたは一部分に相同性の配列を含むこ
とができる。いずれの場合も、標的配列はまたは可変ま
たは不変部領域の一部分のみが置換され、発現タンパク
質が所望のように改変されるエキソン内の領域にフラン
クするコーディング領域配列を含むことができる。
ーディング領域の５′および（または）３′末端に隣接
する領域に相同性の配列を含むことができ−従って、標
的ベクターの構築中に適当に；すなわち置換遺伝子のコ
ーディング領域に対しそれぞれ位置５′および（または
）３′に、配置される。同様に、重または軽鎖可変領域
の置換を指向する標的配列は可変領域にフランクする適
当な領域のすべてまたは一部分に相同性の配列を含むこ
とができる。いずれの場合も、標的配列はまたは可変ま
たは不変部領域の一部分のみが置換され、発現タンパク
質が所望のように改変されるエキソン内の領域にフラン
クするコーディング領域配列を含むことができる。
５．１．２ 置換遺伝子
前記のように、抗体不変部領域の変換に使用される置換
遺伝子は異なるクラスおよび（または）動物またはヒト
種の免疫グロブリンの不変部領域のすべてまたは一部分
のコーディング配列を含むことができる。従って、重鎖
の場合に、置換遺伝子はヒトｒｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧＳ
ＩｇＥおよびＩｇＡ、またはそれらのサブクラスの不
変部領域をエンコードする遺伝子のすべてまたは一部分
を含むことができる。あるいは置換遺伝子は発現される
キメラ抗体に若干の異なるエフェクター機能を与えるこ
とができる生成物；例えば酵素、毒素、増殖因子、生物
活性ペプチド、リンカ−など、をエンコードすることが
できる。置換遺伝子はまた、前記配列例えば新規タンパ
ク質配列に連結した抗体不変部領域のすべてまたは一部
分の任意の組合せからなるこきができる。
遺伝子は異なるクラスおよび（または）動物またはヒト
種の免疫グロブリンの不変部領域のすべてまたは一部分
のコーディング配列を含むことができる。従って、重鎖
の場合に、置換遺伝子はヒトｒｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧＳ
ＩｇＥおよびＩｇＡ、またはそれらのサブクラスの不
変部領域をエンコードする遺伝子のすべてまたは一部分
を含むことができる。あるいは置換遺伝子は発現される
キメラ抗体に若干の異なるエフェクター機能を与えるこ
とができる生成物；例えば酵素、毒素、増殖因子、生物
活性ペプチド、リンカ−など、をエンコードすることが
できる。置換遺伝子はまた、前記配列例えば新規タンパ
ク質配列に連結した抗体不変部領域のすべてまたは一部
分の任意の組合せからなるこきができる。
選ばれる置換遺伝子は、一部は発現されるキメラ抗体分
子に意図される用途による。例えば、ヒトにおける治療
使用が意図されれば、置換遺伝子は、好ましくは治療用
途に望ましいエフェクター機能に留意したクラスの、ヒ
ト不変部領域をエンコードすることができる。抗体の存
在にエフェクター殿能における改良または改変を望むな
らば、不変孔領域の一部分を、生ずるキメラ抗体分子に
そのような改良または改変されたエフェクター機能を与
える配列で置換することができる。生体内の酵素、毒素
、薬物、ホルモンまたは増殖因子の標的供給を望むなら
ば、酵素、毒素、薬物、ホルモンまたは増殖因子あるい
は上記に対する結合に適するリンカ−をコードする置換
遺伝子が使用されよう。キメラ抗体を、例えば標識抗体
が利用される診断検定に使用するならば、酵素またはそ
の基質をエンコードする置換遺伝子を用いることができ
る。そのような酵素／基質系には、反応したときに着色
生成物を生ずるもの、例えばβ−ガラクトシダーゼ、ア
ルカリ性ホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ
などが含まれ、しかしそれらに限定されない。生じたキ
メラ抗体は意図操作における標識抗体として、さらに修
飾、例えば酵素、薬物、毒素、ホルモン、増殖因子など
の化学的結合、とともにまたはそれなく使用することが
できる。
子に意図される用途による。例えば、ヒトにおける治療
使用が意図されれば、置換遺伝子は、好ましくは治療用
途に望ましいエフェクター機能に留意したクラスの、ヒ
ト不変部領域をエンコードすることができる。抗体の存
在にエフェクター殿能における改良または改変を望むな
らば、不変孔領域の一部分を、生ずるキメラ抗体分子に
そのような改良または改変されたエフェクター機能を与
える配列で置換することができる。生体内の酵素、毒素
、薬物、ホルモンまたは増殖因子の標的供給を望むなら
ば、酵素、毒素、薬物、ホルモンまたは増殖因子あるい
は上記に対する結合に適するリンカ−をコードする置換
遺伝子が使用されよう。キメラ抗体を、例えば標識抗体
が利用される診断検定に使用するならば、酵素またはそ
の基質をエンコードする置換遺伝子を用いることができ
る。そのような酵素／基質系には、反応したときに着色
生成物を生ずるもの、例えばβ−ガラクトシダーゼ、ア
ルカリ性ホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ
などが含まれ、しかしそれらに限定されない。生じたキ
メラ抗体は意図操作における標識抗体として、さらに修
飾、例えば酵素、薬物、毒素、ホルモン、増殖因子など
の化学的結合、とともにまたはそれなく使用することが
できる。
抗体可変領域の変換に使用される置換遺伝子は所望の抗
原を規定する抗体分子の可変領域のコーディング配列の
すべてまたは一部分を含むことができる。これらは関連
するかまたは全く関連のない抗原を規定する抗原結合領
域をエンコードすることができる。抗原結合または°特
異性における改良または改変を望むならば、可変領域の
一部分を、生ずるキメラ抗体分子にそのような改良また
は改変された結合または特異性を与える配列で置換する
ことができる。
原を規定する抗体分子の可変領域のコーディング配列の
すべてまたは一部分を含むことができる。これらは関連
するかまたは全く関連のない抗原を規定する抗原結合領
域をエンコードすることができる。抗原結合または°特
異性における改良または改変を望むならば、可変領域の
一部分を、生ずるキメラ抗体分子にそのような改良また
は改変された結合または特異性を与える配列で置換する
ことができる。
５、１．３ 選択可能標識および他の要素標的配列お
よび置換遺伝子に加えて、本発明の標的ベクターは、良
好に形質転換された抗体生産細胞のスクリーニングおよ
び選択を補助する選択可能標識をエンコードすることが
できる。そのような標識には薬物耐性遺伝子、例えばｇ
ｐｔ 、 ｎｅｏ、ｈｉｓなど、などが含まれる。
よび置換遺伝子に加えて、本発明の標的ベクターは、良
好に形質転換された抗体生産細胞のスクリーニングおよ
び選択を補助する選択可能標識をエンコードすることが
できる。そのような標識には薬物耐性遺伝子、例えばｇ
ｐｔ 、 ｎｅｏ、ｈｉｓなど、などが含まれる。
組換え事象の数を増強できる追加の要素を標的ベクター
中へ含ませることができる。例えば、温度感受性である
複製開始点（ｏｒｉ） （例えばポリオーマｔＳＡ ｏ
ｒｉ系）を、標的配列および置換遺伝子の複写数が増加
し、次の組換え数が増加できるように許容温度における
トランスフェクタントの増慝がベクター複製を生ずるよ
うに構築物中に含ませることができる。他のｏｒｉ系も
また複写数の増加に用いることができる（例えば、ＥＢ
Ｖｏｒｉプラス因子、ＢＰＶｏｒｉプラス因子、または
５Ｖ４０ｏｒｉ およびＴ、抗原）。
中へ含ませることができる。例えば、温度感受性である
複製開始点（ｏｒｉ） （例えばポリオーマｔＳＡ ｏ
ｒｉ系）を、標的配列および置換遺伝子の複写数が増加
し、次の組換え数が増加できるように許容温度における
トランスフェクタントの増慝がベクター複製を生ずるよ
うに構築物中に含ませることができる。他のｏｒｉ系も
また複写数の増加に用いることができる（例えば、ＥＢ
Ｖｏｒｉプラス因子、ＢＰＶｏｒｉプラス因子、または
５Ｖ４０ｏｒｉ およびＴ、抗原）。
５．２ 標的ベクターによる抗体生産細胞系のトラン
スフェクション 本発明の方法によれば、所望抗体（すなわち、所望の抗
原特異性または所望の不変孔領域を有するもの）を生産
する細胞系を適当な標的ベクターでトランスフェクトし
、部位指向相同組換えを行なうトランスフェクタントを
生成させる。軽鎖および重鎖標的ベクターはともに適当
な抗体生産細胞系のトランスフェクトに使用でき；しか
じ、多くの場合に重鎖標的ベクターによるトランスフェ
クションがキメラ抗体分子の発現を得るのに十分である
ことができる。
スフェクション 本発明の方法によれば、所望抗体（すなわち、所望の抗
原特異性または所望の不変孔領域を有するもの）を生産
する細胞系を適当な標的ベクターでトランスフェクトし
、部位指向相同組換えを行なうトランスフェクタントを
生成させる。軽鎖および重鎖標的ベクターはともに適当
な抗体生産細胞系のトランスフェクトに使用でき；しか
じ、多くの場合に重鎖標的ベクターによるトランスフェ
クションがキメラ抗体分子の発現を得るのに十分である
ことができる。
トランスフェクションはリン酸カルシウム沈殿、エレク
トロポレーション、微量注入、リポソーム融合、ＲＢＣ
ゴースト融合、プロトプラスト融合などが含まれ、しか
しそれらに限定されない当業者に知られた多くの方法の
いずれかにより行なうことができる。標的ベクターは、
トランスフェクト細胞中の相同組換えの確立を高めるた
めにトランスフェクション前に標的配列内に制限酵素に
よる開裂により線状化することができる。
トロポレーション、微量注入、リポソーム融合、ＲＢＣ
ゴースト融合、プロトプラスト融合などが含まれ、しか
しそれらに限定されない当業者に知られた多くの方法の
いずれかにより行なうことができる。標的ベクターは、
トランスフェクト細胞中の相同組換えの確立を高めるた
めにトランスフェクション前に標的配列内に制限酵素に
よる開裂により線状化することができる。
５．３ 組換え体のスクリーニングおよび選択良好な
トランスフェクション、相同組換えおよび標的遺伝子修
飾に対する最終試験は抗体生産細胞系によるキメラ抗体
の生産である。キメラ抗体を生産するトランスフェクタ
ントの検出は置換遺伝子生成物の性質により多くの方法
で行なうことができる。
トランスフェクション、相同組換えおよび標的遺伝子修
飾に対する最終試験は抗体生産細胞系によるキメラ抗体
の生産である。キメラ抗体を生産するトランスフェクタ
ントの検出は置換遺伝子生成物の性質により多くの方法
で行なうことができる。
標的ベクターが選択可能標識を含むならば、トランスフ
エクト細胞の初期スクリーニングは４ｆｉ ＡＭを発現
するものを選択すべきである。例えば、薬物耐性遺伝子
を用いると、そうでないと致死の薬物を含む選択培地中
で増殖するトランスフェクトントを初期スクリーニング
で６’ｔＬＪできる。次に第２スクリーニングがキメラ
抗体を発現するトランスフェクトントの確認に必要であ
る。
エクト細胞の初期スクリーニングは４ｆｉ ＡＭを発現
するものを選択すべきである。例えば、薬物耐性遺伝子
を用いると、そうでないと致死の薬物を含む選択培地中
で増殖するトランスフェクトントを初期スクリーニング
で６’ｔＬＪできる。次に第２スクリーニングがキメラ
抗体を発現するトランスフェクトントの確認に必要であ
る。
第２スクリーニングに対するプロトコルは置換遺伝子の
性質による。例えば、異なる抗体クラスまたは種の不変
部類域をエンコードする置換遺伝子の発現は特定免疫グ
ロブリンクラスおよび（または）種に特異性の抗体を用
いる免疫検定により検出することができ；あるいは生物
検定を行ない置換遺伝子により与えられた特定エフェク
ター機能について試験することができる。生物活性分子
例えば酵素、毒素、増殖因子、または他のペプチドをエ
ンコードする置換遺伝子の発現は特定生物活性について
検定することができ；例えば、トランスフェクト細胞生
成物を適当な酵素基質、または毒素、増殖因子、ホルモ
ンなどに対する標的を用いて試験することができ；ある
いはこれらの置換遺伝子生成物を置換遺伝子生成物に特
異性である抗体を用いて免疫学的に検定することができ
る。
性質による。例えば、異なる抗体クラスまたは種の不変
部類域をエンコードする置換遺伝子の発現は特定免疫グ
ロブリンクラスおよび（または）種に特異性の抗体を用
いる免疫検定により検出することができ；あるいは生物
検定を行ない置換遺伝子により与えられた特定エフェク
ター機能について試験することができる。生物活性分子
例えば酵素、毒素、増殖因子、または他のペプチドをエ
ンコードする置換遺伝子の発現は特定生物活性について
検定することができ；例えば、トランスフェクト細胞生
成物を適当な酵素基質、または毒素、増殖因子、ホルモ
ンなどに対する標的を用いて試験することができ；ある
いはこれらの置換遺伝子生成物を置換遺伝子生成物に特
異性である抗体を用いて免疫学的に検定することができ
る。
置換遺伝子を発現するトランスフェクトントはまた、適
当な抗原識認について試験されよう。これは初めのおよ
びキメラの抗体を用いる競合免疫検定を含む適当な免疫
検定により行なうことができる。これらのスクリーニン
グ試験は連続的に行なう必要がなく、実際に置換遺伝子
生成物（すなわち、不変部または可変領域）を規定する
捕捉抗体を用いてキメラ抗体を固定化し、非改変タンパ
ク質（すなわち、それぞれ非改変可変領域または非改変
可変領域）の存在または不在を検出する（すなわち、そ
れぞれ標識抗原または標識抗体を用いる）「サンドイッ
チ免疫検定」を用いて同時に行なうことができる。例え
ば、抗原を用いてキメラ抗体を捕捉することができ、不
変部領域置換遺伝子を、置換遺伝子生成物を規定する標
識抗体を用いて、または捕捉キメラ抗体を置換遺伝子生
成物の生物活性（例えば酵素、毒素、ホルモン、増殖因
子など）について検定することにより検出することがで
きた。あるいは、キメラ抗体を不変部類域で（例えば、
その領域に特異性の抗体、またはスタヒロコツカスＡタ
ンパク質などを用いて）固定化することができ、可変領
域遺伝子生成物を、標識した抗原または抗イデイオタイ
プ抗体を用いて検出することができた。
当な抗原識認について試験されよう。これは初めのおよ
びキメラの抗体を用いる競合免疫検定を含む適当な免疫
検定により行なうことができる。これらのスクリーニン
グ試験は連続的に行なう必要がなく、実際に置換遺伝子
生成物（すなわち、不変部または可変領域）を規定する
捕捉抗体を用いてキメラ抗体を固定化し、非改変タンパ
ク質（すなわち、それぞれ非改変可変領域または非改変
可変領域）の存在または不在を検出する（すなわち、そ
れぞれ標識抗原または標識抗体を用いる）「サンドイッ
チ免疫検定」を用いて同時に行なうことができる。例え
ば、抗原を用いてキメラ抗体を捕捉することができ、不
変部領域置換遺伝子を、置換遺伝子生成物を規定する標
識抗体を用いて、または捕捉キメラ抗体を置換遺伝子生
成物の生物活性（例えば酵素、毒素、ホルモン、増殖因
子など）について検定することにより検出することがで
きた。あるいは、キメラ抗体を不変部類域で（例えば、
その領域に特異性の抗体、またはスタヒロコツカスＡタ
ンパク質などを用いて）固定化することができ、可変領
域遺伝子生成物を、標識した抗原または抗イデイオタイ
プ抗体を用いて検出することができた。
６、実施例：ヒトガンマ１免疫グロブリンの不変部類域
によるマウス免疫グロブリン 重鎖の不変部類域の置換 次の実施例はヒトガンマ１免疫グロブリン（ｈｕＩｇＧ
ｌ）の不変部類域をエンコードする置換遺伝子に連結さ
れたマウス標的配列（重鎖遺伝子の第４連結領域および
エンハンサ−をエンコードする）を含む標的プラスミド
の構築を記載する。この標的プラスミドを、マウス重鎖
（全可変および不変部類域）をエンコードする全成熟遺
伝子を含むファージとともに用いて通常軽鎖のみを発現
する重鎖変異体であるマウス骨髄腫細胞を共トランスフ
ェクトした。トランスフェクト細胞をスクリーンし、ヒ
トＩｇ（１１重鎖を発現するクローンがｒ４認された。
によるマウス免疫グロブリン 重鎖の不変部類域の置換 次の実施例はヒトガンマ１免疫グロブリン（ｈｕＩｇＧ
ｌ）の不変部類域をエンコードする置換遺伝子に連結さ
れたマウス標的配列（重鎖遺伝子の第４連結領域および
エンハンサ−をエンコードする）を含む標的プラスミド
の構築を記載する。この標的プラスミドを、マウス重鎖
（全可変および不変部類域）をエンコードする全成熟遺
伝子を含むファージとともに用いて通常軽鎖のみを発現
する重鎖変異体であるマウス骨髄腫細胞を共トランスフ
ェクトした。トランスフェクト細胞をスクリーンし、ヒ
トＩｇ（１１重鎖を発現するクローンがｒ４認された。
これらの実験は良好な相同組換え結果、宿主細胞染色体
中への組込み、およびマウス細胞系中のヒトガンマｌ遺
伝子の発現を示す。
中への組込み、およびマウス細胞系中のヒトガンマｌ遺
伝子の発現を示す。
６、１ 物質および方法
特に示さなければ、次に示す物質および方法が次の実施
例に使用された。
例に使用された。
６．１．１ ）ランスフエクション
トランスフェクションは洗浄し、４℃で２ｍＭ−ＭｇＣ
ｌ ２および２ｍＭ−ＣａＣ１，を有するＰＢＳ （リ
ン酸塩緩衝食塩水中に約１（１７細胞を再！！Ｊ濁し、
細胞とアルミニウム箔でライニングした無菌プラスチッ
クキニベット〔バイオラド（Ｂｉｏ Ｒａｄ、 ＣＡ）
製〕に移すことにより行なった。線状化したＤＮＡを加
え、最終濃度が１０〜１００μｇ／ｍ１になるように混
合し、次いで適当な電源〔例えばジーン・パルサー（Ｇ
ｅｎｅ Ｐｕ１ｓａｒ） 、バイオラド（Ｂｉｏ Ｒａ
ｄ。
ｌ ２および２ｍＭ−ＣａＣ１，を有するＰＢＳ （リ
ン酸塩緩衝食塩水中に約１（１７細胞を再！！Ｊ濁し、
細胞とアルミニウム箔でライニングした無菌プラスチッ
クキニベット〔バイオラド（Ｂｉｏ Ｒａｄ、 ＣＡ）
製〕に移すことにより行なった。線状化したＤＮＡを加
え、最終濃度が１０〜１００μｇ／ｍ１になるように混
合し、次いで適当な電源〔例えばジーン・パルサー（Ｇ
ｅｎｅ Ｐｕ１ｓａｒ） 、バイオラド（Ｂｉｏ Ｒａ
ｄ。
ＣＡ）製〕で電荷をかけた。キュベツトを穏やかに「は
じいて」よく混合した。室温で２分間後、次いで細胞を
３７℃のｌＯ％ＦＢＳを有するＲＰＭＩ培地〔ギブコ（
Ｇ ＩＢＣＯ））９ｄに移した。４８時間インキュベー
トした後生細胞を遠心分離により回収し、カウントし、
１０％ＦＢＳ、ペニシリン（６０＋ｎｇ／ｍｌ）／スト
レプトマイシン（１００ｍｇ／ｍり、ピルビン酸ナトリ
ウム（１ｍＭ）、Ｌ−グルタミン（２９２ｍｇ／ ｉｆ
りおよび、０．１〜２μｇ／ｍｌミコフェノール酸また
は１〜２ ｍｇ／ｍＧ ４１８を有するＲＰＭＩ培地中
、９６ウエルプレート中で１（１３細胞／ウエルまたは
２６ウエルプレート中で１（１４細胞／ウエルの密度で
培養した。
じいて」よく混合した。室温で２分間後、次いで細胞を
３７℃のｌＯ％ＦＢＳを有するＲＰＭＩ培地〔ギブコ（
Ｇ ＩＢＣＯ））９ｄに移した。４８時間インキュベー
トした後生細胞を遠心分離により回収し、カウントし、
１０％ＦＢＳ、ペニシリン（６０＋ｎｇ／ｍｌ）／スト
レプトマイシン（１００ｍｇ／ｍり、ピルビン酸ナトリ
ウム（１ｍＭ）、Ｌ−グルタミン（２９２ｍｇ／ ｉｆ
りおよび、０．１〜２μｇ／ｍｌミコフェノール酸また
は１〜２ ｍｇ／ｍＧ ４１８を有するＲＰＭＩ培地中
、９６ウエルプレート中で１（１３細胞／ウエルまたは
２６ウエルプレート中で１（１４細胞／ウエルの密度で
培養した。
同一培地を２〜３日毎に補充または交換した。２〜３週
後にウェルを増殖について評価した。次いで培養の上澄
みをＥＬＩＳＡによりヒトガンマｌの存在について検定
し、陽性ウェルをクローン化し、再びスクリーンした。
後にウェルを増殖について評価した。次いで培養の上澄
みをＥＬＩＳＡによりヒトガンマｌの存在について検定
し、陽性ウェルをクローン化し、再びスクリーンした。
６．１．２ ）ランスフェクタントの良好な組換え体
に対するスクリーニング ＥＬｒＳΔ検定は、イムｏ ン（ｉｍｍｕｌｏｎ） ２
プレート〔ダイナチク・ラプス（Ｄｙｎａｔｅｃ Ｌａ
ｂｓ。
に対するスクリーニング ＥＬｒＳΔ検定は、イムｏ ン（ｉｍｍｕｌｏｎ） ２
プレート〔ダイナチク・ラプス（Ｄｙｎａｔｅｃ Ｌａ
ｂｓ。
Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ、 Ｖ＾）製］を、コーティング緩
衝液（０，１Ｍ Ｎａ ＨＣＯｚ 、ｐＨ９，６）中
の１ ：１Ｏ００希釈のヤギ抗ヒトＩｇＧ〔アンチボデ
ィーズ社（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｉｎｃ、、 Ｄａｖ
ｉｓ、 ＣＡ）製）１００．ｉ’。
衝液（０，１Ｍ Ｎａ ＨＣＯｚ 、ｐＨ９，６）中
の１ ：１Ｏ００希釈のヤギ抗ヒトＩｇＧ〔アンチボデ
ィーズ社（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｉｎｃ、、 Ｄａｖ
ｉｓ、 ＣＡ）製）１００．ｉ’。
またはｌ：５０００希釈のヤギ抗マウスＩｇＡ〔カペル
（Ｃａｐｐｅｌ ）製〕で４℃で一夜コーティングする
ことにより行なった。次いでプレートに試料希釈剤〔シ
ネチック・システムズ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓｙｓｔｅｍｓ
）製〕を満たし、室温で１時間ブロックし、その後それ
らを振とうし、シールし、４℃で３週間を越えないで貯
蔵した。プレートを洗浄緩衝液（０，１５Ｍ−ＮａＣｊ
２．０．０５％ｖ／ｖ ツイーン２０）で３回洗浄する
ことにより検定の準備を終え、次いで標準液（適当な培
地中に希釈）または培養上澄み１００μｌを加えて３７
℃で１時間インキニベートした。次いでプレートを洗浄
緩衝液で３回洗浄し、結合した抗体をｌ ：６０００希
釈の西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合ヤギ抗
ヒトＩｇＧＣアメリカン・クアレックス（へｍｅｒｉｃ
ａｎ口ｕａｌｅｘ） ｅＪ３．１ ： ５０００希釈の
ＨＲＰヤギ抗マウスＩｇＡＣカベル（Ｃａｐｐｅｌ）製
〕、または１：３，０００の希釈のＨＲＰヤギ抗マウス
ラムダ〔サザン・バイオチク社（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂ
ｉｏｔｅｃｈ、 Ａｓｓ。
（Ｃａｐｐｅｌ ）製〕で４℃で一夜コーティングする
ことにより行なった。次いでプレートに試料希釈剤〔シ
ネチック・システムズ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓｙｓｔｅｍｓ
）製〕を満たし、室温で１時間ブロックし、その後それ
らを振とうし、シールし、４℃で３週間を越えないで貯
蔵した。プレートを洗浄緩衝液（０，１５Ｍ−ＮａＣｊ
２．０．０５％ｖ／ｖ ツイーン２０）で３回洗浄する
ことにより検定の準備を終え、次いで標準液（適当な培
地中に希釈）または培養上澄み１００μｌを加えて３７
℃で１時間インキニベートした。次いでプレートを洗浄
緩衝液で３回洗浄し、結合した抗体をｌ ：６０００希
釈の西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合ヤギ抗
ヒトＩｇＧＣアメリカン・クアレックス（へｍｅｒｉｃ
ａｎ口ｕａｌｅｘ） ｅＪ３．１ ： ５０００希釈の
ＨＲＰヤギ抗マウスＩｇＡＣカベル（Ｃａｐｐｅｌ）製
〕、または１：３，０００の希釈のＨＲＰヤギ抗マウス
ラムダ〔サザン・バイオチク社（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂ
ｉｏｔｅｃｈ、 Ａｓｓ。
Ｉｎｃ、、 Ｂｌｒｍｉｎｇｈａｍ、 ＡＬ）製）１０
０μｆで３７℃で１時間検出した。次いでプレートを洗
浄緩衝液で３回洗浄し、緩衝基質〔シネチック・システ
ムズ（Ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｙｓｔｅｍｓ）製〕中のＴＭ
Ｂクロモゲンの１＝１００希釈とともに室温で１５分間
インキコベートし、３Ｍ−Ｈ２ＳＯ，１００μβ毎ウエ
ルで停止させ、直ちにマイクロプレートリーダー〔シネ
チック・システムズ（Ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｙｓｔｅｍｓ
）製〕で４５０／６３０ｎｍで読みとった。同様に、カ
ッパ生産細胞系を、ＨＲＰヤギ抗マウスカッパ試薬〔サ
ザン・バイオチク社（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ
、 Ａｓｓ。
０μｆで３７℃で１時間検出した。次いでプレートを洗
浄緩衝液で３回洗浄し、緩衝基質〔シネチック・システ
ムズ（Ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｙｓｔｅｍｓ）製〕中のＴＭ
Ｂクロモゲンの１＝１００希釈とともに室温で１５分間
インキコベートし、３Ｍ−Ｈ２ＳＯ，１００μβ毎ウエ
ルで停止させ、直ちにマイクロプレートリーダー〔シネ
チック・システムズ（Ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｙｓｔｅｍｓ
）製〕で４５０／６３０ｎｍで読みとった。同様に、カ
ッパ生産細胞系を、ＨＲＰヤギ抗マウスカッパ試薬〔サ
ザン・バイオチク社（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ
、 Ａｓｓ。
Ｉｎｃ、） 製）を用いてスクリーンすることができ
る。
る。
ヒトＩｇＧおよび（または）マウスＩｇＡに対し陽性の
細胞系を限界希釈により、または軟アガロース中でサブ
クローンし、発現クローンを分離した。軟アガロース中
でクローン化するため、陽性ウェルから約１，０ＱＯｉ
胞を０．４％アガロース中に再懸濁し、マウス腹膜浸出
液フィーダーセルの寒天層上に重ねた。ヒトＩｇＧ１に
特異性の抗血清を含む第３層を１〜２日後に重ねた。陽
性クローンが免疫沈降の存在により確認された。
細胞系を限界希釈により、または軟アガロース中でサブ
クローンし、発現クローンを分離した。軟アガロース中
でクローン化するため、陽性ウェルから約１，０ＱＯｉ
胞を０．４％アガロース中に再懸濁し、マウス腹膜浸出
液フィーダーセルの寒天層上に重ねた。ヒトＩｇＧ１に
特異性の抗血清を含む第３層を１〜２日後に重ねた。陽
性クローンが免疫沈降の存在により確認された。
６、１．３ サザンおよびウェスタンプロット高分子
ｆｆ１ＤＮＡを実質的に初めにプリンはか（Ｂｌｉｎ
ａｎｄ ５ｔａｆｆｏｒｄ） ［プリンほか（Ｂｌｉ
ｎ、 Ｎ ａｎｄＳｔａｆｆｏｒｄ、 ＯｏＷ、）
、ｌ ９７６、二二−クリーク・アンズ・リサーチ（
Ｎｕｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、） ３ ：２
３（１３３により、後にマニアチスはか（Ｍａｎｉａｔ
ｓ。
ｆｆ１ＤＮＡを実質的に初めにプリンはか（Ｂｌｉｎ
ａｎｄ ５ｔａｆｆｏｒｄ） ［プリンほか（Ｂｌｉ
ｎ、 Ｎ ａｎｄＳｔａｆｆｏｒｄ、 ＯｏＷ、）
、ｌ ９７６、二二−クリーク・アンズ・リサーチ（
Ｎｕｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、） ３ ：２
３（１３３により、後にマニアチスはか（Ｍａｎｉａｔ
ｓ。
Ｆｒ１ｔｓｃｈ ａｎｄ ５ａｎｄｂｒｏｏｋ） 〔マ
＝アチス１Ｊａｎｉａｔｓ）ほか、１９８２、分子クロ
ーニング−研究室マニュアル（ＭｏＩｅｃｕＩａｒ Ｃ
Ｉｏｎｌｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａ
ｌ）、コールド・スプリング・ハーバ−（Ｃｏｌｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ、 ＮＹ） 、ｐ、 ２８０
）により記載されたように細胞から分離し、しかし細胞
を初めに標準リン酸塩緩衝食塩水（トリスとは対照的）
中で洗浄し、ＲＮａｓｅ処理をブロテイナーゼに処理と
同時に５５℃で行なった。
＝アチス１Ｊａｎｉａｔｓ）ほか、１９８２、分子クロ
ーニング−研究室マニュアル（ＭｏＩｅｃｕＩａｒ Ｃ
Ｉｏｎｌｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａ
ｌ）、コールド・スプリング・ハーバ−（Ｃｏｌｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ、 ＮＹ） 、ｐ、 ２８０
）により記載されたように細胞から分離し、しかし細胞
を初めに標準リン酸塩緩衝食塩水（トリスとは対照的）
中で洗浄し、ＲＮａｓｅ処理をブロテイナーゼに処理と
同時に５５℃で行なった。
サブンブロ７）およびハイブリッド形成は、初めにサブ
：／ （Ｓｏｕｔｈｅｒｎ） （サザン（Ｓｏｕｔｈ
ｅｒｎ）、１９７５、ジャーナル・オフ・モレキュラル
・バイオロジー（ＪｏＭａｌ、Ｂｉｏｌ、）、９８：５
（１３：］に記載され、より最近にはマニアチスはか（
Ｍａｎｉａｔｓ。
：／ （Ｓｏｕｔｈｅｒｎ） （サザン（Ｓｏｕｔｈ
ｅｒｎ）、１９７５、ジャーナル・オフ・モレキュラル
・バイオロジー（ＪｏＭａｌ、Ｂｉｏｌ、）、９８：５
（１３：］に記載され、より最近にはマニアチスはか（
Ｍａｎｉａｔｓ。
Ｆｒ１ｔｓｃｈ ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ） 〔マ
＝アチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ほか、１９８２、分子ク
ローニング−研究室マニュアル（！、１ｏｌｅｃｕｌａ
ｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａ
ｎｕａｌ）、コールド・スプリング＋ハーバ−（Ｃｏｌ
ｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ、 ＮＹ）、 ｐｐ、
３８３〜３８９） により詳記されたように行なった
。ハイブリッド形成に用いたプローブはヒ）ＩｇＧ１遺
伝子の第１不変部領域ドメインを含む１、Ｏｋｂ Ｈｉ
ｎｄＩ［［−Ｐｓｔ Ｉフラグメント、またはマウスＪ
Ｈ２およびＪＫ３遺伝子セグメントをエンコードする０
、 ７ ｋｂ ＨｉｎｄＩ［Ｉ−）１ｉｎｄＩ［フラグ
メントであった。プローブの標識はニックトランスレー
ションキット〔ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ（
Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅ５ｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏ
ｒ ｉｅｓ ）製〕を用いて製造者プロトコルに従って
行なった。制限酵素はベーリンガー・マンハイム・バイ
オケミカルズ（Ｂｏｅｒ ｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）から購入した。
＝アチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ほか、１９８２、分子ク
ローニング−研究室マニュアル（！、１ｏｌｅｃｕｌａ
ｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａ
ｎｕａｌ）、コールド・スプリング＋ハーバ−（Ｃｏｌ
ｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ、 ＮＹ）、 ｐｐ、
３８３〜３８９） により詳記されたように行なった
。ハイブリッド形成に用いたプローブはヒ）ＩｇＧ１遺
伝子の第１不変部領域ドメインを含む１、Ｏｋｂ Ｈｉ
ｎｄＩ［［−Ｐｓｔ Ｉフラグメント、またはマウスＪ
Ｈ２およびＪＫ３遺伝子セグメントをエンコードする０
、 ７ ｋｂ ＨｉｎｄＩ［Ｉ−）１ｉｎｄＩ［フラグ
メントであった。プローブの標識はニックトランスレー
ションキット〔ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ（
Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅ５ｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏ
ｒ ｉｅｓ ）製〕を用いて製造者プロトコルに従って
行なった。制限酵素はベーリンガー・マンハイム・バイ
オケミカルズ（Ｂｏｅｒ ｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）から購入した。
ウェスタンプロット分析は記載〔トウビン（Ｔｏｗｂｉ
ｎ）ほか、１９７９、プロシーデイングズ・オフ・ザ・
ナショナル・アカデミ−・オフ′・す・ｒｘンス（Ｐｒ
ｏｃ、 Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、 Ｓｃ＋、） （Ｕ
ＳＡ） ７６ ：４３５０）のように行ない、顕色試
薬はＢＬＩＳＡ検定における検出に用いたものと同様で
あった。
ｎ）ほか、１９７９、プロシーデイングズ・オフ・ザ・
ナショナル・アカデミ−・オフ′・す・ｒｘンス（Ｐｒ
ｏｃ、 Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、 Ｓｃ＋、） （Ｕ
ＳＡ） ７６ ：４３５０）のように行ない、顕色試
薬はＢＬＩＳＡ検定における検出に用いたものと同様で
あった。
６．２ ヒト免疫グロブリン不変部領域をエンコード
する標的プラスミドの構築 ヒトガンマ１不変部領域遺伝子を含むｇ、ＱｋｂＨｉ口
ｄＩＩ［−ＢａｍＨＩフラグメントを置換遺伝子として
中ヘクローン化した細菌プラスミドベクターｐＲ３Ｖ−
１４０−ｎｅｏからなる標的プラスミドを構築した（第
２図）。標的遺伝子の第４連結領域（Ｊ４）、ＩｇＨエ
ンハンサ−（ｅ）、およびスイッチ領域に対するイント
ロン配列５′を含むマウス免疫グロブリン重鎖（ＩｇＨ
）部位から誘導された２、 ２ ｋｂ ＨｉｎｄＩＩ［
フラグメントを、ヒトガンマ１遺伝子に対する５′に位
置する旧ｎｄＩ１１部位中へ挿入した（第２図）。次い
でこの構築物をマウス標的配列内の特有ＸｂａＩ部位で
線状化し、後記マウス骨髄腫細胞系中へ前記エレクトロ
ポレーションによりトランスフェクトした。
する標的プラスミドの構築 ヒトガンマ１不変部領域遺伝子を含むｇ、ＱｋｂＨｉ口
ｄＩＩ［−ＢａｍＨＩフラグメントを置換遺伝子として
中ヘクローン化した細菌プラスミドベクターｐＲ３Ｖ−
１４０−ｎｅｏからなる標的プラスミドを構築した（第
２図）。標的遺伝子の第４連結領域（Ｊ４）、ＩｇＨエ
ンハンサ−（ｅ）、およびスイッチ領域に対するイント
ロン配列５′を含むマウス免疫グロブリン重鎖（ＩｇＨ
）部位から誘導された２、 ２ ｋｂ ＨｉｎｄＩＩ［
フラグメントを、ヒトガンマ１遺伝子に対する５′に位
置する旧ｎｄＩ１１部位中へ挿入した（第２図）。次い
でこの構築物をマウス標的配列内の特有ＸｂａＩ部位で
線状化し、後記マウス骨髄腫細胞系中へ前記エレクトロ
ポレーションによりトランスフェクトした。
６．３トランスフエクシヨンおよび相同組換え下記の実
験および結果は、標的プラスミドとマウス骨髄腫宿主細
胞の共トランスフェクトに用いたファージ内に含まれた
マウス重鎖遺伝子との間の良好な相同組換えを示す。マ
ウス骨髄腫宿主細胞染色体中への相同組換えおよび組込
みがヒト免疫グロブリン重鎖（ＩｇＧ１）の発現を生じ
た。
験および結果は、標的プラスミドとマウス骨髄腫宿主細
胞の共トランスフェクトに用いたファージ内に含まれた
マウス重鎖遺伝子との間の良好な相同組換えを示す。マ
ウス骨髄腫宿主細胞染色体中への相同組換えおよび組込
みがヒト免疫グロブリン重鎖（ＩｇＧ１）の発現を生じ
た。
６．３．１ マウス骨髄腫細胞の共トランスフェクシ
ョン （ａ）第４連結領域（Ｊ４）、ＩｇＨエンハンサ−およ
びスイッチ領域に対するイントロン配列５′をエンコー
ドするマウス標的配列、並びにら）ヒトＩｇＧ１不変部
領域をエンコードする置換遺伝子、を含む標的プラスミ
ドを標的配列の領域中で線状化し、機能性Ｊ５５８マウ
ス重鎖遺伝子を含むファージＤＮＡクローンと等モル比
で、軽鎖のみを発現する重鎖変異マウス骨髄腫細胞系Ｊ
５５８Ｌ中へ共トランスフェクトした。次いで（１４１
８（標的プラスミド構築物によりエンコードされた選択
可能標識）に耐性のトランスフェクト細胞をヒ）ＩｇＧ
１タンパク質の存在についてスクリーンした。前記に構
築した標的プラスミド中に含まれたヒトガンマ１不変部
領域が免疫グロブリンプロモーター配列を欠くので、ト
ランスフェクトマウス細胞系によるヒトＩｇＧタンパク
質の発現の検出はトランスフエフ）ＤＮＡ分子と宿主細
胞染色体内の組込みとの間の相同組換え事象の結果であ
ろう。
ョン （ａ）第４連結領域（Ｊ４）、ＩｇＨエンハンサ−およ
びスイッチ領域に対するイントロン配列５′をエンコー
ドするマウス標的配列、並びにら）ヒトＩｇＧ１不変部
領域をエンコードする置換遺伝子、を含む標的プラスミ
ドを標的配列の領域中で線状化し、機能性Ｊ５５８マウ
ス重鎖遺伝子を含むファージＤＮＡクローンと等モル比
で、軽鎖のみを発現する重鎖変異マウス骨髄腫細胞系Ｊ
５５８Ｌ中へ共トランスフェクトした。次いで（１４１
８（標的プラスミド構築物によりエンコードされた選択
可能標識）に耐性のトランスフェクト細胞をヒ）ＩｇＧ
１タンパク質の存在についてスクリーンした。前記に構
築した標的プラスミド中に含まれたヒトガンマ１不変部
領域が免疫グロブリンプロモーター配列を欠くので、ト
ランスフェクトマウス細胞系によるヒトＩｇＧタンパク
質の発現の検出はトランスフエフ）ＤＮＡ分子と宿主細
胞染色体内の組込みとの間の相同組換え事象の結果であ
ろう。
６、３．２ キメラ免疫グロブリンを分泌する細胞の
確Ｓ忍 ヒ）ＩｇＧおよび（または）マウスＩｇＡタンパク質を
分泌するトランスフェクトントをサブクローン化した。
確Ｓ忍 ヒ）ＩｇＧおよび（または）マウスＩｇＡタンパク質を
分泌するトランスフェクトントをサブクローン化した。
相同組換え事象の確認はＤＮＡプロットトランスファー
分析により与えられ、それで新群配列制限フラグメント
が確認され；このフラグメントは予期された大きさく１
０．５ ｋｂ ＢａｍＨＩフラグメント）であり、ヒト
ガンマ１およびマウスＪ□２〜ＪＨ３配列の両方を含有
した。池の確認は上澄み液タンパク質のウェスタンプロ
ット分析により得られ、それはトランスフエフトーマ培
養上澄み中に存在するヒ）ＩｇＧ血清学決定基をもつ約
５０キロドルトン（５０ｋｂ）のタンパク重鎖を示した
。抗ヒ）ＩｇＧ試薬はマウスＩｇＡと反応せず、それは
また遅い電気泳動移動度に基いて識別可能であった。
分析により与えられ、それで新群配列制限フラグメント
が確認され；このフラグメントは予期された大きさく１
０．５ ｋｂ ＢａｍＨＩフラグメント）であり、ヒト
ガンマ１およびマウスＪ□２〜ＪＨ３配列の両方を含有
した。池の確認は上澄み液タンパク質のウェスタンプロ
ット分析により得られ、それはトランスフエフトーマ培
養上澄み中に存在するヒ）ＩｇＧ血清学決定基をもつ約
５０キロドルトン（５０ｋｂ）のタンパク重鎖を示した
。抗ヒ）ＩｇＧ試薬はマウスＩｇＡと反応せず、それは
また遅い電気泳動移動度に基いて識別可能であった。
ＥＬＩＳΔの結果もまた多くのトランスフエフトーマ上
澄み中のマウスＩｇＡの存在を示した。
澄み中のマウスＩｇＡの存在を示した。
これは機能性Ｊ５５８重鎖遺伝子非破壊組込み（すなわ
ち、相同組換え事象をうけなかった）の結果である。ヒ
）ＩｇＧおよびマウスＩｇＡの発現および生産の水準を
比較することにより相同対非相同組換事象の頻度が実験
により、３０〜８０％であると評価された。
ち、相同組換え事象をうけなかった）の結果である。ヒ
）ＩｇＧおよびマウスＩｇＡの発現および生産の水準を
比較することにより相同対非相同組換事象の頻度が実験
により、３０〜８０％であると評価された。
上記結果は結論的に：（ａ）標的プラスミドが設計のよ
うに作用すること；およびら）骨髄腫細胞が相同組換え
を仲介するそれらの能力に非常に有効であることを示し
た。
うに作用すること；およびら）骨髄腫細胞が相同組換え
を仲介するそれらの能力に非常に有効であることを示し
た。
可変領域遺伝子セグメントの上流および（または）下流
の領域に相同性の配列を可変領域遺伝子セグメントまた
はその一部分との結合に用いて抗原親和性および（また
は）特異性を改変することができた。さらに、記載した
Ｊ５５８系をタンパク質増強組換えを確認するスクリー
ニング操作として使用できる。
の領域に相同性の配列を可変領域遺伝子セグメントまた
はその一部分との結合に用いて抗原親和性および（また
は）特異性を改変することができた。さらに、記載した
Ｊ５５８系をタンパク質増強組換えを確認するスクリー
ニング操作として使用できる。
乳 実施例：Ｌ２０ヒト腫瘍関連抗原に対する特異性を
有するキメラ免疫グロブリン 重鎖の生産 次に記載する実験はマウスハイブリドーマ細胞が相同組
換えを有効に仲介できること、およびこの能力が内因性
免疫グロブリン重鎖部位の主再構築の指向に利用できる
ことを示す。マウス重鎖エンハンサ−およびネオマイシ
ン遺伝子によりフランクされたヒトＩｇＧ１不変部領域
エキソンを含むプラスミドが構築された。この構築物を
用いてヒト腫瘍関連抗原に特異性の単クローン性抗体を
生産するハイブリドーマ細胞系Ｌ２０ （１９８６年２
月２６日に提出された特許出願第８４３．１７２号およ
びその参照文献）の内因性重鎖部位に特異的に標的する
部位による抗原特異性キメラ重鎖Ｉｇの生産を指向した
。標的事象の頻度が、プラスミドを組込むハイブリドー
マ細胞の２００中１、すなわち０．５％であると認めら
れる。
有するキメラ免疫グロブリン 重鎖の生産 次に記載する実験はマウスハイブリドーマ細胞が相同組
換えを有効に仲介できること、およびこの能力が内因性
免疫グロブリン重鎖部位の主再構築の指向に利用できる
ことを示す。マウス重鎖エンハンサ−およびネオマイシ
ン遺伝子によりフランクされたヒトＩｇＧ１不変部領域
エキソンを含むプラスミドが構築された。この構築物を
用いてヒト腫瘍関連抗原に特異性の単クローン性抗体を
生産するハイブリドーマ細胞系Ｌ２０ （１９８６年２
月２６日に提出された特許出願第８４３．１７２号およ
びその参照文献）の内因性重鎖部位に特異的に標的する
部位による抗原特異性キメラ重鎖Ｉｇの生産を指向した
。標的事象の頻度が、プラスミドを組込むハイブリドー
マ細胞の２００中１、すなわち０．５％であると認めら
れる。
７、ｌ ａ的ベクターの構築ふよびハイブリドーマし−
２０のトランスフェクション マウス重鎖エンハンサ−（ＭＨＥ）およびネオマイシン
耐性遺伝子（ＮＥＯ）によりフランクされるヒ）ＩｇＧ
１ （Ｃｇｌ）の不変部領域エキソンを含むプラスミ
ドベクターが構築された（第３図）。プラスミドをマウ
スＩｇＨ部位と共有される配列アイデンティティの２．
２ｋｂ領域内の特有）！、ｂａ（ｆ５位で線状になし、
主にヒト癌腫細胞上に発現される抗原に特異性のマウス
ｒｇＧ１抗体を生産するハイプリドーマ細胞系Ｌ２０中
へ次のようにトランスフェクトした：第３図に記載され
るベクターを特有ＸｂａＩｓ位で線状になし、５０μｇ
を用いてエレクトロポレーションにより （物質および
方法中に記載したように）８Ｘ１（１６Ｌ２０ハイブリ
ドーマ細胞をトランスフェクトした。
２０のトランスフェクション マウス重鎖エンハンサ−（ＭＨＥ）およびネオマイシン
耐性遺伝子（ＮＥＯ）によりフランクされるヒ）ＩｇＧ
１ （Ｃｇｌ）の不変部領域エキソンを含むプラスミ
ドベクターが構築された（第３図）。プラスミドをマウ
スＩｇＨ部位と共有される配列アイデンティティの２．
２ｋｂ領域内の特有）！、ｂａ（ｆ５位で線状になし、
主にヒト癌腫細胞上に発現される抗原に特異性のマウス
ｒｇＧ１抗体を生産するハイプリドーマ細胞系Ｌ２０中
へ次のようにトランスフェクトした：第３図に記載され
るベクターを特有ＸｂａＩｓ位で線状になし、５０μｇ
を用いてエレクトロポレーションにより （物質および
方法中に記載したように）８Ｘ１（１６Ｌ２０ハイブリ
ドーマ細胞をトランスフェクトした。
生細胞を９６ウエルプレート中で、２．５ ｍｇ／ ｒ
ｒｄ！ Ｇ４１８を含むＩＭＤＭＩＯ％ＰＢＳ培地中、
ｌ×１（１４（または頻度計算のためにｌＸｌ０’）細
胞／ウェルの密度で培養した。プレートは２〜３日毎に
フィードし、２週後にウェルを標準ＥＬｒＳＡ法を用い
てヒ）ＩｇＧ１の生成についてスクリーンした。ｌ：ｌ
Ｏ，ＱＯＯ希釈のヤギ抗ヒトＩｇＧ〔カタログ＃４１３
２、アンチボテ′イーズ社（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、
Ｉｎｃ、、 Ｄａｖｉｓ、 （八）〕を捕捉試薬と
して用い、１：６０００希釈のヤギ抗ヒトＩｇＧ／ＨＲ
Ｐ（カタログ＃ＨＡＰＯＯ９、アメリカン・クアレック
ス（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｑｕａｌｅｘ、 Ｌａ ！Ｊｉ
ｒａｄａ。
ｒｄ！ Ｇ４１８を含むＩＭＤＭＩＯ％ＰＢＳ培地中、
ｌ×１（１４（または頻度計算のためにｌＸｌ０’）細
胞／ウェルの密度で培養した。プレートは２〜３日毎に
フィードし、２週後にウェルを標準ＥＬｒＳＡ法を用い
てヒ）ＩｇＧ１の生成についてスクリーンした。ｌ：ｌ
Ｏ，ＱＯＯ希釈のヤギ抗ヒトＩｇＧ〔カタログ＃４１３
２、アンチボテ′イーズ社（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、
Ｉｎｃ、、 Ｄａｖｉｓ、 （八）〕を捕捉試薬と
して用い、１：６０００希釈のヤギ抗ヒトＩｇＧ／ＨＲ
Ｐ（カタログ＃ＨＡＰＯＯ９、アメリカン・クアレック
ス（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｑｕａｌｅｘ、 Ｌａ ！Ｊｉ
ｒａｄａ。
ＣＡ））を用いて検出した。陽性上澄みはすべて次のＥ
Ｌ Ｉ ＳＡで同様に実証された。
Ｌ Ｉ ＳＡで同様に実証された。
ヒト１ピＧ１エキンンが可変領域遺伝子セグメントに関
連しないので、ヒ）ＩｇＧ１重鎖タンパク質の生産は単
に機能プロモーター、開始コドン、およびスプライシン
グ配列によるプラスミドの組換えによって生ずることが
できる。従って６４１８含有培地中の細胞生存選択（す
なわち、プラスミドを満足に組込んだすべてのもの）を
ＥＬ Ｉ ＳＡによりヒ）ＩｇＧｌの生産について検定
した（表Ｉ）。
連しないので、ヒ）ＩｇＧ１重鎖タンパク質の生産は単
に機能プロモーター、開始コドン、およびスプライシン
グ配列によるプラスミドの組換えによって生ずることが
できる。従って６４１８含有培地中の細胞生存選択（す
なわち、プラスミドを満足に組込んだすべてのもの）を
ＥＬ Ｉ ＳＡによりヒ）ＩｇＧｌの生産について検定
した（表Ｉ）。
表 ■
２．２ ４８０ １０５６ ８ ０．７５％
トランスフェクションの頻度は低密度の培養により測定
し、ヒト■ｇＧ１の生産を生ずる組込み事象の頻度は従
って１３２中１すなわち０．７５％であると認められた
。同一細胞およびプラスミドによるより最近の実験は５
１２組込み中の２つ、すなわち０．３９％にヒトＩｇＧ
の生産を生じ、これらは平均頻度が０．５％に一層近づ
いていることを示している。興味深いことには、クロー
ン化後でも大部分の細胞系が７ウスふよびヒ）ＩｇＧを
ともに生産することが認められたが、しかし、ときどき
一方または他方を生産するクローンが分離された（表■
）。ヒトＩｇＧ１を生産する親ウェルの細胞を限界希釈
で培養し、客観から１２クローンをヒトＩｇＧ１ （
ｈｕＩｇＧｌ）（表１について記載したように）および
マウスＩｇＧの生産について検定した。マウスＩｇＧ
＜ｍｒｇａ＞検定はヤギ抗マウスＩｇＧＣカタログ＃１
（１７０、サザン・バイオチク（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂ
ｉｏｔｅｃｈ、 Ｂｉｒ＋ｙ＋＋ｎｇｈａｍＡＬ） ）
およびヤギ抗マウスカッパ／ＨＲＰ （カタログ＃０Ｂ
１１４１−８５、フィッシャー・バイオチク（Ｆｉｓｈ
ｅｒ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｏｒａｎｇｅｂｕｒｇ、 ＮＹ
） ）をそれぞれ捕捉および検出試薬として用いて行な
った。
トランスフェクションの頻度は低密度の培養により測定
し、ヒト■ｇＧ１の生産を生ずる組込み事象の頻度は従
って１３２中１すなわち０．７５％であると認められた
。同一細胞およびプラスミドによるより最近の実験は５
１２組込み中の２つ、すなわち０．３９％にヒトＩｇＧ
の生産を生じ、これらは平均頻度が０．５％に一層近づ
いていることを示している。興味深いことには、クロー
ン化後でも大部分の細胞系が７ウスふよびヒ）ＩｇＧを
ともに生産することが認められたが、しかし、ときどき
一方または他方を生産するクローンが分離された（表■
）。ヒトＩｇＧ１を生産する親ウェルの細胞を限界希釈
で培養し、客観から１２クローンをヒトＩｇＧ１ （
ｈｕＩｇＧｌ）（表１について記載したように）および
マウスＩｇＧの生産について検定した。マウスＩｇＧ
＜ｍｒｇａ＞検定はヤギ抗マウスＩｇＧＣカタログ＃１
（１７０、サザン・バイオチク（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂ
ｉｏｔｅｃｈ、 Ｂｉｒ＋ｙ＋＋ｎｇｈａｍＡＬ） ）
およびヤギ抗マウスカッパ／ＨＲＰ （カタログ＃０Ｂ
１１４１−８５、フィッシャー・バイオチク（Ｆｉｓｈ
ｅｒ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｏｒａｎｇｅｂｕｒｇ、 ＮＹ
） ）をそれぞれ捕捉および検出試薬として用いて行な
った。
結果は表Ｈに示される。示した数字はヒト抗体、マウス
、または両方を生ずるクローン数である。
、または両方を生ずるクローン数である。
表■
ヒトＩｇＧ１を生産するし２０トランスフエクタントの
クローンにおけるマウス７Ｃ５０（１１２ ７Ｅ６ １ ０ １１８
Ｆ８ ２ ２ ８１０Ｇ
３ ０ ２ １０９Ｆ１１
０ １ １１９Ｆ１２
１ ０ １１７．２ 発
現キメラＬ２０重鎖の確認７．２．１ ウェスタンプ
ロット分析ヒト重鎖は次のように選んだクローンの上澄
みのウェスタンプロット分析により血清学的に明らかで
あり、以下に示すように予期された大きさの範囲内であ
った。増殖の定常期に近い培養を洗浄し、血清を含まな
い培地中に再懸濁した。２４時間後に上澄みを収集し、
Ｏ，Ｌ Ｍ Ｎ Ｈ４０Ａｃに対し透析し、凍結乾燥
し、５１ＴＩＭトリス、ｐＨ６，８、中に再懸濁した。
クローンにおけるマウス７Ｃ５０（１１２ ７Ｅ６ １ ０ １１８
Ｆ８ ２ ２ ８１０Ｇ
３ ０ ２ １０９Ｆ１１
０ １ １１９Ｆ１２
１ ０ １１７．２ 発
現キメラＬ２０重鎖の確認７．２．１ ウェスタンプ
ロット分析ヒト重鎖は次のように選んだクローンの上澄
みのウェスタンプロット分析により血清学的に明らかで
あり、以下に示すように予期された大きさの範囲内であ
った。増殖の定常期に近い培養を洗浄し、血清を含まな
い培地中に再懸濁した。２４時間後に上澄みを収集し、
Ｏ，Ｌ Ｍ Ｎ Ｈ４０Ａｃに対し透析し、凍結乾燥
し、５１ＴＩＭトリス、ｐＨ６，８、中に再懸濁した。
これらの試料の分割量および親細胞系Ｌ２０、プラス精
製抗体２Ｈ９（ヒトＩｇＧ１タンパク質）、並びに精製
マウスＬ２（１１ｇＧ１をβ−メルカプトエタノールの
存在下に煮沸することにより変性し、１０〜２０％の範
囲の勾配アクリルアミドゲルを通し電気泳動した。ゲル
をニトロセルロース紙に電気泳動的に移した。該フィル
ターをＰＢＳ中の２％脱脂粉乳でブロックし、ヤギ抗ヒ
トＩｇＧ／ＨＲＰ （＃１０５（１１カルタグ（ＣＡＬ
ＴＡＧ、 Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、 ＣＡ） ］
テ染色し、トリス緩衝食塩水中の３０ｍｇ４−クロロ
−１−ナフトール〔シダ？ （Ｓｉｇｍａ、 Ｓｔ Ｌ
ｏｕｔｓ ＭＯ）製〕で顕色した。
製抗体２Ｈ９（ヒトＩｇＧ１タンパク質）、並びに精製
マウスＬ２（１１ｇＧ１をβ−メルカプトエタノールの
存在下に煮沸することにより変性し、１０〜２０％の範
囲の勾配アクリルアミドゲルを通し電気泳動した。ゲル
をニトロセルロース紙に電気泳動的に移した。該フィル
ターをＰＢＳ中の２％脱脂粉乳でブロックし、ヤギ抗ヒ
トＩｇＧ／ＨＲＰ （＃１０５（１１カルタグ（ＣＡＬ
ＴＡＧ、 Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、 ＣＡ） ］
テ染色し、トリス緩衝食塩水中の３０ｍｇ４−クロロ
−１−ナフトール〔シダ？ （Ｓｉｇｍａ、 Ｓｔ Ｌ
ｏｕｔｓ ＭＯ）製〕で顕色した。
７、２．２ フローサイトメトリー分析ヒトおよびマ
ウスＩｇＧ１はともに、また次のようにフローサイトメ
トリーにより抗原特異性であることが示された（表■）
。ウェスタンブロッティングに用いた試料をＥＬ Ｉ
ＳＡにより検出してマウスおよびヒ）ＩｇＧ１の濃度を
測定した。
ウスＩｇＧ１はともに、また次のようにフローサイトメ
トリーにより抗原特異性であることが示された（表■）
。ウェスタンブロッティングに用いた試料をＥＬ Ｉ
ＳＡにより検出してマウスおよびヒ）ＩｇＧ１の濃度を
測定した。
希釈して濃度（μｇ ／ ｍｌ ）をフローサイトメト
リー分析に示した濃度に調製した。ヒト腫瘍系２９８１
または３３４７〔ヘルストロム（Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ）
ほか、１９８６、プロシーデイングズ・オフ・ザ・ナシ
ョナル・アカデミ−・オフ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、Ｎ
ａｔｌ、 Ａｃａｃｌ、 Ｓｃｉ、） ［ＪＳＡ、 ８
３ ： ７０５９〜７（１６３）の５ Ｘ １０’細胞
を、示したＬ２０抗体（または培地）の存在下に４℃で
３０分間インキュベートし、２回洗浄し、１：５０希釈
（培地中）のヤギ抗ヒ） ＩｇＧ／Ｆ ＩＴｃ （フル
オレセインインチオシアネート） 〔カルタグ（ＣＡＬ
Ｔ八Ｇ。
リー分析に示した濃度に調製した。ヒト腫瘍系２９８１
または３３４７〔ヘルストロム（Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ）
ほか、１９８６、プロシーデイングズ・オフ・ザ・ナシ
ョナル・アカデミ−・オフ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、Ｎ
ａｔｌ、 Ａｃａｃｌ、 Ｓｃｉ、） ［ＪＳＡ、 ８
３ ： ７０５９〜７（１６３）の５ Ｘ １０’細胞
を、示したＬ２０抗体（または培地）の存在下に４℃で
３０分間インキュベートし、２回洗浄し、１：５０希釈
（培地中）のヤギ抗ヒ） ＩｇＧ／Ｆ ＩＴｃ （フル
オレセインインチオシアネート） 〔カルタグ（ＣＡＬ
Ｔ八Ｇ。
へａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、 ＣＡ）製〕またはヤギ
抗マウスＩｇＧ／ＦＩＴＣＩ”タボ（ＴＡＧＯ，Ｂｕｒ
ｌｉｎｇａｍｅ、 ＣＡ）重および軽鎖特異性〕で４
℃で３０分間染色した。
抗マウスＩｇＧ／ＦＩＴＣＩ”タボ（ＴＡＧＯ，Ｂｕｒ
ｌｉｎｇａｍｅ、 ＣＡ）重および軽鎖特異性〕で４
℃で３０分間染色した。
これらの調製物を次いで２回洗浄し、再懸濁し、相対け
い光についてフローサイトメ） ＩＪ−により分析した
。結果は表■に示される。示される値は各調製物に関し
て一次けい先光１ （ＬＦＥ）関係にある。
い光についてフローサイトメ） ＩＪ−により分析した
。結果は表■に示される。示される値は各調製物に関し
て一次けい先光１ （ＬＦＥ）関係にある。
表■
Ｅ６−１０
Ｆ８−８
Ｈ１２−１
Ｆ８−１０
Ｌ２０
培 地
■、０
１．０
１．０
１．０
０．５
０．１
０．４
１．０
１．０
７ε６−１０ ０．４ ０
ｍＬ２０ ０ ０．４
培 地 ００
従って、親し２０ｍ胞系はおそらく生産性重鎖対立遺伝
子２複写を保持し、その１つのみが所与細胞内で特異的
組換えをうける。キメラ抗体のみを発現するクローンの
生成水準は増殖の定常期において培養上澄み１０ｍ！！
中に５〜１０μｇ／ｒｎ１程度であると認められた。
子２複写を保持し、その１つのみが所与細胞内で特異的
組換えをうける。キメラ抗体のみを発現するクローンの
生成水準は増殖の定常期において培養上澄み１０ｍ！！
中に５〜１０μｇ／ｒｎ１程度であると認められた。
？、 ２．３ サザンプロット分析
ヒトＣｒ１に特異性のプローブを用いたサザンプロット
分析は、３つの異なる酵素で、ヒ）ＩｇＧ１を生産する
全細胞系に共通に組込み特異性フラグメントを示した。
分析は、３つの異なる酵素で、ヒ）ＩｇＧ１を生産する
全細胞系に共通に組込み特異性フラグメントを示した。
ＢａｍＨ１部位はＬ２０親系中の標的配列の上流１．４
ｋｂに位置し、従って、標的部位における朗換えベクタ
ーの挿入がｈｕＣｒ ｌプローブにハイブリッド形成す
る５、５ｋｂのＢａｍ旧フラグメントを生ずると予期さ
れる。そのようなフラグメントがヒトＩｇＧ１を生産す
る各クローン中に認められた。
ｋｂに位置し、従って、標的部位における朗換えベクタ
ーの挿入がｈｕＣｒ ｌプローブにハイブリッド形成す
る５、５ｋｂのＢａｍ旧フラグメントを生ずると予期さ
れる。そのようなフラグメントがヒトＩｇＧ１を生産す
る各クローン中に認められた。
？、２．４ ＡＤＣＣ分析
マウスＬ２０ＩｇＧ１抗体とキメラ重鎖をもつタンパク
質とを、ＡＤＣＣ検定〔ヘルストロム（Ｈｅｌ ｌｓｔ
ｒｏｍ） ほか、１９８５、プロシーデイングズ・オフ
・ザ・ナショナル・アカデミ−・オフ・サイエフ ス（
ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 八ｃａｄ、 Ｓｃｉ、
） ＵＳＡ 、８２：１４９９〜ｌ ５０２）におけ
る活性について比較した。表■中の結果から知見できる
ように、重鎖不変部領域がヒ）ＩｇＧのそれに変わると
この特異性に新規エフェクター機能を与える。
質とを、ＡＤＣＣ検定〔ヘルストロム（Ｈｅｌ ｌｓｔ
ｒｏｍ） ほか、１９８５、プロシーデイングズ・オフ
・ザ・ナショナル・アカデミ−・オフ・サイエフ ス（
ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 八ｃａｄ、 Ｓｃｉ、
） ＵＳＡ 、８２：１４９９〜ｌ ５０２）におけ
る活性について比較した。表■中の結果から知見できる
ように、重鎖不変部領域がヒ）ＩｇＧのそれに変わると
この特異性に新規エフェクター機能を与える。
表■
マウスＭＡｂ Ｌ２０およびキメラ重鎖Ｌ２０により
仲介された２９８Ｂｉ的細胞のＡＤＣＣ濃 度
２９８１標的細胞 免疫グロブリン （μｇ ／ ｍｆ！ ） のΔＤ
ＣＣＬ２（１８Ｆ８−８ ４ ５
８％Ｌ２（１７ε６−１０ ８ ５
３％！Ａ八ｂ へ２０ １
０ ３ １ ％な し
＊ ０ ３１％＊
エフェクター細胞（リンパ球）のみ７．３ 異なる
標的ベクターを用いて生じたキメラＬ２０重鎖 他の実施例において、我々は第４Ａ図に示した他のプラ
スミドを用いてヒトＣｒ１エキソンをマウスハイブリド
ーマ細胞Ｌ２０中に導入し、ヒトＩｇＧ１キメラ重鎖タ
ンパク質の生成させ、プラスミド４Ａはハイプリドーマ
細胞系Ｌ２０中へトランスフェクトされ、約７００組込
み事象のＥＬＩＳＡ検定で４ウエルがｈｕ Ｉ ｇ Ｇ
を生じた。
仲介された２９８Ｂｉ的細胞のＡＤＣＣ濃 度
２９８１標的細胞 免疫グロブリン （μｇ ／ ｍｆ！ ） のΔＤ
ＣＣＬ２（１８Ｆ８−８ ４ ５
８％Ｌ２（１７ε６−１０ ８ ５
３％！Ａ八ｂ へ２０ １
０ ３ １ ％な し
＊ ０ ３１％＊
エフェクター細胞（リンパ球）のみ７．３ 異なる
標的ベクターを用いて生じたキメラＬ２０重鎖 他の実施例において、我々は第４Ａ図に示した他のプラ
スミドを用いてヒトＣｒ１エキソンをマウスハイブリド
ーマ細胞Ｌ２０中に導入し、ヒトＩｇＧ１キメラ重鎖タ
ンパク質の生成させ、プラスミド４Ａはハイプリドーマ
細胞系Ｌ２０中へトランスフェクトされ、約７００組込
み事象のＥＬＩＳＡ検定で４ウエルがｈｕ Ｉ ｇ Ｇ
を生じた。
８、 キメラＧ ２ ｇ、 １重鎖の構築他の実施例に
おいて、我々は第３図に示したプラスミドを用いてマウ
スハイブリドーマ細胞系Ｇ２８．１（レドベター（Ｌｅ
ｄｂｅｔｔｅｒ）ほか、リウコサイト・タイピング（Ｌ
ｅｕｋｏｃｙｔｅ ｔｙｐｉｎｇ） ＩＩＩ、マクマイ
クル（Ａ、 ＪｏＭｃ ＭｉｃｈａｅｌＨＪｉｉ、オフ
スフオード・ユニバーシティ・プレス（Ｏｘｆｏｒｄ
Ｌｌｎｉｖ、 Ｐｒｅｓｓ）、り１１．３３９〜３４０
（１９８７））を同一方法により抗原特異性ヒ）Ｉ
ｇＧ１重鎖を生産するように変換した。■試験が８６４
組込み事象中４ｈｕ Ｉ ｇ Ｇ ｌ生産体を生じた。
おいて、我々は第３図に示したプラスミドを用いてマウ
スハイブリドーマ細胞系Ｇ２８．１（レドベター（Ｌｅ
ｄｂｅｔｔｅｒ）ほか、リウコサイト・タイピング（Ｌ
ｅｕｋｏｃｙｔｅ ｔｙｐｉｎｇ） ＩＩＩ、マクマイ
クル（Ａ、 ＪｏＭｃ ＭｉｃｈａｅｌＨＪｉｉ、オフ
スフオード・ユニバーシティ・プレス（Ｏｘｆｏｒｄ
Ｌｌｎｉｖ、 Ｐｒｅｓｓ）、り１１．３３９〜３４０
（１９８７））を同一方法により抗原特異性ヒ）Ｉ
ｇＧ１重鎖を生産するように変換した。■試験が８６４
組込み事象中４ｈｕ Ｉ ｇ Ｇ ｌ生産体を生じた。
これらの細胞系はＥＬ Ｉ ＳＡにより確認され、立証
され、次いでそれらの扁桃Ｂ細胞に結合する能力につい
て次のように試験した：ヒト扁桃Ｂ細胞を、示した細胞
系の上澄み（または培地）とともにインキュベートし、
洗浄し、ヤギ抗ヒトＩｇＧ（αｈｕ）またはヤギ抗マウ
スＩｇＧ（αｍ）で前記のように対比染色し、フローサ
イトメトリーにより分析した。結果は表Ｖに示される。
され、次いでそれらの扁桃Ｂ細胞に結合する能力につい
て次のように試験した：ヒト扁桃Ｂ細胞を、示した細胞
系の上澄み（または培地）とともにインキュベートし、
洗浄し、ヤギ抗ヒトＩｇＧ（αｈｕ）またはヤギ抗マウ
スＩｇＧ（αｍ）で前記のように対比染色し、フローサ
イトメトリーにより分析した。結果は表Ｖに示される。
上澄みをＥＬＩＳＡによりマウスおよびヒ）ＩｇＧにつ
いて定量し、値はｎｇ／ｄで示される。けい光データは
一次けい充当１関係として示される。
いて定量し、値はｎｇ／ｄで示される。けい光データは
一次けい充当１関係として示される。
表■
重鎖キメラＧ ２ ｇ、 １上澄みの抗原特異性ＦＥ
細胞系 ｈｕｌｇＧ ｍｌｇＧ ａ −ｈ
ｕｌｌＦＩＯ（１８７９ １ＦＩＩ ９７ ８９ ９３４Ｆ
５ ８６ ９１ ３８３Ｄ２
９０ ８６ ７７３Ｄ１１
５６ ８５ １６培 地
０ ０ ９ハイブリドーマ細胞
系Ｌ６中へトランスフェクトするとキメラ重鎖を（マウ
ス重鎖の不在下に）安定に生産するクローンを生ずる単
一細胞系が生じた。抗体がヒト腫瘍細胞に結合すること
およびヒトエフェクター細胞でマウスＬ６よりも有効に
ＡＤＣＣによる破壊を仲介しく表■）、普通の組換え法
（特許出願第６８４，７５９号（１９８４年１２月２１
日提出）および特許願第７７６．３２１号（１９８５年
ＩＯ月１８日提出）並びにそれらの参照文献〕により生
じた重および軽鎖キメラＬ６のそれに匹敵することが示
された。
ｕｌｌＦＩＯ（１８７９ １ＦＩＩ ９７ ８９ ９３４Ｆ
５ ８６ ９１ ３８３Ｄ２
９０ ８６ ７７３Ｄ１１
５６ ８５ １６培 地
０ ０ ９ハイブリドーマ細胞
系Ｌ６中へトランスフェクトするとキメラ重鎖を（マウ
ス重鎖の不在下に）安定に生産するクローンを生ずる単
一細胞系が生じた。抗体がヒト腫瘍細胞に結合すること
およびヒトエフェクター細胞でマウスＬ６よりも有効に
ＡＤＣＣによる破壊を仲介しく表■）、普通の組換え法
（特許出願第６８４，７５９号（１９８４年１２月２１
日提出）および特許願第７７６．３２１号（１９８５年
ＩＯ月１８日提出）並びにそれらの参照文献〕により生
じた重および軽鎖キメラＬ６のそれに匹敵することが示
された。
α−ｍ
Ｇ２８．１ ０ ８３
５３培 地 ０ ０
３結果は再びヒ）ＩｇＧｌキメラ重鎖をもつ抗体
分子に対する抗原特異性の保存を示す。
５３培 地 ０ ０
３結果は再びヒ）ＩｇＧｌキメラ重鎖をもつ抗体
分子に対する抗原特異性の保存を示す。
９、 キメラし６重鎖の構築
第４Ｂ図に示す組換え標的プラスミドをマウス表
■
１６ ７Ｂ？、１６ ０．（１１
８Ｌ６ ７Ｂ７，７ ０．（１１
８ＭＡｂ Ｌ６ ０．（１１
５な し＊ ０．（１１
５３％ ２．５％ ８％ ３％ ＊ エフェクター細胞（リンパ球）のみサザンプロット
が１ｏｋｂＡｖａｌフラグメントおよび８ｋｂ ８ｇｌ
ｎフラグメントの存在を確認し、それらの両方がｈｕｃ
ｇｌプローブにノーイブリッド形成する。これらのフラ
グメントはクローン化ゲノムし６重鎖可変領域遺伝子セ
グメントの以前の地図作成に基く標的部位におけるベク
タープラスミドの挿入を支持した。
８Ｌ６ ７Ｂ７，７ ０．（１１
８ＭＡｂ Ｌ６ ０．（１１
５な し＊ ０．（１１
５３％ ２．５％ ８％ ３％ ＊ エフェクター細胞（リンパ球）のみサザンプロット
が１ｏｋｂＡｖａｌフラグメントおよび８ｋｂ ８ｇｌ
ｎフラグメントの存在を確認し、それらの両方がｈｕｃ
ｇｌプローブにノーイブリッド形成する。これらのフラ
グメントはクローン化ゲノムし６重鎖可変領域遺伝子セ
グメントの以前の地図作成に基く標的部位におけるベク
タープラスミドの挿入を支持した。
本発明は実施例に開示された態様により範囲を限定すべ
きでなく、それらは本発明の種々の観点の単なる１例示
として意図され、機能的に等しい方法は本発明の範囲内
にある。実際に、こ５に示され、記載されたものに加え
て本発明の種々の改変が前記記載から当業者に明らかに
なろう。そのような改変は特許請求の範囲の範囲内に属
するものである。
きでなく、それらは本発明の種々の観点の単なる１例示
として意図され、機能的に等しい方法は本発明の範囲内
にある。実際に、こ５に示され、記載されたものに加え
て本発明の種々の改変が前記記載から当業者に明らかに
なろう。そのような改変は特許請求の範囲の範囲内に属
するものである。
第１図は本発明の標的ベクターを用いる相同組換えによ
る遺伝子置換の一般化図式、第２図は標的プラスミドＩ
） ＲＳ Ｖ −１４０−ｎｅｏ−／ＨｕＣガフ７１
／ＭｕＪ ４ ／ ｅ ｏ）構築を示す線図、第３図は
ヒ）ＩｇＧ１組換えベクターの地図、第４Ａおよび４Ｂ
図はヒ）Ｃガンマ１配列の標的に用いた他のプラスミド
を示す図である。 ＦＩＧ。 ２、Ｏｋｂ ＦＩＧ。 ４Ａ × ２、Ｏｋｂ
る遺伝子置換の一般化図式、第２図は標的プラスミドＩ
） ＲＳ Ｖ −１４０−ｎｅｏ−／ＨｕＣガフ７１
／ＭｕＪ ４ ／ ｅ ｏ）構築を示す線図、第３図は
ヒ）ＩｇＧ１組換えベクターの地図、第４Ａおよび４Ｂ
図はヒ）Ｃガンマ１配列の標的に用いた他のプラスミド
を示す図である。 ＦＩＧ。 ２、Ｏｋｂ ＦＩＧ。 ４Ａ × ２、Ｏｋｂ
Claims (21)
- （１）キメラ抗体分子を製造する方法であって、 （ａ）抗体生産細胞系を、 （ｉ）細胞系により生産される抗体の一部分をエンコー
ドする配列を修飾する置換遺伝子、および （ｉｉ）修飾される抗体配列に隣接する第２ＤＮＡ配列
に相同性の標的配列、 を含む標的ベクターで、置換遺伝子が生体内で部位特異
性相同組換えにより抗体配列を修飾するようにトランス
フェフトし、 （ｂ）キメラ抗体分子を生産するトランスフェクタント
を選択する、 ことを含む方法。 - （２）修飾される抗体配列が不変部領域遺伝子またはそ
の一部分を含む、請求項（１）記載の方法。 - （３）置換遺伝子が第２抗体不変部領域またはその一部
分をエンコードする、請求項（２）記載の方法。 - （４）置換遺伝子が酵素、毒素、ホルモン、増殖因子ま
たはリンカーをエンコードする、請求項（２）記載の方
法。 - （５）修飾される抗体配列が可変領域遺伝子またはその
一部分を含む、請求項（１）記載の方法。 - （６）置換遺伝子が第２抗体可変領域、またはその一部
分をエンコードする、請求項（５）記載の方法。 - （７）修飾される抗体配列が重鎖遺伝子を含む、請求項
（１）記載の方法。 - （８）標的配列がＶ、Ｄ、Ｊまたはスイッチ領域あるい
は修飾される重鎖遺伝子に隣接するイントロンに相同性
である、請求項（７）記載の方法。 - （９）修飾される抗体配列が軽鎖遺伝子を含む、請求項
（１）記載の方法。 - （１０）標的配列がＶ、ＤまたはＪ領域あるいは修飾さ
れる軽鎖遺伝子に隣接するイントロンに相同性である、
請求項（９）記載の方法。 - （１１）キメラ抗体分子を製造する方法であって、 （ａ）抗体生産細胞系を、 （ｉ）細胞系により生産される抗体の一部分をエンコー
ドする配列を修飾する置換遺伝子、および （ｉｉ）修飾される抗体配列に隣接する第２ＤＮＡ配列
に相同性の標的配列、 を含む標的ベクターで、置換遺伝子が生体内で部位特異
性相同組換えにより抗体配列を修飾し、キメラ抗体がト
ランスフェクト細胞系により発現されるようにトランス
フェクトすることにより調製されたキメラ抗体生産細胞
系を培養し、 （ｂ）キメラ抗体分子を培養から分離する、ことを含む
方法。 - （１２）キメラ抗体分子がマウス由来の可変領域および
ヒト由来の不変部領域を含む、請求項（１）または（１
１）記載の方法。 - （１３）キメラ抗体分子が酵素、毒素、ホルモン、増殖
因子またはリンカーに連結した可変領域を含む、請求項
（１）または（１１）記載の方法。 - （１４）トランスフェクトされる抗体生産細胞系が単ク
ローン性抗体Ｌ６を生産する、請求項（１２）記載の方
法。 - （１５）トランスフェクトされる抗体生産細胞系が単ク
ローン性抗体Ｌ６を生産する、請求項（１３）記載の方
法。 - （１６）抗体生産細胞系がＡＴＣＣに寄託されたＨＢ８
６７７を含む、請求項（１４）記載の方法。 - （１７）抗体生産細胞系がＡＴＣＣに寄託されたＨＢ８
６７７を含む、請求項（１５）記載の方法。 - （１８）トランスフェクトされる抗体生産細胞系が単ク
ローン性抗体Ｌ２０を生産する、請求項（１２）記載の
方法。 - （１９）抗体生産細胞系がＡＴＣＣに寄託されたＨＢ８
９１３を含む、請求項（１８）記載の方法。 - （２０）トランスフェクトされる抗体生産細胞系が単ク
ローン性抗体Ｌ２０を生産する、請求項（１３）記載の
方法。 - （２１）抗体生産細胞系がＡＴＣＣに寄託されたＨＢ８
９１３を含む、請求項（２０）記載の方法。
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