JPH02501857A - 検体中のカルボン酸を検出する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 検体中のカルボン酸を検出する方法 明細書 技術分野 本発明は、一般に、検体中に存在するカルボン酸の検出に関する。さらに詳しく は、宿主の腸内寄生螺出によって生産された遊離脂肪酸（ＦＦＡ　）代謝産物を 検出する触媒的方法に関背景技術 腸内寄生螺出の代謝について研究している研究者は多い。

５ｏｐｒｕｎｏｖ、　Ｆ、Ｆ、らは、　Ａｃｔａ　Ｔｒｏ　ｉｃａ　３８　：　 ４４９−４６０（１９８１）において、　Ａｓｃａｒｉｓ　Ｉｕｍｂｒｉｃｏｉ ｄｅｓの代謝最終生成物の特徴付けを行った。　Ｙ、　Ｌｌｅｎｏも、　Ｊ、　 Ｂｉｏｃｈｅｍ、　４８に）　：　１６１−１６８　（１９６０）において、　 Ａｓｃａｒｉｓ生物の代謝を研究した。これらの研究は。

本発明の発明者らによって実施されたその後の研究と同様に。

腸内寄生畑土が極めて異常な代謝経路を用いており、この結果宿主の腸へ多量の 遊離脂肪酸を排出していることを示した。

従って、腸内寄生螺出は、それらの宿主とは代謝的に非常に有意に異なる。寄生 畑土は非常に嫌気的な環境に存在し一エネルギー源としては、はとんど完全に嫌 気的糖分解に頬っている０本発明の発明者らは、寄生生物が脂質かアミノ酸をエ ネルギーとして用いているという証拠は見出していない。

すなわち、寄生螺出およびそれらの宿主は、第１図に示されているように９重要 な代謝分岐点に達した後で、糖分解能力において異なっている。宿主は、ホスホ エノールピルビン酸（ＰＥＰ）を、トリカルボン酸回路および電子伝達類を経て 、ピルビン酸、二酸化炭素および水に変換するのに対し、寄生螺出は酸素利用度 が限定されているので、これらのうち後者の２つの経路を用いることができない 。その代わり、寄生畑土は、フマル酸、コハク酸、酢酸、およびプロピオン酸を 含む。

多量の遊離脂肪酸を排出する。

これらの代謝産物に加えて、多くの寄生螺出は、酢酸およびプロピオン酸を結合 させて、４個、５個、または６個の炭素原子を有するＦＦＡ生成物を形成する。

生じた炭素鎖は、直鎖状または分枝状であり得る。典型的には、ｎ−酪酸、ｉ− 酪酸、吉草酸、２−メチル酪酸、カプロン酸、２−メチルバレリアン酸、２−メ チルカプロン酸、チグリン酸、および３−メチル酪酸が含まれる。これらの酸の い々つかは、宿主によって吸収され、かつ代謝される。他方、尿および便中に排 出されるものもある。５個または６個の炭素原子を有する直鎖状および分枝状の 遊離脂肪酸は、を椎動物によっては合成されず、寄生畑土が体内に侵入した場合 にのみ、血清、尿。

唾液、または便の試料中に見られる。従って、寄生螺出の体内侵入と密接な相関 がある。これらの５個または６個の炭素原子を有する遊離脂肪酸の排出に基づく 診断検査法を開発することが非常に望ましい。

しかしながら、現在まで、これらの代謝産物の存在に基づき、寄生螺出の体内侵 入を、簡便に現場で検出する方法は。

まだ開発されていない。従って３本発明は、線虫類（例えば。

回虫、鉤虫、および日出）および条虫類（例えば、サナダムシ）を含む主な腸内 寄生畑土による体内侵入を、対応する最終生成物である５個または６個の炭素原 子を有するＦＦＡ代謝産物を検出することによって調べる方法を目的とする。こ の方法はまた。他のカルボン酸を検出するのにも有用である。

ある好ましい実施態様では２本発明の方法は、５個または６個の炭素原子を存す るＦＦＡ代謝産物およびコハク酸に対して特異なものである。該方法は、以下の ような多くの利点を与える：　（１）　５個または６個の炭素原子を有するＦＦ Ａ産物およびコハク酸に対して特異的であること；（２）使用される試薬が物理 的および化学的に安定であること、（３）少量の試料が使用でき、かつ偽陽性が 実質的に排除されるような高い感度および特異性を有すること；そして（４）約 ０　、０５ｍＭと１０ｓ＋Ｍとの間の濃度、すなわち寄生螺出が侵入した補乳動 物の血清２便、尿。

および唾液検体において見られうる濃度で、　ＦＦＡを検出し得ること。

発明の開示 本発明のある局面は、検体中に存在するカルボン酸を検出する方法であって、該 方法は、以下の工程を包含する：（ａ）検体を、カルボン酸と反応性がある金属 塩と接触させて、金属−カルボン酸錯体を形成させること；およびｂ）このよう な錯体の触媒活性をモニターすることによって、形成される金属−カルボン酸錯 体の存在を検出すること。

本発明の他の局面では、上記の方法は、ある腸内寄生螺虫代謝産物の存在を検出 することによって２腸内寄生螺虫の体内侵入を検出するために使用される。検出 される代謝産物は遊離脂肪酸であり、これらの遊離脂肪酸は腸内寄生螺出によっ て生産されるが、を椎動物によっては生産されない。従って、これらの遊離脂肪 酸は９体内侵入がある場合にのみ、血清９便、尿、および唾液検体中に見られる 。これらの遊離脂肪酸には、コハク酸だけでなく、５個または６個の炭素原子を 有する分枝状および非分岐状の酸が含まれる。検体と接触する顕色系は、これら の特定の酸から形成される金属−脂肪酸錯体がその中で単離され、かつ存在しう る他の脂肪酸とは無関係に検出されるように選択された有機溶媒を含む。

本発明のさらに他の局面では、固相診断法が提供される。

該診断法では、（ａ）血清２便、尿、または唾液試料が塗布されている固定支持 体（例えば、フィルターベーパーなど）を用意し、そして（ｂ）該支持体上の検 体を、上記のように金属−カルボン酸錯体が形成されかつ比色定量的に検出され るように。

顕色系と接触させる。金属塩は、固体支持体上かあるいは顕色系の水相中に存在 する。

本発明のさらに他の局面では、カルボン酸を検出するのに使用される顕色系が提 供される。この系は、以下のものを含む：（ａ）カルボン酸と反応性があり、金 属−カルボン酸錯体を形成する金属塩；（ロ）選択された金属−カルボン酸錯体 が実質的に可溶であり、かつ金属塩が実質的に不溶である溶媒を含む有機相；（ Ｃ）色原体；および（ｄ）金属−カルボン酸錯体の存在下で、該色原体を有色化 合物に酸化し得る酸化剤。該顕色系は、さらに、金属塩がその上に存在する固体 支持体、または金属塩が実質的に溶解している水相を含んでいてもよい。色原体 はまた。固体支持体上に存在していてもよく、あるいは有機溶媒中に溶解してい てもよい。

図面の簡単な説明 第１図は、を椎動物の糖代謝と、腸内寄生螺出の糖代謝とを比較するヤローチャ ートである。列挙された寄生畑土代謝産物は、さらに結合して、より長い鎖の遊 離脂肪酸を形成することもある。

本発明を実施するための様式 ここで用いられている「遊離脂肪酸Ｊ　（ＦＦＡ）には、酸または塩の形の、寄 生嬬虫の代謝におけるカルボン酸最終生成物が含まれる。これらの最終生成物の 例を表１に示す。

（以下余白） １：　による−の 基Ａぼ１１筑 酸　回虫　鉤虫　鞭虫　条虫 酢酸　＋　＋＋＋ プロピオン酸　＋　＋＋＋ ｎ−酪酸　＋　＋ ｉ−酪酸　十 吉草酸　＋　＋　＋ ２−メチル酪酸　＋　＋ カプロン酸 ２−メチル吉草酸　＋　＋　＋ ２−メチルカプロン酸　十 チグリン酸　＋　＋ ３−メチル酪酸　＋　＋ 長鎖ＦＰＡ　＋ ある好ましい実施態様では１本発明の方法によって検出されるこれらのＦＦＡの 部分集合には、寄生螺出によって生産されるが、を椎動物によっては生産されず 、従って寄生嬬虫が。

体内に侵入した場合にのみ検体中に存在するような酸が含まれる。

本発明の方法によって検出し得る「カルボン酸」には、ここで使用される金属塩 と金属−酸錯体を形成する。すべてのカルボン酸が含まれる。このように形成さ れた金属−酸錯体は９選択された有機溶媒に実質的に可溶であり２本発明の方法 において触媒活性を有し、そして好ましくは固体支持体上で移動し得る。これら のカルボン酸はまた。（１）水溶液中に実質的に可溶であり、（２）立体的な要 件が金属−酸錯体形成の際に問題とならないような構造を有するのであり、（３ ）顕色系の他の成分と実質的に反応性がなく、そして（４）本発明の方法によっ て検出されるのに少なくとも充分な時間にわたって、化学的および物理的に比較 的安定である。

「顕色系」は、カルボン酸が存在する場合に陽性の検査結果を、そうでなければ 陰性の検査結果を与えるように、検体と反応するようなものである。陽性の検査 結果は、典型的には、肉眼で見える色の変化である。

ｒ色原体」は、ある条件下で、有色物質を生成し得る化合物である。通常、この 化合物は還元状態で無色であり、適切な酸化剤で酸化すると、酸化状態で発色す る。

「実質的に可溶な」金属−カルボン酸錯体は、血清２便。

尿、または唾液検体において典型的に見られる濃度で、それらがここに示された 方法によって検出し得る程度まで溶媒に可溶であるような酸である。有機溶媒中 に「実質的に不溶な」金属塩は、有機相中で比色定量的に検出されるのに充分に は該有機相中に抽出されない。

「実質的に水と混和しない」有機溶媒は、水層からの相分離が充分であり、従っ て金属−カルボン酸錯体を水層から有機相へ抽出することが可能であるようなも のである。

「触媒活性がある」金属塩および金属−カルボン酸錯体は。

酸化剤の存在下で９色原体を酸化し得る。例えば１本発明のある好ましい実施態 様では、金属塩およびそれらから形成された錯体は、クメンヒドロペルオキシド の存在下で、グアヤクの酸化を触媒する。典型的には、触媒活性のある金属−カ ルボン酸錯体は、触媒活性のある金属塩から形成される。

本発明の方法においては１分析すべき検体を、まず試料中に存在するカルボン酸 との反応性を有する金属塩と接触させて、比色反応を触媒する金属−カルボン酸 錯体を形成させる。

従って、これらの錯体は、それらの触媒活性をモニターすることによって検出さ れる。ある好ましい実施態様では、これらの錯体は、酸化剤による色原体の有色 状態への酸化を触媒するそれらの活性によって検出される。

金属塩は、好ましくは、鉄塩、銀塩、および銅塩からなる群から選択される。触 媒活性のある化合物である。ここで使用するのに特に好ましい金属塩は、鉄、銀 、および銅の塩化物、硫酸塩、および硝酸塩である。ただし、これらの金属の有 機塩（例えば、酢酸塩、プロピオン酸塩）も同様に使用し得る。後者の場合、有 機塩は明らかに、検出されるカルボン酸のいずれからも形成されるべきではない し、それらは他のどんな様式でも検出を妨害すべきではない。これらの有機塩は 、顕色系の成分のいずれとも反応性を有すべきではないし。

それらは立体的な問題、溶解性または安定性に関する問題も示すべきではない。

金属塩は、最初から顕色系に存在する。ある実施態様では。

顕色系は金属塩が実質的に溶解している水相を含む。他の実施Ｂ様では、顕色系 は、金属塩がその上に存在する固体支持体を含む、前者の場合、溶液中に存在す る金属塩の好ましい濃度は、約０．５〜約５０ｍＭの範囲である。特に好ましい 濃度は。

約１．０〜約１０ｍＭである。後者の場合、すなわち固体支持体が金属塩で前処 理される場合、検体中に含まれる水は、適切な水相を形成するのに充分である。

溶媒は、ある種の金属−カルボン酸錯体を選択的に溶解するが、他のものは溶解 しないように選ばれる。一般的に、適切な溶媒には、以下のような有機溶媒が含 まれる：（１）選択されたカルボン酸から形成される金属−カルボン酸錯体が実 質的に可溶である；（２）金属塩が実質的に不溶である；（３）水と混和しない ；そして（４）存在する他の試薬（色原体および酸化剤を含む）を実質的に溶解 し得る。

腸内寄生畑虫によって典型的に生成された遊離脂肪酸を表１に示す、顕色系で使 用するために選択された溶媒を変更することによって、遊離脂肪酸の全（別のグ ループを検出し得る。表１から明らかなように、生成されるＦＦＡのある種のボ ターンは２種々の腸内寄生螺出による体内侵入に対応し得る。

従って、ここに述べられた方法は、これらの寄生螺出を区別するのに使用しても よい。

本発明のある好ましい実施態様では、吉草酸、カプロン酸。

チグリン酸、２−メチル酪酸、および３−メチル酪酸を含む。

５個または６個の炭素原子を有する遊離脂肪酸寄生畑土代謝産物が検出される。

コハク酸も同様に検出される。この好ましい応用に対して通切な溶媒には、トル エン、ハロゲン化炭化水素（例えば、　１，１．１−　トリクロロエタン）、ベ ンジルアルコール、イソプロピルベンジルアルコール、ジクロロメタン。

酢酸エチル、酢酸オクチル、クメン、安息香酸ベンジル、約６〜約１１個の炭素 原子を有するアルコール（例えば、ヘキサノール）、およびこれらの混合物が含 まれる。１２個またはそれ以上の炭素原子を有するアルコールは、典型的には、 室温で固体であり、従って本発明の方法における使用からは除外される。

診断方法はまた。検体と２色原体および該色原体を酸化し得る酸化剤とを接触さ せることを包含する。ある好ましい実施態様では９色原体および酸化剤は、共に 顕色溶液の有機相中に存在する。

溶媒中に存在する金属−カルボン酸錯体は、酸化剤による色原体の酸化を触媒す る。色原体は、酸化されると肉眼でもはっきりとした色の変化が見えるように選 択される。適切な色原体は、グアヤク、４−クロロ−１−ナフトール、０−フェ ニレンジアミン、テトラメチルベンジジン、ロイコマラカイトグリーン、２，２ −アジノビス（３−メトラキシジフェニルアミン）、ｏ−ジアニシジン、５−ア ミノサリチル酸、およびこれらの混合物からなる群から選択される。特に好まし い色原体はグアヤクであり、これは還元状態では無色であり。

酸化状態では濃い青色である。必要に応じて９色原体は、使用に先立って９例え ば溶媒抽出によって精製されてもよい。

溶媒中に存在する色原体の好ましい濃度は１選択された溶媒系によって様々であ る。典型的には８色原体の濃度は、約０．０１重量％〜約２．０重量％の範囲で ある。ヘキサノール系については、この範囲内の比較的低い濃度が適切であるが 、他方トリクロロエタン系またはトルエン／ヘキサン混合物については、比較的 高い濃度が好ましい。

適切な酸化剤には、過酸化水素または有機ヒドロペルオキシド（例えば、クメン ヒドロペルオキシド、ｔ−ブチルヒドロペルオキシド、ジイソプロピルベンゼン ヒドロベルオキシド、２，５−ジメチルヘキサンヒドロペルオキシド）、および これらの混合物が含まれる。有機ヒドロベノオキシドが好ましく、特に好ましい 酸化剤は、クメンヒドロペルオキシドである。

また、酸化剤の濃度も１選択された特定の溶媒系によって様々である。典型的に は、酸化剤の濃度は、約０．０２重量％〜約１．０重量％の範囲である。この範 囲内の比較的低い濃度はヘキサノール系またはトルエン／ヘキサノール混合物に 対応しており、比較的高い濃度は純粋なトルエンまたはトリクロロエタン基に対 応している。

カルボン酸について分析される検体は、固体支持体上に用意され、必要に応じて 、顕色に先立って酸化される。次いで。

この検体は、完全な顕色が可能になるのに、すなわち金属−カルボン酸錯体の存 在による色変化の観察が可能になるのに充分な時間にわたって、顕色系と接触さ せられる。一般に。

有色生成物は、約１分以内に見られる。ただし、より低いカルボン酸濃度を確実 に検出、するために、より長いインキュベーション時間が時々用いられる。イン キュベーション時間は。

好ましくは約１分より短いが、所望であれば低濃度のカルボン酸を確実に検出す るために、１５分またはそれ以上延長されてもよい。より短い顕色時間が好まし い。

顕色系のｐＨは様々でよいが、非常に低いｐＨも非常に高いｐＨも望ましくない 。ここに述べられた方法は、約４〜約１１のｐＨ範囲内で効果的であり、好まし いｐＨは約７である。必要に応じて、顕色系は、適切な緩衝剤を用いて、特定の ｐＨ（例えば。

ｐＨ７）に調節してもよい。

本発明の方法の感度は５寄生嬬虫の体内侵入を検出するのに必要な最低の感度よ りも、実質的に高い。実施例で例示するように、　０．０５ａ＋Ｍ程度の遊離脂 肪酸の濃度は、この方法で検出され得るが、１〜１０＋ａＭ程度の濃度を検出す る能力は９体内侵入を検出するのに充分であり得る。

金属塩９色原体、および酸化剤は、すべて固体支持体上に存在していてもよい。

それに代わる実施態様では、これらの試薬の１つまたはそれ以上が溶液中に存在 していてもよく。

金属塩は水溶液中に９色原体または酸化剤あるいはその両方は有機溶媒中に存在 していてもよい。

本発明の第２の局面では、固相診断法が提供される。該診断法では、（ａ）血清 １便、尿、または唾液試料が塗布されているかまたはスポットされている固体支 持体（例えば、フィルターペーパーなど）を用意し、そして（ｂ）該支持体上の 検体を。

上記のように金属−カルボン酸錯体が形成されかつ比色定量的に検出されるよう に、顕色系と接触させる。この診断法を実施するのに必要な試薬は上記のとおり である。すなわち。

以下のものを含む顕色系である：カルボン酸と反応性がある金属塩（この塩は固 体支持体上かあるいは水相中に存在し得る）；色原体；酸化剤；および選択され た金属−カルボン酸錯体が実質的に可溶であり、かつ金属塩が実質的に不溶であ る有機溶媒。色原体および酸化剤の一方または両方は固体支持体上にまたは有機 溶媒中に存在していてもよい。

本発明の他の局面では、カルボン酸（例えば、腸内寄生畑土の体内侵入により生 産された遊離脂肪酸代謝産物）を検出するのに有用な顕色系が提供される。該顕 色系は、金属−カルボン酸錯体を形成するためにカルボン酸と反応性の嘉る金属 塩；選択された金属−脂肪酸錯体が実質的に可溶であり。

かつ金属塩が実質的に不溶である溶媒を含む有機相；色原体：および該色原体を 酸化し得る酸化剤を含む。該顕色系はさらに、金属塩がその上に存在する固体支 持体、あるいは金属塩が実質的に溶解する水相を含んでいてもよい。色原体およ び酸化剤の一方または両方は、固体支持体上に存在するか。

あるいは有機溶媒中に存在してもよい、ある好ましい実施態様では、金属塩は銅 塩であり９色原体はグアヤクであり、酸化剤はクメンヒドロペルオキシドである 。

本発明は、その特定の実施態様に関連して記述されているが、上の記述および以 下の実施例は２本発明を例示するためのものであり２本発明の範囲を限定するも のではない。本発明の範囲は、添付の請求の範囲によって定義される。ここでは 明白には示されていないが９本発明が属する当該技術分野の当業者には明白な他 の局面、利点、および変形例もまた同様に９本発明の範囲内にあると考えられる 。

１験：ここで用いられるすべての化学物質は、　Ｓｉｇｎ＋ａ　Ｃｈｅｍｉｃａ ｌＣｏ、、　Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、Ｊ、Ｔ、　Ｂａｋｅ ｒ　Ｃｏ、、　Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔａｎｄ　Ｌａｎｃａｓｔｅｒ　５ｙｎ ｔｈｅｓｉｓ、　Ｌｔｄ、から市販されているものである。

（以下余白） 亥１１引１ ″　２　の　円　の （１）水混和性、（２）グアヤク溶解度および（３）発色に関して、様々な溶媒 をそれらの有用性についてテストした。水０．５　ｄを各溶媒０．５　ｄと混合 し、そして、相分離が起こるか否かに注目することによって、水混和性を評価し た。相分離が観察された場合には９表２に「−」が示され、そうでない場合には 。

「＋」が示されている。

顕色剤を下記のように調製した。エタノール中の０．３７５重量％グアヤク溶液 ０．２００　ｍを、清浄な各試験管に添加し、エタノールを蒸発させた。表２に 示されているような所定の溶媒４ｄを添加し、グアヤクを可能な程度まで溶解さ せた。各溶媒中のグアヤクの溶解度を視覚的に観察し、これを表２に示す。本質 的に、沈澱していたグアヤクのすべてを溶解する溶媒は、はっきりした黄褐色を 生じた（　＋　＋　＋　）。中程度の量のグアヤクを溶解した溶媒は中程度の黄 色を生じた（＋十）。

少量のみのグアヤクを溶解した溶媒は薄い黄色を生じた（＋）。

グアヤクを実質的にまったく溶解しない溶媒は無色のままであった（＝）。

次に、８０％のクメンヒドロペルオキシド４８μ２を、容管に添加しく水だけの サンプルが入っているものを除＜）、テストのための完全な顕色剤（溶媒２色原 体、酸化剤）を作成した。クメンヒドロペルオキシドは本質的には水に不溶であ るので、その代わりとして過酸化水素が、水だけのサンプル中の酸化剤として使 用された。しかしながらグアヤクは、十分な発色を生じるには水への溶解性が不 十分であった。

マイクロタイタープレートウェルへ、テストサンプル５０μ！。

１ｍＭの硫酸ｆ１３０μ！および顕色剤１００μｌを添加して９発色評価テスト を実施した。脂肪酸テストサンプルは、蒸溜水中１００　ｍＭであり、これを希 水酸化ナトリウム溶液で最終的にｐＨ７，０に調整した。色の強度を下記のよう に評価した。０＝青色かまった（認められない；１＝青色がほとんど認められな い；２＝はっきりと、かつ確かにわずかな青色が認められる；３〜９＝中程度の 変色；および１０＝最大限の色が生じる。結果を表２に挙げる。

（以下余白） 亥１１影 ＦＦＡ−ａのｒ 実施例１の最初のスクリーニングに基づいて、その後のテストに４つの溶媒系を 選択した：トルエン、　１，１．１−　トリクロロエタン（”ＴＣＥ”　）　、 ｎ−ヘキサノールおよび９０　：　１０ｖ／ｖトル工ン／ヘキサノール溶媒混合 物。これらの溶媒について。

様々の鎖長のＦＦＡから形成された銅イオン−脂肪酸錯体を選択的に抽出するそ れらの能力についてのテストを行なった。

１００μ！の硫酸銅溶液（８００ｍＭ）および１００μ２の脂肪酸溶液（１００ ｍＭ、水酸化ナトリウムでｐＨ７に調整された）、あるいは１００μｌの塩化ナ トリウム（１００ｍＭ）を清浄な試験管に添加した。溶媒５００μｌを添加し、 試薬混合物を３０秒間ポルテックスで撹拌した。相を分離させ、１００μｌの有 機相を。

ヘキサノール中にクメンヒドロペルオキシド１重量％およびグアヤク０．５５重 量％を含有する。顕色剤１００μ２に添加した。

発色を、実施例１のようにモニターした。結果を表３に示す。

（以下余白） ヘキサノールは１〜１２０間の鎖長の、テストされたＦＦＡのすべてを抽出した 。トルエンおよびＴＣＥは、５〜１６個の炭素原子の鎖長を有するＦＦＡでのみ 強い色を生じた。トルエン／ヘキサノール混合物は、５〜１６の鎖長を有するＦ ＦＡのすべてを抽出した。従って２表３のデータは、溶媒を変えることによって 、　ＦＦＡを選択的に抽出することができることを示す。

災施■主 の　イオンの クメンヒドロペルオキシドによってグアヤクの酸化を触媒する能力について、様 々な金属イオンをテストした。０．００１Ｍおよび１．０Ｍの濃度の水溶液中の 金属塩が提供された。これらの溶液を、水酸化ナトリウムでｐＨ７，０に調整し た１００　ｍＭ酪酸２０μ！と、ヘキサノール中のグアヤク０．５重量％および クメンヒドロペルオキシド５重量％を含む２顕色剤１００μｌとともに混合し１ 色の形成を上記の実施例のようにモニターした。結果を表４に示す。

（以下余白） 衷↓ １〜２分後の色強度 金属塩濃度 金属　試験試料　０．００１Ｍ　１．、ＯＦ２ここかられかるように、銀、銅お よび鉄の塩のみが、テストされた濃度で適切な触媒であることがわかった。

次に、これらの塩の基質特異性を、酪酸およびコハク酸溶液で評価した。金属塩 溶液（０，００１ＭのＣｕ５Ｏ，または１．０ＭのＡｇＮＯｓ　）　２０μ！お よび１００　ｍＭ酪酸またはコハク酸（水酸化ナトリウムでｐＨ７に調整した） １００μ！を、清浄な試験管に添加した。ヘキサノール中のグアヤク０．５重量 ％およびクメンヒドロペルオキシド１重量％を含む、顕色剤１００μ！を添加し 、５分間インキュベートした後に１色の形成をモニターした。

ｌ１ ５分後の色強度 試験イオン ０．１を酪酸　１０　８ ０．１ｈコハク酸　８０ 表５に要約した結果は、金属塩の選択が、鑑別診断において、すなわち様々な遊 離脂肪酸と金属塩（ここでは、　ＡｇＮ０ｓ）との反応の時に９種々の色強度が 生じる場合に有用であり得ることを示す。

実ｌ困土 成立１斐工 色、　ヒ　および　− 色原体および酸化剤についての適切な濃度範囲が２次の２つの時間間隔について 決定された。すなわち（１）２分間のインキュベーション時間および（２）１０ 分間のインキュベーション時間、これらのテストの各々における色原体は、グア ヤクであり、その濃度を表６ａ〜６ｈに示されているように、　０．００１重量 ％〜２．０重量％まで変化させた。酸化剤は、クメンヒドロペルオキシドであり 、同様にその濃度は、示された様々な濃度であった。下記のプロトコルに従って 最適な濃度範囲を評価した。水酸化ナトリウムでｐＨ７，０に調整した。　２． ０　ｍＭのｎ−カプロン酸（またはブランクの場合は、水）１００μ！。

１．０　ｍＭの硫酸銅６０μ！および示された濃度のグアヤクおよびクメンヒド ロペルオキシドを含む顕色剤１００μ２を、清浄な試験管に添加し、１０秒間ポ ルテックスにより撹拌した。上記実施例のように色の変化をモニターした。結果 を表６ａ〜６ｈにまとめた。

（以下余白） ｌｌ１ 溶媒＝ヘキサノール ２分後の色強度 １旦上 ス玉」工 糞ｌ圭 鷹」Ｌ免 ｌ旦１ 溶媒＝トルエン １０分後の色強度 表１」− 溶媒＝９０％９０％トルエン：１キサノール１０分後の色強度 盗エエ 溶媒＝ｉ、ｔ、ｉ−トリクロロエタン １０分後の色強度 ついで、最適な金属イオン濃度を決定するために、類似のテストを実施した。水 酸化ナトリウムでｐｎ７．ｏに調整し、２．０ＩＩＩＭのｎ−カプロン酸（また はブランクの場合は、水）１００μ！。

表７ａ〜７ｄに示された様々な濃度の硫酸銅６０μ！、およびグアヤクとクメン ヒドロペルオキシドを含む顕色剤２００μ！を清浄な試験管に添加した。混合物 を１０秒間ポルテックスにより撹拌した。２分および１５分のインキュベーショ ン時間の後、上記実施例のように色の変化をモニターした。結果を表７ａ〜７ｄ にまとめた。

（以下余白） 実ｌ１１ｉ ｍｌ凶ｌ【霞 この方法におけるｐＨの影響を下記のように評価した。　５００１Ｍのｎ−カプ ロン酸（示されたｐＨで）１００μ！、および１ｍＭの硫酸銅６０μｌを清浄な 試験管に添加した。グアヤク、クメンヒドロペルオキシドおよび溶媒を９表９に 示された濃度で含む顕色剤１００μｌを添加した。試薬混合物を１０秒間ポルテ ックスで撹拌し、上記実施例のように色の形成をモニターした。

結果を表９に要約する。

表９ ２分後の色強度 水相のｐｎ 試薬　１　２　３　４　５　６　７　８　９　１０　１１　１２上記結果から、 この方法は、血清、尿１便または唾液サンプルを用いて、予期された４、５〜７ ．４の生理学的ｐＨ範囲を含むかなり広いｐＨ領域にわたって、効果的であるこ とが結論として述べられる。非常に低いｐＨ（１〜３）あるいは非常に高いｐｕ 　（１／２１１）でのみ、試薬の性能の悪化が見られた。従って系の緩衝化が望 ましいかもしれないが、それはこの方法における上記ｐＨ感受性によって拘束さ れるものではない。

裏施拠旦 カプロン　に・する感ス カプロン酸は、　Ａｓｃａｒｉｓ体内侵入において診断上の重要性を有すること が証明されたＦＦＡの１つであるので、感受性予備テストために選ばれた。Ｍｏ ｎｔｅｏｌｉｖａ、　Ｍら、　Ｒｅｖ、　ＩｂｅｒｉｃａＰａｒａｓｉｔ、４１ 巻（３）、　３３３〜３４０頁（１９８１年）　：　５ｏｐｒｕｎｏｖ　ら。

前出、水酸化ナトリウムでｐＨ７，０に調整された。　０．０５ｉｏＭ〜１００ ＋ａＭの様々な濃度のカプロン酸（または、ブランクの場合には水）を、１ｍＭ の硫酸銅６０μ！、および示された様々な溶媒中のグアヤク０．５重量（χ）お よびクメンヒドロペルオキシド１．０重量％を含む顕色剤１００μｌと混合した 。試薬混合物を５秒間ポルテックスにより撹拌し、２分後および１０分後に色の 形成をモニターした。様々な溶媒系において検出しうるカプロン酸塩の最小濃度 を表１０に示す。

（以下余白） 糞則 カプロン−ａの　口　゛＠ｌＩＭ 溶媒　２分後　１０分後 玉記データにより、５および６個の炭素原子を有するＦＦＡ（これは、ヒトにお けるＡｓｃａｒｉｓ体内侵入の診断を可能にする）の尿中の各濃度が、このテス トによって容易に検出されることが示される。例えば、　５ｏｐｒｕｎｏｖａら のハ憇五ノ肛と」坦１１４巻、１１〜１７頁（１９７３年）およびＫｈａｒｎａ ｋｏｖおよび５ｏｐｒｕｎｏｖａ。

Ｗｅｄ、　Ｐ　ｒａｚｉｔｏｌ、　Ｐａｒａｚｉｔ、　Ｂｏｌｅｚｎｉ４５巻、 　４５０〜４５２頁（１９７６年）を参照されたい。

裏奮付工 益１葺　のさ゛なる　六 この実施例においては、様々な遊離脂肪酸についてのこの方法の特異性を評価し た。表１１ａおよびｌｌｂに示された濃度におけるサンプル溶液５０ｕＥ、１＋ ＋Ｍの硫酸銅２０μ！、硫酸銅２０μ！、および示された濃度のグアヤクおよび クメンヒドロペルオキシドを含む顕色剤１００μ２をマイクロタイタープレート ウェルに添加した。ある実験においては、プレートを２分間撹拌しく表１１ａ） 、そして第２の実験においては、１５分間撹拌した（表１１ｂ）。色の形成を上 記実施例において行なったようにモニターした。結果を表１１ａおよびｌｌｂに 示す。

これらの結果により証明されるように、他の遊離脂肪酸または代謝産物とは無関 係に２選択された遊離脂肪酸（溶液状であり得る）の濃度を決定するように、溶 媒を選択することが明らかに可能である。

この実施例においては、２−メチル吉草酸を加えたイヌの糞を、下記のように分 析した。濾紙に、　２０ｍＭの硫酸銅２０μ２をスポットし、乾燥した。蒸溜水 （“ＤＷ″）あるいは４０ｍＭの２−メチル吉草酸（“２ＭＶ”）を用いて、１ ：１の重量比で処理された。はぼ３０μｌの糞を、乾燥濾紙上にスポットし１０ 分間放置した。次に、溶媒（９０／１０　ν／ν　トルエン：ヘキサノール）３ ０μｆを、糞をスポットしたのと反対側の面の該サンプルの中央部にスポットを することによって、サンプルを溶離した。９０／１０ν／Ｖ　）ルエン／ヘキサ ノール混合物に、グアヤク２重量％およびクメンヒドロペルオキシド１％を含む 顕色剤（約３００μ／りを添加し、５分間インキュベートした後に。

色の形成をモニターした。結果を表１２に示す。ここでわかるように、この方法 は、「偽陽性」の発生を最小限にし、遊離脂肪酸を検出するのに非常に効果的で ある。

（以下余白） 表１２ 実画１１亀 ２の　２　についての−スト ２−メチル吉草酸を加えた唾液、上記実施例の方法に実質的に従って分析した。

濾紙に２０ｍＭ硫酸銅２０μｌをスポットし。

乾燥した。蒸留水あるいは２０ｍＭの２−メチル吉草酸が１：１の重量比で添加 された。３０μｌの唾液を加えた。サンプルを１０分間放置しておき、その後、 溶媒（９０／１０　ｖ／ｖ　）ルエンーヘキサノール）３０μｌを、サンプルを スポットしたのと同じ側の該サンプルの中央部にスポットすることによって、サ ンプルを溶離した。顕色剤（９０／１０　ｖ／ｖ　）ルエンーヘキサノール中に 、グアヤク２重量％およびクメンヒドロペルオキシド１重量％を含む）を添加し 、５分間のインキュベートした後に２色の形成を観察した。結果を表１３に示す 。上記実施例のようにこの方法は、陽性のテスト結果を与えることがわかった。

ｕ 種々のカルボン酸（表１４参照）の１００　ｍＭ水溶液を、水酸化ナトリウムで ｐＨ７に調整した。濾紙に、５．１０．２０および５０１の硫酸銅水溶液２０μ ２をスポットし、乾燥した。各酸溶液２０μ！を、一連の硫酸銅のスポットに添 加し、湿っている間に９０／１０　ｖ／ｖ　）ルエン／ヘキサノールで溶離した 。酸／銅錯体の移動を、顕色剤（９０／１０　ｖ／ｖ　トルエン／ヘキサノール 中に、グアヤク２重量％およびクメンヒドロペルオキシド１重量％を含む）で検 出した。

表■ 痘塁■体隻弦度 −声　ｍＭ：５　１０　２０　５０ 衆 ２−メチル吉草酸　７　８　８　８ 安息香酸　４　５　５　６ サリチル酸　１　４　５　６ アセチルサリチル酸　４　５　７　８ イソニコチン酸　０　１　１　１ Ｌ−ビＵグルタミン　酸　００　１　１Ｎ−７セチルーし一■イシシ　３　５　 ７　８（蒸留水＞　ｏｏ　ｏ　。

揮発性脂肪酸の検出のために典型的に使用される硫酸銅の比較的低い濃度下にお いて、テスト系は２−メチル吉草酸に最も感受性が高かった。他の酸については 、様々な程度の感受性が観察された。これらのデータは、上記示されたデータと 共に、このテストが、揮発性脂肪酸以外の特定のカルボン酸を検出するために使 用されうることを示す。

（以下余白） 本ス本ヱノールピル５゛ン０Ｌ ニュ１ｂ亥イと、χρ七馴辷　オキシｔｔフか酸国際調査報告 １ｓ１１−串−＾ｍｍｐｃ’ｒ７ｏｓａフ１０３３４Ｂ

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. １．試料中のカルボン酸の検出法であって，該方法は次の工程を包含する： （ａ）試料と，カルボン酸と反応し得る金属塩とを接触させて，金属−カルボン 酸錯体を形成すること；および（ｂ）そのような錯体の触媒活性をモニターする ことによって，形成される金属−カルボン酸錯体の存在を検出すること。
2. ２．前記金属塩が，鉄，根および銅塩でなる群から選択される，請求項１に記載 の方法。
3. ３．検出された前記金属−カルボン酸錯体が，腸内寄生蠕虫体内侵入を示す遊離 脂肪酸により形成される金属−脂肪酸錯体である，請求項２に記載の方法。
4. ４．試料中の遊離脂肪酸を検出する方法であって，該方法は次の工程を包含する ： （ａ）血清，便，尿または唾液試料が付与された固体支持体を準備すること；お よび （ｂ）試料と，次の（ａ）〜（ｄ）を含有する顕色系とを接触させること：（ａ ）カルボン酸と反応して金属−カルボン酸錯体を形成し得る金属塩；（ｂ）選択 された金属−カルボン酸錯体が実質的に可溶であり，かつ該金属塩が実質的に不 溶である溶媒を含む有機相；（Ｃ）色原体；および（ｄ）金属−カルボン酸錯体 の存在下に，色原体を有色化合物に酸化しうる酸化剤。
5. ５．前記金属塩が，鉄，銀および銅塩でなる群から選択される，請求項４に記載 の方法。
6. ６．前記金属塩が銅塩であり，前記色原体がグアヤクであり，そして，前記酸化 剤がクメンヒドロベルオキシドである，請求項４に記載の方法。
7. ７．カルボン酸を検出するために用いられる顕色系であって，該顕色剤は，次の （ａ）〜（ｄ）を含有する：（ａ）カルボン酸と反応し，金属−カルボン酸錯体 を形成し得る金属塩； （ｂ）選択された金属−カルボン酸錯体が実質的に可溶であり，かつ該金属塩が 実質的に不溶である溶媒を含む有機相；（ｃ）色原体；および （ｄ）金属−カルボン酸錯体の存在下に，色原体を有色化合物に酸化しうる酸化 剤。
8. ８．前記金属塩が，鉄，銀および銅塩でなる群から選択される，請求項７に記載 の顕色系。
9. ９．前記カルボン酸が，腸内寄生蠕虫体内侵入を示す遊離脂肪酸である，請求項 ７に記載の発現系。
10. １０．前記金属塩が銅塩であり，前記色原体がグアヤクであり，そして前記酸化 剤がクメンヒドロベルオキシドである，請求項７に記載の顕色系。