JPH02500565A - 転写に基づいた核酸増幅／検出系 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】

転写に基づいた核酸増幅／検出系 発明の分野 本発明は一般に分子生物学および分子遺伝学の進歩に関する。 より詳細には、本発明はＡＮＡ、ＤＮＡまたはそれらの両方でありうる１種以上 の核酸、を含む試料中の少なくとも１種の所定の核酸セグメント（配列〕または その相補鎖もしくはハイブリッド形成性相同セグメントのｓｓν１ｔｒｏまたは ｚ−ｖｉｖｏコピー数を増加させる（すなわち、増幅させる）ための新規な方法 、必要な試薬類を含むキット、および手段に関する。 本発明の方法およびキットが利用される適用例には、１）　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　 ４たはｚ−ｖｉｖｏ核酸プローブハイブリダイゼーション検定により遺伝病また は病厚体による疾患に特徴的な特定の核酸配列を検出するための体液および組織 の分析、並びに２）単一コピーの、珍しい、または低発現率の遺伝子の選択的ク ローニングが含まれる。 発明の背景 分子生物学、分子遺伝学およびそれらの応用（例えば、血液由来の病原体や欠損 遺伝子の核酸プローブハイブリダイゼーション検定）における研究の多くは、特 定の核酸配列の検出または分離を包含する。このような研究の根本的問題は、対 象となる核酸配列を検出または分離し、その後定量化することにある。その問題 は細胞培養物、組織標本および血液試料のような住物学的材料がＡＮＡおよびＤ ＮＡの複雑な混合物から成り、しかも非常に小さい画分が対象配列を含むにすぎ ないので離しいものとなっている。 実際に、核酸プローブハイブリダイゼーション検定の応用は、日常一般的使用に 適する試薬を使用し且つ許容しうる程度に短い時間で実施する混合、試料中に含 まれる対象配列の低い濃度では、検定の感度が低すぎてそれらを検出できないた めに制限されている。 複雑な杉板混合物中に低濃度で存在する対象の核酸配列（標的セグメント）を検 出する問題を解決するために、基本的に異なる２つの手εが考えられた。 第一の手法では、試料中に含まれる核酸（標的セグメントを含む）の量を変えず 、その代わりに、信号発生系を標的セグメントに結合させて、標的セグメントの 分子数に相当する検出可能な信号を発生させる。例えば、標的セグメントのサブ セグメントに相補的な配列を有する核酸プローブをアルカリ性ホスファターゼの ような酵素に結合させ、それをプローブと標的セグメントの間でハイブリダイゼ ーションが起こる（しかし、プローブと試料中の他の核酸配列の間では起こらな い〕ハイブリダイゼーション条件下で試料と混合する。ハイブリダイズしなかっ た酵素結合プローブを除いた後、アルカリ性ホスファターゼ用の発色性基質を適 当な条件下で加え、そして、原理的には標的セグメントにハイブリダイズした各 プローブ分子に対して多数の検出しうる着色分子を速やかに形成させる。 試料中の標的係酸の量を変えずに核酸配列な検出する方法は他にも当分野で多数 知られている。例えば、ｓｔｐのような放射性原子で核酸プローブを慣例的にラ ベリングし、その後放射性核種の崩壊により止する増幅信号から標的にハイブリ ダイズしたプローブを検出する。さらに別の例は標的セグメントに対するプロー ブを複製可能な別の核酸に結合させて、既知技術で容易に検出できるようにした ものである。ある槽のＲＮＡはバクテリオファージＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラ ーゼ（例えば、Ｑβレフリ刀−ゼやブロームモザイクウィルス（ｂｒｏｍａｔｈ ｏｘａｉｃ　ｖｉｒｓａ　：　ＢＭＶ　）由来のレプリカーゼ）のようなポリメ ラーゼによるレブリカーゼ誘導複製（自己触媒的ＶＣ誇導される複製）を受けや すいことが知られている。 このような系においては、ＲＡ’　Ａと相補的配列のＲＮＡとの両方がＲＮＡポ リメラーゼによる複製の鋳型となり、その結果複製ＡＮＡの童は（ＲＮＡｆｋ世 分子の数が系中のＲＮＡポリメラーゼ分子の数を越えない限り）時間が標的セグ メントに対するプローブがＱβレブリカーゼにれており、ＢＭＶレプリカーゼに よって複製され得るＲＮＡＫＭ合された系は）ｄａｒｚｈ　ａｔ　ａｌ、、　Ｐ ｏ５ｉｔｉｖｅＳｔｒａｎｄ　ＡＨＡ　ｉ’ｉｒ＊ｚａａ、ＡＪａ＊　Ｒ，Ｌｉ ｅｓ　（ｐｓｂｌｒ。 Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）　（１９８７；Ｐｒｔｒｃａｅｄｉ＊ｇａ　１１／　ＩＩｃ ＬＡ　Ｓｙｗ−ア１１１１Ｓ％惰、１９８６）Ｋ記載されている。 第一の手法は２つの重大な欠点を有している。まず第一に、多くの場合において 、笑際の大きさの試料に含まれる標的セグメントのコピー数は非常に低いので、 かなり迅速な信号発生系でさえも、バックグラウンドを有意に越える検出可能な 信号を発生させるのに景する時間が長くなり、冥用的でない。第二に、“バック グラウンド２信号発生分子と標的に結合した１号発生分子とは本質的に同じ速度 で信号を発する。標的セグメントの慌定において、１バツクグラウンド”による 信号は避けられず、すなわち、フィルターや他の担体に非特異的に付着したプロ ーブ、または標的セグメントにょく似℃いる配列をもつセグメントにハイブリダ イズしたプローブによって発せられる信号が若干存在する。標的のコピー数があ まりに低い場合は、標的＋バックグラウンドからの信号（すなわち、“信号″″ ）対バックグラウンドからの信号（すなわち、”ノイズ〕の時間足叙比ばあｌり に低すぎて有意にバックグラウンドを越えて検出できないであろう。これらの欠 点および他の欠点は、複雑な核酸混合物中に低レベルで存在する標的セグメント を検出する問題を解決する第二の手法へ導いた。 この第二の手法は根本的に相違しており、標的セグメントそれ自体のコピー数ｔ 、好ましくは試料中の他の配列（！＃に配列の類似性ゆえに標的セグメントとし て誤って検出される恐れのあるもの）よりも多くなるまで、増加させることを包 含する。この第二の手法の例は、標的セグメントを保有する細胞の数を、往々に して多数の他の細胞よりも一層速やかに増殖させる培養技術、あるいは標的セグ メントを含む特定のｗ；、酸（例えばブ５ヌミドやＡＮＡ）の数を増加させる種 々の培養技術を必要とする。 このような培養技術は煩わしく、疑わしく、しかも時間がかかるという難点を有 しており、避けられない事実：すなわち、標的セグメン）Ｙ苫むもの以外の俵酸 もそのコピー数が同時に１加し、１バツクグラウンド”を高める可能性があると い５事笑、が明らかになった。その他の難点は、増幅な連取させるのに必要な工 程が危険であり５ろ微生物を結果的に増やすことになるというものである。 この第二の手法のもう一つの例は、いわゆる°ポリメラーゼ鎖伸長反応（ＰＣＢ ）”によるＤＮＡ標的セグメントの増幅である。この技術は、例えば、ある種の ウィルスの１本鎖ＤＮＡゲノムの複製廼程で起こることが知られた自然界の方法 を借りて適合させたものであり、いず６５０２（１９８０）；および２ｏＩＬｍ ｒ　ａｔ　ａｌ、。 Ｍａｔｈａｄａ　ｉｓ　Ａ”ｓｓｙｍｅ（ｓｐｙ　１００．４６ｇ−５００（１ ９８３）に記載されろｃ　Ｄ　Ａ’　Ａ作製に類似した方法である。この技術に よれば、特定セグメントのコピー数が多数のサイクルＹＸ’ｊｆＡるたびに指数 的に増加し、各サイクルは（１）標的セグメントおよび七の相補鎖（すなわち、 標的セグメントに相補的な配列をもつセグメント）のそれぞれの３′宋端サブセ グメントにＤＮＡプライマーをハイブリダイズさせ、（２）そのプライマーをＤ ＮＡポリメラーゼで伸長させ、そして（３）段階（２１で得られた２本鎖を熱父 性して１不鎖にする、ことを包含している。この技術号および第２０１１８４号 に開示されている。この技術を約３時間にわたって２０回！’）返すことにより 、標的セグメントのコピー数を約１０”倍まで増加しうろことが報告さｎている 。これらのセグメントのみに特定のプライマーが十分安定した状態でハイブリダ イズしてポリメラーゼによる鎖伸長を開始し、それにより相補鎖を形成し、また はこれらのセグメントが相補ｆａミラし、その相補鎖に別の特定プライマーが同 様にハイブリダイズして鎖伸長の際に標的セグメントを生成するので、それらの コピー数は指数的に増加する。一方、用いたプライマーと誤ってハイブリダイズ した他の非標的セグメントはそのコピー数が、増加するにしても、せいぜいサイ クル数の関数として線状に増加するにすぎない。このポリメラーゼ釧伸長反応技 術は、標的セグメントのコピー数ばかりでな（、標的セグメントの量対バックグ ２クンドの原因となるセグメントの量の比を非常に高めることができるＯ もちろん、この第二手法は増幅された標的セグメントに対して適用される第一の 手法と併用することによって、さらに強い検出信号を得ることができる。 本発明の目的は、従来技術によって提出された問題点を解決し且つこれらの問題 点を解決しようとして研究者らが列挙した難点を克服することである。本発明の 他の目的は、既知試薬の有利性を利用し且つ一定の科学的結果に島違するのに必 要な精度を有し、短時間でね用できる簡便な技術、丁なわち再挽可菖巨な検定設 備で使用することができ且り英数呈／臨床分析用キットとして応用しうる仮術を 提供することである。 従って、本発明の目的は、ある種の核酸配列（標的セグメント）の検出可能性を 、従来技術の努力によって列挙された難点を排除したｉ％ｖｉｔデ・またはｇ− ｔｓｗｏ系での標的配列の増幅により高めることである。 本発明は、複雑な残′＠混合物中に低レベルで存在する標的セグメントを検出す る第二の手法な貢施するための新規な技術に関する。それは完全なサイクルとし て標的配列の合成２本鎖ｃ　Ｄ　Ａ’　Ａコピーと共に、それらから誘導される 新規なＡＮＡ転写生産段階を用いるものである。 多数のサイクルが実施される。この転写段階は新規な面ヲ構成するので、本明細 書においては便宜上転写に基づイタ増幅系（ｔｒａ＊ａｅｒｉｐｔｉｏ惰−ｂａ ａｅｄ　ａｔｇｐｌｔｆｉｃａｔｉ　−ｏｓ　ｓｙａｔａｍ　：　ＴＡＳ　）と 呼ぶことにする。本発明の新規ｆｘ　Ｔ　Ａ　Ｓ技術は、ＤＮＡ依存性ＡＮＡポ リメラーゼの２つの性質：すなわち（１）各ポリメラーゼに対し特異的なほおよ び（２１ＲＮ　Ａポリメラーゼによって認識されるプロモーターの各コピーから の多数の転写物の迅速な生Ｍ（−照；を利用することによって所定の標的セグメ ントのコピー数を速やかに増加させる。不発明のこの技術は、ＡＮＡ依存性ＡＮ Ａレプリカーゼによって迅速ｉＣ（自己触媒的に）複製されるある配列のＡＮＡ の能力をも利用し得る。Ｍ４＊Ｊ−らの上記文献を蓼照されたい。さらに、それ は試料ＣＰ６Ｃ存在する標的ＤＮＡの童の疑う余地のない測定を可能にする標準 化技術を提供する。 本発明は、（もし自己触媒的複製を誘導しないならば）標的セグメントの配列ま たは標的セグメントに相補的な配列のサブセグメントを有し且′）相補配列のサ ブセグメントを有する核酸に比べて大過剰で存在する１本鎖ＲＮＡ転写物、また はそれから形成された２本＠ＲＮＡ−ＤＮＡ（その形成を妨げる測定が行われな い場合）をもたらす。 初期におけるこの過剰の１本鎖ＲＮＡ転写物は増幅産物を標識核酸プローブによ り検出する方法において有利である。その理由は、増幅産物にハイブリダイズす るプローブと競合する相補配列のセグメントが少ししか存在しないからである。 また、１本鎖ＲＮＡ転写物は多かれ少なかれ連続して切り洛とされ、厄介な、誤 りやすい反復ＰＣλサイクルおよび鎖分離の必要がない標的セグメントのｉＩ接 検出をもたらす。このような利点は、検出前に、しかも許容し５る増幅レベルに 到達するのに必要な多数回の反復サイクルの後に１分離する必要のある２本鎖Ｄ ＮＡ（一方の鎚は標的セグメントヲ含み、他方の鎮は標的セグメントの相＝ｓｙ ｘ含む）をもたらすＰＣＢ技術によっては侍らｎない。 本発明の技術は、はぼ同じ時間にわたってＰＣＢ技術と少なくとも同じくらい多 ：ｔＫ／ｍ足の標的セグメントを増幅させるが、はるかに簡単でしかも再現性の ある方法であり、自然界の方法または他の仮術と明瞭に区別し得る。 発明の要約 本発明者らは、バクテリオファージＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを用いて、 核酸試料中に存在する所定の標的核酸配列（番的配列または標的セグメント）を 迅速に増幅する（すなわち、標的配列のコピー数を増加する）方法を見出した。 さらに、我々１″−バクテリオファージＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼをバク テリオファージＡＮＡ依存佐ＡＮＡポリメ２−ゼと併用することによりて同じ結 果を得る方法を発見した。これまで、このようなバクテリオファージＲＮＡポリ メラーゼがこの目的のために利用できることは知られていなかった。 本発明はこれらの発見に基づいた方法およびその方法な＊ｍするためのキットを 提供する。 これらの方法およびキットは特に１本発明に従って増幅される標的セグメントを 含む核酸の核酸プローブハイブリダイゼーション検定に関連して適用される。従 って、本発明は壕だ、特定のセグメントを含む核酸試料中の該セグメントの有無 を、本発明による増幅後に、該セグメントとハイブリダイズするプローブによっ て検出する方法、並びにその方法な英雄するためのキットを提供する。 本発明はある種のＲＮＡ転写物、それらの生産、任意の複製、および（塩基配列 において）対応する標的核酸配列の新型の増幅および検出を達成するだめのその 使用という新規性に基づいている。本発明は％％ｖｓｔｒｏまたは５−ｖｔｖ＊ の環境で実施され、２本鎖係酸鋳型（上記ＲＮＡ転写物の生産のために用いられ る）をつくるための標的配列の２重鎮ｃ　Ｄ　ＮＡコピーの台底と共同して用い られる。２本Ｑ　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ合成とＲＮＡＥ−写から成るこのＡ程は、本発 明の転写に基づいた増幅系（ＴＡＳ）の阜−サイクルを構成する。所望により、 このサイクルを繰り返し行ってより一層高レベルのｆＩａ幅ン達成してもよい。 それらが生産（および複製〕される方法であるために、それらの転写物は核酸混 合物のまじったもとの試料に含まれる標的核酸配列に塩基配列の点で対応（一致 もしくは相補的）している。それ故に、増幅された形の転写物の存在はそれらの 検出のために、ひいては、上記試料中の標的核酸配列の存在のｉｎ　ｖｉｔｒｏ または＄−９％９０検出のために利用される。 従って、本発明は核酸含有試料中の少なくとも１種の特定の核酸配列（標的配列 または標的セグメント）のｉｉｔデ０または２シｖｉｖｏ検出を包含する。本発 明は、プロモーターに連結された標的配列に対応する配列を含む２本鎖核酸を作 製し；該２不録核酸を２本鯛核酸＃８型として使用して、それらから多数のＲＮ Ａｆ写物（それぞれ上記標的配列に対応するＡＮＡ配列を有する）なつくり；そ して＃ＲＮＡ配列の存在を検出して標的配列の存在を類推する、ことから成る方 法を提供する。 本発明はこのようなＲＮＡ転写物の作製および使用に関連したあらゆる方法およ び手段に向けられる。従って、本発明は標的配列のセグメントに対応する配列に 連結されたプロモーター配列を含む第一の核酸プライマーを用意し；第一の核酸 プライマーを核酸含有試料中の標的配列と適当な条件下でハイブリダイズさせ； ハイブリダイズした第一の核酸プライマーをポリメラーゼ伸長反応により標的配 列に対し相補的に伸長させて、対応する２不録核酸を形成させ；該２本鎖核酸を １苓鎖に分離し；分離したプロモーター含有配列釧に適当な条件下で該プロモー ター配列と反対の末端で第二の核酸プライマーなハイブリダイズさせ；そしてハ イブリダイズした第二の核酸プライマーをポリメラーゼ伸長反応により該プロモ ーター含有配列に対し相補的に伸長させる、ことから成る上記の２本鎗桜酸餉呈 を作表するだめの任意に反復しうる方法に向けられる。 本発明はさらに、標的配列のセグメントに相補的な配列に作動可能な状態で這結 されたプロモーター配列を含む第一核酸プライマー、および標的配列のセグメン トと同一の配列を有する第二核酸プライマー（前記プライマー類は標的配列の異 なる領域に対応するが、標的へのそれらの対応において重複せず、または実質的 に重複せず、一方の伸長産物カニその札補錨から分離さｆるとき他方の伸長産物 のためのＫＷとして役立つように選ばれる）？：用意し；標釣配列？有する核酸 を含む試料と前記のプライマー類とを、ハイブリダイゼーションおよびその後の 釦分離の条件下で接触させて、厘次前記のプライマー類の伸長産物カニる；こと から成る２本Ｂ夜版鋳型（上記＃照）のも５１つの作り方法および手段（例えば 、本質的にシングルポット（ａｉｘｇＬｓ−ｐｏｔ）の反応から成る方法〕に向 けられる。 本発明はさらに、ＤＮＡ依存性ＡＮＡポリメラーゼ（そのプロモーターを認識す る）により触課される反応において多数のＲＮＡ転写物を作るための＠証として 前記の２本部核酸を使用し、該ＲＮＡ転写物の存在を検出および測定する方法お よび手段に向けらｎる。 本発明はさらに、内部標準として用いた既＠偽酸の存在に相関させることにより （検出されたＲＮＡ転写物の童に対応させて〕検出された標的配列の量を標準化 する方法および手段に向けられる。１ａ準のコピー数は予め決定されており、本 発明の貢施中、標準は標的配列と同じ条件を経験するので、それは平行して作ら れたその転写物と標的配列の転写物との相対量を決定する際の評価手段として役 立つであろう。 本発明はさらに、得られた前記のＲＮＡ転写物中にンブリカーゼ認員部位が存在 するために、該ＲＮＡ転写物を０表することに向けられる。これはレプリカーゼ 認諏邪位配列を、好ましくはプロモーター配列と標的配列に対応する配列との間 に、保有する上記の第一核酸プライマー、および／またはレプリカーゼ認臓部位 を有する上記の第二核酸プライマーを用意することにより有利に達成される。そ の後の転写において、結果市に生じた転写物はレプリカーゼ認ｋｍ位ン有し、そ ｎ故にレプリカーゼの存在（例えば、反応の場またはキットに含まれる）は転写 物の複製を（目己触拝的に）誘導して、検出を容易にする追加コピーをもたらす 。 不発明はさらに、上記の１決および手段を用いて、核酸含有試料中の少なくとも ｌ！！の嵜足の残数配列（標的配列ンをｉｎ　ｖｉｇｒａ　”ｌたはＺ−９％９ ０検出するのに有用な試薬類および関連手段を含むキットに向けられる。 ４、

【図面の簡単な説明】

第ＬＡ、１ＢおよびｌＣ図は核＠（ＤＮＡまたはＡＮＡ）の標的セグメント（核 酸Ａ）を増幅するための本発明方法を示しており、標的セグメントに相補的な配 列のセグメントを含む第−ＲＮＡ（ＲＮＡ　Ｉ）が多コピー数つくられろ。 第２Ａ、２Ｂ、２Ｃ図は第１Ａ、ＩＢおよびＩＣ図に示したＲＮＡ　Ｉセグメン トの別の本発ＢＡ増＠を示し℃おり、ＲＮＡ　Ｉをりくるために増幅された標的 セグメントのサブセグメントと同じ配列のセグメントを含む第二ＲＮＡＣＲＮＡ 　ｎ）が多；ビー数つくられる。 第３図は一定濃度のヒトβ−グロビン俵酸と同時にＴＡＳにより増幅された、い ろいろな濃度のＥＩＶ　ＲＮＡｔ示すオートラジオグラムである。 第４図はＤＮＡ依存性ＡＮＡポリメラーゼによっつ（られたＲＮＡがＲＮＡ依存 性レプしカーセの銅製として役立つＡＮＡ分子ｔもたらす一般的計略法を示して いる。 ２、一般方法および定義 本発明の基本的技術：例えば、ＤＮＡ合成を含めたＤＮＡプローブまたはプライ ｉ−の作製：標的ＤＮＡ配列に対するブライｉ−の指向性の程度により多かｎ少 なかれハイブリダイゼーションのｖａ笑性をもたらすストリンジェント条件の変 化を含めた、）・イブリダイゼーション方法論；プロモーターの同定、単ｍまた は調製、より詳ｍＫはバクテリオファージＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼおよ びバクテリオファージＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、あるいは真截細胞系Ｙ 用いる場合は、ウィルスＤＮＡ−およびＲ５１−依存ｔＥＲＮＡポリメラーゼ（ 例えば、アゾンウィルスによりコードされるＲＮＡポリメラーゼおよびブローム モザイクウィルスＡＮＡポリメラーゼ）によって認識されるプロモーターまたは 部位の同定、単Ｗ＆または調製；いわゆる転写エンハンサ−配列を含めたＲＮＡ 転写物の作製に役立つ条件；（誘導された）ｇＬ製の機構８よび方法論；ポリメ ラーゼ仙伸長反応方法（そのための試薬を含む）；などン実施するための定義お よび方法並びに手段は分子住物字の標準教則本に論及される。例えは、Ｍａｓｉ ａｔｉａ　ａｔ　ａｌ　、、　ｎｒｏｌｇｃｓ−１ａｒ　Ｃｌｏｓｉ％ｇ：　Ａ 　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ａ１ａｔｓａｌ、Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＥａｒｂｏ ｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅ５ａ　Ｙｏｒｋ＋　（１９８２）、　およびこ こに引用した種々の文献；木由秀許第４６８３１９５（１９８５）；Ｊｔローｗ ａｓ　ａｔ　ａＪ、、　Ｊ、　Ｂｉａｌ、　Ｃｈ−ｍ。 ＡｌｅＬｓ　Ｒ，Ｌｉｍｅ　（ｐｓｈｌ、；Ｎｏｖ　Ｙｏｒｋ）　（１９８７； Ｐｒａｃａａｄｉ＊ｇａ　ｏｆ　ＵＣＬＡ　Ｓｙｍｐｏａｉ＊ｍ、１９８６　） ｔを参照されたい。 先に列挙した刊行物は参照によりここに引用される。 １プロモーター”なる用語は、ＡＮＡポリメラーゼ（認識した配列に結合して転 写過程を開始させ、それによりＲＮＡ転写物を生産する）によって特異的に認識 される核酸配列（自然界に存在するもの、合成されたものまたは制限消化の産物 ）を意味する。それは分解に対して安定性を付与すると考えられる、実際の認ｌ ＆部位を越えて伸長するヌクレオチド塩基を含んでいてもよい。原理的には、そ の開始配列を認識しうる大手可能な既矧ボＩｌｌ’）−ゼが存在するならば、ど のプロモーター配列用してもよい。代表的で、有用な既知プロモーターはバクテ リオファージＴ３％Ｔ７またＦｉＳＰ６のようなバクテリオファージポリメラー ゼによって認識されるものであを参照されたい。これらは関連したプロモーター 配列と共に本発明の実施に２いて使用できるポリメラーゼの例にすき゛ない。 ”ＲＮＡ転写Ｗ′にプロモーター配列のＲＮＡポリメラーゼ認識に経いて起こる 転写開始後に生産されたリボ核酸配列を意味する（上記参照）。このような転写 物の生産は多かれ少なかれ連続的であシ、存在するポリメラーゼの量によっても 若干左右される。 本明細曹に２いて、１プライマー”とは適当なハイブリダイゼーション条件下で 標的配列にハイブリダイズし得る（すなわち、結合し得る）ように標的配列との 十分な相同性を有する核酸配列（自然界に存在するもの、合成されたもの、また は制限消化の産物）をＩ！味する。代表的なプライマー伸長反応が少なくとも約 ｌＯヌクレオチドであシ、最も好ましくは約３５以上のヌクレオチド長であり、 そのｔｉな実２！１Ｉｉ１＃様において、それは標的配列との同一性または極め て高い相同性を共有している。例えば、ＥＰＡｔ４１２Ｂ０４２号（１９８４年 １２月１２日発行）を参照されたい。 プライマー配列中のプロモーター配列の結合に関して特に用いられる°作動可能 な状態で連結された“という表現は、本発明の最終的な＠２本鎖核酸鋳型”が、 適当なポリメラーゼがプロモーターを認識したときに、対応するＲＮＡ転写物を 生産しうるような、その鋳型の機能性を意味する一−−上記参照。 ２本鎖核酸を製造するためのプライマー伸長反応にそれ自体既知である。上記文 献を参照されたい。この目的に適したポリメラーゼｒｉＥ　、　ｃ　ｏ　ｌ　ｉ 　Ｄ　Ａ’　Ａポリメラーゼ■、Ｅ、ｃａｌｉ　ＤＮＡポリメラーゼＩのＫ１ｍ ＊ａｗ断片、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写＃素などである。 検出信号を形成する孜術（例えば、放射性ラベリングまたは色素産性＠素を用い る発色手段によるもの）は周知であシ、当分野に２いて論じられ℃いる。上記の 論議を参照されたい。 本発明のＲＮＡ転写物の複製を（自己触媒的に）誘導するためのルプリカーゼの 使用は一般に当分野で匂られている。本発明で用いられるこの檻のレブリカーゼ の例は、所定のＲＮＡ転写物の３′宋選と５′宋端の両刃に存在する核酸配列部 位を認識するいわゆるＱβウィルスレブリカーゼ、および所定のＲＮＡ転写物の ３′末端の核酸配列を認識すると考えられるいわゆるブロームモザイクウィルス （ｂｒｏ惰ａ　ｔｎｏａａｉｃ　豐１ｒｓａ：ＢＭＶ）およびアルファウィルス のレプリカーゼである。これらのレプリカーゼはＲＮＡ転写物および相補鎖を複 製する（すなわち、再生産する）のく役立ち、そのコピー数を増幅させる。この ような酵素が転写過程で反応位置に存在する場合、転写の間に生産された多数の 転写物それら自体が複製を受けてＥＲＡ転写産物の量を指数的に増加させると予 測することができる。 内部標準法（ｊｓｔ＊ｒｓｓｊ　ａｔａ＊ｄａｒｄｉｔａｔｉｏりはＧ）ＴＡＳ 増幅法が操作手順の誤りのために失敗したことを確かめ：且つｈ）対象の試料と 常に関連した所定量の残虐に対する標的核酸のノベルを測定する；ために用いら れる方法として定義される。このような内部標準法は標的配列の一部と内因性配 列とを同一反応で同時増幅させることにより行われる。例えば、生物学的試料中 に存在する細胞数を知ることにより、単一コピー遺伝子（例えばβ−グロビン） を内部標準として使用することができるであろう。それはＲＮＡの形で発現され ないので、その初期コピー数は試料中の細胞の総数の２倍に等しい。 β−グロビンの一部と対象の標的配列とを同時増幅させることにより、増幅され た信号の比率を比べて対象の標的配列のノベルを定量化することが可能である。 各細胞は、生物学的試料が別の標的配列（例えばＨＩＶ）を含むかどうかにかか わりなく、この内部標準を（２倍体細胞中に）２コピー含んでいるので、各試料 は内部標準から生ずる陽性の増幅信号を発することが期待される。 Ｇｙｏ＊５ｄ（ｓ＊　ａｔ　ａｌ、Ｎ５ｃｌａ４ｅ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒ ｃｈ　１２．１４２７（１９８４）およびＭｃｋ＊ｉｇｈｔ、　Ｃｅ１ｌ　３１ ．３５５（１９８２）を参照されたい。また、英国特許出履公開第２１８７２８ ３　Ａ号（１９８７年９月３日発行）を参照されたい。 ３、好　な態様の詳細な説明 その態様の１つとして、本発明は式Ｉ：３′−（第一サブセグメント）ｔ−（第 二サブセグメント）１−（第三サブセグメント）ｔ−５’ 〔ここで（第一サブセグメント）ｔは（第二サブセグメント）ｔの３′床端に隣 接する少なくとも１０ヌクレオチドの既昶配列の桜准セグメントでおり、（第二 サブセグメント）ｔはＯまたはそれ以上のヌクレオチドの核酸セグメントであり 、そして（第三サブセグメント）、は（第二サブセグメント）ｔの５′床端に隣 接する少なくとも１０ヌクレオチドの既知配列の長酸セグメントである〕で表さ れる標的咳散セグメントの増幅方法に関し、その方法は： （１）　上記標的セグメントの（第一サブセグメント）ｔに、式Ｉ： ５′−（プロモーター）、−（可変サブセグメント）、−（３′−プライマーサ ブセグメント）Ｉ−３’〔ここで（プロモーター）１はバクテリオファージＤＮ Ａ依存性ＲＮＡポリメラーゼ特異的プロモーターのプラス鎖の配列なｉする１本 鎖ＤＮＡセグメントであり、（可変サブセグメント）、は（プロモーター）、０ ３′末端ヌクレオチドおよび（３′−プライマーサブセグメント）、０５′宋端 ヌクレオチドに隣接する０〜１００ヌクレオチドの１本ｍＤＮＡセグメントであ り、そして（３′−１ライマーサブセグメント）、は（第一サブセグメント）ｔ の３′宋端ヌクレオチドで終わる（揖−サブセグメント）ｔのサブセグメント配 列に相補的な配列を有する少なくとも１０ヌクＶオチドの１本鎖ＤＮＡセグメン トであり、（可変サブセグメント）、がＯヌクレオチドである場合、（プロモー ター）Ｉは（３′−プライマーサブセグメント）、０５′宋端にみ接する〕 で表される３′宋端サブセグメントから成る１本鎖ＤＮＡの第一プライマーなハ イブリダイズさせ；（２工程（１ンに従ってハイブリダイズさせた第一プライマ ーを、第−ＤＮＡポリメラーゼにより８媒される反応で伸長させて、式ＩＩｌ： ５′−（プロモーター）、−（可変サブセグメント）Ｉ−（第一サブセグメント ）ｔｃ−（第二サブセグメント）ｔ、−（Ｎ三すブセグメント）ｔｃ−３’ ■ 〔ここで（第一サブセグメン））ｔｃは（第一サブセグメント）ｔに相補的な配 列を有するＤＮＡセグメントであり、（第二サブセグメン））ｔｃは（第二サブ セグメント）！に相補的な配列を有するＤＮＡセグメントであり、そして（第三 セグメン））ｔｃは（第三サブセグメント）ｔに相補的な配列を有するＤＮＡセ グメントである〕で表されるサブセグメントから成る第一の相補ＤＮＡセグメン トを形成させ（但し、標的セグメントがＲＮＡセグメントである場合、　第　Ｄ ＮＡポリメラーゼは逆転写ｌ！＃素である）； （３）工程（２）の反応で形成された２重鎖核酸を１本鎖となし： （４）式ｍのｇ−札＠ＤＮＡのく第三サブセグメント）ｔｃＫ、式■： ３’−＜　５’−プライマーサブセグメン）　）１−　（可変サブセグメント） ｔ”’ｓ’ ■ 〔ここで（５′−プライマーサブセグメント）！は（第三サブセグメン＞）１０ ５′末端ヌクレオナトで終わる（第三サブでグメント）ｔのザブセグメント配列 を有し、（可変サブセグメント）、は（５′−プライマーサブセグメント）、０ ５′末端に隣接する０〜１００ヌクレオチドのセグメントである〕 で衣される少なくともｌＯヌクレオチドの１本＠ＤＮＡの第ニプライマーをハイ ブリダイズさせ；（５）工程（４）に従ってノ・イブリダイズさせた第ニプライ マーセグメントを第二ＤＮＡポリメラーゼによって触媒される反応で伸長させて 、式Ｖ： ５′−（可変サブセグメントバー（第三サブセグメン））１−（第二サブセメメ ン１ｔ−（第一サブセグメン））！−（可変サブセグメント）＋−−（プロモー ター）＋ｃ−３’ ■ 〔ここで（可変サブセグメント）１．は（可変サブセグメント）、に相補的な配 列を有するＤＮＡセグメントであり、（プロモーター）１．は（プロモーター） 、に相補的な配列を有するＤＮＡセグメントである〕で弄されるサブセグメント から成る第二相補Ｄｈ’Ａセグメントを形成させ（但し、第二ＤＮＡポリメラー ゼは第−ＤＮＡポリメラーゼと同一であっても異なっていてもよい）；そして （６）工程（５）の２本鎖産豐を、（プロモーター）、である一方の銹のプロモ ーターを認識する第一のバクテリオファージＤＮＡ依存性ＡＮＡポリメラーゼに より触媒される反応において鋳型として使用して、式■：５′−（可変サブセグ メン）　）ｒｒ−（第一サブセグメン）　）　ｔｃｒ−（第二サブセグメント） １ｃヶ−（第三サブセグメント）　ｔｇｒ−（可変サブセグメン）　）ｔｃｒ− ３′ ■ 〔ここで（可変サブセグメント）、７は（可変サブセグメント）、の配列を有す るＲＮＡセグメントであり、（第−サブセグメント）　ｔａｒは（第一サブセグ メント）！に相補的な配列を有するＲＮＡセグメントであり、（第二サブセグメ ント）！ケは（第二サブセグメント）１に相補的な配列を有するＲＮＡセグメン トであり、（第三サブセグメント）ｔｏは（第三サブセグメント）ｔに相補的な 配列を有するＲＮＡセグメントであり、そして（可変サブセグメント）、７は（ 可変サブセグメント）、に相補的な配列を有するＲＮＡセグメントである〕で表 される第−ＲＮＡ産物を形成させる；ことから成っている。 別の態様として、本発明は、（第一サブセグメント）ｔが少なくとも１０ヌクレ オチドの鎖長であって式別Ｌ３″−（Ｍ−サブセグメント）ｔｌ−Ｃ７ｊｇ−サ ブセグメント）ｔ＋−５’ Ｘ■ 〔ここで（第一サブセグメント９口は０またはそれ以上のヌクレオチドを有し、 ０より多い場合は（第一サブセグメン））１．の３′末端に隣接し、そして（Ｎ −サブセグメント）１＋は少なくとも１０ヌクレオチドの鎖長である〕で表され ：（第三サブセグメント）ｔが式ＸｔＶ：３′−（第三サブセグメン））ｉｔ− （第三サブセグメント）ｌｘ−５ 正 〔ここで（菖三すブセグメン））ｔｔ−は０またはそれ以上のヌクレオチドを有 し、０より多い場合は（Ｍ三すブセグメント）ｔ、の５′末端にｒｉｓ接し、そ して（第三サブセグメｙ））ｔｔは少なくともｌＯヌクレオチドの鎖長である〕 で懺され；（３′−プライマーサブセグメント）、が（第一サブセグメント）□ の全部と（第一サブセグメント）ｔｌの０またはそれ以上のヌクレオチドから成 る標的セグメントのサブセグメン）Ｋ相補的な配列を有し；（５′−プライマー サブセグメント）！が（Ｍ三すブセグメン））１．の全部と（第三サブ七グメン ））、、の０またはそれ以上のヌクレオチドから成るサブセグメントであり；そ して上記の工程ｆｉｌ〜（６）の後に、下記の工程（７）〜（１２）から成る方 εによって式■： ５′−（第一サブセグメン）　）ｔｌｃｒ−（第二サブセグメント）＊ｃｒ−（ 第三ブプセグメン）　）　ｔ、ａｙ−”〔ここで（篤−サブセグメント）　ｔｌ ｃｒは（第一サブセグメン））！、に相補的な配列を有するＲＮＡセグメントで あり、そして（第三サブセグメント）ｔｌｃｒは（第三サブセグメント）ｔＩＫ 相補的な配列を有するＲＮＡセグメントである〕で弄されるＡＮＡサブセグメン トがさらに増幅される方法を提供する： （７）式■の第−ＲＮＡｇ物に、式）１：５′−（プロモーター）、−（可変サ ブセグメント）。 −（３′−プライマーサブセグメント）、−３’■ 〔ここで（プロモーター）、はバクテリオファージＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラ ーゼ特異的プロモーターのプラス鎖の配列を有する１本ｇＤＮＡセグメントであ り、＃（プロモーター）、の配列は（プロモーター）１の配列と同一であっても 異なっていてもよ＜、（可変サブセグメント）、は（プロモーター）、０３′末 端ヌクレオチドおよび（３′−プライマーサブセグメント）、０５′末端ヌクレ オチドに隣接する０−１００ヌクレオチドの１本鎖ＤＮＡセグメントであり、そ して（３′−プライマーサブセグメント）、は（第三サブセグメント）ｔｒと同 じ配列を有し且つ（可変サブセグメント）ｓが０ヌクレオチドである場合は（プ ロモーター）、０３′末端ヌクレオチドに隣接するｌ不離１）ＨＡ上セグメント ある〕の３′宋選サブセグメントから成る１重鎖ＤＮＡの第三プライマーをハイ ブリダイズさせ； （８）工程（７）に従ってハイブリダイズさせた第三プライマーを、第三ＤＮＡ ポリメラーゼ（逆転写酵素であり、上記の第一および第二ＤＮＡポリメラーゼと 同一であっても異なっていてもよい）により触媒される反応で伸長させて、式■ ： ５−（プロモーター）、−（可変サブセグメント）。 −（第三サブセグメント）ｔ、−Ｃ第二サブセグメン））１−（第一サブセグメ ント）１−−（第一サブセグメント）ロー（可変サブセグメント）、、　−３’ ■ 〔ここで（可変サブセグメント〕１ｃは（可変サブセグメント）、に相補的な配 列を有するＤＮＡである〕の３′末端サブセグメントから成る第三の相補ＤＮＡ セグメントな形成させ： （９）工程（８）の反応で形成された２不知核酸を１本鎖となし； （ｌの工８（８）の反応で形成された第三の相補ＤＮＡに、式Ｘ： ５′−（可変サブセグメントルー（５−プライマーサブセグメント）４−３’ （ここで（可変サブセグメント）４は０〜１００ヌクレオチドのセグメントであ り、そして（５′−プライマーサブセグメント）４は、（可変サブセグメント） ４が０より多いヌクレオチドを有する冶金、（可変サブセグメント）４０３′ヌ クレオチドに隣接し且つ式Ｘｘ：５′−（可変サブセグメン）　）、−（ｊｌＥ −サブセグメント）ｔｔｃ−（第一サブセグメント）ｔＩｅ−３’Ｘ 〔ここで（第一サブセグメント）ｔｌ、は（第一サブセグメント）！！に相補的 な配列を有するＤＮＡセグメントであり、（第一サブセグメン））１＋ｃは（第 一サブセグメント）ｔ＋に相補的な配列を有するＤＮＡセグメントである〕のセ グメントの少なくとも１０個のヌクレオチドから成る既知配列のサブセグメント である、但し上記の少なくとも１０個のヌクレオチドのうち少なくとも１個は（ 第一サブセグメント）　ｔＩｅの５′末端ヌクレオチドに存在するか、またはそ の５′末端ヌクレオチドから５′側に存在する）の第四プライマーを／Ｓイブリ ダイズさせ；（９）工程（１０）　Ｋ従ってハイブリダイズさせた第四プライマ ーを第四Ｉ）ＨＡポリメラーゼ（第一、第二および第三ＤＮＡポリメラーゼと同 一であっても異なっていてもよい）により触媒される反応で伸長させて、式Ｍ： ５′−（第一サブセグメント）ｔ□−（第二セグメント）ｔ。 −（第三サブセグメント）ＳＳＣ−（可変サブセグメント）、、　−（ブロモ− ターン１６−３′Ｘ■ 〔ここで（第二サブセグメント）１は（第二サブセグメント〕ｔに相補的な配列 を有するＤＮＡセグメントであり、（Ｍ三すブセグメント）１＋６は（第三サブ セグメン））ｔ＋に相補的な配列ビ有するＩ）ＮＡ上セグメントあり、（可変サ ブセグメｙ））ｓｃは（可変セグメント）。 に相補的な配列を有するＤＮＡセグメントであり、そして（プロモーター）１． は（プロモーター）、に相補的な配列ン有するＤＮＡセグメントである〕のセグ メントから成る第四の相補ＤＮＡを形成させ；そして（至）工程（１１）の２本 ｆｉＡＭ物を、第二のバクテリオファージＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（上 記の第一バクテリオファージＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼと同一であっても 異なっていてもより、（プロモーター）。 である一方の鎖のプロモーターを認識する）により触媒される反応において鋳型 として用いて、式Ｘ■二５′−（可変サブセグメン）　）ｓｒ　−（第三サブセ グメント）ｔ＝−−Ｃ第二サブセグメン））ｓｒ−（第一サブセグメン））ｔ＋ ｒ−ｘ□−（可変サブセグメン）　）、、、−３’ ＸＩ［ 〔ここで（可変サブセグメントハ、は（可変サブセグメント）、の配列を有する ＲＮＡセグメントであり、（第三サブセグメント）ｔ、２は（第三サブセグメン ））１＋の配列を有するＲＮＡセグメントであり、（第二サブセグメント）ケは （第二サブセグメントンｔの配列を有するＲＮＡセグメントであり、（第一サブ セグメン））Ｌｔｙは（第一サブセグメン））１＋の配列’に！するｆｃＮＡセ グメントであり、（可変サブセグメン）　）ａｃｒ　は（可変サブセグメン）） 、に相補的な配列を有するＲＮＡセグメントであり、そしてＸ□は（、＠−サブ セグメント）８Ｃの５′累端から５′＠にある（５′−プライマーサブセグメン ト）４のサブセグメントに相補的な配列を有するＲＮＡセグメントである〕の５ ′末端サブセグメンｌ有する第二ＲＮＡ産物を形成させる。 上述したように、不発明はまた不発明の増幅法を実施するためのキットを提供す る。第−ＡＮＡ産物を作る本発明方法の場合には、本発明キットは２つのプライ ミー１対応するバクテリオファージＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、およびＤ ＮＡポリメラーゼを含むであろう。第二ＲＮＡ産物と第二λＮＡ産物の両方を作 る本発明方法を実施するためのキットは、４つの適当なプライマー（１組２つの プライマーを２組）と対応するポリメラーゼを含むであろう。 本発明に従って標的セグメントを増幅することを含む核酸ハイブリダイゼーショ ンプローブ検定な実施するための本発明方法およびキットは、それぞれ増幅方法 の工程Ｓよびキットの成分のほかに、本発明増幅方法により生ずるＲ　Ａ’　Ａ 産物を検出するのに必妥な工程および成分を包含する。当業者は当分野で知られ た多数の核酸プローブハイブリダイゼーション検定法の増幅工程から得られるＲ ＮＡＭ物を検出するのに必景とされる種々の追加工程および成分に精通している であろう。勝識ＲｈＡ増幅のビーズ捕獲を伴う好適な少酸プローブハイブリダイ ゼーション検定法が以下の実施例■に示される。 （３′−プライマーサブセグメント）！、（５’−プライマーサブセグメント） ｔ、（３’−プライマーサブセグメント）、および（５′−プライマーサブセグ メント）４は２０〜４０ヌクレオチドを有し、より好ましくは、増幅しようとす る標的セグメントの末端に種々のプライマーが結合する特異性！高めるために約 ３０ヌクレオチドを有するのが好適である。 （第一サブセグメント）ｔおよび（第三サブセグメント）ｔの選択により増幅の ため九選ばれる対象の標的核酸セグメントは、（第二サブセグメント）ｔｒが少 なくとも３０、より好ましくは少なくとも約５０、のヌクレオチドな有するよう に選ばれるのが好適である。これによりプライマーサブセグメントのどれとも重 複しない配列を有する核酸プローブの標的として、増幅ＡＮＡＮ物産の（第二サ ブセグメント）　ｔｅｒｉたは（ＮニサブセグメンＦ）ｔｒを使用することが可 能である。 バクテリオファージＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼは１０００６ｐよりも長い ＭＷを使用し得るが、それらの転写効率は鋳型が長くなるＫつれて低下する。従 って、１０００塩丞長より迫い標的セグメントが好適である。 ＴＡＳの第二サイクルにおいてＡＮＡを作るために一１ＲＮＡ＠成で用いるプラ イマーは同一の組を使用するのが好ましい。ＲＮＡの製造のところで述べたよう に、プライマ一対は重複すべきでない。ＲＮＡの製造が望まれる本発明方法を実 施する場合に、（５′−プライマーサブセグメント）、に相補的な配列を有する 標的セグメントのサブセグメントは（３′−ブライ！−サブセグメントハに相補 的な配りｕｙｔ有する標的セグメントのサブセグメントから５′方向にあって、 それと１′ｇＬＬないであろう。 同＃に、（３−プライマーサブセグメント）、と同じ配列を有する標的セグメン トのサブセグメントは（５′−プライマーサブセグメント）、と同じ配列を有す る標的セグメントのサブセグメントから３′方向にあって、それと重複しないこ とが好ましい。この計略は、同一部位に対する異なるプライマーの競合を減じ、 それによって本発明の増幅効率を著しく高めるので有益であるだろう。 重ね合わせたプライマーの組に若干の重複が存在する場合は、第二組の１ライマ ーを使用する前に未使用の第一組プライマーを除くことが好ましい。 本発明の焦点は、ある種のプロモーターに対する特異性ゆえに、バクテリオファ ージＤＮＡ依存性ＡＮＡポリメラーゼに集中している。特定のプロモーターに対 して同様に高い特異性を示す他のポリメラーゼもバクテリオファージポリメラー ゼの代わりに木兄Ｆ！Ａｉｃおいて利用され、本発明はこのような他のポリメラ ーゼも包含するものである。 好適なバクテリオファージＤＮＡ依存性ＡＮＡポリメラーゼはＴ７、Ｔ３および ＳＦ３からのものである。これらのポリメラーゼと共に使用するのに適したプロ モーターは実施例および請求の範囲に記載されるが、これらのポリメラーゼ用の 他のプロモーターも当分野で数多く知られており、同様に使用できる。 さらに、好適な３種以外のバクテリオファージからのポリメラーゼ、およびこの ような他のポリメラーゼによって認識されるプロモーターも本発明に従って使用 される。 本発明方法で用いるＤＮＡポリメラーゼとしては、５′→３′エキンヌクレアー ゼ活性を欠（ＤＮＡポリメラーゼおよび逆転写酵素を用いるのが好適である。本 方法の全工程において、ｌｓ＃ｊｉのＤＮＡポリメラーゼを用いるのが最も好ま しい。最適なりＮＡポリメラーゼｋｕＭＶ逆転写酵素および組み洪えＭＭＬＶ逆 転写簿素である。 しかしながら、Ｔｈ−ｒ町６１６９％ａｔｔｃｓａからの熱安定性ＤＮＡポリメ ラーゼ（Ｃｈｉｎａ　ｓｔ　ａＪ、　Ｊ、　Ｂａｅｔａｒｉｏｌ。 州りリープラ７ドＵ、Ｓ、　Ｂｉａｃｈａｍｉａａｌａ社からの商標名Ｓｍｇ％ −％ａｘｅという組み換えＴ７　ＤＮＡポリメラーゼ、Ｅ、ｅ・１ｉＤＮＡ　ポ リメラーゼ■の公知のＥ１ｍ％・替断片、およびウシ胸ｐｓＤＮＡポリメラーゼ αのような他のポリメラーゼも許容される。 １可変サブセグメント２は種々のプライ＝ｒ　−Ｋ任意に含まれ、３つの機能を 果す。実際、それらは”多目的サブセグメント”とよつ適切ＩＣ１１？ぷことか できる。まず舅・−に、プロモーター包含む第一および第三プライマーにλいて 、そのプロモーターサブセグメントは好ましくはそのプロモーターに対応するＡ ＮＡポリメラーゼによって認識される転写開始配列を含む。第二番目に、すべて のプライマーにおいて、可変サブセグメントは増幅からのＲＮＡｇ物が核酸プロ ーブハイブリダイゼーション検定で検出できろよ５に％定のセグメントを任意に 含むことができる。夫際、増幅（および検定ンは認識セグメント（例えば（３′ −プライマーサブセグメント）、）を異にするが共通の可変サブセグメントを含 むプライマーの組を用いることにより、いくつかの異なる標的セグメントにおい て同時に行われる。また、可変セグメントはその後のクローニングを容易にする ための制限部位を多数もっているポリリンカー配列を含むこともできる。最後に 、可変サブセグメントはＱβレプリカーゼ（Ｊｆ４＊ｊ−らの上記文献参照）の ようなバクテリオファージＲＮＡ％異的ＲＮＡポリメラーゼによりＲＮＡ産物を （自己触媒的に）複製させるのに必要な配列、およびコー）　惰Ｒ／ｊ’　Ａの 合成を促進する植物ウィルスのＡＮＡ−３クロモソームからのＢλｒ配列を、増 幅からのＲＮＡＭ物に組み入れるために使用される。　Ａｈ１ｇ＊ｉａｔ　ａｔ 　ａｌ、、　Ｊ、Ｍｏ１．　ＥＮｏｌ。 を参照されたい。 Ｑβレプリカーゼ（当分野で知られている）の場合は、（可変サブセグメント） 、に配列： ５’　−ＣＧＣＧＣＴＣＴＣＣＣＡＧＧＴＧＡＣＧＣＣＴＣＧＡＧＡＡＧＡＧＧ ｃＧＣＧＡＣＣＴＴＣＧＴＧＣ−３’ を挿入し、（可変サブセグメン））１１ｃ配列：５　’　−ＴＧＧＧ−ＧＡＡＣ ＣＣＣＣＣＴＴＣＧＧＧＧＧＴＣＡＣＣＴＣＧＣＧＣＡＧＣ−３’を挿入し、そ の後第−ＲＮＡ産＠（すなわち、第１図のＲＮＡ１；第４図も参照〕を（自己触 媒的に）複製させるか、あるいは（可変サブセグメント〕４に配列：５　’　− ＣＧＣＧＣＴＣＴＣＣＣＡＧＧＴＧＡＣＧＣＣＴＣＧＡＧＡＡＧＡＧＧＣＧＣＧ ＡＣＣＴＴＣＧＴＧＣ−３’ を挿入し、（可変サブセグメント）、に配列：５　’　−ＴＧＧＧＧＡＡＣＣＣ ＣＣＣＴＴＣＧＧＧＧＧＴＣＡＣＣＴＣＧＣＧＣＡＧＣ−３’ を挿入し、その後第二ＲＮＡ産物（すなわち、第１図のＲＮＡ　■；第４図も参 照）を（自己触媒的に）複製させることにより有利に実施できる。 ＢＭＶレプリカーゼ（これも既知である）１に一使用する場合は、（下記のＥＩ Ｖ実旅例の特定使用において）可変配列２（塩基１−２５）中に次のＢＭＶ配列 二ＢＭＶプロモーター ＴＣ５＝８７−２９ＣＥＩＶ−特異的）（５４塩基）をコア配列として含めるこ とにより有利に実施され、さらにＢＭＶからのレプリカーゼ活性を高めるために その５′末端ｔｆｃＡ（Ｊに冨む配列を挿入することもできる。このオリゴは第 ニプライマーとして使用される。この第ニプライマーと共に用いられる第一プラ イマーはｒ７に由来するＥＩＶ％異的プライマーである。 Ｔ７プロモーター 十ｌ５ ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＩＧＧＯＡＩ（５２塩基） ＴＣ５−８７−３４ 本発明の理解に役豆つ非制限的細部を以下の実施例に３いて示すことにする。 ４、実施例 冥り例！ ヒト免役不全ウィルス−１ｄ　（ＨＩ　Ｖ　−１）に感染した疑いのある患者か ら採取した血液１０ＪＩ７をＳａｐｒａｅｍｌｌＴＭ装重（米国オクラホマ州オ クラホマシテイ、Ｓａｙａｔｇｃｈ　社）により、あるいはフィコール勾配によ り分画化してリンパ球を分離する。そのｆＩＪンパ球を溶解し、それらからのシ ＃ＲをＥｚ１デａｃｔｏｒ　（木１カリフォルニア州サンジエゴ、Ｍｏ１ｅｃｕ ｌａｒ　Ｂｉａａｙｚｔａｔｈａ社）で分離するか、あるいに別法として、リン パ球を豫準的なドデシルａ酸ナトリウム（ＳＤＳ）−酵素処理により溶解し、残 数をＤＥＡＥセルロースの逆相クロマドグ２フィーにかけて分離する。 これは次のようにして行われる： 細胞を沈殿さゼる：ｌａのＴｒｉｍ緩衝ｇ（ＹＥＳ）、ｐＨ７，５、かうｓｘ　 ｒｐｍで４分。 上ｆｆ’に除く。 ペレットを下ｆ？、浴黴に再懸濁する：１００ＰＬ　Ｚチ　ＳＤＳ　加える。 ２００μｔ　５■／Ｒｔ　プロテアーゼに２００μｍ　０，２５Ａｆ　ＥＤＴＡ 激しくポルテックス撹拌し、５０℃で４５分インキュベートする（その間ｌＯご とにｌＯ〜１５秒ポルテックス混合を行う）。 排水した佃出器カラムにかける。 カラムをｌＸ４ｍのＱ、　３　Ｍ　ＮａＣＬ／　２０ｍＭ　Ｔ　ｖｉａ　。 アＩｉ７．５、で批う。 ４就の０．５　Ｍ　ＮａＣＬ／　２０ｍＭ　Ｔｒｉｍ　、　ｐＨ７，５、で１） ＮＡ／ＲＮＡを浴出する。 溶出物に次の鎖成分を即える： ５μｔ　グリコーゲン ４００１’ｔ　：ＬＷ　！１ａＯＡｃ ９．０就　氷冷　Ｅ　ｔｏＨ 十分に混合 一２０℃で一晩沈殿させる。ドライアイス／エタノール浴を１時間使用してもよ い。 （人ｉｍｖす＃）で２分乾かす。 ｌＯ分凍結乾珠する。 １７０μＬ　ＴＥにペレットを再懸濁する。 ３７℃で５分インキュベートする。 次のようにして１ｍスピンカラムを調製する：ＩＷシリ／ジに少量のガラスウー ル（オートクレーブ滅菌済）を詰める。 シリンジをピロ戻酸ジエチル（１）ＥＰＣ）で処理した（ＴＥ（Ｔｒｉｍ−Ｅｌ ）ＴＡ）で満たす。 すぼや（セファデックスＧ−５０（ＴＥ甲；オートクレーブ滅菌）をｍえる。 固体マトリックスがシリンジの頂部に山のように層積する筐で辺え続ける。 ＴＥＣテーブルトップ運心休で体０００ｙｐＳ、３０秒遠心する。 Ｚｏｏμｔ　ＴＥで況い、中間速度（約１０００　ｒｐ胃〕で１分遠心し、洗液 を捨てる。 歪量９Ｊ乞カラムに入ｎ％衿度１分間遠心する。 １５０ｐｔＴＥで丁丁ぎ、１０００り琳で１分遠心する。ｊ′１″ぎ液と最初の 画分なプールする。この段階で多数の反応のために試料を分割してもよい。 ＸＪｉｔ”８”　Ｌｉ”Ｌを加”’。２．５Ｘ容ｆｉの１００％ＥｔＯＨと混曾 する。十分にポルテックス混合を行う。ドライアイス／ＥｔＯＨで３０分ｖｃ＃ させる。 ａｔ遠心後を用いて４℃、最高速度で１５分遠心する。 ペレットを乾かす。 分離後、試料からの全核酸を１００μｌ　（ｒ）ＴＥ緩衝液（１０ｔａＭ　Ｔｒ ｉｍ、　Ｃ１，１９％Ｍ　ＥＤＴＡ、ｐＨ８＞に溶解する。１００μ）の全核酸 のうち１０μノを次の鎖成分：４０　悔ＭＴデｉａ、ｃｌ、ｐＨ８ ２５情ＭＮαＣ１ １０愼Ｍ　ＭｇＣら ＩＣ１ｍ＆　ジテオトレイトール（ＤＴＴ）２ｆｌＩＭ　スペルミジン １００μシーウシ血清アルブミン ４００惟ＭずつのｄＡＴＰ、ｄｃＴＰ％ｔｔＧＴＰ　およびＴＰ を含む混合物中に溶解して最終容量を１００μｌとする。 次の配列： ５’−ＧＡＡＣＧＣＧＧＣＴ　ＡＣＡＡＴＴＡＡＴＡ　ＣＡＴＡＡＣＣＴＴＡＴ ＧＴＡＴＣＡＴＡＣＡＣＡＴＡＣＧＡＴＴ　ＴＡＧＣ；ＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧ ＡＡＴＡＣＴＴＴＣＧＴＡＡＣＡ　ＣＴＡＧＧＣＡＡＡＧＧＴＧＧＣＴＴＴＡＴ 　Ｃ−３’ で衣わされる３０９％Ｍの１０１塩基の１重鎖ＤＮＡプライマーＡを加える。配 列： ５’　−ＡＣＡＣＣＡＴＡＴＧ　ＴＡＴＧＴＴＴＣＡＧ　ＧＧＡＡＡＧＣＴＡ− ３’で弄される３０％Ｍの２９塩基のＤＮＡプライマーＢを加える。第ニプライ マーであるプライマーＢはＨＩＶ−１のＳＯＲ遺伝子中の塩基５１５１−５１７ ９の配列な有する。第ニプライマーの別のセグメントはＨＩＶ−１のＳＯＲ遺伝 子の塩基５３５７−５３８７に対応し、配列： ５’−ＧＣＡＣＡＣＡＡＧＴ　ＡＧＡＣＣＣＴＧＡＡ　ＣＴＡＧＣＡＧＡＣＣＡ −３’で表され、使用する場合はこれも３０％Ｍ加えられる。 プライマーＡは第一プライマーであり、その６４個の５′−ヌクレオチドはＳＰ Ｇ　ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼに対するプロモーターのプラス幼を形成す る。配列：５’−ＧＡＡＴＡＣ−３’のセグメントは（可変サブセグメン））、 であＱ、Ｉｉｌ開始部位Ｃ５’−Ｇ）とｓＰ６　ＲＮＡポリメラーゼによって明 らかに好まれる他の塩基類を５’末；４ＶＣ含んでいる。ｉ＆後に、３１個の３ ′末端ヌクレオチドは（プライマーサブセグメント）、を形成し、ＥＩＶ−１単 離ｅｅＥｆ）ＳＯＲＩ伝子ｆ）塩Ｎ５５７７−５５４７の配列に相補的な配列を 有する（完全な配列に（１９８５）を参照されたい。）（ＢＩＶ単離物はこれら の実施例において”ＥＩＶ−１”と表される。）これらの実施例で用いる全ての オリゴヌクレオチドはＡｐｐｌｉａｄ　Ｈ４ｏａｙａｔａｍａ社（米国カリフォ ルニア州フォスターシティ）の自動合成機＜３８０Ａｆｊｌ）を用いて面相合成 により作られ、Ｃ８逆相カラムを用いるＨＰＬＣにより本質的に均一にクロマト グラフィー精製されることに注意されたい。これとは別に、他の市販されている 合成機と標準ｗｉ法を用いてオリゴヌクレオチドを製造することもできる。 ｌＯＯμノの溶液を６５℃で２分加熱し、その後１分間で４２℃に冷却する。こ の加熱および４２℃またはそれ以上での保持は、溶液の組成と組み合わせて、（ ３′−プライマーサブセグメント）、をそれに相補的な配列へ高度に特異的に且 つＩ）ＮＡ合成を開始させるに足る安定した状態でハイブリダイズさせるのに十 分なストリンジェント条件を提供する。 その後、この溶液に１０単位のトリ筋芽球症ウィルス（ａｖｔａ＊　ｍｙｏｈｌ ａａｔｏａｉａ　ｖｉｒｓａ　：ＡＭＶ）の逆転写酵素または５００巣位の赳み 換えモロニーマウス白血病ウィルス（Ｍｔｒｌｏｎｔｙ　ｍｕｒｉ％ａ　Ｉｇｓ ｋａｔｎｉａ　ｖｉｒｓａ　：ＭＭＬＶ）の逆転写酵素（米国フロリダ州Ｓｔ、 ビータースバーグ、Ｌｉｆｅ　５ｃｉａｎｃａａ社から購入ンを加え、４２℃で １０分インキュベートする。（Ｅａｘｔｓ　ａｔ　ａｌ、、　Ｊ、　ＶｉｒｏＬ 。 ２９．５１７（１９７９）によって定めらｎる鋳屋−プライマーとしてポリ（Ａ ）オリゴＣＴ）ｎ、ｓを使用し、３７℃、１０分間で１ｎｍｏｌｅのＴＴＰ？： 酸沈殿形体へ組み入れるのに要テろ童ｔ１単位とする。１０分インキュベーショ ン後、この溶液を沸騰水浴に１分間入れる。この加熱は逆転写酵素により形成さ れた２本領残飯の会分離を起こさせる。 その後、この溶液を１分かけて４２℃に冷却する。この冷却の間に、第ニプライ マーが逆転写酵素により触媒される反応において形成された標的セグメントの相 補鎖の３′末端セグメントにハイブリダイズする。この場合も、ハイブリダイゼ ーション条件は第ニプライマーとそれに相補的な配列との十分に！＃異的なハイ ブリダイゼーションのために十分にストリンジェントである。 冷却後、追加のｌＯ年単位ＡＭＶ逆転写酵素または５００単位のクローン化ＭＭ ＬＶ逆転写′＃素を加え、４２℃で１０分さらにインキュベートする。 次に、米国ウイヌコンシン州マジソン、Ｐデｏｔ＊ａｇａＢｉｏｔａｃ社からの ＲＮａａｔ％８（商品名）リボヌクレアーゼ阻害剤を１単位／−の濃度で（任意 に）加える。（１単位は５０界？のりボヌクレアーゼＡの活性を５０％阻害する のに必要な阻害剤の菫である。ｋｏｔｋ、Ｍｏｔｈ。 Ｃａ％ｃｅｒにｇｍ、　３．１５１　（１９７６）さらに、リボヌクレオシド− ５′−三リン酸ＡＴＰ％ＧＴＰ％ｃｒｐおよびＵＴＰをそれぞれ４００鴨λずつ 加える。最後に、Ｐｒａｖｓｈａｇ蟲Ｂｉｏｔａｃ　社から購入した１０〜２０ 率位のＳＰＧ　ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを加え、この溶液を４２℃で３ ０〜６０分インキュベートする。（１単位はｌｌ！準反応条件（４０ｖｐｒＭ　 Ｔｒｉｍ、　Ｃ１，ｐＨ７，９，６５ＭＭｇＣ１２、１０ｔｓ＝Ｍ　ＤＴ　Ｔ、 　２　ｍＭスペルミジン、０．５惰ＭずつのＡＴＰ、ＧＴＰ％ＣＴＦおよびＵＴ Ｐ。 Ｏ，ＳＣイのａＥ−ＣＴＰ％ＩＰのＳＰｅ　ＤＮＡおよび酵素；全容量５０μｌ ）下３７℃、６０分で１％ｗｏｏｌ−のりボヌクレオシド三リン酸な酸不浴性産 物へ組み入れる反応を触媒するのに必要なＲＮＡポリメラーゼの量である。）そ の後、次のオリゴヌクレオチドを加えてその濃度をそれぞれ３０ガｙとする： 第三プライマー： ５’−ＧＡＡＣＧＣＧＧＣＴ　ＡＣＡＡＴＴＡＡＴＡ　ＣＡＴＡＡＣＣＴＴＡＴ ＧＴＡＴＣＡＴＡＣＡＣＡＴＡＣＧＡＴＴ　ＴＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡ ＡＴＡＣＡＣＴＡＡＴＴＣＡＴ　ＣＴＧＴＡＴＴＡＣＴＴＴＧＡＣＴＧＴＴ”ｌ ’　ＴＴＣ−３’第四プライマ一二 ５’−ＴＴＴＴＴＴＧＧＴＧ　ＴＴＡＴＴＡＡＴＧＣＴＧＣＴＡＧＴＧＣＣ−３ ’第三プライマーにおいて、５′末端の６４塩基は第一プライマーと同様にプロ モーターセグメントであり、次の６塩基は可変セグメントである。この可変セグ メントはＳＰＧ　ＲＮＡポリメラーゼによりプロモーターから転写される最初の ６Ｉａの塩基であり、これらの塩基はこのような転写レベルを高めるために選ば れ、る。最後に、第三プライマーの（３′−プライマーサブセグメント）３部分 は３′末端の３３塩基であり、ＥＩＶ−１のショート・オープン・リーディング ・フレーム（ＳＯＲ）遺伝子中の塩基５３８８−５４２０と同じ配列である。萬 四プライマーはＥＩＶ−１のＳＯＲ遺伝子の塩基５５４６−５５１７の配列に相 補的な配列を有する。 第三およびＭ四プライマーの添加後、この溶液ヲ４２℃で１分インキュベートす る。この期間中に、第三プライマーの（３′−プライマーサブセグメント）、と ５Ｐ６ＲＮＡポリメラーゼにより触媒される反応で形成されたｇＲＮＡとの間に ハイブリダイゼーションが起こる。 ハイブリダイゼーション条件がストリンジェントであるために、（３′−プライ マーサブセグメント）、は第−ＲＮＡの相補配列のセグメントに対して高度に特 異的に、しかもＤＮＡ合成を開始させるべく十分安定した状態でハイブリダイズ する。 インキニベーション後、ｌＯ単位のＡＭＶ逆転写酵素または５００単位のクロー ン化ＭＭＬＶ逆転写酵素を加え、この溶液を４２℃で１０分インキュベートして 第三の相補Ｄ）ＩＡを形成させる。 この溶液はその後沸騰水浴中に１分間置き、１分かけて４２℃に離動し、これに より第三相補ＤＮＡと第−ＲＮＡから成る２不鎗を１不鎗となし、次に第四プラ イマーと第三相補ＤｆｉＡとＹノ・イブリダイズさぜる。他のハイブリダイゼー ションと同様に、この条件は十分にストリンジェントであるので、第四プライマ ーのノーイブリダイゼーションは第四プライマーに相補的な配列の萬三相補ＤＮ Ａのセグメントに対し高度に％異的に、かつＤＮＡ合成を開始させるに足る安定 した状態で起こる。 その後、再び、１０単位のＡＭＶ逆転写障累または５００単位のクローン化ＭＭ ＬＶ逆転写酵素を加え、４２℃で１０分インキュベートする。 伏いて、　ＲＮａａｓ−（商品名）リボヌクレアーゼ阻害剤を１単位／−の濃度 で（任意に）加え、その後ｌＯ〜２０単位のＳＦ３　ＲＮＡポリメ之−七を加え てこの溶液を４２℃で３０分〜１時間インキュベートする。 得られた第二ＲＮＡは核酸プローブハイブリダイゼーションεにより検出するこ とができる。 実施例■ 実施例Ｉの方法に従うが、以下で述べるような変更を有し、ａａ崩の試料：（Ａ ）ＥＩＶを含まないヒト血液１Ｏ−１ＣＢ）約１０”ＥＩＶ−１感染細胞／ｇＩ ｔヲ有する培養物１０ｍ、および（Ｃ）ＥＩＶ−１に感染した疑いのあるヒトか らの血液１０−を用いる。この１臼の変更は、第二ｔｃｓｉｌ（作るためのＳＦ ３　ＲＮＡポリメラーゼにより触媒される反応中に基質としてα−５Ｐ−標識リ ボヌクレ７シド三すン版ヲ加えるという点である。その結果、第二ＲＡ’　Ａは ａｐ−標識される。 七フアクリルー、５５００　マクロ孔質ビーズはカルボキシル末端リンカ−（式 −ＣＣ＝Ｍ）　Ｎｉｌ　（ＣＭＪｓＣＯ＊−で辰されるもの）を用いて誘導体化 し、続いて１ｉｌＶ−１のＳＯＲ遺伝子中の塩基５３５７−５３８７の配列に相 補的な配列である配列： ５’−ＴＧＧＴＣＴＧＣＩＡ　ＧＴＴＣＡＧＧＧＴＣＴＡＣＴＴＧＴＧＴＧ　Ｃ −３’の５’−（６−７ミノへキシルホスホルアミデートノー誘導体化オリゴヌ クレオチドを用いて誘導体化する。 （ＳＯＲ遺伝子の塩基４９０１−４９３２の配列は、試料からの核酸の増＠中に 作らｎる第二ＲＮＡＫ見いださｎる。）ビーズの作製は１９８６年８月１１日付 けの米国特許出願第８９５７５６号（参照によりここに引用される）Ｋ記載され る方法に従った。袂約すると、支持材料はアミノ宋渇リンカ−で誘導体化された 多孔質のケイ酸ガラスまたはマクロ孔質の架橋デキストラン（その際、捕獲プロ ーブの末端ヌクレオシドにホスホルアミデート基を介して共有結合されていない アミノ基は笑質的に全部、脂肪族アシル基をもつ核酸と非Ｉ＃異的に相互作用し ないよ５に遮断される）；臭化シアンで活性化されたマクロ孔質架橋デキストラ ン（アミンと反応してアミノアルキルホスホルアミデート誘導体化オリゴヌクレ オチドに結合する）；カルボキシル末端リンカ−またはスクシンイミドエステル 末端リンカ−で誘導体化された多孔質ケイ酸ガラス、マク口孔５架橋テキストラ ンまたはジビニルベンゼン架橋ポリスチレン（カルボキシル基の部分はジアミノ アルカンの１つのアミノ基にアミド結合で結合さｎ、ジアミノアルカンの他方の アミノ基はホスホルアミデートの一部であって、その後Ｗｉ獲プローブの末端ヌ クレオシドに直接結合さｎる〕である。針通な支持材料は米国イリノイ州ロック フォード、　Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈａｔｈｉ−ｃａＬ社からそれぞｆ製品番号２４ ８７５Ｓよび２３７３５として市販されている呼称孔径５００オングストローム 、粒径約１２５〜１７７ミクロンのビーズの形をした、長鎖アルキルアミン−誘 導体化およびカルボキシル−誘導体化コントロールトホアガラス（ｃｏｓｔデｏ ｇｌｅｄ　ｐｏデーｇｌａｚｅ　）％および米国ニューシャーシー州ビスカタウ エー、Ｐｈａｒｍａｃｔａ社から；−ド番号１７−０４７５−０１として市販さ れている湿潤直径約４０−１０５ミクロンおよび＋Ｆ１２Ｘ１０’ダルトン以上 の分子量をもつデキストランの併除容Ｊｉを有するビーズの形をした、臭化シア ンで又はアミン末端リンカ−やカルボキシル末端リンカ−で誘４藻化さｎたセフ ァクリルＳ−５００である。 １つの面において、その支持体は （２）ケイ累原子が ＋１１　式−ＣＣＥｔ　）　ｎ　（ＮＥ）　（（’０）　（ＣＢりｃｃＢ　ｍお よび−（ＣＥＪｎＣＮｌｉ）　ＣＰＯＪ　Ｏ−（０１ｉｇｏ）の基（式中、Ｃは Ｏ〜５であり、負は２〜８であり、−０−（Ｏｌｉｇｏ　）　ｉ：オリゴスクレ オチドプローブであり、（（Ｊｌｓｇａ）に結合された酸素原子はプローブの５ ′−ヌクレオシドのｓ′−＝ｘまたは３′−ヌクレオシドの３′−除累である） で誘導体化さｎた（但し、末端に７ミノ蚤が付いた基で誘導体化さｎたケイ素原 子′ｌｋ：笑質的に含まない）、あるいは、 （２）式−ＣＣＨｔ）ＳＣＡＲ）ＣＣＯ）ＣＣＥ、）、、Ｃ０ｔＥおよび−ＣＣ ＩＩ）＊ＣＮＥ）　（ＣＯ）　ＣＣＥｔ）−ＣＣｕ）　ＣＭ）　ＣＣＥｔ）。 Ｎｌ１ＣＰＯ，）Ｏ−ＣＣＪｌｉｇ＊　）の基（式中溝、％およびｐは向−であ るか又は異なり、それぞれ２〜８である） で誘導体化された、多孔質ケイ酸ガラス；ＣＢ）非誘導体化ヒドロキシル基を有 する少なくとも１個の隣接炭素原子をもつ糖部分のＲ素原子上に存在するヒドロ キシＡＩ酸素が （１１式−ＣＣ−１＋”１ｌ）ＨＥ　ＣＣＥ、）　、　０；Ｅ）　（ＣＯ）　Ｃ ＣＥ、）　、ＣＭ。 および −ｃ（−ＮＥ）ＮＢ（ＣＨＪ　ｐ　（ＮＥ　）　ＣＰ□ｔ）　０−０１　ｉｇ＊ 　）　ｆ）Ｍで誘導体化された（但し、７：′；４アミン基を有する基で誘導体 化されたヒドロキシル酸素を実質的に含まない）、あるいは、 （２１式−ＣＣ＝ＮＥ）ＮＥＣＣＨ，）ｑＣＯ，Ｅ−Ｍ！ヒ−ＣＣ−Ｎｊｉ）Ｎ ＨＣＣＢ、）　、　（Ｃｏ）　ＣＮＥ）　ＣＣＥ、）ｐＮＢＣＰＯ，）ｔ）−（ ＯＬｉｇｏ　）の基（式中Ｃ，９およびアは同一であるか又は異なり、ｑは２〜 １０である） でき導体化された、栗橋デキストランマクロ孔５ｉｉ材料；および （のフェニル基が 式　−（ＣＥ、）　、ＣＯ，Ｅ　および−（ＣＢ、）　＃　ＣＣ０）　（Ｎｉ） 　（（：’＃ｔ）一方ＣＰＯＪＯ−（ｏＨ，Ｏ）の基 （式中ａＨよびｐは同一であるか又は具なり、１は２〜１０である） で誘導体化された、ジビニルベンゼン−呆橋ポリスチレン； のうちの１つである。Ｇｈｏａｈ−寥ａ１．．Ｎ５ｃｌａｉｃＡｃｉｄａＲｅｓ ｅａｒｃｈ　１５，５３５３（１９８７）を参照さｔたい。 上記のような誘導体化されたセファクリルと−ズ５０Ｍ９′％：含む３つのバッ チはそれぞれ０．１％ＳＤＳ％　ｌＯ％デ井ストラン硫酸、ＩＸｖ／−サケ精子 ＤＮＡ、および５　Ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｐ　Ｅ　（０，７５ｍ　ＮａＣ１、５０ｔｍＭ 　ｈ”ａＥ、ＰＯ２゜ｐＨ７，４、および５　ｍＭ　ＥＤＴ　Ａ　）を含有する プレハイブリダイゼーション溶液２５０μ１ＰＫ３７℃で１５分間浸漬する。浸 漬後、ビーズ材料を遠心により沈殿させ、プレハイブリダイゼーション溶液を吸 引除去する。 ３つの試料のそれぞれに対する増＃Ａ法から得られた核ｆＲをエタノール沈殿に より分離し、サケ精子ＤｊＶＡを除いたプレハイブリダイゼーション溶液と同じ 溶液２５０μ１ｃｐＫ溶解する。その後、この琵酸溶液のそれぞれをプレハイブ リダイズさ一？ニア：万すゴヌクレ万チド訪４坏１じセファクリルビーズの１つ のバッチと混合し、得られた混合物を穏やか＃Ｃ攪拌しながら４２℃で９０分イ ンキュベートする。 セファクリルビーズな遠心により沈殿させ、ハイブリダイゼーション浴液を吸引 除去し、その後ビーズ？：２ＸＳ　Ｓ　Ｃ（０，３０Ｍ　ＮａＣ１，０，０：ｌ クエ７　酸Ａ’ａ　、　ｐＨ７、Ｏ）の浴液１−で３７℃、１０分、３回洗浄す る。洗浄ごとに、ビーズを遠心により工殿させて況准を吸引除去する。 ３回目の洗浄後直ちにビーズをチェシン＝２（Ｃ−デーｓｈｏｗ　）カウンティ ングにかける。 試料Ａからの増＠咳ｒＲｙｋ：有するビーズは、シンナレーション液体単独から のバックグラウンドカウント数をかろうして越える低レベルのカウント数を往す る。試料Ｂからの増幅核酸を有するビーズは、試料Ａと関係したビーズの場合に 般６１Ｑされたレベルよりも一層高いレベルのカウント数をもたらす。試料Ｃか らの増幅核酸を有するビーズは、もしもそれらが試料Ａと関係したビーズよりも 翌意に高いレベルのカウント数を生ずるならば、試料Ｃのために採血されたヒト がＥＩＶ−１にｇ染していることを示す。 実施例■ 実施例Ｉおよび■の方法は、ＳＦ３　ＲＮＡポリメラーゼの代わりに７７　ｆｔ ＪＶＡポリメラーゼ（Ｐデ◎情りＧＢｔｅｔｇｃ社）を使用し、蕗−プライマー のサブセグメン）５’−（プロモーター）、−（可変サブセグメント）、−３′ および第三プライマーのサブセグメン）５’−（プロモーター）、−（可変セグ メン）几−３’がそれぞれ配列： ｓ’−ＴＡＡｌｃａＡＣＴ　ＣＡｃｒＡＴＡ　ＧＧＧ、＜−３’　（ここで１７ 個の５′末ＸＲａ塩基はプロモーターサブセグメントであり％４個の３′−塩基 は可変セグメントである）を有するプライマーを用いて実施する。可変セグメン トはプロモーターからの転写物の４個の５′末潟塩基に対応する。この方法では どの工程においても、少なくともＰｒｏｎｈｍｇａ　Ｂｉｏｔａａ　社製のポリ メラーゼン使用する場合、リボヌクレアーゼ阻！％Ｊ’に使用しない。 実施例■ 実施例工および■の方法は、ＳＦ３　ＲＮＡポリメラーゼの代わりにＴ３　ＲＮ Ａポリメラーゼ（カリフォルニア州すンジエゴ、５ｔｒａｙｓＳ−社製）を使用 し、第一プライマーの（プロモーター）Ｉ−（可変サブセグメント）、サブセグ メントおよび第三プライマーの（プロモーター）Ｓ−（可変サブセグメント）、 サブセグメントとして次のセ／　メ７　）　：　Ｓ’−ＴＡＴＴＡＡＣＣＣＴ　 ＣＡＣＴｉＡＡ　ＧＧＧＡ−３’（ここで１７個の５′末端塩基はプロモーター セグメントであり、４個の３′末端塩基はプロモーターからの転写物の４個の５ ′末端塩基に対応する可変セグメントである）を用いて来施する。 実施例Ｖ 実施例■のように７７　ＲＮＡポリメラーゼを使用し、また実施例工に記載した プライマーの代わりに次のプライマーを用いて、ヒト血液試料からのＢＩＶゲノ ムの標的セグメントを増幅させる： 第一プライマー：　５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴ　ＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＴＣ ＴＡＡＴＴＡＣＴ　ＡＣＣＴＣＴＴＣＴＴ　ＣＴＧＣＴＡＧＡＣＴ−３’　（こ こで３０＠の３′末端塩基はＥＩＶ−１ｆ）ＥＮＶ遺伝子の塩基７０７６−７０ ４７の配列に相補的である）第ニプライマー：　５’−ＡＣＡＡＧＴＴＧＴＡ　 ＡＣＡＣＣＴＣＡＧＴＣＡＴＴＡＣＡＣＡＧ　−３’　（Ｅ　Ｉ　Ｖ　−１０Ｅ ＮＶ遺伝子の塩基６８３８−６８６６の配列を有する） 第三プライマー：次の２７個の３′末端塩基：Ｓ’−ＡＡＡＧＧＴＡＴＣＣＴＴ ＴＧＡＧＣＣＡＡ　ＴＴＣＣＣＡＴＡ　−３’ＣＥＩＶ−１ｔｖＥＮＶ３１伝子 中の塩基６８７５−６９０２の配列を有する）に連結された、本実施例の第一プ ライマーと同じ２１個の５′末端塩基 第四プライマー：　Ｓ’−ＡＧＴＴＧＡＴＡＣＴＡＣＴＧＧＣＣＴＡＡＴＴ−３ ’（Ｅ７Ｖ〜１のＥＮＶ遺伝子中の塩基７０３３−７０７７の配列に相補的な配 列を有する）０実施例■ 実施例■のように７７　ＡＮＡポリメラーゼを使用し、また実施例ＩＫ紀載した プライマーの代わりに次のプライマーを用いて、ヒト血液試料からのＥＩＶゲノ ム中の標的セグメントを増幅させる： 第一プライマー二次の３１個の３′末端ヌクレオチド二Ｓ’−ＣＡＣＣＴＡＧＧ ＧＣＴＡＡＣＴＡＴＧＴＧ　ＴＣＣＴＡＡＴＡＡＧ　Ｃ，−３’ＣＥＩＶ−１の ＳＯＲ遺伝子の塩基５４７１−５４４１の配列に相補的な配列を有する）に連結 された、実施例Ｖの第一および第三プライマーと同じ２１個の５′末端ヌクレオ チド 第ニプライマー：　５’−ＡＣＡＣＣＡＴＡＴＧ　ＴＡＴＧＴＴＴＣＡＧＧＧＡ ＡＡＧＣＴＡ−３’　ＣＭ　Ｉ　Ｖ　−１のＳＯＲ遺伝子の塩基５１５１−５１ ７９と同じ配列を有する）第三プライマー１次の３１個の３′末端ヌクレオチド ：５　’−ＡＡＧＡＡＴＡＡにＴＴＣＡＧＡＡＧＴＡＣＡＣＡＴＣＣＣＡＣＴ− ３’ＣＥ７Ｖｆ）ＳＯＲ遺伝子の塩基５２２０−５２４９　と同じ配列を有する ）に連結された、実施例Ｖの第一および第三プライマーと同じ２１個の５′末端 ヌクレオチド第四プライマー：　５’−ＴＧＧＴＣＴＧＣＴＡＧＴＴＣＡＧＧＧ ＴＣＴＡＣＴＴＧＴＧＴＣ−３’　（ｎ　Ｉ　Ｖ　−１のＳＯＲ′ｉ伝子中の塩 基５３８７−５３５７の配列に相補的な配列を有する）。 実施例■ 実施例Ｉの方法に従って、１）１０’非感染ＣＥＭ細胞と混合した１０”ＥＩＶ 感染ＣＥＭ細胞を含む試料（Ｃａｓａａｒ　Ｃｅｎｔｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　 Ｆｏｓ算ｄａｔｆｓ、ＣＣＲＦ　−ＣＥＭ；ＡＴＣＣ／％（：’Ｃ１１１９）； および２）１０＠非感染ＣＥＭ細胞を含む試料からジ酸を分離する。これらの試 料はＥｚｔｒａｔｔｏｒ　ＴＭ　カラムｃＭＢＩ）から得られた試料を濃縮する ために、エタノール沈殿工程後１００ａｌｊ　の　１　０　ｔｈＭ　Ｔｒｉｍ− ＥＣＩ、　、Ｅ７．４　、　１　ｍＭ　ＥＤＴＡ（ＴＥ）に再懸濁する。再懸濁 した試料はセファデックスＧ−５０スピンカラム（Ｍａ％ｉａｔ＜ａの上記文献 参照）にかけ、ＴＥで溶出して分画化する。溶出した試料をエタノール沈殿（０ ，８ｊｆ　ＬｉＣ１，３倍各倉のエタノール中、ドライアイス／エタノール浴〒 で１５分間）Ｋより諌扁する。濃縮した試料を遠心によりペレットとなし、その ベレツｌ’排水し、乾燥し、その後４０％ＭＴデ１ａ−ＥＣＩ、ｐＨ８，１，８ 愼Ｍ　ＭｇＣ１，、２５鴨ｊｆ　ＮａＣ１，２鴨Ｍ　スペルミジン、５ｄｓＭ　 ジチオトレイトール、１００μＭ−ｆりのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよび ｄＴＴＰ、１懲にずつのｒ　Ａ　Ｔ　Ｐ　％ｒ　ＣＴ　Ｐ　、　ｒ　Ｇ　Ｔ　Ｐ およびｒ　Ｕ　Ｔ　Ｐ。 １００μｙ／ｍｌ　ＢＳＡ　（ヌクレアーゼ不含）、２５０％にずつのＤＮＡオ リゴヌクレオチドブライマーＡ：（５’−ＡＡＴＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣ ＴＡＴＡＧＧＧＡＣＡＣＣＴＡＧＧＧＣＴＡＡＣＴＡＴＧＴＣＣＴＡＡＴＡＡＧ Ｇ−３）およびプライマーＢ： （５’　−ＡＣＡＣＣＡＴＡＴＧＴＡＴＧＴＴＴＣＡＧＧＧＧＡＡＡＧＣＴＡ− ３’　）を含有する緩＠液１００μｌＫ再慇濁する。 対照として、Ｏ，Ｏ１／ｓ＋ｃの濃度の精製ＥＩＶ　ＲＮＡを含む２通りの試料 を上記の緩衝液１００μｌ　ＫＭ濁する。 最後に、Ｈｉｓｄｍで吻状化したプラスミドＢβ１９Ａ（Ｉｌ’ａｌｌａｃａ　 ａｔ　ａｌ、、　ｈ’ｓｃ１．　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｍａ、　９．３６４７（１９８ １）中に含まれる１０／ｖａのβ−グロビン配列を、オリゴヌクレオチドプライ マーン除いた上記の酸＠准１００μ！に懸濁するｅｙｒリゴヌクレオチドプライ マーＤ　（５’−ＡＣＡＴＴＧＣ’ＴＴＣＴＧＡＣＡＣＡＡＣＴにＴＧＴＴＣＡ −３’　）およびプライマーＣ（５’　−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡ ＧＧＧＡＣＡＡＡＧＧＡＣＴＣＡＡＡ−３’　）　はβ−グロビン配列に特異的 であり、これらを２５０％λすり戸−グロビン反応混合物に加える。 Ｉ−グロビン試料を除いて、反応混合物を６５℃で１分加熱する。Ｉ−グロビン 試料は１分沸騰させる。全部の試料ｋ１分間４２℃に冷却し、その後ｌＯ年単位 ＡＭＶ逆転写′ｅ＃素を加える。これらの反応硯合物Ｙ４２℃で１５分インキュ ベートし、１分沸騰させた後４２℃で１分冷却する。追加の１０単位のＡＭＶ逆 転写＃素を加え、４２℃で１５分インキュベートする。１００単位の１７ＡＮＡ ポリメラーゼを加え、反応混合物を３７℃で３０分インキュベートする。 試料を１分沸騰さセ、４２℃で１分冷却し、萩いて１０単位のＡＭＶ逆転写酵素 を加える。反応凌合物を４２℃で１５分インキュベートし、１分沸騰させ、４２ ℃で１分冷却する。追加のｌＯ単位の逆転写酵素を加え、その後４２℃で１５分 インキュベートする。１００ＩＩ！−位の７７　ＤＮＡポリメラーゼを加え、３ ７℃で３０分インキュベートする。このサイクルをさらに２回繰り返す。 その後、増幅された標的は以下で述べる０１す＠　Ｂａａ−ｄ、　Ｔ　Ｍを用い て検出する。 ｈＩｙ−ｖ＠異的オリゴヌクレオチドを含むセファクリルビーズは記載さｎる通 りに作製し、２５０μｌの懸濁ｇが５０■のセファクリルビーズを含むような濃 度でＴＥ甲に４℃で貯蔵する。オリゴヌクレオチドは記載される通りに合成し、 ＨＰＬＣで精製する。 ビーズへの結合と検出の両方のために用いたオリゴヌクレオチドはＨＩＶ−１ゲ ノムのＳＯＲ領域に相同である。これらの実験において用いたオリゴヌクレオチ ドは８６−３１（オリゴヌクレオチドの検出）　Ｃ５’−ＧＣＡＣＡＣＡＡＧＴ ＡＧＡＣＣＣＴＧＡＡＣＴＡＧＣＡＧＡＣＣＡ　−３’　）および８７−８３（ ビーズ上でのオリゴヌクレオチドの捕獲＝（５’−ＡＴＧＣＴＡＧＡＴＴＧＧＴ ＡＡＴＡＡＣＡＡＣＡＴＡＴＴ−３’）であ１００個のヌクレオチドにより隔て られる。検出のために、オリゴヌクレオチドは標準プロトコルに従って″Ｐで末 端標識した。組み込まれなかった標識はセファデックスＣ−５０カラムでのゲル 濾過により除き、オリゴヌクレオチドを一２０℃で貯蔵した。 一般的なビーズを用いたサンドイッチハイブリダイゼーションシステム（ＢＢＳ ＢＳ）の英数において、標的とＡｔＰ−標識検出用オリゴヌクレオチドはニッパ ｙ　トｙ　７チユーブ中の０．２％ＳＤＳを含むＴＥＩＯμｌ中で６５℃、５分 間変性を起こさせる。こｎに、１０μｌの２×溶液ハイブリダイゼ一シヨン混合 ６（１０ＸＳＳＰＥ７１０％テキストラン硫吐ス加える。この溶液を混合し、２ 秒遠心し、４２℃で１時間インキュベートする。 その間に、セファクリルビーズなプレハイブリダイズさせる。ビーズの貯蔵懸濁 ｇを十分に混合し、２５０μｌの７リコート（ビーズ５０Ｑ９）を、それぞれの 移し変えの間混合して均一な懸濁液を保ちながら、エツベンドルフチューブに移 す。そのアリコートを１０秒遠心し、ＴＥ−１（抜き取り用パスツールピペット を用いて除去する。 ２５０μｔのハイブリダイゼーション浴ｍ＜５ｘｓｓｐｚ（ｏ、　９　Ｍ　Ｎａ ｃｌ　−５０ｔＩ＆Ｍ　ＮａＨ＊Ｐ　０４％ｐＨ７，４，１ｍｊｆＥＤＴＡ）１ ０％テキストラン＠＃１０．１％５ＤＳ）を加え、ビーズを穏やかに償拌しなか ら慇濁し、３７℃で３０〜６０分時々混合しながらインキュベートする。捕獲工 程の直前に、ビーズを１０秒遠心し、プレハイブリダイゼーション溶液を除き、 ３７℃のハイブリダイゼーション浴ｉｓｏμｌを加えて、ビーズを３７℃に戻す 。 溶液ハイブリダイゼーションを２秒遠心し、ビーズとハイブリダイゼーション溶 液に移す。ビーズを懸濁させ、時々混合して懸濁液を保ちながら３７℃で１時間 インキュベートする。 捕獲後、ビ・−ズを１０秒遠心し、未捕獲標的と検出用オリゴヌクレオチドを含 むハイブリダイゼーション浴液なシンチレーション計測器バイアルに移す。その 後、ビーズを２ｘＳＳＣＫより３７℃で５回洗う。初めの３回の洗浄は迅速であ る；ｌ−の洗液を加え、ビーズを十分に混合して１０秒遠心し、その洗液を計鉤 用バイアルに移す。最後の２回の洗浄では、１−の洗液を加え、ビー、＜Ｗ混合 し、３７℃で５分インキュベートした後遠心にかける。それぞれの洗液を；その 手εを監視するために別々に計測する。 ハイブリダイゼーション浴液、５つの洗液およびビーズのチェレンコフカウント は５〜１０分間計測スル。計測器のパックグラウンドを全ての試料から差し引く 。検出された７ｍｇ的は次のようにして計算する：（ビーズのＣＰＭ／全ＣＰＭ 　）　Ｘ　ｆｔｈオリゴヌクレオチドここで全ＣＰＭはハイブリダイゼーション 溶液、５つの洗液およびビーズのＣＰＭの合計である。 ＢＢＳＢＳによる増幅標的の検出 １０”ＨＩＶ感染細抱；　０．３３　０．０６１０”ＯＥＭ非感染細胞　０．６ ６　０．１３１０６非感染ＣＥＭ細胞　０．０７　０．０１０．１４　０．０１ ５ ０．０１／惟ＨＩＶＲＮＡ　Ｏ，００７０，１４０，０１４０，２９ １０／情β−グロビンＤＮＡ　１０　０．０１４５Ｉ！施例■ 実施例１の方法に従って、２つの試料：ａ）１０’　非感染ＯＥＭｋＢ胞を含む １０息ＨＩＶｇ桑ＣＥＭ細胞、およびｂ）１０”非感染培養ｃｚｈｔｉｇｚ胞（ 抽出後０．０１　ｆｍｏｌａのｎ製ＨＩＶを加える）から仇敵を分離する。Ｅｚ ｔｒａ−ｃＬｏｒカラム工程後セファデックスＧ−５０（ファイン）スピンカラ ム（Ｍα＊ｔａｔｓａの上記文献参照）に通しＴＥで溶出することによりさらＫ ｆｆ製する。硯いて、孤酸のエタノール沈殿（０，８Ｍ　ＬイＣｔ中；２．５倍 容量のＥ　ｔ　ＯＨ）を行う。その後被酸を下記成分を含む溶液１００μを中に 再懸濁する： ４０　ｍＭ　Ｔｒｉｍ−ＥＣ４ｐＨ８，１８鴨Ｍ　ＭＱＣＬ２ ２５毒Ｍ　ＮａＣＬ ２毒ど　スペルミジン ５？ＲＭ　ＤＴＴ　（ジチオトレイトール）１００雷Ｍ　ｄＡＴＰ％ｄＴＴＰ、 　ｄｃＴＰ、　ｄＧＴＰ　（各々）］　ｍｕ　ｒＡＴＰ、ｒｃＴＰ％　ｒＧＴＰ 、ｒＵＴＰ１００μ２７ゴ　ＢＳＡ　ヌクンアーゼ不含２５０％Ｍ２９ｂｐＤＮ ＡオリゴヌクＶオチド（プライマーＢ）（配列：　５’ＡＣＡＣＣＡＴＡＴＧＴ ＡＴＧＴＴＴＣＡＧＧＧＡＡＡＧＣＴＡ−３’）２５〇九Ｍ５６ｂｐＤＮＡオリ ゴヌクレオチド（プライマーＡ）（配列：　５’−ＡＡＴＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣ ＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ−ＡＣＡＣＣＴＡＧＧＧＣＴＡＡＣＴＡＴＧＴＧＴＣＣ ＴＡ−ＡＴＡＡＧＧ−３’） この溶９１００μｔを６５℃で１分加熱し、１分にわたって４２℃に冷却する。 この加熱およびその後の４２℃またはそれ以上での保持は、浴液の組成と組み合 わせて、（３′−プライマーサブセグメント）、（第１図参照）をそれＫａ補的 な標的ＨＩＶ　ＥＮＡの配列へ高度に特異的にしかも十分に安定した状態でハイ ブリダイズさせるのに足るストリンジェント条件を提供する。 その後、ｌＯ単位のトリ筋芽球症ウィルス（ＡＭＶ）逆転写酵素（Ｌｉｆｅ　５ ｃｉａ％ｃ＃ｊ社）を加え、この溶液を４２ような鋳型−プライマーとしてポリ ＣＡ）オリゴ（Ｔ）　１２−１８を用いて１％ＳａＬのＴＴＰを酸沈殿形体へ３ ７℃、１０分で組み入れる。〕ｌＯ分インキュベーション後、この＃！散を１分 間沸騰水浴に入れる。この加熱は逆転写＃素によシ形成された２本＠杉酸の鎖分 離と逆転写酵素の不活化を起こさせる。 次に、この溶液を１分で４２℃に冷却する。この冷却期間中に、第ニプライマー （プライ−ｒ　−Ｂ　）が前工程で逆転写＃素により触媒される反応から形成さ れた標的相＠ＤＮＡ鎖の３′宋遇（第三サブセグメント）ｃ−ｃ（第１図参照） にハイブリダイズする。この場合も、ハイブリダイゼーショ７条件ｒｉ第ニブ２ イマーとその第ニプライマーに相補的な配タリとを特異的に−イプリダイズさせ るのに十分なストリンジェント条件である。 ？′４却後、追加の１０率位のＡＭＶ逆転写酵素を加え、４２℃で１０分さらに インキュベートする。 この反応混合物Ｋ１００率位のＴ７ボＶメ２−ゼを加え、３７℃で３０分インキ ュベートする。逆転写酵素により新たに合成された２不鎖ＤＮＡ＠型の５’：ｔ ：端に存在するＴ７プロモーターから出発して、もとの１解Ｉ　ＶＲＮＡに相補 的なＲＮＡ転写物が合成される。この転写物ｒｉ配列５’−ＧＧＧＡｔｔ有し、 その後に標的配列の第二サブセグメントに相補的な配列（すなわち、第二サプセ グメ／トｔｅｒ、第１図参照）が続く。この工程以前では逆転写＃素に不活化さ れて２らず、しかもプライマーＢ２よびデオキシヌクレオチド三す／酸が存在す るので、２回目の合成がこの段階で起こる。プライマーＢはそれに相補的な、新 たに合成されたＲＮＡ転写物（第三サブ七グメ”））ｔｔｅデ（第１図参照）の ３′領域にハイブリダイズする。ＣＭ工程で加えられた〕逆転写酵素は鋳型とし て新たに合成されたＲＮＡ転写物（Ｔ７ポリメラーゼによシ作られたものンを使 用し、５′宋遇にプライマーとしてオリゴヌクレオチドＢを用いＣＤＮＡ鎖を合 成する。 この反応混合物を１分沸騰させ、２本頒ＲＮＡ　：　ＤＮＡをに注する。その後 この混合物を１分で４２℃へ冷却する。この冷母工程中に、プライマーＡｆ）標 的相補セグメントが前工程で合ｂｙ、されたり！ＷＡ＠にハイブリダイズする。 内時に、プライマーＢが前工程で合成されたＲＮＡ転写物の相補配列にハイブリ ダイズする。 冷却後、追加の１０率位のＡＭＶ逆転写酵素を加え、４２℃で１０分さらにイン キュベートする。逆転写酵素にプライマーとじ℃オリゴヌクレオチドＡを使用し 、またｖｌａ型として前工程で作られた１）ＨＡを用いてＨＩＶ標的に相補的な りＮＡを合成する。第二ＤＮＡ鎖はプライマーとしてオリゴヌクレオチドＢを、 そして鋳型として前工程で作られたＲＮＡ転写物を用いることによｐ合成される 。 反応混合物を１分沸騰させて２本鎖ＤＮＡおよび２本鎖ＲＮＡ　：　ＤＮＡを変 性する。この反応混合物を１分で４２℃に冷却する。プライマーｌに前工程で鋳 型としてＲＮＡ転写物を用いて合成されたｅ　ｌ）Ｎ　Ａにノーイブリダイズす る。（鋪型鎮の３’、ｆ：ｍが逆転写酵素プライマーとし”ｌ！用されろ場合、 次の反応の目的産物と同じ産物が作られる二）プライマーＢは標的ＨＩＶ　ＲＮ Ａに相補／）　５’　−ＧＧＧ　、４−３　ｒを富む２本鎖ＤＮＡの産物をもた らす。 この反応混合物に１００単位の１７ポリメラーゼを加える。３７℃で３０分イン キュベートする。Ｔ７　ＲＩｆＡポリメラーゼに鋳型とし℃２不鎖Ｔ７プロモー ターを含む２本＠ｔｕｙＡを使用して、５′床選に追加配列５′−〇〇ＧＡ−３ ’を含む標的第二サブセグメントに相補的なＲＮＡに転写する。 このサイクル（１分沸騰、４２℃で１分、Ｒ７４２℃で１０分、Ｒ７４２℃で１ ０分、Ｔ７ポリメ２−ゼ３７℃で１０分）は捺的配列の希望する増幅が得られろ １で何回も繰り返丁ことができる。得られた生産物はその後核醗プロープハイブ リダイゼーショ／技法により検出される。 災　Ｍｌ　例　Ｖ Ｉｆｍｏｌｅ　の濃度で精製ＥＩＶ　ＲＮＡを下記溶液に再懸濁する： ４０　ｓＭＴｒｉｍ−ＥＣＩ　、　ｐＨｆ３，１８−Ｍ　ＭＱＣＬ。 ２５悔Ｍ　ＮσＣｔ ２惰Ｍ　スペルミジン ５惇Ｍ　ジテオトレイトール ｌ鶏Ｍ　各ｋｒＡＴＰ、ｒｃＴＰ、ｒＧＴＰ、ｒＵＴＰ１００Ｐｆ／ａｔ　Ｂ５ Ａ３＜り１／７−ゼ不含２５０　ｓＭ２９　ｈｐ　Ｄ−ＮＡオリゴヌクｖｔチド （プライマーＢ） （配列： ５’　−ＡＣ，’ＡＣＣＡＴＡＩ’ＧＴＡ：Ｔ（ＪＴＴＣＡＧＧＧＡＡＡＧＣ’ ＴＡ−３’　）２５０％Ｍ　５６ｂｐｌ）ＮＡオリゴヌクレ万テド（プ２マーＡ ） （配列：　５’−ＡＡＴＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＣ；ＡＣＡ ＣＣＴＡＧＧＧＣＴＡＡＣＴＡＴＧＴＧＴＣＣＴＡＡＴＡＡＧＧ−３’） この溶液１００μＬを６５℃で１分ＦＪ熱し、１分かけて４２℃に？？即する。 この加熱２よび冷却工程は、溶液の組成と組み合わせて、プライマーＡを標的Ｂ ＩＶ　ＲＮＡのプライマーＡ領域に相補的な配列〔（第一サブセグメント）ｔ！ 、第１図参照〕へ、十分安定した状態でしかも高度に特異的にハイブリダイズさ せるに足るストリンジェント条件を提供する。 その後、ｌＯ単位のトリ筋芽球症ウィルス（ＡＭＶ）逆転写＃累ＣＬｉｆｅ　Ｓ ｃｉａｓｃｇ社〕な加え、この溶液を４２℃で１０分インキュベートする。１０ 分イ／キュベーショ／ｖｋ−溶液を沸騰水浴中に１公人れる。この加熱は逆転写 ＃累により形成された２重鎖′ｇｃ＠の鎖分離２よび逆転写酵素の不活化を引き 起こす・ この溶液を１分にわたシ４２℃へ冷却する。この冷却中に、第二プライマーＢは 新たに合成された標的相補鎖〔または第１図の（第三サブセグメ７）　）ＩＢ− １の３′末遁へハイブリダイズする。この場合も、ハイプリダイゼーショ７条件 に第ニプライマーとその第ニプライマーに相補的な配列とを特異的にノ・イブリ ダイズさせるに足るストリンジェント条件である。 冷日後、追加の１０単位のＡＭＶ逆転写酵素を加え、４２℃で１０分さらにイン キュベートする。 この反応混合物に１００率位のＣ７ＲＮＡポリメラーゼ（Ｎｏｖ　Ｅｎｇｌａｎ ｄ　Ｂｉｏｌａｂａ社）を加える。その後３７℃で３０分インキュベートする。 逆転写酵素によシ合成さｎた２本領１）ＪＶＡ駒益の５′宋端に存在するＴ７プ ロモーターから出発して、もとの標的１１１Ｖ　ＲＮＡに相補的なＲＮＡ転写物 が合成される。このＲＮＡ転写物は５ｌ−ＧＧＧＡの配列を有し、その後に標的 配列の第二サブセグメントにお補的な配列（ｊなわも第二サブセグメントｔｃデ 、第１図）が続く。この工程以前では、逆転写酵素は不活化されて２５ず、しか もプライマーＢとデオキシヌクレオチド三リン酸が存在するので、この段階に２ いて２＠目の合成が起こる。プライマーＢはそれに相補的な、新たに合成された ＲＮＡ転写物〔（第三サブセグメント）ｔｔａｒｓ第１図参照〕の３′領域にハ イブリダイズする。（前工程で添加された〕逆転写酵素ｒ！鋳型として新たに合 成されたＲＮＡ転写物（Ｃ７ＲＮＡポリメラーゼによシ作られたもの〕を使用し 、また５′宋端にプライマーとしてオリゴヌクレオチドＢを用いてＩ）ＮＡ鎖を 合成する。 その後、反応混合物を１分間沸騰させてＲＮＡ　：　Ｉ）ＮＡ２本鎖を変性させ る。次いで１分にわたって４２℃に冷却する。この冷却工程中に、プライマーｊ （Ｉ’）標的８１輛セグメントが前工程で合成さｔｚ　ｒｓ　ｎ　ｓ　Ａ鎖にハ イブリダイズする。同時に、プライマーＢが前工程で合［されたＲＮＡ転写物の 相楕配列にハイブリダイズする。 冷形後、ｌＯ単位のＡＭＶ逆転写酵素を加え、４２℃で１０分さらにインキュベ ートョ／を集流する。逆転写出紫に５′不趣にプライマーとしてオリゴヌクレオ チドＡを使用し且つ鋳型として前工程で合成した１）ＮＡを用いて、ＨＩ　Ｆ標 的に相補的なりＮＡを合成する。鋳型釧の３’：１ｆｒａをプライマーとして使 用すると、５′禾ｇｓＫ２不鎮Ｔ７プロモータ一部位な有する最終の２本＠１） ＮＡが合成さ九る。第二Ｌ）ＮＡ餉はプライマーとしてオリゴヌクレオチドＢを 、鋳型として前工程で作られたＲＮＡ転写物を用いて合成される。 この反応混合物に１００単位の１７ポリメラーゼを加え％３７℃で３０分インキ ュベートする。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼに鋳型として５′宋選にポリメラーゼ結 合部位（Ｔ７プロモーター）を含む２本ｇＤＮＡを用いてＲＮＡ転写物を合成す る。このＲＮＡ転写物にその５′宋端に追加配列５／−ＧＧＧＡ−３’を含む標 的第二サブセグメント（第１図参照）に相補的なＲＮＡである。増幅を高めるた めに、これ以上のサイクルを繰シ返し行ってもよい。得られた主産物は核酸ハイ ブリダイゼーション法により検出できる。 ５ｊ！：　施　ｍｘ ＴＡＳ増幅産物のｉ＃、Ｐ−回ラベリングプロトコルＡ、Ｍｉみ込まれなかった ヌクレオチドを除去するためのカラム １、最終ＴＡＳサイクルでのｃｌ）ＨＡ合成後に、ＴＡＳ反応混合物１００μを 乞取シ出丁。これに試薬、４（０，ＩＭ　Ｔｒｉｍ　−ＨＣＬ、　ｐＨ７，７、 ｌ　Ｑ　ｇｎＭ　）リエテルアミン、１１１Ｍ　ＥＤＴｉジナトリウム塩）４０ ０μｔを加える。 ２、Ｎ　Ｂ　Ａ’　Ｓ（Ｊ　／？　Ｂ　２１１　（１）ｓ　ｐ　ｏ　ｎ　ｔ　） プレパックカラムのカラ人材料乞１００チメタノール（ｔｌＰＬｃ級）中で湿潤 させることによシ平衡化し、久いで２ｄの試薬Ａで平衡化する。 ３、　カラムに試料を入れる。 ４、カラムを１ＩＬｔの試薬Ａで３回洗う。 ５、　カラムを１ｌｌｊの水で３回洗う。 ６、核酸を５０チメタノールで溶出し、２５０〜３００μｔの画分な集める（総 容量１ｍ以下〕。（初めの２つの両分に大部分の核酸が含まれるであろう。）７ 、画分をスピード・バック（ｓｐｅｅｄ−ｗａｇ）または凍結乾燥機で乾かす。 Ｂ、増Ｉ！＠産物のラベリングプロトコルτＭ １、ＮＥＮＳＯＲＢ、。　カラムからの画分（最初の２画分を合わせてもよい） を４０惰ＭＴｒｉｍ　−ＲＣＬ、　ｐＨ８，１，８ａｈＭ　ＭｇＣＬｔ、２５％ ＭＮａＣＬ、　’：／Ｉｌｄ　ス／＜Ａ／ミジン（ＨＣＬｈ、５％Ｍジチオトレ イトール、４００μＭずつのｒＡＴＰ、ｒｃＴＰ％＠；よびｒＧＴＰ、１２ｐＭ の、ｔｔｒｐ、２；よひ２５　ｐＣｉの（１−”Ｐ　−ｒＵＴ　Ｐ　（８００Ｃ ３Ｉ％ｍａｊ）中に再懸濁する。 ２、そｎぞれ５０μＬの試料に対して５０率位の１７ＲｓＡポリメラーゼ（Ｎｅ ｗ　Ｅｘｇｔａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂａ）を加え、３７℃で３０分インキュベート する。 ３．０−５０スピ／カラム（ＭａｎｉＧｔｉａらの上記文献）により組み込ヱ九 なかった標識を除く。 ４、標記した試料をシークエンシ７グ用のポリアクリルアミドゲルにかけて、増 幅産物の大きさを決定する。 襟臓星物は０１すｏ−Ｂｇａｄａ’〜用いても検出できる。 ５Ａ施例Ｘ 試料はｌ）０．１／惰ＥＩＶ　ＲＮＡΣよび０．１ｌｍβ−グロビンＤＮＡ配列 （Ｐｊｔ！で切断したＢ／１９４）；２）０．０１／胃ＨＩＶ　ＲＮＡ５よび０ ．１／溝β−グロビノＤＮＡ（Ｐａｔ　ｌで切断した１１１１９Δ）　；　３） 　Ｏ，ｌ　ｆＩＩＢＢＩＶＲＮＡ；！たｔ！４）０．１／ａβ−グａ　ヒｙ　Ｉ ）ＮＡ　（Ｐａ　ｔ　１で切断したＨβ１９Ａ）を４０　ｗｈＭ　Ｔｙｉａ−Ｈ ＣＬ％ｐＨ８，１゜８ｗｈＭ　ＭｇＣＬ、、２５餌Ｍ　ＮａＣＬ、　２愼Ｍ　ス ペルミジン−（ＨＣｌ）、、５ｍＭジチオトレイトール、１００ｐｔずつのｄＡ ＴＰ、ｄＴＴＰ％ｔＬｃＴＰ２よびｔｔＧＴＰ％１ｇｈＭずつのｒＡＴＰ、ｒＵ ＴＰ、ｒｃＴＰ％２よびｒＧＴＰ、　１００μり／就　ＢＳＡ（ヌクレアーゼ不 ｔ）、Ｓよび２５０％ＭプライマーＡ　（５’−ＡＡＴＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴ ＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＣＡＣＣＴＡＧＧＧＣＴＡＡＣＴＡＴＧＴＧＴＣＣＴＡ ＡＴＡＡＧＧ−３′）、２５０％ＭプライマーＥ（５’−ＡＣＡＣＣＡＴＡＴＧ ＴＡＴＧＴＴＴＣＡＧＧＧＡＡＡＧＣＴＡ−３’）、２５０％Ｍプライ−ｒ　− Ｃ（５’　−Ｔ　ＡＡＴ　ＡＣＧＡＣＴ　ＣＡＣＴ　ＡＴＡＧＧＧＡＡＣＴＡＡ ＡＧＧＣＡＣＣＧＡＧＣＡＣＴＴＴＣＴＴＧＣＣ−３’）、および２５いｉプラ イマーＤ（５’−ＡＣＡＴＴＧＣＴＴＣＴＧＡＣＡｃＡ、ａｃＴＧＴＧＴＴｃＡ −３’）を官有する溶液１００μｔに加えて調装した。ｚｏの出発核酸な含む試 料をゼロ回試料とし℃変性用溶液７．４％ホルムアルデヒド、　１０ｘＳＳＣ（ １，５Ｍ　ＮａＣＬ、　０．１５　Ｍクエン酸Ａ’ａ１．Ｈ７，４＞に入れた。 上記の試料を１分沸騰させ、４２℃で１分冷却し、ａいて１０率位のＡＭＶ逆転 写＃素を加える。この反応混合物を４２℃で１５分インキュベートし、１分沸騰 させ、４２℃で１分冷却する。追加のｌＯ年単位ＡＭＶ逆転写酵素を加え、４２ ℃で１５分インキュベートする。１００率位の７７　ＲＮＡポリメラーゼを加え 、３７℃で３０分インキュベートする。このサイクルを２回縁シ返ス。 （必要とされる増幅の程度に応じて、それ以上のサイクルを行ってもよい。）ｚ ｏの出発１７Ｓ酸を含む２つの試料を２回転写試料として変性用茫液に入れた。 全１の試料を５５℃で３０分加熱し、その後２枚のニトロセルロース膜上に濾過 した。２５し１のＵＶ光線を４分照射することによシ核酸を膜に固定した。対照 として、全ＨＩＶゲノムｃ　Ｄ　／ｉ’　Ａ　を含むプラスミド、ＡＲＶＯｌｏ 　１　ｆｍを０．２　Ｎ　ＮａＯＨ中で変性し、等容量の２Ｍ酢酸アンモニワム で中和し、その後ニトロセルロース膜上に濾過した。−万の農にｌ１ｌＶの増幅 置物に荷異的な１１　ｐ　−標Ｈオリゴヌクレオチド８６−３１’　とＩ・イブ リダイズさせた。他方の膜は増幅さｎたβ−グロビン産物２よび標釣β−グロビ ／プラスミドにノ・イブリダイズする３１　ｐ　−憚ｗオリゴヌクレオチド８７ −４５９”　にノ・イブリダイズさせた。 ハイプリダイゼーシＥ７（”１１％　Ｓ　Ｄ　Ｓ　、　０．９　Ｍ　ＮａＣ１゜ ５０　ｓＡｆ　ＮａＢｔＰ　Ｕ＊　（ｐＨ７，４）、５　ｔｇＭ　Ｅ　Ｄ　Ｔ　 Ａ（ｐＨ７，４）、２よび１０＠ｃｐｗｃ／ｍの３２７）　−標識オリゴヌクレ オチド中で５５℃で１時間行った。膜を１％、５Ｉ）５，０．１８ＥＤＴＡ中呈 温で３回洗い、次に同−緩衝液中５５℃で１回洗った。 その後、Ｍｄ１枚の増感スクリーンを使用してコダックＸｉＲフィルム上−７０ ℃で１６時間オートラジオグラフィーにかけた。 生 １、　８６−３１：　５’−ＧＣＡＣＡＣＡＡＧＴ、イＧＡＣＣＣＴＧＡＡＣＴ ＡＧＣＡＧＡＣＣ−３’ ２、　８７−４５９：　５’−ＡＧＧＴＴＴＡＡＧＧＡＧＡＣＣＡＡＴＡＧＡＡ ＡＣＴ−３’ 第３図のオートラジオグラフは、ＢＩＶおよびβ−グロビンｖｃｔＲに対して同 時に実施した２サイクルのＴＡＳ後に検出されたＢＩＶとβ−グロビ／配列の量 を示す。 β−グロビ／の出発ｉに一足の１１であるが、ＨＩＶ標的の童は変化した。 不発明は本明細薔に２いてかなり特定的に記載されているが、関連分野に２いて 通常の卸識を有する者は本発明の精神にｔ＝れろ不発明の変更ａよび修飾を認め るであろう。このような変更２よび修飾もまたここに記載の不発明の範囲内に含 まれるものである。 浄書（内容に変更なし） ｃｒ＋ＬＬ ２　−りり 、、　へ　リ〜〜 ・　・　１ｆｍ ・　０．１ｆｍ 、Ｑｌｆｍ 久すコ゛　８６−３　ｉ　大り丁　８７−４５９ＦＩＧ、　３ 手続補正書（旗） 平成　元年１１月ン困Ｉ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．プロモーター配列に作動可能な状態で連結された標的配列に対応する配列を 含む２本鎖核酸の製法であつて、標的配列のセグメントに対応する配列に作動可 能な状態で連結されたプロモーター配列を含む第一核酸プライマーを用意し、 適当な条件下で該第一核酸プライマーを核酸含有試料中の標的配列とハイブリダ イズさせ、 ハイブリダイズした第一核酸プライマーをポリメラーゼ伸長反応により標的配列 に対し相補的に伸長させて、対応する２本鎖核酸を形成し、 該２本鎖核酸の鎖分離を行い、 分離したプロモーター含有配列鎖に適当な条件下で第二核酸プライマーを該プロ モーター配列を含む鎖と反対の末端でハイブリダイズさせ、そして ハイブリダイズした第二核酸プライマーをポリメラーゼ伸長反応により該プロモ ーター配列含有鎖に対し相補的に伸長させる、ことから成る２本鎖核酸の製法。 ２．少なくとも１回繰り返す、請求項１記載の方法。 ３．核酸含有試料中の少なくとも１種の特定の核酸標的配列の検出に有用な方法 であつて、該標的配列に対応するＲＮＡ配列を有するＲＮＡ転写物を多数つくる ための２本鎖核酸鋳型として請求項１記載の２本鎖核酸な使用し、そして該ＲＮ Ａ配列の存在を検出することから成る方法。 ４．プロモーターに作動可能な状態で連結された標的配列に対応する配列を含む ２本鎖核酸の製法であつて、標的配列のセグメントに相補的な配列に作動可能な 状態で連結されたプロモーター配列を含む第一核酸プライマー、および標的配列 のセグメントと同一の配列を有する第二核酸プライマーを用意し（該第一および 第二プライマーは標的配列の異なる領域に対応するが、標的へのそれらの対応に おいて重複しないか又は実質的に重複せず、一方の伸長産物がその相補鎖から分 離されるとき他方の伸長産物の鋳型として役立ち得るように選ばれる）、標的配 列を含む核酸含有試料と該プライマー類とをハイブリダイゼーションおよびその 後の鎖分離の条件下が接触させて、順次該プライマー類の伸長産物をつくる、こ とから成る２本鎖核酸の製法。 ５．プロモーターを認識するポリメラーゼにより触媒される反応において多数の ＫＮＡ転写物をつくるための鋳型として請求項１または４記載の２本鎖核酸を使 用し、そして該ＲＮＡ転写物の存在を検出する、ことから成る方法。 ６．該転写物はレプリカーゼ誘導により該転写物を複製するためのレプリカーゼ 認識部位を含む、請求項３または５記載の方法。 ７．該ＲＮＡ転写物の検出されたＲＮＡ配列を標準化方法により測定して、２本 鎖核酸鋳型の製造において使用した核酸試料中に含まれる標的配列の量を測定す る、請求項３、５まには６記載の方法。 ８．該ＲＮＡ転写物の検出されにＲＮＡ配列を、やはり該試料中に含まれる既知 コピー数の核酸の存在により内部標準化されに方法で測定する、請求項７記載の 方法。 ９．標的配列は遺伝的な又は病原体による病気や症状の特徴と関連した核酸配列 内に配置されている、請求項３記載の方法。 １０．該核酸配列はヒト免疫不全症ウイルスのセグメントである、請求項９記載 の方法。 １１．該核酸配列は欠陥遺伝子のセグメントである、請求項１０記載の方法。 １２．プロモーターはバクテリオフアージＴ７プロモーターであり、ＲＮＡ転写 物はＴ７ＲＮＡポリメラーゼを用いてつくられる、請求項５記載の方法。 １３．プロモーターはＳＰ６プロモーターであり、ＲＮＡ転写物はＳＰ６ＲＮＡ ポリメラーゼを用いてつくられる、請求項５記載の方法。 １４．伸長反応はＥ．ｅｏｌｉＤＮＡポリメラーゼ１により触媒される、請求項 １または４記載の方法。 １５．伸長反応はＥ．ｅｏｌｉＤＮＡポリメラーゼ１のＫｌ■■■■断片により 触媒される、請求項１または４記載の方法。 １６．伸長反応はＴ４ＤＮＡポリメラーゼにより触媒される、請求項１または４ 記載の方法。 １７．伸長反応は逆転写酵素により触媒される、請求項１または４記載の方法。 １８．検出前に該ＲＮＡ転写物を標識する、請求項３または５記載の方法。 １９．該ＲＮＡ転写物を放射能標識する、請求項１８記載の方法。 ２０．該ＲＮＡ転写物を発色団標識する、請求項１８記載の方法。 ２１．核酸含有試料中の少なくとも１種の特定の核酸標的配列の検出に有用なキ ツトであつて、標的配列のセグメントに相補的な配列に作動可能な状態で連結さ れたプロモーター配列を含む第一核酸プライマーおよび標的配列のセグメントと 同一の配列を有する第二核酸プライマー（これらの第一および第二プライマーは 該標的配列の異なる領域に対応するが、該標的へのそれらの対応において重複せ ず、又は実質的に重複せず、一方の伸長産物がその相補鎖から分離されるとき他 方の伸長産物の鋳型として役立ち得るように選ばれる）；および該第一プライマ ーを標的配列にハイブリダイズさせ、ハイブリダイズしたプライマーを鎖伸長さ せ、得られた２本鎖核酸を鎖分離させ、プロモーターを含む分離鎖に第二核酸プ ライマーをハイブリダイズさせ、ハイブリダイズしたプライマーを鎖伸長させ、 得られたプロモーター配列き含む２本鎖核酸に転写物をつくらせ、そして該転写 物を検出するための手段；を含むキツト。 ２２．式Ｉ： ３′−（第一サブセグメント）ｔ−（第二サブセグメント）ｔ−（第三サブセグ メント）ｔ−５′ Ｉ 〔式中（第一サブセグメント）ｔは（第二サブセグメント）ｔの３′末端に瞬接 する少なくとも１０ヌクレオチドの既知配列の核酸セグメントであり、（第二サ ブセグメント）ｔは０またはそれ以上のヌクレオチドの核酸セグメントであり、 そして（第三サブセグメント）ｔは（第二サブセグメント）ｔの５′末端に隣接 する少なくとも１０ヌクレオチドの既知配列の核酸セグメントである〕の標的核 酸セグメントを増幅する方法であつて、（１）該標的セグメントの（第一サブセ グメント）ｔに、式ＩＩ： ５′−（プロモーター）１−（可変サブセグメント）１−（３′−プライマーサ ブセグメント）１−３′ＩＩ 〔式中（プロモーター）１はバクテリオフアージＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラー ゼ特異的プロモーターのプラス鎖の配列を有する１本鎖ＤＮＡセグメントであり 、（可変サブセグメント）１は（プロモーター）１の３′末端ヌクレオチドおよ び（３′−プライマーサブセグメント）１の５′末端ヌクレオチドに隣接する０ 〜１００ヌクレオチドの１本鎖ＤＮＡセグメントであり、そして（３′−プライ マーサブセグメント）１は（第一サブセグメント）ｔの３′末端ヌクレオチドで 終わる（第一サブセグメント）ｔのサブセグメント配列に相補的な配列を有する 少なくとも１０ヌクレオチドの１本鎖ＤＮＡセグメントであり、（可変サブセグ メント）１が０ヌクレオチドである場合、（プロモーター）１は（３′−プライ マーサブセグメント）１の５′末端に隣接する〕の３′末端サブセグメントから 成る１本鎖ＤＮＡの第一プライマーをハイブリダイズさせ； （２）工程（１）に従つてハイブリダイズさせた第一プライマーを第一ＤＮＡポ リメラーゼにより触媒される反応で伸長させて、式ＩＩＩ： ５′−（プロモーター）１−（可変サブセグメント）１−（第一サブセグメント ）ｔｃ−（第二サブセグメント）ｔｃ−（第三サブセグメント）ｔｃ−３′ ＩＩＩ 〔式中（第一サブセグメント）ｔｃは（第一サブセグメント）ｔに相補的な配列 を有するＤＮＡセグメントであり、（第二サブセグメント）ｔｃは（第二サブセ グメント）ｔに相補的な配列を有するＤＮＡセグメントであり、そして（第三サ ブセグメント）ｔｃは（第三サブセグメント）ｔに相補的な配列を有するＤＮＡ セグメントである〕のサブセグメントから成る第一相補ＤＮＡセグメントをつく り（但し、標的セグメントがＲＮＡセグメントである場合、該第一ＤＮＡポリメ ラーゼは逆転写酵素である）；（３）工程（２）の反応で形成された２本鎖核酸 を１本鎖となし； （４）式ＩＶの第一相補ＤＮＡの（第三サブセグメント）ｔｃに、式ＩＶ： ３′−（５′−プライマーサブセグメント）２−（可変サブセグメント）２−５ ′ ＩＶ 〔式中（５′−プライマーサブセグメント）２は（第三サブセグメント）ｔの５ ′末端ヌクレオチドで終わる（第三サブセグメント）ｔのサブセグメント配列を 有し、そして（可変サブセグメント）２は（５′−プライマーサブセクメント） ２の５′末端に隣接する０〜１００ヌクレオチドのセグメントである〕の少なく とも１０ヌクレオチド▽の１本鎖ＤＮＡの第二プライマーをハイブリダイズさせ ； （５）工程（４）に従つてハイブリダイズさせた第二プライマーセグメントを第 二ＤＮＡポリメラーゼにより触媒される反応で伸長させて、式Ｖ： ５′−（可変サブセグメント）２−（第二サブセグメント）ｔ−（第二サブセグ メント）ｔ−（第一サブセグメント）ｔ−（可変サブセグメント）１ｃ−（プロ モーター）１ｃ−３′ｖ 〔式中（可変サブセグメント）１ｃは（可変サブセグメント）１に相補的な配列 を有するＤＮＡセグメントであり、そして（プロモーター）１ｃは（プロモータ ー）１に相補的な配列を有するＤＮＡセグメントである〕のサブセグメントから 成る第二相補ＤＮＡセグメントをつくり（但し、該第二ＤＮＡポリメラーゼは第 一ＤＮＡポリメラーゼと同一であつても異なつていてもよい）；そして（６）工 程（５）の２本鎖産物を、（プロモーター）１である一万の鎖のプロモーターを 認識する第一バクテリオフアージＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼにより触媒さ れる反応において鋳型として使用して、式ＶＩ：５′−（可変サブセグメント） １ｔ−（第一サブセグメント）ｔｃｒ−（第二サブセグメント）ｔｃｒ−（第三 サブセグメント）ｔｃｒ−（可変サブセグメント）ｔｃｒ−３′ ＶＩ 〔式中（可変サブセグメント）１ｒは（可変サブセグメント）１の配列を有する ＲＮＡセグメントであり、（第一サブセグメント）ｔｅｒは（第一サブセグメン ト）ｔに相補的な配列を有するＲＮＡセグメントであり、（第二サブセグメント ）ｔｃｒは（第二サブセグメント）ｔに相補的な配列を有するＲＮＡセグメント であり、（第三サブセグメント）ｔｃｒは（第三サブセグメント）ｔに相補的な 配列を有するＲＮＡセグメントであり、そして（可変サブセグメント）ｔｅｒは （可変サブセグメント）２に相補的な配列を有するＲＮＡセグメントである〕の 第一ＲＮＡ産物をつくる； ことから成る増幅方法。 ２３．（第一サブセグメント）ｔは長さが少なくとも１０ヌクレオチドであつて 、式ＸＩＩＩ： ３′−（第一サブセグメント）ｔ２−（第一サブセグメント）ｔ１−５′ＸＩＩ Ｉ 〔式中（第一サブセグメント）ｔ２は０またはそれ以上のヌクレオチドを有し、 ０より多い場合は（第一サブセグメント）ｔ１の３′末端に隣接し、そして（第 一サブセグメント）ｔ１は長さが少なくとも１０ヌクレオチドである〕で表され ；（第三サブセグメント）ｔは式ＸＩＶ：３′−（第三サブセグメント）ｔ１− （第三サブセグメント）ｔ２−５′ ＸＩＶ 〔式中（第三サブセグメント）ｔ２は０またはそれ以上のヌクレオチドを有し、 ０より多い場合は（第三サブセグメント）ｔ１の５′末端に瞬接し、そして（第 三サブセグメント）ｔ１は長さが少なくとも１０ヌクレオチドである〕で表され ；（３′−プライマーサブセグメント）１は（第一サブセグメント）ｔ２の全部 と（第一サブセグメント）ｔ１の０またはそれ以上のヌクレオチドから成る標的 セグメントのサブセグメントに相補的な前列を有し；（５′−プライマーサブセ グメント）は（第三サブセグメント）ｔ２の全部と（第三サブセグメント）ｔ１ の０またはそれ以上のヌクレオチドから成るサブセグメントであり；（可変サブ セグメント）２は０ヌクレオチドであり；そして請求項１の工程（１）〜（６） の後に、式ＶＩＩ：５′−（第一サブセグメント）ｔ１ｃｒ−（第二サブセグメ ント）ｔｅｒ−（第三サブセグメント）ｔ１ｃｒ−３′ＶＩＩ 〔式中（第一サブセグメント）ｔ１ｃｒは（第一サブセグメント）ｔ１に相補的 な配列を有するＲＮＡセグメントであり、そして（第三サブセグメント）ｔ１ｃ ｒは（第三サブセグメント）ｔ１に相補的な配列を有するＲＮＡセグメントであ る〕のＲＮＡサブセグメントが下記工程（７）〜（１２）から成る方法によつて さらに増幅される：（７）式ＶＩの第一ＲＮＡ産物に、式ＶＩＩＩ：５′−（プ ロモーター）３−（可変サブセグメント）３−（３′−プライマーサブセグメン ト）３−３′ＶＩＩＩ 〔式中（プロモーター）３はバクテリオフアージＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラー ゼ特異的プロモーターのプラス鎖の配列を有する１本鎖ＤＮＡセグメントであり 、（プロモーター）３の配列は（プロモーター）１の配列と同一であつても異な つていてもよく、（可変サブセグメント）３は（プロモーター）３の３′末端ヌ クレオチドおよび（３−プライマーサブセグメント）３の５′末端ヌクレオチド に隣接する０〜１００ヌクレオチドの１本鎖ＤＮＡセグメントであり、そして（ ３′−プライマーサブセグメント）３は（第三サブセグメント）ｔ１と同じ配列 を有し且つ（可変サブセグメント）２が０ヌクレオチドである場合は（プロモー ター）３の３′末端ヌクレオチドに隣接する１本鎖ＤＮＡセグメントである〕の ３′末端サブセグメントから成る１本鎖ＤＮＡの第三プライマーをハイブリダイ ズさせ； （８）工程（７）に従つてハイブリダイズさせた第三プライマーを、第三ＤＮＡ ポリメラーゼ（逆転写酵素であり、第一および第二ＤＮＡポリメラーゼと同一で あつても異なつていてもよい）により触媒される反応で伸長させて、式ＩＸ： ５′−（プロモーター）３−（可変サブセグメント）３−（第三サブセグメント ）ｔ１−（第二サブセグメント）ｔ−（第一サブセグメント）ｔ１−（第一サブ セグメント）ｔ２−（可変サブセグメント）１ｃ−３′ ＩＸ 〔式中（可変サブセグメント）１ｃは（可変サブセグメント）１に相補的な配列 を有するＤＮＡである〕の３′末端サブセグメントから成る第三相補ＤＮＡセグ メントをつくり；（９）工程（８）の反応で形成された２本鎖核酸を１本鎖とな し； （１０）工程（８）の反応でつくられた第三相補ＤＮＡに、式Ｘ： ５′−（可変サブセグメント）４−（５′−プライマーサブセグメント）４−３ ′ Ｘ １式中（第二サブセグメント）４は０〜１００ヌクレオチドのセグメントであり 、そして（５′−プライマーサブセグメント）４‘は、（可変サブセグメント） ４が０より多いヌクレオチドを有する場合、（可変サブセグメント）４の３′− ヌクレオチドに隣接し且つ式ＸＸ：５′−（可変サブセグメント）１−（第一サ ブセグント）ｔ２ｃ−（第一サブセグメント）ｔ１ｅ−３′ ＸＸ 〔式中（第一サブセグメント）ｔ２ｃは（第一サブセグメント）ｔ２に相補的な 配列を有するＤＮＡセグメントであり、そして（第一サブセグメント）ｔ１ｃは （第一サブセグメント）ｔ１に相補的な配列を有するＤＮＡセグメントである〕 のセグメントの少なくとも１０個のヌクレオチドから成る既知配列のサブセグメ ントである、但し、上記の少なくとも１０個のヌクレオチドのうさ少なくとも１ 個は（第一サブセグメント）ｔ１ｃの５′末端ヌクレオチドに存在するか、また はその５′末端ヌクレオチドから５′側に存在する１の第四プライマーをハイブ リダイズさせ；（１１）工程（１０）に従つてハイブリダイズさせた第四プライ マーを第四ＤＮＡポリメラーゼ（第一、第二および第三ＤＮＡポリメラーゼと同 一であつても異なつてもよい）により触媒される反応で伸長させて、式ＸＩ：５ ′−（第一サブセグメント）ｔ１ｃ−（第二セグメント）ｔｃ−（第三サブセグ メント）ｔ１ｃ−（可変サブセクメント）ｔｃ−（プロモーター）３ｃ−３′ ＸＩ 〔式中（第二サブセグメント）ｔｃは（第二サブセグメント）ｔに相補的な配列 を有するＤＮＡセグメントであり、（第三サブセグメント）ｔ１ｃは（第三サブ セグメント）ｔ１に柏補的な配列を有するＤＮＡセグメントであり、（可変サブ セグメント）３ｃは（可変セグメント）３に相補的な配列を有するＤＮＡセグメ ントであり、そして（プロモーター）３ｃは（プロモーター）３に相補的な配列 を有するＤＮＡセグメントである〕のセグメントから成る第四相補ＤＮＡをつく り；そして （１２）工程（１１）の２本鎖産物を、第二バクテリオフアージＤＮＡ依存性Ｒ ＮＡポリメラーゼ（第一バクテリオフア−ジＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼと 同一であつても異なつていてもよく、（プロモーター）３である一方の鎖のプロ モーターを認識する）により触媒される反応において鋳型として使用して、式Ｘ ＩＩ：５′−（可変サブセグメント）３ｒ−（第三サブセグメント）ｔ１ｒ−（ 第二サブセグメント）ｔｒ−（第一サブセグメント）ｔ１ｒ−Ｘ１２−（可変サ ブセグメント）ｔｃｒ−３′ＸＩＩ 〔式中（可変サブセグメント）３ｒは（可変サブセグメント）３の配列を有する ＲＮＡセグメントであり、（第三サブセグメント）ｔ１ｒに（第三サブセグメン ト）ｔ１の配列を有するＲＮＡセグメントであり、（第二サブセグメント）ｔｒ は（第二サブセグメント）ｔの配列を有するＲＮＡセグメントであり、（第一サ ブセグメント）ｔ１ｒは（第一サブセグメント）ｔ１の配列を有するＲＮＡセグ メントであり、（可変サブセグメント）４ｃｒは（可変サブセグメント）４に相 補的な配列を有するＲＮＡセグメントであり、そしてＸ１２は（第一サブセグメ ント）ｔ１ｃの５′末端から５′　側にある（５′−プライマーサブセグメント ）４のサブセグメントに相補的な配列を有するＲＮＡセグメントである〕の５′ 末端サブセグメントを有する第二ＲＮＡ産物をつくる、請求項２２記載の方法。 ２４．（可変サブセグメント）１および（可変サブセグメント）２はそれぞれ０ 〜６０個のヌクレオチドを有し、（３′−プライマーサブセグメント）１および （５′−プライマーサブセグメント）２はそれぞれ１５〜４５個のヌクレオチド を有し、（第二サブセグメント）ｔは少なくとも３０個のヌクレオチドを有し、 そして標的セグメントは１０００個以下のヌクレオチドを有する、請求項２２記 載の方法。 ２５．標的セグメントはＤＮＡセグメントであり、工程（２）の産物は熱変性に より１本鎖となし、（可変サブセグメント）２は０個のヌクレオチドを有し、第 一および第二ＤＮＡポリメラーゼはそれぞれＥ．ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼ１ のＫｌｃ■ｏ■断片、ＡＭＶ逆転写酵素、クローン化ＭＭＬＶ逆転写酵素、ウシ 胸腺ＤＮＡポリメラーゼアルフア、Ｔｈｅｒｍｕｓ　ａｑｕａｔｉｃｕｓ熱安定 性ＤＮＡポリメラーゼ、および商標名ＳｅｑｕｃｎａｓｅＴＭのクローン化Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼより成る群から選ばれ、バクテリオフアージＤＮＡ依存性Ｒ ＮＡポリメラーゼはＴ７ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼおよびＳ Ｐ６ＲＮＡポリメラーゼより成る群から選ばれる、請求項２３記載の方法。 ２６．第一および第二ＤＮＡポリメラーゼはＥ．ｅｏｌｉＤＮＡポリメラーゼＩ のＫｌｅｍｏｗ断片、ＡＭＶ逆転写酵素、およびクローン化ＭＭＬＶ逆転写酵素 より成る群から選ばれる、請求項２５記載の方法。 ２７．（１）バクテリオフアージＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼはＴ７ＲＮＡ ポリメラーゼであり、（プロモーター）１は【配列があります】であり、そして （可変サブセグメント）１はその５′末端に配列【配列があります】のジヌクレ オチドを有する；または（２）パクテリオフアージＤＮＡ依存柱ＲＮＡポリメラ ーゼはＴ３ＲＮＡポリメラーゼであり、（プロモーター）１は【配列があります 】であり、そして （可変サブセグメント）１はその５′末端に配列【配列があります】のテトラヌ クレオチドを有する；あるいは（３）バクテリオフアージＤＮＡ依存性ＲＮＡポ リメラーゼはＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼであり、（プロモーター）１は【配列が あります】 であり、そして（可変サブセグメント）１はその５′末端に配列【配列がありま す】のヘキサヌクレオチドを有する、請求の２６記載の方法。 ２８．第一プライマーの５′末端は（プロモーター）１の５′−ヌクレオチドで ある、請求項２７記載の方法。 ２９．バクテリオフアージＤＮＡ依存住ＲＮＡポリメラーゼがＴ７またはＴ３Ｒ ＮＡポリメラーゼである場合、（可変サーブセグメント）１は配列【配列があり ます】を有し、 そしてバクテリフア−ジＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼがＳＰ６ＲＮＡポリメ ラーゼである場合、（可変サブセグメント）１は配列【配列があります】を有す る、請 求項２８記載の方法。 ３０．標的セグメントはＲＮＡセグメントであり、工程（２）の産物は熱変性に より１本鎖となし、（可変サブセグメント）２は０個のヌクレオチドを有し、第 一ＤＮＡポリメラーゼはＡＭＶ逆転写酵素およびクローン化ＭＭＬＶ逆転写酵素 より成る群から選ばれ、第二ＤＮＡポリメラーゼはＥ．ｃｏｌｉＤＮＡポリメラ ーゼ１のＫｌｃｎｏｍ断片、ＡＭＶ逆転写酵素、クローン化ＭＭＬＶ逆転写酵素 、ウシ胸腺ＤＮＡポリメラーゼアルフア、Ｔｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｅｕｓ熱 安定性ＤＮＡポリメラーゼ、および商標名Ｓｃｑ■■■ａ■■ＴＭのクローン化 Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼより成る群から選ばれ、そしてバクテリオフアージＤＮ Ａ依存性ＲＮＡポリメラーゼはＴ７ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ＲＮＡポリメラー ゼおよびＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼより成る群から選ばれる、請求項２４記載の 方法。 ３１．第二ＤＮＡポリメラーゼほＥ．ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼ１のＫｌｃｎ ■■断片、ＡＭＶ逆転写酵素、およびクローン化ＭＭＬＶ逆転写酵素より成る群 から選ばれる、請Σ求項３０配載り方法。 ３２．（１）バクテリオフアージＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼはＴ７ＲＮＡ ポリメラーゼであり、（プロモーター）１は【配列があります】であり、 そして（可変サブセグメント）１はその５′末端に配列【配列があります】のジ ヌクレオチドを有する；または（２）パクテリオフアージＤＮＡ依存性ＲＮＡポ リメラーゼはＴ３ＲＮＡポリメラーゼであり、（プロモーター）１は【配列があ ります】であり、そして（可変サブセグメント）１はその５′末端に配列【配列 があります】のテトラヌクレオチドを有する；あるいは（３）バクテリオフアー ジＤＮＡ依存任ＲＮＡポリメラーゼはＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼであり、（プロ モーター）１は【配列があります】で あり、そして（可変サブセグメント）１はその５′末端に配列【配列があります 】のヘキサヌクレオチドを有する、請求項３１記載の方法。 ３３．第一プライマーの５′末端は（プロモーター）１の５′−ヌクレオチドで ある、請求項３２記載の方法。 ３４．第一および第二ＤＮＡポリメラーゼはそれぞれＡＭＶ逆転写酵素およびク ローン化ＭＭＬＶ逆転写酵素から選ばれる、請求項３３記載の方法。 ３５．バクテリオフアージＤＮＡ依存性ポリメラーゼがＴ７またはＴ３ＲＮＡポ リメラーゼである場合、（可変サブセグメント）１は配列【配列があります】を 有し、 バクテリオフア−ジＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼがＳＰ６ＲＮＡポリメラー ゼである場合、（可変サブセグメント）１は配列【配列があります】 を有する、請求項３４ 記載の方法。 ３６．標的セグメントはヒト免疫不全症ウイルス、すなわちＨＩＶ−１ウイルス 、のゲノムのセグメントであり、その場合（１）（３′−プライマーサブセグメ ント）１は配列【配列があります】 を有し、（５′−プライマーＣＣＴＣＴＴＣＴＴＣＴＧＣＴＡＧＡＣＴ−３′お よび（５′−プライマーサブセグメント）２は配列【配列があります】 を有する；まには（２）（３′−プライマ−サブセグメント）１は配列【配列が あります】を有し、そして（５′−プライマーサブセグメント）２は配列 【配列があります】および【配列があります】より成る群から選ば れる、請求項３０、３１、３２、３３、３４まには３５記載の方法。 ３７．（可変サブセグメント）１および（可変サブセグメント）３は０〜６０個 のヌクレオチドを有し、（３′−プライマーサブセグメント）１、（５′−プラ イマーサブセグメント）２、（３′−プライマーサブセグメント）３および（５ ′−プライマ−サブセグメント）４はそれぞれ１５〜４５個のヌクレオチドを有 し、（第二サブセグメント）ｔは少なくとも３０個のヌクレオチドを有し、そし て標的セグメントは１０００個以下のヌクレオチドを有する、請求項２３記載の 方法。 ３８（Ａ）標的セグメントがＤＮＡセグメントである場合、工程（２）の産物は 熱変性により１本鎖となし、また工程（８）の産物も熱変性により１本鎖となし ；第一、第二および第四ＤＭＡポリメラーゼはｃれぞれＥ．ｃｏｌｉＤＮＡポリ メラーゼ１のＫｌｕｎｏｗ断片、ＡＭＶ逆転写酵素、クロー化ＭＭＬＶ逆転写酵 素、ウシ胸腺ＤＮＡポリメラーゼアルフア、Ｔｈｅｒｍｕｓａｑｎａｔｉｃｕｓ 熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、および商標名Ｓａｑ■■■ａ■ＴＭのクローン化 Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼより成る群から選ばれ；第三ＤＮＡポリメラーゼはＡＭ Ｖ逆転写酵素およびクローン化ＭＭＬＶ逆転写醇素から選ばれ；そして第一およ び第二バクテリオフアージＤＮＡ依存在ＲＮＡポリメラーゼはＴ７ＲＮＡ歩リメ ラーゼ、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼおよびＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼより成る群か ら選ばれる；および（Ｂ）標的セグメントがＲＮＡセグメントである場合、工程 （２）の産物および工程（８）の産物はそれぞれ熱変性によク１本貧となし；第 二およひ露四ＤＮＡポリメラーゼはそれぞれＥ．ｅｏｌｉＤＮＡポリメラーゼ１ のＫｌｅｎｏｗ断片、ＡＭＶ逆転写酵素、クローン化ＭＭＬＶ逆転写酵素、ウシ 胸腺ＤＮＡポリメラーゼアルフア、Ｔｋａｒｍｕｓａｑｎａｔｉｃｕｓ無安定性 ＤＮＡポリメラーゼ、およｖ＠商標名Ｓａｑ■■■ａ■■ＴＭのクローン化Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼより成る群から選ばれ；第一および第三ＤＮＡポリメラーゼ はそれぞれＡＭＶ逆転写酵素およびクローン化ＭＭＬＶ逆伝写酵素より成る群か ら選ばれ；そして第一および第二バクテリオフアージＤＮＡ依存在ＲＮＡポリメ ラーゼはそれぞれＴ７ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼ、およびＳ Ｐ６ＲＮＡポリメラーゼより成る群から選ばれる、請求項３７記載の方法。 ３９．標的セグメントはＲＮＡセグメントであり、第二および第四ＤＮＡポリメ ラーゼｆｃれぞれＥ．ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼ１のＫｌａ■ｏ■断片、ＡＭ Ｖ逆転写酵素、およびクローン化ＭＭＬＶ逆転写酵素素より成る群から選ばれ、 そして第一および第三ＤＮＡポリメラーゼはそれぞれＡＭＶ逆転写酵素およびク ローン化ＭＭＬＶ逆転写酵素より成る群から選ばれる、請求項３８記載の方法。 ４０．（３′−プライマーサブセグメント）１に相補的な配列を有する標的セグ メントのサブセグメントは、（５′−プライマーサブセグメント）４に相補的な 配列を有する標的セグメントのサブセグメントから３′方向にあつてそれと重複 せず、（５′−プライマーサブセグメント）２の配列を有する標的セグメントの サブセグメントは（３′−プライマーサブセグメント）３の配列を有する標的セ グメントのサブセグメントと重複しない、請求項３８記載の方法。 ４１．（３′−プライマーサブセグメント）１に相補的な配列を有する第三相補 ＤＮＡのサブセグメントは（５′−プライマーサブセグメント）４に相補的な配 列を有する第三相補ＤＮＡのサブセグメントから５′方向にあつてそれと重複せ ず、そして（５′−プライマーサブセグメント）２の配列を有する標的セグメン トリサブセグメントは（３′−プライマーサブセグメント）３の配列を有する標 的セグメントのサブセグメントと重複しない、請求項４０記載の方法。 ４２．第三相補ＤＮＡにおいて、（可変サブセグメント）１ｃは０より多いヌク レオチドを有し、そして（５′−プライマーサブセグメント）４と第三相補ＤＮ Ａとの２本鎖核酸において、少なくとも（５′−プライマーサブセグメント）４ のサブセグメントが（可変サブセグメント）１ｃにハイブリダイズする、請求項 ４１記載の方法。 ４３．（３′−プライマーサブセグメント）１に相補的な配列を有する標的セグ メントのサブセクメントは、（５′−プライマーサブセグメント）４に相補的な 配列を有する標的セグメントのサブセグメントから３′方向にあつてそれと重複 せず、そして（５′−プライマーサブセグメント）２の配列を有する標的セグメ ントのサブセグメントは（３′−プライマーサブセグメント）３の配列を有する 標的セグメントのサブセグメントと重複しない、請求項４１記載の方法。 ４４．（３′−プライマーサブセグメント）１に相補的な配列を有する第三相補 ＤＮＡのサブセグメントは、（５′−プライマーサブセグメント）４に相補的な 配列を有する第三相補ＤＮＡのサブセグメントから５′方向にあつてそれと重複 せず、そして（５′−プライマーサブセグメント）２の配列を有する標的セグメ ントのサブセグメントは（３′−プライマーサブセグメント）■の配列を有する 標的セグメントのサブセグメントと重複しない、請求項４１記載の方法。 ４５．第三相補ＤＮＡにおいて、（可変サブセグメント）１ｃは０より多いヌク レオチドを有し、そして（５′−プライマーサブセグメント）４と第三相補ＤＮ Ａとの２本鎖核酸において、少なくとも（５′−プライマーサブセグメント）４ のサブセグメントが（可変サブセグメント）１ｃにハイブリダイズする、請求項 ４４記載の方法。 ４６．（１）工程（６）まには工程（１２）においてＴ７ＲＮＡポリメラーゼを 用いる場合、（プロモーター）１（その工程が工程（６）である場合）または（ プロモーター）３（その工程が工程（１２）である場合）は配列【配列がありま す】を有し、そして（可変サブセグメント）１（その工程が工程（６）である場 合）または（可変サブセグメント）３（その工程が工程（１２）である場合）は その５′末端に配列【配列があります】のジヌクレオチドを有する；あるいは（ ２）工程（５）または工程（１２）でＴ３ＲＮＡポリメラーゼを用いる場合、（ プロモーター）１（その工程が工程（６）である場合）または（プロモーター） ３（その工程が工程（１２）である端合）は配列【配列があります】を有し、そ して（可変サブセグメント）１（その工程が工程（６）でる場合）または（可変 サブセグメント）３（その工程が工程（１２）である場合）はその５′末端に配 列【配列があります】のテトラヌクレオチドを有する；あるいは（３）工程（６ ）まには工程（１２）でＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼを用いる場合、（プロモータ ー）１（その工程が工程（６）である場合）または（プロモーター）３（その工 程が工程（１２）である場合）は配列【配列があります】を有し、そ して（可変サブセグメント）１（その工程が工程（６）である場合）または（可 変サブセグメント）３（その工程が工程（１２）である場合）はその５′末端に 配列【配列があります】のヘキサヌクレオチドを有し；第一プライマーの５′末 端は（プロモーター）１の５′−ヌクレオチドであり、そして第三プライマーの ５′末端は（プロモーター）３の５′−ヌクレオチドである、請求項４０、４１ 、４２、４３、４４または４５記載の方法。 ４７．（Ａ）（１）第一バクテリオフアージＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼが Ｔ７またはＴ３ＲＮＡポリメラーゼである場合、（可変サブセグメント）１は配 列【配列があります】を有し、そして第二プライマー（可変サブセグメント）２ は配列【配列があります】 を有する； または（ＩＩ）第一バクテリオフアージＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼがＳＰ ６ＲＮＡポリメラーゼである場合、（可変サブセグメント）１は配列【配列があ ります】を 有し、そして第二プライマー（可変サブセグメント）２は配列【配列があります 】 を有する；（Ｂ）（１） 第二バクテリオフアージＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼがＴ７またはＴ３ＲＮ Ａポリメラーゼである場合、（可変サブセグメント）３は配列【配列があります 】を有 する；（ＩＩ）第二バクテリオフアージＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼがＳＰ ６ＲＮＡポリメラーゼである場合、（可変サブセグメント）３は配列【配列があ ります】を有し、そして第四プライマーは５′末端の４０ヌクレオチドとして【 配列があります】 を有する； そして（Ｃ）工程（１２）の後に、第二ＲＮＡはＱβレプリカーゼにより自己触 媒的に複製される、請求項４０、４１、４２、４３、４４または４５記載の方法 。 ４８．標的セグメントはヒト免疫不全症ワイルス、すなわちＨＩＶ−１ワイルス 、のゲノムのセグメントであり、（１）（３′−プライマーサブセグメント）１ は配列【配列があります】を 有し、（５′−プライマーサブセグメント）２は配列【配列があります】を有し 、（３′プライマーサブセグメント）３は配列【配列があります】 を有し、そして第四プライマーは配列【配列があります】を有する；または（２ ）（３′− プライマーサブセグメント）１は配列【配列があります】を有し、（５′ −プライマーサブセグメント）２は【配列があります】および【配列があります 】 より 成る群から選はれる配列を有し、（３′−プライマーサブセグメント）３は配列 【配列があります】を有し、そして第四プライ マーは配列【配列があります】 を有する、請求項３７、３８、３９、 ４０、４１、４２、４３、４４４または４５記載の方法。 ４９（Ａ）標的セグメントがＤＮＡセグメントである場合、工程（２）の産物は 熱変性により１本鎖となし；第一および第二ＤＮＡポリメラーゼはそれぞれＥ． ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼ１のＫｌｅｎｏｗ断片、ＡＭＶ逆転写酵素、クロー ン化ＭＭＬＶ逆転写酵素、ワシ胸腺ＤＮＡポリメラーゼアルフア、Ｔｈｅｒｍｕ ｓａｑｕａｔｉｃｕｓ熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、および商標名Ｓ■ｑ■■ａ ｓ■ＴＭのクローン化Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼより成る群から選ばれ；そして第 一バクテリオフアージＤＮＡ依存在ＲＮＡポリメラーゼはＴ７ＲＮＡポリメラー ゼ、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼおよびＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼより成る群から選 ばれる；および（Ｂ）標的セグメントがＲＮＡセグメントである場合、工程（２ ）の産物は熱変性により１本鎖となし；第二ＤＮＡポリメラーゼはＥ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼ１のＫｌ■ｎｏ■断片、ＡＭＶ逆転写酵素、クローン化ＭＭ ＬＶ逆転写酵素、ウシ胸腺ＤＮＡポリメラーゼアルフア、Ｔｈｅｒｍｕｓａｑｕ ａｔｉｃｕｓ４熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、および商標名Ｓｅｑｕｅｎａ■■ ＴＭのクローン化Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼより成る群から選ばれ；第一ＤＮＡポ リメラーゼはＡＭＶ逆転写酵素およびクローン化ＭＭＬＶ逆転写酵素より成る群 から選ばれ；そして第一バクテリオフアージＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼは Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼおよびＳＰ６ＲＮＡポリメラ ーゼから選ばれる、請求項２４記載の方法。 ５０．第一および第二ＤＮＡポリメラーゼはＡＭＶ逆転写酵素およびクローン化 ＭＭＬＶ逆転写酵素より成る群から選ばれる、請求項４９記載の方法。 ５１．第一プライマーの５′末端は（プロモーター）１の５′−ヌクレオチドで あり、バクテリオフアージＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラ−ゼがＴ７ＲＮＡポリメ ラーゼである場合、第一プライマーのサブセグメント（プロモーター）１−（可 変サブセグメント）１は配列【配列があります】を有し； バクテリオフアージＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼがＴ３ＲＮＡポリメラーゼ である場合、第一プライマーのサブセグメント（プロモーター）１−（可変サブ セグメント）１は配列【配列があります】 を有し；バクテリオフアージＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼがＳＰ６ＲＮＡポ リメラーゼである場合、第一プライマーのサブセグメント（プロモーター）１− （可変サブセグメント）１は配列【配列があります】を有し；（可変サブセグメ ント）２は配列【配列があります】 を有し；そして工程（６）の後に、第一ＲＮＡはＱβレプリカーゼにより自己触 媒的に複製される、請求項５０記載の方法。