JPH02504144A

JPH02504144A - ヌクレオシド誘導体

Info

Publication number: JPH02504144A
Application number: JP63505657A
Authority: JP
Inventors: ハララムビディス，ジム
Original assignee: Howard Florey Institute of Experimental Physiology and Medicine
Current assignee: Florey Institute of Neuroscience and Mental Health
Priority date: 1987-06-24
Filing date: 1988-06-24
Publication date: 1990-11-29
Anticipated expiration: 2013-11-25
Also published as: WO1988010264A1; CA1340032C; US5552540A; ATE113059T1; DE3851889D1; EP0366685A4; EP0366685B1; JP2828642B2; EP0366685A1; AU1990988A; AU598946B2; DE3851889T2; NZ225176A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】ヌクレオシド誘導体本発明はヌクレオシド誘導体、その合成方法、およびそのようなヌクレオシド誘導体を利用したポリヌクレオチドの合成および配列決定方法に関するものである。［註二本明細書に引用した参考文献は本明細書末尾にまとめて収録しｔ；〕同定可能なマーカーで標識したＤＮＡ、合成オリゴヌクレオチドおよびＲＮＡは分子生物学で広い応用の途がある。１！ＰおよびｓｓＳのような放射性標識がほぼ独占的に分子生物学的手段に使用されてきた。しかし放射性標識はその半減期が比較的短く（例えばＰの半減期は１４日）、またその崩壊の間に放射される電離放射線はタンパク質、脂質、核酸のような細胞構成要素を損傷しかねず、それによって細胞死を招き、あるいは細胞を悪性状態へ転換することがあるので不都合である。ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドをけい先口、コロイド質化合物および酵素のような非放射性マーカーで標識することが提案された。提案された一方法（１）として、５′末端に反応性アミン基を含んだオリゴヌクレオチドが作成された。ついでけい先口またはその他の非放射性マーカーをそのアミノ基に結合させ、検出可能なマーカーを挿入したオリゴヌクレオチドが作成された。そのような方法では５′末端を介してオリゴヌクレオチド鎖へただ１個の検出可能なマーカーしか導入できない不都合がある。まｊ；別の提案３２１〜ｆｌ）ではＣ−５置換基の遠位末端にアミン基を有するＣ−５置換デオキシウリジン化合物が作成された。そのような化合物は検出可能なマーカーで標識し、これをオリゴヌクレオチド鎖へ挿入することができるのでオリゴヌクレオチドを多数の部位で標識することが可能である。これらの化合物の製造は難しく、シかも極めて毒性のある水銀誘導体を使用する反応を含んでいる。しｊ：がって非同位体係識をしたポリヌクレオシドの製造に使用でき、しかも簡単で安全に作成し得るヌクレオシド誘導体の必要性が存在する。本発明は、式（１）：［式中、ＹはＨまたはＯＨ，または保護基を有するヒドロキシ基、ＸはＨ１ホスホネート基、または式：（ここで、ＲＩおよびＲ２は同一または異なってもよく、分枝しまたは分枝していないアルキルおよび置換アルキルから選ばれ、Ｑはリン酸保護基である）で示されるホスホアミダイト基、２はＨ１ホスフェートまたはトリホスフェート基、まにはヒドロキシ保護基、Ｘ″は分校しまたは分校していない０１〜Ｉ、アルキル基、Ｒはアミノ保護基またはけい先口またはその他の非放射性の検出可能なマーカー、またはＹ’ＮＨＡ基（ここで、Ｙ″は分校しまたは分枝していないアルキル（Ｃ，〜４゜）カルボニル基、Ａはアミン保護基またはけい先口またはその他の非放射性の検出可能なマーカー）である〕で示されるヌクレオシド誘導体を提供する。以下、議論を進める便宜上、本明細書で使用するＣ−５置換ヌクレオシドの番号表示方法を第１図に示す（ここに示した化合物は本発明の好ましい化合物の一つを図示したものである）。本発明では非放射性標識と結合し、またはこれと結合可能な第１級脂肪族アミノ基を有するＣ−５置換ウリジンまたはデオキシウリジンを、アミノアルキンと５ −ヨードウリジンまたは５−ヨードデオキシウリジン誘導体との間にＣ−Ｃ結合を作成するパラジウム触媒反応を用い、膿和な糸件下に容易に作成できることが判明した。Ｒ１およびＲ２はそれぞれ１〜３０個の炭素原子を含み得る。好ましくはＲ′およびＲ２はいずれもイソプロピル基である。Ｒ’８よび／まｔ；はＲ２が置換アルキルである場合、置換基が化合物の所望の特性を妨げず、またはその他有害な効果を示さない限り、置換基の性質は重要ではない。例えば置換基はフェニル、ベンジルおよびアシル基から選ぶことができる。Ｑはメチル、フェニル、置換フェニル、ベンジルまたはシアンエチル基のような任意のリン酸保護基である。例えばフェニルであればこれをハロゲン、ヒドロキシまたはニトロ基で置換し得る。グリーン（各）によって報告されたような任意のヒドロキシ保護基が使用できる。例えばヒドロキシ保護基としては、置換または未置換のアルカノイル（例えばホルミル、アセチル、プロピオニル、プチリノ呟イソブチリノ呟バレリル、ブロモアセチル、ジクロロアセチル、トリフルオロアセチル）、置換または未置換のアロイル（例えばベンゾイル、トルオイル、キシロイル、ニトロベンゾイル、ブロモベンゾイル、サリチロイル）、アリールアルキル（例えばベンジル）、メチル、メトキシ、メチルチオメチル、２−メトキシエトキシメチル、ビス（２−クロロエトキシ）メチル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロチオピラニル、４ −メトキシテトラヒドロピラニル、４−メトキシテトラヒドロチオピラニル、テトラヒドロ７ラニル、テトラヒドロチオフラニル、１−エトキシエチル、ｌ−メチル−１−メトキシエチル、２−（フェニルセレニル）エチル、ｔ−ブチル、アリル、ベンジル、０−ニトロベンジル、トリフェニルメチル、ａ−す７チルージフエニルメチル、ｐ−メトキシフェニルジフェニルメチル、９−（９−フェニル −１０−オキソ）アントリル［トリチロン］、ジメトキシトリチルまたはピキシル、トリメチルシリル、イソプロビルジメチルシリノ呟ｔ−ブチルジメチルシリル、

【−ブチルジフェニルシリル、トリメチルシリノ呟　トリイソプロピルシリルのようなアシルから選ぶことができる。グリーン（１）によって報告されたような任意のアミノ保護基が使用できる。例えばアミノ保護基としては、例えばアシル、特に有機アシル、例えば置換まｊ：は未置換の脂肪族炭化水素−オキシカルボニノ呟例えばアルコキシカルボニル（例えばメトキシカルボニル、エトキシカルボニル、プロポキシカルボニル、ブトキシカルボニル、ｔ−ブトキシカルボニル、５−ペントキシカルボニル）、ハロゲン化アルコキシカルボニル（例えばクロロメトキシカルボニル、トリブロモエトキシカルボニル、トリクロロエトキシカルボニル）、アルカン−またはアレン−スルホニルアルコキシカルボニル（例え１ｆ２−（メシル）エトキシカルボニル、２−（ｐ−５ルエンスルオニル）エトキシカルボニル）、アルキルチオ−またはアリールチオアルコキシカルボニル（例えば２−（エチルチオ）エトキシカルボニル、２−（ｐ−トリルチオ）エトキシカルボニル）、ハロゲン化（低級）アルカノイルのような置換または未置換のアルカノイル（例えばホルミル、トリフルオロアセチル）、単環または縮合環脂環式オキシカルボニル（例えばシクロヘキシルオキシカルボニル、アダマンチルオキシカルボニル、インボルニルオキシカルボニル）、置換または未置換のアルケニルオキシカルボニル（例えばアリルオキシカルボニル）、置換または未置換のアルキニルオキシカルボニル（例えば１．１−ジメチルプロパルギルオキシカルボニル）、置換または未置換のアリールオキシカルボニル（例えばフェノキシカルボニル、ｐ−メチルフェノキシカルボニル）、置換または未置換のアラルキルオキシカルボニル（例えばベンジルオキシカルボニル、ｐ− ニトロベンジルオキシカルボニル、ｐ−７二二ルアゾベンジルオキシカルポニル、ｐ−（ｐ−メトキシフェニルアゾ）ベンジルオキシカルボニル、ｐ−クロロベンジルオキシカルボニル、ｐ−ブロモベンジルオキシカルボニル、σ−ナフチルメトキシカルボニル、ｐ−ビフェニルイソプロボキシ力ルポニル、フルオレニルメトキシカルボニル）、置換または未置換のアレンスルホニル（例えばベンゼンスルホニル、ｐ−トルエンスルホニル）、置換または未置換のジアルキルホスホリル（例えばジメチルホスホリル）、置換または未置換のジアラルキルホスホリル（例えばｏ、Ｏ−ジベンジルホスホリル）、置換または未置換のアリールオキジアルカノイル（例えばフェノキシアセチル、ｐ−クロロフェノキシアセチル、２−ニトロフェノキシアセチル、２−メチル− ２−（２−ニトロフェノキシ）プロピオニル）、フェニル、トリルのような置換または未置換のアリール、ベンジル、ジフェニルメチノ呟　トリチルまｔ；はニトロベンジルのような置換または未置換のアラルキルから選ぶことができる。「けい先口」の語は、それ自身がけい光を発し得る部分、またはけい光を他の部分へ付与し得る部分をいう。また本明細書で用いるように、「けい先口」の語はけい光を抑制する１またはそれ以上の基を含み、ｔ：だし一度それらの基が除かれるとけい光体となり得るけい元口前駆体をも表わす（例えはジインブチリル− ６−カルボキシフルオレセインはけい光を発しない。アンモニア処理によってジイソブチリル基を除くとけい光体６−カルボキシフルオレセインが生成する）６けい先口またはけい元口前駆体を例示すれば、フルオレセイン−５−インチオシアネート−アシル（例えばジイソブチリノ呟アセチルまたはジピバロイル）−５ −８よび／または６−カルポキシフルオレセインペンタフルオロフニニルエステルール−５−および／または６−カルボニル−フルオレセイン）−アミノヘキサン酸ペンタフルオロフェニルエステル［テキサス・レッド（Ｔｅｘａｓ　Ｒｅｄ）、モレキュラー・ブローブズ・インコーホレーテッド（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ，　Ｉｎｃ．　）の商標］、テトラメチルローダミン−５（および６）−インチオシアネート（以下、ローダミンという）、エオシン−５−インチオシアネート、エリスロシン−５−インチオシアネート、４−クロロ−７−ニドロベンズー２−オキサ−１．３−ジアゾール、°４ーフルオロー７ー二トロベンズー２−オキサ−１。３−ジアゾール、３−（７−ニドロベンズー２−オキサ−］、］３ーシアソールー４ーイルメチルアミノプロピオニトリル、６−（７−二トロベンズー２−オキサ−Ｉ，３−ジアゾール−４−イル）アミノヘキサン酸、スクシンイミジル−１２−（Ｎ−メチル−Ｎ−（７−ニドロベンズー２−オキサ−１．３−ジアゾール −４−イル）−アミノドデカノユート、７−ジニチルアミノー３−（４’−イソチオシアネートフェニル）−４−メチルクマリン［ＣＦ３，？ーヒドロキシクマリンー４−酢酸、７−シメチルアミノクマリンー４−酢酸、スクシンイミジル− ７−シメチルアミノクマリンー４−アセテート、７−メドキシクマリンー４−酢酸、４−アセトアミド−４″−インチオシアネートスチルベン−２．２′−ジスルホン酸［ＳＴＴＳ］、９−クロロアクリジン、スクシンイミジル−３−（９− 力ルバゾール）−プロピオネート、スクシンイミジル−１−ピレンブチレート、スクシンイミジル−１−ビレンノナノエート、ｐ−ニトロフェニル−１−ピレンブチレート、９−アントラセンプロピオン酸、スクシンイミジルアントラセン− ９−プロピオネート、２−アントラセンスルホニルクロリド等が挙げられる。けい先口またはけい先回源物質は、好ましくは（ｉ）　　商業的に使用される高圧水銀ランプの強い輝線の一本と一致する励起極大、（ｉｌ）　　スペクトル可視部における発光極大の分光学的特性を有する。非放射性の検出可能なマーカーは、ｌｉ微鏡下で検出できる電子集密物質のようなその物理的な特性によって直接検出し得るもの、または検出可能なマーカーと適当な基質との反応により、色のような検出可能な信号を発し得るような化学的まｔ；は生物化学的な特性によって間接的に検出し得るものからなる。直接検出し得る非放射性の検出可能なマーカーを例示すれば、コロイド金およびコロイド銀および７エリチンのようなコロイド質化合物が挙げられる。間接的に検出し得る非放射性の検出可能なマーカーを例示すれば、ビオチン、アビジンおよびβ− ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼのような酵素等が挙げられる。Ｘ′は好ましくはＣＨ，、Ｒは好ましくはＣｏ（ＣＨｚ）＋−＋ｓＡであり、一層好ましくはＣ０−（ＣＨｓ）ｓＡである。特に好ましい式（Ｉ）の化合物は、下表Ｙ　　　　　Ｘ　　　　　　Ｚ　　　　　　　Ｘ’　　　　　　Ｒ￥Ｈ’／　　　　　ＤＭＴｒ　　　ＣＨ２／１０ＨＨＤＭＴｒ　　　ＣＨ，／／ＨＨトリホス　　ＣＨ２／／（ここで、基Ａは前記と同意義、ＤＭＴｒはジメトキシトリチルを表わし、Ｄはヒドロキシ保護基である）で示される置換基を有する。式（１）の化合物は、式：（式中、Ｘおよび２は前記請求項１と同意義である）で示される５−ヨードウリジンまノニは５−ヨードデオキシウリジンを式Ｈ−Ｃ＝ＣＸ’ＮＲ（式中、Ｘ′ およびＲは前記と同意義）を有するアミノアルキンとパラジウム触媒の存在で反応することにより製造することができる。より詳細には、式（Ｉ）の化合物は（Ａ）式（１）：（式中、ＢおよびＢｏは同一まｌ；は異なってもよいヒドロキシ保護基、Ｙは前記と同意義である）の化合物を（Ｐ　ｈｓ　Ｐ　）！　Ｐ　ｄＣ（ｈおよびＣｕｌの存在で、Ｈ−’ ＣａＣ−Ｘ’ＮＲ（ここで、Ｘ′８よびＲは前記と同意義である）と室温で反応させて式（２）：の化合物を作成し、（Ｂ）式（２）の化合物から保護基ＢおよびＢ′を除去して、を作成する段階を経て製造し得る。弐（３）の化合物はさらに反応によって本発明の他の化合物へ変換し得る。（Ｃ）化合物（３）を式Ｂ″Ａ’（ここで、Ｂ”はトリチル基の任意の誘導体のような保護基、Ａ′は脱離基である）の化合物と反応させて式（４）：を作成し、（Ｄ）化合物（４）を式ＸＲ’（ここで、Ｒ′は脱離基、Ｘは前記と同意義である）の化合物と反応させ、式（５）を作成し、（Ｅ）化合物（５）を、保護基Ｂ”が酸まツ：は塩基のどちらに不安定であるかによって、例えば酸または塩基のいずれがと反応させてＢ″基を除き、ついでトリエチルホスフェートの存在でｐｏｃｎ３と反応させて式（６）を作成し、ＣＦ）化合物（６）を最初カルボニルジイミダゾール、ついでトリス（テトラ− ブチルアンモニウム）ピロホス７エートまたはトリブチルアンモニウム−ピロホスフェートと反応させて式（７）を作成することができる。本発明の好ましい化合物の一つに属する化合物（７）は、その５′トリホスフエート基の存在によりイオン交換クロマトグラフィー、逆層クロマトグラフィーまたはセルロースクロマトグラフィーによって精製することができる。任意の通常の脱離基Ｒ′を上記の反応（Ｄ）に使用し得る。そのような基を例示すれば、ＣＱ、Ｂｒ、Ｉ％　ｐ−二トロフェニルオキシ、ペンタフルオロフェニルオキシおよびジイソプロピルアミノが挙げられる。Ｂ″はＢ８よびＢ″と同一または異なってもよい。当技術で自体公知の標準的な手技を用いてＢ”を選択的に５′ヒドロキシへ導入できる。式（２）の化合物のＣ−５置換基（ここで、ＲはＢＯＣのようなアミノ保護基）の鎖長は酸処理によってＲ基を除き、ついで（１，８−ジアザシクロ［４，４，０］ウンデカ−７−エン）ＤＢＵの存在で下記の式：１式中、Ｒはアミノ保護基、ｎは１〜５０、Ｅはｐ−ニトロフェニルオキシまｔ；はペンタフルオロフェニルオキシのような（当技術で自体公知の）好適な脱離基である１の型の活性エステルと反応することによりを作成することによって伸長することができる。この処理を所望の回数だけ実兄し、炭素５置換基の鎖長を伸ばすことができる。当業者ならば容易に理解し得るように、式（Ｉ）の化合物（ここで、Ｒま１；はＡはＢＯＣのようなアミノ保護基）から、好適な条件下に保護基を除き、けい先口またはその他の非放射性マーカーと遊離アミノ基とを反応させると、それによってけい先口またはその他の非放射性マーカーで標識したヌクレオシド誘導体を製造し得る。式（Ｉ）の化合物を用いてポリヌクレオチドを製造することができる。本発明はまた、式（ＩＩＩ）（式中、Ｘ′、ＹおよびＲは前記と同意義である）で示されるｌまたはそれ以上のヌクレオチド単位を含んでいるポリヌクレオチドを提供する。ヌクレオチド単位（ｍ）はポリヌクレオチド鎖ｌ；挿入された式（１）の化合物を表わす。式（１）の化合物は標準的な方法を用いてｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ　％合成オリゴヌクレオチドおよびＲＮＡへ挿入できる…・＋ａゝ−３１２）。本発明はまた、個々のヌクレオチドまたはヌクレオチド群を伸長しつつあるヌクレオチド鎖へ逐次結合し、その際、ヌクレオチドの少なくとも一つが既述した式（１）のヌクレオシド誘導体であることからなるポリヌクレオチドの合成方法を提供する。より詳細には、１またはそれ以上の式（Ｉ［Ｉ）のヌクレオチド誘導体を含んだポリヌクレオチドは（ａ）策１のポリヌクレオチド、（ｂ）第１のポリヌクレオチドの一部とハイブリダイズするｗ１２のポリヌクレオチド、（ｃ）　１またはそれ以上のヌクレオチドトリホスフェート、（ｄ）ＤＮＡポリメラーゼまＩ；はＲＮＡポリメラーゼを反応させることにより製造することができ、この場合、該第２のポリヌクレオチドの３″末端からポリヌクレオチドが合成され、該ヌクレオチドトリホスフェートの少なくとも一つが式（１）のヌクレオシド誘導体（Ｚはトリホスフェート、Ｘは水素）であることを特徴とする方法によって製造できる。本発明はまたもう一つの態様として、ヌクレオチドの少なくとも一つが式（１）のヌクレオシド誘導体［ここで、Ｘはホスフェートまたは式：（式中、Ｒ］、Ｒ１およびＱは前記と同意義である）で示される基から選ばれる］であるヌクレオチドを、互いにそれぞれの５″および３゛末端で逐次結合することによる、１またはそれ以上の該ヌクレオシド誘導体を含んだポリヌクレオチドの製造を提供する。式（１）の化合物は標準的なホスホトリエステル化学を用いて合成オリゴヌクレオチドへ挿入できる＋ｌＩ）。ＲＮＡへ挿入する場合には、式（１）の化合物は５″トリホスフエート基および３″および２″位にヒドロキシル基を有する。多重部位でｉ識したポリヌクレオチドは本発明の一態様によって製造できる。多重標識の効果は、単一位置で標識しＩ；ポリヌクレオチドによって生じた信号よりも読み取った信号が増強されるので有利である。ポリヌクレオチドへ挿入する前に式（１）のヌクレオシド誘導体がけい先回または非放射性の検出可能なマーカーを含んでいない場合は、作成しｔ；ポリヌクレオチドへ、その後に検出可能な標識を挿入してもよい。例えばＣ−５置換基の脂肪族アミノ基をマスキングしている保護基を除き、このようにして生成したアミノ基を、フルオレセイン−５−インチオシアネートのようなけい先回と反応させることによって実施し得る。けい光を有しないけい光間類似体（けい先口前駆体）を含んでいるヌクレオシドをポリヌクレオチドの製造に使用できる。けい先口前駆体を使用すると、ポリヌクレオチド製造に必要な化学操作の間にけい先回が脱色を起こす可能性が避けられる。好適な条件下に（例えばアンモニア処理）けい光を抑えているけい先口前駆体のそれらの基を除き、けい先口前駆体をけい光体の形へ変換することができる。フルオレセインのけい光を発しない類似体を含んだ式（１）のヌクレオシド誘導体を製造するための反応式を例示的に第２図に示す。第２図で生じた化合物Ｂは下記の式を有する。化合物Ｂはアンモニア処理によるインブチリル基の除去によってけい光を発し得る。化合物Ｂはオリゴヌクレオチド合成（５’、３’を保護しｔ；ホスホアミダイトの形で）またはｃＤＮＡ（５’　トリホスフェートの形で）に使用し得る。化合物Ｂのウリジン類似体はＴ４ポリメラーゼＦｉｌｌまたはＳＰ６ポリメラーゼ１１″１によるＲＮＡ合成に使用し得る。本発明の化合物は通常同位元素で標識したプローブを利用する分子生物学的技術に有用である。そのような技術はドツトプロット、サザンプロット、ハイブリダイイー９１２組織化学、ノーザンプロットおよびプラークハイブリダイゼーシヨンのようなりＮＡおよびＲＮＡハイブリダイゼーシ２ン等である。式（１）のヌクレオシド誘導体まＩ；はそのようなヌクレオシド誘導体を挿入したポリデオキシヌクレオチドはＤＮＡ配列決定反応に使用し得る。本発明のもう一つの態様は、（ａ）　（ｉ　）ポリデオキシヌクレオチド、（ｎ）ポリデオキシヌクレオチド（ｉ）の一部とハイブリダイズし得るポリデオキシヌクレオチドブライマー、（ｉｉｉ）ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄｃＴＰ、ｄＴＴＰ。（ｉｖ）ｄｄＡＴＰ。（ｖ）ＤＮＡポリメラーゼまたはＤＮＡポリメラーゼのタレノー断片、かもなる第１の反応混合物を用意し、（ｂ）　ｃｌｄＡ　Ｔ　ＰをｄｄＧＴＰに置き代えた以外は第１の反応混合物と同一である第２の反応混合物を用意し、（ｃ）　ｄｄＡ　Ｔ　ＰをｄｄＣＴＰに置き代えた以外は第１の反応混合物と同一である第３の反応混合物を用意し、（ｄ）　ｄｄＡ　Ｔ　ＰをｄｄＴ　Ｔ　Ｐに置き代えた以外は第１の反応混合物と同一である第４の反応混合物を用意し、（ｅ）上記の反応混合物を別々にインキュベートして、それぞれのポリデオキシヌクレオチドブライマーをその３′末端から伸長させ、種々の鎖長のポリデオキシヌクレオチド群を作成し、この場合、伸長しつつある鎖へジデオキシヌクレオチドが挿入されることによって新ｔ；に合成される各ポリデオキシヌクレオチドにおけるヌクレオチド数が決定され、（ｆ）ゲルマド“リックスを通過させることにより反応混合物（ａ）〜（ｄ）を分画する、各工程からなり、ポリデオキシヌクレオチドブライマー（ｉｉ）が１またはそれ以上の上記の式（ｍｌ）のヌクレオチド単位（ここで、ＲおよびＡはけい元口またはその他の非放射性の検出可能なマーカーである）を含有するポリデオキシヌクレオチドであり、モして／または上記の各反応混合物が式（Ｈのヌクレオシド誘導体（ここで、２はトリホスフェート、Ｘは水素、Ｒま！；はＡはけい元口またはその他の検出可能なマーカーである）を含有しており、それによってけい元口まｌ；はその他の非放射性の検出可能なマーカーが新たに合成した各ポリデオキシヌクレオチドへ挿入されること、および新たに合成されたポリデオキシヌクレオチドに含まれｔ；けい元口またはその他の非放射性の検出可能なマーカーの検出によって、ゲルマトリックスで分離されＩ；新たに合成され！：ポリデオキシヌクレオチドの相対的な位置を確認し、このようにして第１のポリヌクレオチドのＤＮＡ配列を明らかにすることを特徴とするＤＮＡの配列決定方法を提供するものである。上記の段階（ｅ）の新たに合成され！；ポリヌクレオチドは、例えばレーザー光のような光源の照射によって誘発されたけい光により検出できる。上記の各反応混合物（ａ）〜（ｄ）はそれぞれ異なった発光極大を有する異なったけい元口または異なつｊ；非放射性の検出可能なマーカーを含むことができる。即ち上＝己の各反応混合物（ａ）〜（、ｄ）においてオリゴヌクレオチドブライマー（ｉ）および／または式（１）のヌクレオシド誘導体は区別し得る発光極大を有するＲまたはＡ基を含んでいる。本発明の幾つかの態様を単に例示するｊこめ、添付図面を引用して説明する。第１図は本明細書に用いたＣ−５置換ヌクレオシドの番号表示方法、第２図は修飾されｔ；非けい光のフルオレセイン部分を挿入した本発明のヌクレオシド誘導体の製造、第３図は保護アミノアルキンたカリクレイン・オリゴヌクレオチドとマウス唾液腺π：ＲＮＡとのドツトプロットハイブリダイゼーション検定を示す。プローブを１２Ｐ末端探識し、以下に説明するようにハイブリッドを形成する。Ａは標準プローブを高度ストリンジエンシー条件下で４時間露光、Ｂは単一標識プローブを中程度ストリンジエンシー条件下で４時間露光、Ｃは標準プローブを高度ストリンジエンシー条件下で１６時間露光、Ｄは多重標識プローブを低ストリンジニンシー条件下で１６時間露光、Ｅは多重標識プローブを最低ストリン° ジエンシー条件下で１６時間露光しｔ；ものである。第７図は長いＣ−５鎖にけい光で標識したカリクレイングローブで実施したドツトプロットハイブリダイゼーション検定を示す。グローブは３２ｐ末端標識し、高度ストリンジエンシー条件下でハイブリッド形成しｔ；。オートラジオグラフの露光時間は４時間であった。Ａは標準プローブ、Ｂは巣−標識グローブ、Ｃは多重標識プローブである。Ｍ８図はＳａｐ末端標識、単一けい光標識をしたカリクレインプローブと３つの異なっｆ：　ＲＮ　Ａ種とのプロソトハイプリダイゼーン３ン検定を示す。ハイブリダイゼーションは中程度ストリンジエンシー条件下で実施し、オートラジオグラフの露光時間は１６時間であった。Ａは短いＣ−５鎖のグローブ、Ｂは長いＣ−５鎖のプローブである。材料および方法５−ヨードデオキシウリジンおよびフルオレセインインチオシアネート（Ｆ　Ｉ　ＴＣ）はシグマ・ケミカル・カンパニー（Ｓ　ｉｇｍａ　Ｃｈｅｍ−ｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ）から入手した。’ＨＮＭＲスペクトルはＪＥＯＬＦＸ９０Ｑ（７）９０ＭＨｚ、ＪＥＯＬ　ＦＸｌ　００の１００ＭＨｚ、まｔ；はＢＲＵＫＥＲ３００の３００ＭＨｚのいずれかで測定した。１３ＯＮＭＲスペクトルはＪＥＯＬ　ＦＸ９０Ｑの２２．５ＭＨｚ、ＪＥＯＬＦＸＪＯＯの２５ＭＨｚまたはＢＲＵＫＥＲ３００の７５ＭＨｚのいずれかで操作して測定した。多重度が観察された場合、ＪＥＯＬ　　ＦＱ９０Ｑまｌ；はＦＸ　Ｉ　ＯＯでは単一周波数オフレゾナンス（ＳＦＯＲ）法により、またＢＲＵＫＥＲ３００ではＤＥＰＴパルス系列を用いることによって多重度を測定した。ＮＭＲ分析に用いたヌクレオシド番号表示方法は親ヌクレオシドを例にとって第１図に示す。３１ＰＮＭＲスペクトルはＢＲＵＫＥＲ３００で１２１　ＭＨｚで操作し、外部標準として用いＩ；８５％Ｈ３Ｐ０．から低磁場側を測定した。低磁場の値が正である。微量分析はオーストレーリアン・マイクロアナリティカル・サービス（Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ　　ＭｉｃｒｏａｎａｌｙｔｉｃａｌＳ　ｅｒｖｉｃｅＸメルボルン）で測定した。ピリジンは水酸化カリウムで蒸留し、５Ａモレキユラーシーブで貯蔵した。アセトニトリルおよびメタノールは３Ａモレキユラーシーブで乾燥した。トリエチルアミンは水素化カルシウムで蒸留し、アルゴンを封入して貯蔵しｔ；。ホスホアミダイト合成で使用するジクロロメタンは、５Ａモレキユラーシーブで乾燥した。テトラゾールは０．０５＋ｎｍＨｇで１１０℃で昇華した。ジイソプロピルアミンは水素化カルシウムで蒸留し、３Ａモレキユラーシーブで貯蔵した。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）はメルク・アナリティカル・シリカゲル・プレート［メルク（Ｍｅｒｃｋ）Ｎｏ、　５７３５　］で下記の溶媒系：Ｓ　Ｌ　ＣＨ＊Ｃｆｆｚ／ＭｅＯＨ（９Ｏ：１０、ｖ／ｖ）、Ｓ２、ｃＨ２ＣＩ２２／ＭｅＯＨ（９８：２、ｖ／ｖ）またはＳ３、ＣＨｚ（ｌｘ／ＥｔＯＡｃ／ＥｔｓＮ（４５：４５：１０、ｖ／ｖ）を使用して実施した。融点は電熱式融点測定装置で開放毛細管を用いて測定した。デオキシウリジンの代わりに５−ヨードデオキシウリジンを使用し、ロビンスらの方法０″）の改良法により、表題の化合物を製造した。収率９２％。叩２０５〜２０６℃（文献値３Ｉ４）、１９５〜１９６℃）ｅ　”ＣＮＭＲ（ＣＤＯｆｆ、、２５ＭＨｚ）、δ２１．７（ＣＨＩ）、３ｇ、７（Ｃ−２’）、６４．１（Ｃ−５’）、６９．０（Ｃ−５）、７４．９（Ｃ−３’）、８３．４（Ｃ−１’ ）、８５．８（Ｃ−４’）、１２６．１．１２６．４（トルオイル、Ｃ−１）、１２９．３．１２９．５．１２９．８（トルオイル、Ｃ−２、Ｃ−３、Ｃ−５、Ｃ−６）、１４３．６（Ｃ−６）、１４４．６（）ルオイル、Ｃ−４）、１４９．２（Ｃ−２）、１５９．７（Ｃ−４）、１６６．０（トルオイル、Ｃ−０）。３−第３級ブチルオキシカルボニルアミドプロビンＣＨｘＣｎ＝２００ｍｆｆへ３−７ミノブロビン２．７５ｇ（５０ミリモル）を添加し、ついでジー第３級ブチルピロカーボネート１０．９２９（５０ミリモル）を添加した。３時間撹拌した後、反応混合物を蒸発してシロップ状とし、−２０°Ｃに保って結晶化させた。生成物を濾過し、ヘキサンで洗浄し、乾燥して５．３４ｇを得た（６９％）。ｍｐ４２〜４４℃（文献値””％ｍｐ４３°Ｃ）。 ’ＨＮＭＲ（ＣＤＣｆｆ、、９０ＭＨｚ）：δ’ｈ−４６（９Ｈ％ｓ％ＣＨｓ）、２−２１（ＬＨ，ｔ、Ｊ＝２−６Ｈｚ、Ｃ−ＣＨ）、３．９１（２Ｈ，ｄｄ。Ｊ＝２．６Ｈｚおよび３　、５　Ｈｚ、　ＣＨり、４．６８（ＩＨ，巾広いＳ、ＮＨ）。＋３ＣＮＭＲ（ＣＤＣ１２３，２２，５ＭＨｚ）、δ２８．４（ＣＨ２）、３０．６（ｃＨｚ）、７１．２（Ｃ−１）、８０．１（旦（ＣＨＩ）３）、８０゜２（Ｃ−２）、１５５．３（Ｃ−０）。５、−（３ｇ３級ブチルオキシカルボニルアミドプロパー１−インイル）−３’ 、５’−ジー０−ｐ−）ルオイルデオキシウリジン（２）脱酸素化した酢酸エチル５００−へ３″、５′−ジー０−ｐ−トルオイル−５−ヨードデオキシウリジン（１）の５．９０ｇ（１０ミリモル）を添加シ、：ｆｉｌ：Ｎ−ＢＯＣ−３− ７ミノブロビ７３．１０９（２０ミリモル）、（ＰｈｓＰ）ｚＰｄｃＬｌ　５０ｍｇ、Ｃｕ１１５０ｕおよびトリエチルアミン５．７ｍ＋２（５０ミリモル）を添加した。得られた懸濁液を室温で撹拌し、反応をＴＬＣ（Ｓ２）で追跡した。９０時間後、出発物質が消失した。ついでさらに酢酸エチル２０ＱｍＱを追加し、得られた反応溶液を５％ＥＤＴＡニナトリウム／ＨｚＯ（２Ｉ３００Ｔｎ（１）、ＨｚＯ（３００１１＜１）および食塩水（３００りで洗浄しｔ；。ついでこれを乾燥しくＮａ２５Ｏ，）、溶媒を蒸発し、残留物を溶媒（Ｓ３）１５Ｉ１１１２に再溶解して、これと同じ溶媒を使用したフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。収量５．０８ｇ（８４％）、試料をＣＨＣＱｓ／ＭｅＯＨ（１：５）から再結晶して（２）を得ｌ；。ｍｐｌ　６９．５〜１７０．５℃。ＵＶ（ＭｅＯＨ）Ｊｍａｘ：２９０ｎｍ（肩）、２８３．２３７ｎｍ（ｔｌ１８００．１２４００．３９８００’）。λｍｉｎ：２６３ｎｍ（ｔ　５９００）、　’ＨＮ　Ｍ　Ｒ（ＣＤ　ＣＱ　ｓ、９０ＭＨｚ）：δ’ｈ−４４（９Ｈ，ｓＳ　Ｃ（ＣＨＩ）り、２．４２（６Ｈ，ｓ、トルオイル、ＣＨ，）、２．７（２ＨＳｍＳＨ，’）、３．９７（２Ｈ，ｄ、Ｊ＝５−ＩＨｚ、Ｈｇ）、４．６−４．７（４Ｈ，ｍ。Ｈ，ｌ、Ｈｓ’およびＢＯＣＮＨ）、５−６（ｌ　Ｈ，ｍ、　Ｈｓ’）、６．４（ＩＨ−ｍ、Ｈ＋’）、７．２６（４Ｈ，ｄ、Ｊ＝８．１Ｈｚ、　　トルオイル、Ｈ。およびＨ，）、９−１６（ＩＨ％ｍ、　Ｈａ’）、６．４（ｌ　Ｈ，ｍ、　Ｈ＋ ’）、７゜２６（４Ｈ，ｄ、Ｊ−８，１Ｈｚ、）ルオイノ呟Ｈ３およびＨ，）、９．１６（ＬＨ，ｓ、複素環ＮＨ）、　１３ＣＮＭＲ（ＣＤＣＩ２３．２２．５ＭＨｚ）、８２１．７（ｑ、トルオイル、ＣＨＩ）、２８．４（ｑ、、Ｃ（立Ｈ３）り、３１、．４（ｔ、Ｃ−９）、３８．６（ｔ、Ｃ−２’）、６４．１（ｔ、Ｃ−５’）、７３．８（ｓＳＣ−８）、７４．９（ｄ、Ｃ−３’）、８０．０（ｓ、Ｃ（ＣＨｓ）ｓ）、８３．４（ａ、　ｃ−１’）、８６．１（ｄ％Ｃ−４ ’）、９Ｏ−３（ｓ、Ｃ−７）、１００．２（ｓＳＣ−５）、１２６．４８よび１２６−６（２ｓ、　　）ルオイル、Ｃ−１）、１２９．３−１２９．９（４ｓ、）ルオイル、Ｃ−２、Ｃ−３、Ｃ−５およびＣ−６）、１４１．９（ｄＳｃ− ６）、１４４．５（ｓ１トルオイル、Ｃ−４）、１４９−２（ｓＳＣ−２）、１５５．３（ｓ。ＢＯＣ，Ｃ＝Ｏ）、］　６１．７（ｓｌＣ−４）、１６６．０４および１６６．１５（２ｓ、　　トルオイル、Ｃ−０）。元素分析（ＣｓｓＨ３５０ＩＮ　ｓ）：計算分析値：Ｃ６４，ｌ　７；Ｈ５，７１；Ｎａ、８０実測値：Ｃ６３−９４；Ｈ５，５２；Ｎａ、５５５−（３−第３級ブチルオキシカルボニルアミドプロバー１−インイル）−５’−０−ジメトキシトリチルデオキシウリジン（５）乾燥ＫｚＣＯｇ３０４ＴＡｙ＜２−２ミリモル）の乾燥メタノール５＋Ｊ懸濁液を撹拌しながら、（２）の６１７＋ｎ５（１ミリモル）をこれに添加しｔ；。１．５時間後に反応混合物を濾過し、濾液をダウエックス（ＤｏＷｅｘ）５０−Ｘ　８（Ｈつで中和し、樹脂を濾去し、濾液を蒸発乾固して（！Ｌ）を得た。生成物を乾燥ピリジン５ｍＱと共に蒸発して（３Ｘ５＋＋Ｑ）宛全に乾燥し、乾燥ピリジン５＋ｍ（２に再度溶解した。４．４′ −ジメトキシトリチルクロリド４０６ηｇ（］、、２ミ２ミリ）を添加して混合物を室温で４時間撹拌したのち、反応の完結をＴＬＣ（Ｓ　ｌ）により判定した。ＭｅＯＨ２ｔｎＱを加えて溶液をさらに１０分間撹拌し、蒸発し、ジクロロメタン３０ｍｆｆに溶解して、１０％ＮａＨＣＯ３／Ｈ、○（３０峰）、食塩水（３０ｉＱ）で洗浄し、乾燥した（Ｎ　ａｊ、　Ｓ　Ｏ−）。溶媒を再び蒸発して生成物をＣＨ２ＣＣ２５−に溶解し、フラッシュクロマトグラフィーニよって精製し、最初２％ＭｅＯＨ／ＣＨｚＣＱｚ３００ｍＱ、ついで１０％ＭｅＯＨ，ＣＨ，（１，で溶出した。生成物を含有する画分をプールして蒸発乾固し、（５）の４６８ｍｅ（２に対して６８％）を得た。ＵＶ（ＭｅＯＨ）λｍａｘ：　２９４　ｎｍ（肩）、２８３．２３１ｎｍ（ｇ６１００．６８００．２１５００）、λｗｉｎ：２５７ｎｍ（２５００）。’ＨＮＭＲ（ｃ　Ｄｃ　Ｑｓ、１００ＭＨｚ）：δｌ　−３９（９Ｈ％５ＳＢＯＣ，ＣＨｓ）、２２−４（２ＨＳ、Ｈ！’）、３．３８（２ＨＳｍ、Ｈｓ’）、３．７８（８Ｈ。ｓ、ＯＣＨ３プラスＨＳ）、４−１（Ｉ　Ｈ１ｖａＳＨ４’）、４．６（３ＨＳｍ。Ｈ＊’＋ＢＯＣＮＨ）、６．３２（Ｉ　Ｈ，ｔＳＨ＋’）、６．８０．６．８９（４Ｈ，Ｊ　＝９−ＯＨｚ、Ｐｈ０ＣＨｓのメタ位ＣＨ）、７．２−７．５（９Ｈ１叱ＰｂＯＣＨ３のオルト位のＣＨおよびＰｈの７．２９．７．３４（Ｊ＝９．０Ｈｚ）の２重線を含んでいる）、８．１１（ＩＨ％ｓ％Ｈａ）。元素分析（Ｃ３ｉＨ１＋０ｓＮ３）’ 計算分析値：Ｃ６６，７５；Ｈ６，０４：Ｈ６，１５突測値：Ｃ６６，８９；Ｈ５，８２；Ｈ６，００まｔ；ヌクレオシド（土）は脱保護反応後、炭酸カリウムを濾過し、粗製反応混合物のフラッシュクロマトグラフィーにより（溶出液２０％ＭｅＯＨ／　ＣＨｘ　ＣＯり精製し、（！Ｌ）を得た。　’ＨＮＭＲ（ｄ、− ＤＭＳＯ，１００ＭＨｚ）：δ１．３９（９Ｈ，５ＳＣＨｓ）、２．１（２Ｈ。ｖｎ、　Ｈ２’）、３．３５（６Ｈ，ｓ、試料中に存在す６２分子（１））　９　／　−ル）、３．６（２Ｈ％ｍ、Ｈｓ’）、３．８（ＩＨｌｍ−Ｈ４’）、３．９３（２Ｈ，ｄ、Ｊ＝５．９Ｈｚ、ＨＳ）、４．２（ＩＨ，ｍ、Ｈｓ’）、５．１０（ＩＨ，ｔ、Ｊ　＝５Ｈｚ、５’−０Ｈ）、２．２５（Ｉ　Ｈ，ｄ％Ｊ　 −４Ｈｚ。３’−０Ｈ）、６−１１（ｌ　Ｈ，ｔ−Ｊ＝６．６）Ｔｚ、Ｈ＋’）、８．１４（ＩＨＳｓ、複素環ＮＨ）。ＵＶ（ＭｅＯＨ）λｃｏａｘ：　２９０．２３１ｎｍ（ｃ１２９００、ｌ　８２００）、λｍｉｎ：２５４ｎｍ（ｔ　４２００）。２６０ｎｍではε−５８００Ｍ弓。５−（３−第３級ブチルオキシカルボニルアミドプロバー１−インイル）−５′ −〇−ジメトキントリチルー３’−Ｎ、Ｎ−ジイソプロＣＣ２５ｔｈＱに溶解した溶液を２５１１１２丸底フラスコへ加えた。これにテトラゾール１７．５１１ｇ（０，２５ミリモル）および乾燥ジイソプロピルアミン２５μＱＣ０，２５ミリモル）を添加した。テトラゾールが溶解するまで溶液を撹拌した。ついでビス（ジイソプロピルアミノ）メトキシホスフィン”’（６）の３００μｍ２（１，１ミリモル）を添加−２後、反応をＴＬＣ（δ３）で追跡した。５時間後、反応混合物を１０％ＮａＨＣＯ３／ＨｔＯ（２Ｘ２５ｍ（ｉ）および食塩水（２Ｘ２５ｍｆｆ）で洗浄し、乾燥した（Ｎａ２　Ｓ　Ｏｉ）。溶媒を蒸発して、（７）を３９２１１１ｇ得ｔ；（粗収率９３％）。この物質の”Ｐ　ＮＭＲスペクトルは１５０．１９および１５０．４５ｐｐｍの２重線からなる主ピークと４．２３およびｉｏ−４１ｐｐｍに低いピークを示した。これらの副生物は結合反応を妨害しない。この物質の少量をフラッシュ・クロマトグラフィー（δ３）により精製しＩ；。 ’ＨＮＭＲ（ＣＤｓＣＮ−１００ＭＨｚ）：δ１．１３（１２Ｈ，２ｄ、Ｊ　＝６．５Ｈｚ、ＣＨ（ＣＨ３）ｘ）、１．３８（９８，ｓ％ＢＯＣＣＨ＄）、２− ４　（２Ｈ，ｍ、　　Ｈ！’）、３．２−３．５（５Ｈ，２ｄを含んだｍ（Ｊ　 ””　１３．３　Ｈｚ、　Ｐ　ＣＨｓ）およびＨ６’）、３．５（２Ｈ，ｍ％ＣＨ（ＣＨ３）２）、３．７−３．８（８Ｈ，３，７７に１本の強い１重線を含んだｒｒｌ（トリチル、ＯＣＨ３）およびＨｌ）、４．１（ＩＨ，ｍ５Ｈ４’）、４．６（Ｉ　Ｈ，ｖ１Ｈｓ’）、６−１（Ｉ　Ｈ−ｄｔ、　　Ｈ＋’）、６．８ −７．５（１３Ｈ，ｍ、トリチル、ＣＨ）、７．９０および７．９１（Ｉ　Ｈ，２ｓ、Ｈ６）。５−（３−７ミノプロパー１−イフイ／Ｌ−）−３’、５’−ジーｏ−−トルオイルデオキシウリジン・トリフルオロ酢酸塩（８）９５％ＣＦｉＣＯ＊Ｈ／ＨｘＯ（ＴＦＡ／ＨｚＯ）２０ｍＭ”、（２）の３−０９９（５ミリモル）を添加しｆ：、１０分間撹拌した後、溶媒を蒸発乾固した。ついで酢酸エチル１０ｍＱを加えて再び蒸発し、生成物を結晶化させ、これを濾取し、乾燥して（３Ｌ）を２．５６ｇ（８１％）得た。ｍｐ１２０℃（分解）。ｕＶ（ＭｅＯＨ）λｍａｘ：　２９　Ｏｎ＋ｎ（肩）、２８２、２３６ｎｎ＋（ｔ　　１１９００　　、　１２４００　　、　４１２００）、　　　λ　ｍｉｎ：　　２　６　３冊（（９０００）。’ＨＮＭＲ（９０ＭＨｚ、ｄａ−ＤＭＳＯ）：δ２．３９（６Ｈ，ｓ、ＣＨｓ）、２．５−２．６（ｍ、溶媒プラスＨ３′）、３．７（ｍｓ溶媒中のＨ３○不純物プラスＨｓ）、４．６（３Ｈ−ｍ、　Ｈ４°およびＨ５′）、５−６（ＩＨ，ｍ、Ｈ，’）、６．２４（ｌ　Ｈ％ｔ、Ｈ＋’）、７．３４（４Ｈ，２ｄ、Ｊ−８，１Ｈｚ、トルオイル、Ｈ３およびＨｌ）、７．９０（４Ｈ，２ｄ、Ｊ＝８．１Ｈｚ、トルオイル、Ｈ３およびＨ８）、８．０７（ｌ　Ｈ５５１Ｈ＆）、８．３（３Ｈ，ｂｓ、Ｎ’Ｈｓ”）、１１．８０（ｌ　Ｈ，ｓ。複素環ＮＨ）。”ＣＮＭＲ（７５ＭＨｚ％ｄｓ　　ＤＭＳＯ）、δ２１．２（ＣＨＩ）、２９．０（Ｃ−９）、３６．４（Ｃ−２’）、６４．２（Ｃ−５’）、７４．４（Ｃ−３’）、７８．５（Ｃ−８）、８１．５（Ｃ−１’）、８５．２（Ｃ−７）、８５．７（Ｃ−４’）、９７．６（Ｃ−５）、　１２６．４（トルオイル、Ｃ−１）、１２９．３．１２９．５（）ルオイル、Ｃ−２、Ｃ−３、Ｃ −５およびＣ−６）、１４３．９（Ｃ−６）、１４ｃ８０ルオイル、Ｃ−４）、１４９．３（Ｃ−２）、１６１．３（Ｃ−４）、１６５．２（カルボキシル）、１６５．６（トルオイル、Ｃ−０）。元素分析（Ｃ３ＤＨ、ａ○＊Ｎ５Ｆｓ＞：計算分析値：Ｃ５７，０５；Ｈ４，４７；Ｎａ、６５；Ｈ９，０２実測値：Ｃ５７，ｌ　２；）（４，７５；Ｎａ、４２；Ｈ９，１６−第３級ブチルオキシカルボニルアミドヘキサン酸６−アミノヘキサンＤ　ｌ　３．１２９（１００ミリモル）のジオキサン４００ｒｎＱ溶液へ０°Ｃで１ＭＮａＯＨ１００−およびジー第３級ブチルピロカーボネート２４．０１ｇ（１１０ミリモル）を添加した。得られＩ；懸濁液を室温で３日間撹拌すると、その後、ニンヒドリン反応は陰性となっｔ；。ついで減圧で容量を１００ｍＱに減らし、混合物を０℃に冷却し、酢酸エチルを液面に加えて、ＩＭ　ＫＨＳＯ，でｐＨ２〜３の酸性とした。生成物を酢酸エチルで抽出しく３　Ｘ　１５０ｍ１２）、有機層をＨ，Ｏで洗浄しく２　Ｘ　３００ｍＱ）、乾燥しくＮａ、Ｓ○、）、蒸発して粘稠なシロップ状にしｌ；。これを酢酸エチル／ヘキサンから再結晶して２０．４０ｇを得ｆ：、ｃ８８％）。ｍｐ３９−４１℃（文献値［４）、ｍｐ３９．５℃）。ヘキサノエート（９）６−第３級ブチルオキシカルボニルアミドヘキサン酸２．３１ｇ（１０ミリモル）およびｐ−ニトロフエノニ′ル１．６２９（１２ミリモル）ノＥ　ｔｏ　Ａｃ３０　ｒｎＱ溶液へ０℃でジシクロへキシルカルボジイミド２゜０６９（１０ミリモル）を滴下した。この溶液を０℃で０．５時間、ついで室温で３．５時間撹拌し、ジシクロヘキシル原素を濾去し、蒸発乾固し、生成物を１％酢酸を含有する９５％ＥｔＯＨから再結晶して（９）を３．３５ｇ得？＝（９５％）ａ　ｍｐｌ　ｌ　９−１２０℃（文献値３］６ン、ｍｐＨ６，５℃）。５−Ｎ−（６−第３級ブチルオキシカルボニルアミドヘキサノイル−３−アミノ −プロパー１−インイル　一３’、５’−ジーｏ−ｐモル）を添加した。１時間撹拌した後、混合物を真空下に蒸発し、残留物をＣＨｚＣＩ２ｚ５０ｗＱおよび酢酸エチル４００ｔｄに再溶解し、Ｈ２０（２Ｘ　３００ｍＱ）、食塩水（３００ＴＡ（２）で洗浄し、乾燥しくＮａ２５Ｏ，）、蒸発乾固した。固体をメタノールから再結晶し、（上止）を１゜７６９得プ；（８０％）、　　ｍｐｌ　　９　２−１　９　４　℃。　ＵＶ（ＭｅＯＨ）　λｍａｘ：２９０ｎｍ（肩）、２８２．２３７ｎｍ（ｇ１３８００．１４４００．４３０００）、λｗｉｎ：２６２ｎｍ（ｔ　Ｉ　０３００）。’ＨＮＭＲ（ＣＤＣＱ３．１００ＭＨｚ）：δ１．４−１．９（１５Ｈ，１，４３（ＢＯＣＣＨ，）およびＨ３″、Ｈ４″およびＨ３”にＳを伴った１１１）、２．１６（２Ｈ，５、Ｊ＝７．５Ｈｚ、Ｈ３つ、２．４２（６Ｈ，ｓ、　　トルオイル、ＣＨ３）、２゜７５（２Ｈ，ｍ、　Ｈ！ ’）、３−１　（２Ｈ，ｍ、　Ｈａ”）、’４．０４（２Ｈ，ｄ。Ｊ−５−ＯＨ２％Ｈｌ）、４．５　４．８（４Ｈ，ｒｒ＋、Ｈ，’、Ｈ，′およびＢＱＣＮＨ）、５−６（Ｉ　ＨＳｍ、Ｈｓ’）、６．３１（ｌ　Ｈ，ｄｄ、　Ｈｔ’）、７．２７（４Ｈ，ｄｌ　Ｊ−８，２Ｈｚ、）ルオイル、Ｈ３およびＨＳ）、７゜８４（ｌ　Ｈ，５ＳＨａ）、７．９１および７．９３（４Ｈ，２ｄ、Ｊ−８゜２８Ｚ、トルオイル、ＨｌおよびＨ，）、９．０（ＩＨ，巾広いｓ１複素環ＮＨ）。”ＣＮＭＲ（ＣＤ（１，，７５ＭＨｚ）、δ２１．７（トルオイル、ＣＨｚ）、２５．２（Ｃ−４”）、２６．４（Ｃ−３”）、２８．４（ＢＱＣＣＨｓ）、２９．７（Ｃ−５つ、３０．０（Ｃ−９）、３６．１（Ｃ−２”）、３８．６（Ｃ−２″）、４０．４（Ｃ−６”）、６４．２（Ｃ−５″）、７４．０（Ｃ−８）、７４．８ＣＣ−３’＞、７９．８（旦（ｃ　Ｈｓ）ｇ）、８３゜４（Ｃ−１’）、８６．０（Ｃ−４″）、８９．９（Ｃ−７）、１００．０（Ｃ −５）、！２６．２．１２６．４（）ルオイル、Ｃ−１）、１２９．３．１２９．５．１２９．６および１２９．８（トルオイル、ＣＨ）、１４２．１（Ｃ−６）、１４４．８（）ルオイル、Ｃ−４）、１４９．１（Ｃ−２）、１５６．１（ＢＯＣＣ−〇）、１６１．９（Ｃ−４）、１５６．０．１６６．２（トルオイル、Ｃ−０）、１７２．３（Ｃ−１”）。元素分析（Ｃｓ＊Ｈ＋ｓＯ＋ｅＮ４）：計算分析値：Ｃ６４，１０；Ｈ６，３４；Ｈ７，６７実測値：Ｃ６４，３４；Ｈ６，３２；Ｈ７，５１５−［Ｎ−（６− 第３級ブチルオキシカルボニルアミドヘキサノイル−３−アミノ−プロパー１− インイル）］−５’−０−ジメトキシトリチルデオキシウリジン（１２）（１）から（ｉ）を製造し！二のに用いｔ；のと同一の方法を用いて（１立）から表題の化合物を製造しｌ；。収量１．２０ｇ（ＩＱに対して７５％）ｅ　ＵＶ（ＭｅＯＨ）λｍａｘ：　２９３　ｎｍ（肩）、２８３．２３３ｎｍ（ｔ　８５００．９０００．２４５００）。λｗｉｎ：２５７ｎｍ（ｔ　２９００）。この化合物の’ＨＮＭＲスペクトルは（ｉ）のデオキシリポース部分から起こった共鳴スペクトルと複素環環基部分から起こった共鳴スペクトルから構成される。”ＣＮＭＲＣＣＤＣＱ、、７５ＭＨｚ）、Ｂ２５．１（Ｃ−４”）、２６．４（Ｃ−３”）、２８．４（Ｃ（皇Ｈ３）ｌ）、２９．７（Ｃ−５つ、３０．０（Ｃ−９）、３５．９（Ｃ−２つ、４０．４（Ｃ−６”）、４１．７（Ｃ−２’）、５５．３（ＯＣＨ３）、６３−６（Ｃ−５’）、７２．２（Ｃ−３’）、７４．１（Ｃ−８）、７９．２（立（ＣＨ３）り、８６゜０（Ｃ−４’）、８６．８（Ｃ−１’）、８７．００リチル中心のＣ）、８９．７（Ｃ−７）、９９．５（Ｃ−５）、１１３．４（メトキシフェニル、Ｃ−３３よびＣ−５）、１２７．０．１２７．９および１２８．１（フェニル、ＣＨ）、１３０．０（メトキシフェニル、Ｃ−２およびＣ−６）、１３５．６（メトキシフェニル、Ｃ−１）、１４３．１（Ｃ−６）、１４４．６（フェニル、Ｃ−１）、１４９．４（Ｃ−２）、１５６．０（ＢＯＣＣ−０）、１５８．６（メトキシフェニル（Ｃ−４）、１６２．５（Ｃ−４）、１７２．７（Ｃ−１”）。元素分析（Ｃｔ＋ＨｓｚＯ＋ａＮａ）：計算分析値：Ｃ６６，３２；Ｈ６，５８；Ｈ７，０２実測値：Ｃ６５，９４；Ｈ６，５２；Ｈ６，７０３５，１３，０６および１８．２５ｐｐｍに低いピークを伴った１４９゜８６ｐｐｍの主ピークを示した。チドの５′−ヒドロキシルへのカップリング修飾しｌ；ヌクレオシドホスホアミダイトを、完全に保護し固体支持体へ結合したオリゴヌクレオチドの５′−末端へ追加するのに用いＩ；方法は標準的なものであり７；＋１６１゜完全に保護し樹脂へ結合したオリゴヌクレオチドはアプライド・バイオシステムズ３８０Ａ・ＤＮＡシンセサイザー（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　３８０Ａ　　ＤＮＡ５　ｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）を用いて１マイクロモルの規模で合成した。ついで固体支持体を手動反応セルへ移し！；。このセルは直径ｌＣｗ、長さ３ｃＩ１１のミニアチュアクロマトグラフィー力ラムと類似しており、Ｂ１４クイツクフイツト先端および底部にテフロン製３方活栓を備えた中間気孔性焼成ガラス円盤を有する。脱トリチル化反応（３％ジクロロ酢酸／　ＣＨ２Ｃｆｆ、）のあと、樹脂を乾燥ＣＨ）ＣＮで完全に洗浄し、アルゴン大気中に放置しｔ；。ついでホスホアミダイト１０１４７０モルおよびテトラゾール４０マイクロモルを添加し、さらに乾燥ＣＨｓ　ＣＮ　ｌ　ｗＱを追加した。セルを１５分間振とうし、排液し、亜リン酸トリエステルを０．１Ｍヨー素浴溶液通常の方法により酸化した。反応の程度を定量するため少量の試料でトリチル検定を実施した。ホス７；−トのメチル保護基を除去しＩ；のち（チオフェノキシトイオン、２時間）、樹脂を９０％ＴＦＡ／ユタンジチオールで５分間処理し、排液し、ＣＨ，ＣＮ、合計２０ｖｒＱの２０％Ｅｔ３Ｎ／ＣＨ２ＣＱ２で完全に洗浄し、ついでＣＨｓ　ＣＮで再度洗浄して、乾燥した。ついで３５％ＮＨ，水溶液（４πΩ）でオリゴヌクレオチドを支持体から取り外し、得られた溶液を一夜５５℃に保ち、塩基性保護基を除去した。生成物は蒸発乾固することによって得られ、ＨｘＯＣ３ｖＩＱ）に再溶解しｔ；。オリゴヌクレオチドをポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製した。生成物は、誘導されなかつｔ；オリゴヌクレオチドよりも〜ｌ−２ヌクレオチド遅れて移動する最も動きが遅い主バンドである。原則的にはオリゴヌクレオチド溶液の〜１５０μｇを、厚さ１．５ｍｍ、長さ２０ｃｒＡの１０％ポリアクリルアミドゲル（ｌｃｎＸ１ｃｍウェル１つ当り２５ μＱ＋５μｇホルムアミド）で精製しｔ；。バンドはけい光ＴＬＣシリカゲル薄板をバックグラウンドとして使用するＬＪＶシャドウィングにより可視化した。生成物のバンドを切り取り、Ｈ，０で溶出し、透析し、凍結乾燥し、）（２０１５０μＱＩ；再溶解した。ｌまたはその他の修飾したヌクレオシドでチミジン残基を置き換えたオリゴヌクレオチドをアプライド・バイオシステムズ・ＤＮＡシンセサイザーで製造するため、ヌクレオチドホスホアミダイト（７）および（１１）を使用した。ホスホアミダイトは、乾燥アセトニトリル中、Ｏ，１Ｍ（（７）の場合）または０．１５Ｍ（（１上）の場合）のいずれかとしｊ；９合成は０．２マイクロモルの規模で実施した。反復カップリングの収率は９９〜１００％であった。連鎖組立てのあと修飾したヌクレオシドを含有するオリゴヌクレオチドの例として固体支持体から取り外した。目的の生成物はＨｘ　Ｏ２ｖＱに再溶解した。実施例４　′アミノオリゴヌクレオチドへの色素結合５″末端で修飾した１個のヌクレオシドを含有する精製オリゴヌクレオチドへＦＩＴＣをフンシュゲート結合するため、以下の方法を用いた。　Ｆ　Ｉ　ＴＣ２ｍｇ（５？マイクロル）のＤＭＦ２０μ４溶液へ０．１Ｍ　Ｋ２ＨＰＯ４（＋）Ｈ９−０）の１８０μＱを添加、混合し、ついでアミノオリゴヌクレオチド溶液１００μａ（〜３０ナノモル）を添加した。混合物を一夜暗所に保ち、ついで０．１Ｍ酢酸アンモニウム（ｐＨ９，０）を飽和したセフ７デツクス（Ｓ　ｅｐｈａｄｅｘ）　Ｇ　−２５（中間）の１０μΩカラムへこれを適用した。両分を０．５ｍＱずつ採取し、溶出液中に出てくるけい光物質（ＵＶランプ照射により検出）を採取した。これを凍結乾燥し、０．１Ｍ酢酸アンモニウム（ｐＨ９、０緩衝液）２００μｇに再溶解して、別の類似のセファデックスＧ−２５カラムへもう一度適用した。前記と同様に、けい光画分を採取して、これをプールし、２６０ｎｍおよび４９５ｎｍの吸収を読み取った。この比率から修飾したＫＰＩＢおよびＨＣＡＬ（これらのオリゴヌクレオチドはヌクレオチド配列の結果の項を参照）のそれぞれ３．２Ｘ１０６Ｍ−１および４．４Ｘ１０Ｍ−’ではε２．。を用い、フルオレセイン７　Ｘ　Ｉ　Ｏ’Ｍ”ではε、１．を用いてオリゴヌクレオチド１分子に対するフルオレセイン残基数を測定した。ついで生成物を凍結乾燥し、Ｈ，Ｏから２回凍結乾燥した。多重内部アミン基を持ったオリゴヌクレオチドへＦＩＴＣをコンジュゲート結合するｌ；めはるかに大過剰のＦＩＴＣを使用しｔ；。ＦＩ　ＴＣ２６＋１１９（６３マイクロモル）のＤＭＦ　Ｉ　ＯＯμｇ溶液へ１．ＯＭＫ、ｚＨＰＯ−（ｐＨ９−０）１００ｓＱを添加し、混合し、ついでアミノオリゴヌクレオチド１００μＱ（〜１０ナノモル）を添加しｔ；。これを−夜暗所に放置して反応させた。前把の例と同様にこれを精製し、修飾しｆ：ＫＰＩＢおよびＨＣＡＬのそれぞれ３．２ＸＩＯ″Ｍ−１および４．４ｘ　１０’Ｍ−１ではε２６゜を用い、フルオレセインの２ＸＩＯ’Ｍ−１ではε３．、を用いてフルオレセインの２６０ｎｍの吸収を考慮してフルオレセイン負荷量を測定した。先に報告のようにＵＮマウス唾液腺由来のポリアデニル化したＲＮＡでＲＮＡドツトプロットを作成しＩ；。１μ９の初期値から出発しｉ：　ＲＮ　Ａの量は連続した各ドツト上、３の倍数で減少した。ニトロセルロースフィルターを、５ＸＳＳＣ（０，７５Ｍ　ＮａＣ＜１，０．０７５Ｍクエン酸ナトリウム）、５３ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６−５）、０．０２％ウシ血清アルブミン、フラクションＶ、０．０２％フィコール（Ｆ　１ｃｏ１）、０．０２％ポリビニルピロリドン、３０μｇ／＋ｎ１２の変性した子ウシ胸腺ＤＮＡ、５０％ホルムアミドからなる溶液で４２℃で４時間プレハイブリッド化した。ハイブリダイゼーションは下記のように４つの異なった条件の組合わせで実施した。高度ストリンジエンシー条件下、４０℃で２４時間ハイブリダイゼーションし、２ＸＳＳＣで室温で洗浄する。中程度ストリンジエンシー条件下、上記と同様の条件でハイブリダイゼーションを室温で行なう。低ストリンジエンシー争件下、上記と同様の条件であるが、ハイブリダイゼーション混合物は５０％ホルムアミドの代わりに１０％ホルムアミドを含有する。最低ストリンジエンシー条件下、４℃でプレハイブリッド化し、ホルムアミドの存在なしで４℃で５日間ハイブリッド形成し、２ＸＳＳＣで室温で洗浄する。結果　Ｃ−５置換ヌクレオチドの製造置換デオキシウリジンの製造に用いた方法をｊｇ２図に示す。商業的に入手可能な５−ヨードデオキシウリジンから作成した３″、５′−ジーｏ−ｐ−ｈルオイルー５−ヨードデオキシウリジン（１）をビス（トリフェニルホスフィン）パラジウムクロリドおよびヨー素化第一銅の触媒量の存在でＮ−ＢＯＣ−３−アミノプロピンと縮合させた。ロビングおよびバールはアルキルまたはエステル置換基を有するアルキンを使用して末端アルキンと５−ヨードウラシルまたは５−ヨードデオキシウリジンとのカップリングを報告している（１８）。この反応はトリエチルアミンを溶媒として５０℃で行なわれた。発の構造を有する）の生成を最小とするため種々の条件を試みた。その結果、最も良好な（２）の収量を与える条件は溶媒として酢酸エチルを使用し、トリエチルアミンを（± ）に対して５倍モル過剰に使用し、反応を室温で行なうことであることが判明した。これによって８４％の収率が得られた。生成物の構造を’ＨＮＭＲおよび１３ＣＮＭＲスペクトル分析によって確認した。この生成物は基本的な化合物であり、この化合物から多数の他の誘導体を得ることができる。３′、５″エステル保護基を除去し、得られた生成物（！Ｌ）をピリジン中でジメトキシトリチルクロリドで処理して（５）を得た。また（土）のＵｖスペクトルはヌクレオシド構造の証拠を提供する。複素環塩基の吸収極大はチミジンの２６５ｎｔｎから（！Ｌ）の化合物では、強度の増加を伴って２９０ｎｍヘシフトした。吸収極大のこのシフトはこのけい先口を含んで合成されｔ；すべでの誘導体で認められる。５′をトリチル化したヌクレオシド（５Ｌ）を触媒条件下に２倍過剰のビス（ジアルキルアミノ）ホスフィン（１）で処理するとホスホアミダイト（Ｌ）が得られた。このホスホアミダイトの製造方法は、カルザーズら００１によって報告されたホスホアミダイトのイン・サイチュ製造と類似している。１！匹見　長いリンカ−鎖をＣ−５に有するヌクレオシドの製造後述するであろう様に、オリゴヌクレオチドに内部の第１級脂肪族アミノ基を導入するのに（Ｌ）を使用することができるが、複素環塩基と標識の結合部位（末端アミン基）との間のリンカ−鎖の鎖長が短いとオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション特性に影響するであろうということは初めから推測された。けい先部分は大きい平面分子であることが多いので、このけい先部分が結合する場合、特にそうなることが予想される。しｔ；がってＣ−５にさらに長いリンカ−鎖を導入する作戦が展開された。その概略を第４図に示す。基本化合物（２）のアミノ基を９５％ＴＦＡ／Ｈ，Ｏで脱保護し、（８）を高収量で得た。ついで１当量の１．８−ジアザビシクロ［５，４，０］ウンデカ−７ −エン（ＤＢＵ）の存在下で、この化合物をｐ−二トロｉ　　修飾したヌクレオシドのオリゴヌクレオチド５′−末端への挿入前もって組立てたオリゴヌクレオチドの５′−末端へまず手動操作によりホスホアミダイト（７）および（１上）をカップリングすることによって試験した。そこで自動化したアプライド・バイオシステムダ３８０Ａ−ＤＮＡシンセサイザーで３０量体ＧＧＧＣＴＴＣＡＣＡＡＣＡＴＣＴＧＴＧＡＴＧＴＣＡＧＣＡＧＧを組立て、樹脂上に残しｔ；まま完全に保護した。この配列はすべてのカリクレインに共通し！；カリクレインｍＲＮＡの領域″Ｓ】と相補的であり、ＫＰＩＢと呼ばれる。樹脂を手動反応セルへ移しｌ；。最後のヌクレオシドを脱トリチル化しｔ；後、テトラゾールの存在下で（７）または（１上）のいずれかをカップリングした。トリチル試験による検定で、カップリングは本質的に定量的であった。チオフェノキシトイオンでリン酸保護基を除去した後、ＢＯＣ保護基を除去するため樹脂を９０％ＴＦＡ：１０％エタンジチオールで５分間処理した。エタンジチオールの存在はオリゴヌクレオチドを分解から保護する。トリエチルアミンを使用して新たに作成しｔニアミノ基および第２のホスフェートを中和し、ついでオリゴヌクレオチドを標準的な方法で処理して樹脂から取り外し、塩基保護基を除去した。修飾されたオリゴヌクレオチドが通常のＫＰＩＢより１〜２ヌクレオチド遅れて移動することを利用して、オリゴヌクレオチドをポリアクリルアミドゲル電気泳動によって精製した。したので、これら２つの修飾したヌクレオシドを内部的に挿入したオリゴヌクレオチドの合成に着手した。合成はアプライド・バイオシステムズ・ＤＮＡシンセサイザーで自動的に実施した。上記の各ホスホアミダイトを使用してそれぞれ２つの異なったオリゴヌクレオチドを合成した。一つはＫＰＩＢで、もう一つは４０量体ＡＧＧＴＧＣＴＣＣＡＡＣＣＣＣＡＡＴＴＧＣＡＧＴＴＴＧＧＧＧＧＡＡＣＧＴＧＴＧＡ（ＨＣＡＬ）である。ＨＣＡＬはヒトカルシトニンのｒｂＲＮＡの一部□と相補的であり、組′織切片中のこのｒｎＲＮＡを検出するのに使用される［＋６１．その配列を上記の配列のように合成した。ただしすべてのチミジン残基を修飾したヌクレオシドの１つで置き換えて合成した。反復カンプリングの収率は９９〜１００％の水準であっｔ；。連鎖を組立てた後、オリゴヌクレオチドをチオフェノキシト・イオン、９０％ＴＦＡ／エタンジチオールで順次処理し、濃厚アンモニア溶液で固体支持体から取り外し、５０ ℃で１５時間地理して塩基保護基を除去した。この生成物をポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析を試みｔ；が、標準的なＵＶシャドウィングの方法では何らの物質もゲル上に認められなかっｔ；。ゲル媒質のｐＨによって荷電されたアミノ基の存在がオリゴヌクレオチドの電気泳動特性を変化するようである。したがつてさらに精製することなくこれを次の段階に使用しｌ；。然し反復カップリングの収量は高いから、短い方の配列は少量だけ生成物中に存在していることが予想されｔ：。アミン反応性のけい先口をアミノオリゴヌクレオチドへ結合するために用いた方法は、タンパク質でリシン残基のＣ−アミノ基へそのような分子を結合するのに広く用いられている方法３１′）と基本的に同一である。この方法は脂肪族アミン基の有効部分がプロトン化されないようｐＨ９でアミノオリゴヌクレオチドを反応性けい先口と反応させることからなる。スミスらは５′−アミノチミジンを含んだオリゴヌクレオチドへけい先口をカップリングするのに同様の方法を用いた＋１１゜過剰の未反応色素をオリゴヌクレオチドから分離するため標識反応混合物をセファデックスＧ−２５カラムへ２回通した。ついで２６０ｎｍおよび４９５ｎｍにおける生成物の吸収を測定することによって１１ＡｗＸの程度を測定した。（７）に由来するヌクレオチド（短いＣ−５Ｃ−５ｌを５゛−末端に含んでいるオリゴヌクレオチドの場合、１５０倍モル過剰のＦＩＴＣを使用した一回だけの反応によりカリクレインオリゴヌクレオチド分子の２０％およびカルシトニンオリゴヌクレオチド分子の３分の１が標識されｔ；。この標識物質の５′− 末端を［λ−”ＰＩＡＴＰでさらに標識し、電気泳動を行なった。その結果、期待した位置に単一の放射性バンドが現れた（データは添付していない）。また複数の内部第１級脂肪族アミノ基を含み、したがって多重標識挿入可能部位を含んでいるオリゴヌクレオチドでＦＩＴＣカップリング反応を行なった。最初に短いＣ−５鎖を有するオリゴヌクレオチドを標識しｌ：ａカリクレインプローブは７ケ所の標識挿入可能部位を含んでいるが、前記と同一の標識反応を用いるとオリゴヌクレオチド１分子当りただ１つのフルオレセインが含まれ、カルシトニングローブでは９ケ所の可能性部位を含んでいるが１．５分子の標識が含まれた。極めて大過剰のＦＩＴＣ（９００倍）を使用する方法に変えると、挿入水準はＫＰＩＢで４．１、ＨＣＡＬでは７．２に増加した。多数のけい先口がオリゴヌクレオチド分子へ結合したとき有効となるので、２６０ｎｍにおけるフルオレセインの吸収を考慮してこれらの数字を計算しｆ−、反応の反復は標識の程度に何ら有意な効果を示さない。試験反応で通常のＫＰＩＢを大過剰のＦＩＴＣとの標識反応にかけると１１０個のヌクレオチドで１個のバックグラウンドレベルの標識が得られることが判明した。これを対応するアミノオリゴヌクレオチドにおける１１０個のヌクレオチド当り１５と比較した。（１１）に由来するヌクレオチドを５′−末端に含んだカリクレインオリゴヌクレオチドを９００倍過剰のＦＩＴＣで標識すると、−回だけの反応で完全な標識挿入が達成された。またこのけい光体生成物を５′−末端で放射能標識すると、ゲル電気泳動により期待した位置に単一のバンドが得られた（データは添付していない）。長いＣ−５鎖を有する多重内部ヌクレオチド置換を含んだオリゴヌクレオチドを上記のようにＦＴＴＣカップリング反応にかけると（大過剰のＦＩＴＣ）、標識挿入のレベルはＫＰＩＢでは２．７、ＨＣＡＬでは５．２であった。まｌ；これらの多重標識プローブの５′−末端を［λ−”Ｐ）ＡＴＰで標識しｔ；。反応からの生成混合物をセファデックスＧ−２５で精製すると放射性の高分子量のピークが得られた。然しゲル電気泳動では何らの放射性バンドも認められなかった。カリクレインメツセージに冨んだマウス唾液腺ポリ（Ａ）”ｍＲＮＡへの、カリクレインオリゴヌクレオチドのハイブリッド形成能を試験しＩ：ｆｉｌ１０ニトロセルロースフィルターにポリ（Ａ）′″ｍＲＮＡを１ドツト当り１μりから低濃度へ種々の濃度でドツトした。ついで標準的な方法でけい光体オリゴヌクレオチドを５′−末端で５２Ｐ標識し、これを使用してニトロセルロースフィルターをプローブした。短いリンカ−鎖を含んだけい光体オリゴヌクレオチドを使用して高度ストリンジエンシー条件下でニトロセルロースフィルターをプローブすると、何ら信号を認められなかった。然し中程度ストリンジエンシー条件を用いると、５′に単一標識したグローブでは、通常の修飾しなかったプローブで得られたのと同等の強度の信号が得られ（第５図）、一方、多重標識プローブでは感知し得る信号はこの条件でも得られなかった。低ストリンジエンシー条件および最低ストリンジエンシー条件下で多重標識プローブとハイブリッド形成させると、信号は標準プローブより、それぞれ１０倍および３倍少なかっｔ：。これらの結果から、ハイブリダイゼーション信号を起こすのは混入している少量の漂準プローブではなく、けい光で標識したプローブそのものであることが判明した。そうでなければ信号は一層ストリンジェンシーの高いハイブリダイゼーション条件でも現れるはずである。Ｃ−５鎖を含んだけい光体オリゴヌクレオチドをハイブリッド形成すると、単一標識プローブは標準プローブと同様に高度ストリンジエンシー条件下でもハイブリッド形成した（第６図）。多重標識プローブはこれと同一条件下でほぼ３倍弱い信号を与えた。またけい光で標識したオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション特異性を検査しｌ；。第７図は２種類の単一標識をした（短鎖および長鎖）カリクレインオリゴヌクレオチドを中程度ストリンジエンシー条件下で肝臓ｍＲＮＡおよびｔＲＮＡとハイブリダイゼーシ１ンした成績を、唾液腺ｍＲＮＡのハイブリダイゼーシ會ンと比較した結果を示す。カリクレインでないＲＮＡを含んだ核酸の場合は可視信号が認められず、ハイブリダイゼーシ理ンがカリクレインｍＲＮＡを含んでいる槍ｌ：特異釣であることを示している。［参考文献〕１、　スミス、Ｌ、Ｍ、、フ７ング、Ｓｌ、バンカピラー、Ｍ、Ｗ、、バンカピラー、Ｔ、Ｊ　、、フッド、Ｌ、Ｅ、（１９８５）；ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ、上３．２４３９−２５０２（Ｓｍｉｔｈ。Ｌ　、Ｍ、、　Ｆ　ｕｎｇ、　Ｓ　、、　Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ、　Ｍ　、Ｗ、　、　Ｈｕｎｋａｐｉｌ　ｌｅｒ、　Ｔ　。Ｊ　、、ａｎｄ　　Ｈｏｏｄ、Ｌ、Ｅ−（１９８５）　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ。上３，２４３９−２５０２）。２、　ヤブロンスキー、Ｅｏ、ムーモー、Ｅ、Ｗ、、チェリス、Ｒ，Ｈ，、ラス、Ｊ　、Ｌ、（１９８６）；ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ、１土、６１１５〜６１２８（Ｊａｂｌｏｎｓｋｉ、Ｅ、、Ｍｏｏｍａｖ、Ｅ、Ｗ、。Ｔｕｌｌｉｓ、Ｒ，Ｈ，ａｎｄ　Ｒｕｔｈ、Ｊ　、Ｌ、　（１９８６）　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１４、　ラス、Ｊ、Ｌ、、モーガン、Ｃ１、パスコ、Ａ、（１９８５）；ＤＮＡ、　　４．９３（Ｒｕｔｈ、Ｊ、Ｌ、、Ｍｏｒ、ｇａｎ、Ｃ，ａｎｄ　Ｐａ５ｋｏ、Ａ、（１９８５）ＤＮＡ　　４．９３）。５、　ヤブロンスキー、Ｅｏ、ラス、Ｊ、Ｌ、（１９８６）；ＤＮＡ、５．８９（Ｊａｂｌｏｎｓｋｉ、Ｅ、　ａｎｄ　Ｒｕｔｈ、Ｊ　、Ｌ、（１９８６）　ＤＮＡ５．８９）。６、　グリーン、Ｔ、Ｗ、（１９８１）；ブロテクティブ・グルーラス・イン・オーガニック・シンセシス、ジョン・ウィリー・＆・サンズ、インコーホレーテッド（Ｇｒｅｅｎｅ、Ｔ　、Ｗ、（１９８１）Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　Ｇｒｏｕｐｓ　ｉｎ　Ｏｒｇａｎｉｃ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ、　Ｊ　ｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ＆　５ｏｎｓ、　Ｉｎｃ、）。７、バローン、Ａ、Ｄ、、タング、Ｊ、−Ｙ、、カルザース、Ｍ、Ｈ，ｃ１９８４）；ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ、１２．４０５１−４０６１　（Ｂａｒｏｎｅ、Ａ、Ｄ、、Ｔａｎｇ、　Ｊ　、　−Ｙ　、　ａｎｄ　Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ、Ｍ、Ｈ、ｃ　１９８４　）　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、上２．４０５１−４０６’ｌ）。８、　リグビー、Ｐ、Ｊ、Ｗ、、ディークマン、Ｍ９、ロデス、Ｃ０、バーズ、　Ｐ、（１９７７）；ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー、１１３．２３７−２５１（Ｒ４ｇｂｙ、Ｐ、Ｊ、Ｗ、Ｄｉｅｃｋｍａｎｎ、Ｍ、、Ｒｈｏｄｅｓ、Ｃ，、ａｎｄ　Ｂｅｒｇ、Ｐ、　（，１９７７）　Ｊ　、Ｍ。１、Ｂｉｏｌ、ｌ　ｌ　３：２３７−２５１）。９、テーラ−１Ｐ、Ｍ、、イルメンシー、Ｒ８、サマーズ、Ｊ、（１９７６）；バイオロジー・工・バイオロジー・アクタ、４４２゜３２４〜３２０（Ｔａｙｌｏｒ、Ｐ、Ｍ、、　ｌ　ｌｌｍｅｎｓｅｅ、Ｒ，、ａｎｄ　Ｓｕｍｍｅｒｓ、　Ｊ　、（１９７６）　Ｂｉｏｃｈｉｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ　４４２　：３２４Ｊ、Ｗ、、フィッシャー、Ｅ、Ｆ、、ゴールドマン、Ｒ，Ａ、、デ・ハセツ、Ｐ、Ｌ、、マンチェツキ、Ｗｏ、マツクツチ、Ｍ、Ｄ、、ローゼンタール、Ｍ、Ｓ、、スタビウスキー、＆、（１９Ｂ　２）；コールド・スプリング・ハーバ−・シンポジウム；クオンテイタティブ・バイオロジー、４７　、４１１〜４１８　（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ。Ｍ、Ｈ、、Ｂ　ｅａｕｃａｇｅ、　Ｓ　、Ｌ　、、　Ｅｈｅａｖｉｔｉｍ、　Ｊ　、Ｗ、　Ｆ　１ｓｈｅｒ、　Ｅ　、Ｆ　、。Ｇｏｌｄｍａｎ、Ｒ，Ａ、、ｄｅ　　ＨａｓｅＬｕ、Ｐ、Ｌ、、Ｍａｎｃｈｅｃｋｉ、Ｗ、、Ｍａｔｔｋｕｃｃｉ、Ｍ、Ｄ、、Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ、Ｍ、Ｓ、、　ａｎｄ　　５ｔａｂｉｕｓｋｙ、＆、（１９８２）　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｓｙｍ、Ｑｕａｎｔ、旧ｏ、４７：４１１−４１８）。１１、メルトン、Ｄ、Ａ、、クリーブ、Ｐ、Ａ、、レバリアチ、Ｍ、Ｒ，、マニアナイス、Ｔ１、ジン、Ｋ１、グリーン、Ｍ、Ｒ，（１９８４）；ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ、１２，７０３５〜７０５６（Ｍｅｌｔｏｎ、Ｄ、Ａ、、Ｋｒｉｅｇ、Ｐ、Ａ、、Ｒｅｂａｇｌｉａｔｉ、Ｍ、Ｒ，。Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、、　Ｚ　ｉｎｎ、　Ｋ　、、　Ｇｒｅｅｎ、Ｍ、　Ｒ、（１９８４）Ｎ　ｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、上２ニア０３５−７０５６）。１２、ロワシー、Ｒ８、サンブソン、Ｊ８、ミリガン、Ｊｏ、ブレーベ、Ｄｏ、オーレンベツク、ｏ、ｃ、（１９８６）；ｒストラフチャー・アンド・ダイナミックス・オブ・ＲＮＡ、ＮＡＴＯ−ＡＳ　Ｉシリーズ、ｌｌ０Ｊ、６９〜７６頁、ファン・クニッベウバーグ、Ｐ、Ｈ，およびヒルバーズ、Ｃ，Ｗ、＠、ブレムナム・プレス・ニュヨーク（Ｌｏｖａｒｙ、Ｐ、、Ｓａｍｐｓｏｎ、　Ｊ　、、Ｍｉｌｌｉｇａｎ、　Ｊ　、。Ｇｒｏｅｂｅ、Ｄ　、　ａｎｄ　０ｈｌｅｎｂｅｃｋ、Ｏ，Ｃ、ｃ　ｌ　９８６　）“Ｓ　ｔｒｕｃｔｕｒｅａｎｄ　Ｄｙｎａｍｉｃｓ　ｏｆ　ＲＮＡ、ＮＡＴＯ、ＡＳ　Ｔ　　５ｅｒｉａｓ　１１０”ｐｐ、６９−７５　、　ａｄ、　ｖａｎ　Ｋｎｉｐｐｅｕｂｅｒｇ、Ｐ、Ｈ，ａｎｄ　ＨＮｂｅｒｓ。Ｃ、Ｗ、、　Ｐ　Ｉｅｎｕｍ　Ｐ　ｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）。１３、スチル、Ｗ、Ｃ、、カー２、Ｍｌ、ミトラ、Ａ、（１９７８）；ジャーナル・オブ・オーガニック・ケミストリー、４３．２９２３−２９２５（Ｓｔｉｌｌ、Ｗ、Ｃ，、Ｋａｈｎ、Ｍ、　ａｎｄ　Ｍｉｔｒａ、Ａ、（１９７８）　Ｊ　、Ｏｒｇ、Ｃｈｅｍ、土３．２９２３−２９２５）。１４、テツサー、Ｇ、１．、フィッシャー、Ｈｏ、シュワイツァ−１Ｒ。（１９７４）；ヘルベチ力・キミ力・アクタ、５７，１７１８〜１７３０（Ｔｅｓｓｅｒ、Ｇ、　Ｉ　、、Ｆ　１ｓｃｈｅｒ、Ｈ，ａｎｄ　Ｓｃｈｗｙｚｅｒ、Ｒ。（１９７４）　Ｈｅ１ｖ、Ｃｈｉｍ、Ａｃｔａ　５７．１７１８−１７３０）。１５、ファン・リーラエン、Ｂ、Ｊ　、、ユバンス、Ｂ、Ａ、、トレギャ、Ｇ、Ｗ、、リチャーズ、Ｒ，Ｉ　、（１９８６）；ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、２６１．５５２９〜５５３５（ｖａｎ　Ｌｅｅｕｗｅｎ、Ｂ、Ｊ　、、Ｅｖａｎｓ、Ｂ、Ａ、、Ｔｒｅｇｅａｒ　Ｇ、Ｗ。ａｎｄ　Ｒｉｃｈａｒｄｓ、Ｒ，ｌ　、（１９８６）　Ｊ　、Ｂｉｏ、Ｃｈｅｍ、２６上、５５２９−５５３５）。１６、ザヤック弓、Ｄ１、ベンジ２−５Ｊ１、メーソン、Ｔ４、トレギア、Ｇ、Ｗ、、コークラン、Ｊ、Ｐ、、マーチン、Ｔ、Ｊ、（１９８６）；ジャーナル・オブ・クリニカル・エンドクリノロジー・アンド・メタポリズム、■、１０３７〜１０４３　（Ｚａｊａｃ。Ｊ　、　Ｄ　、、　Ｐ　ｅｎｓｃｈｏｗ、　Ｊ　、　、Ｍａｓｏｎ、　Ｔ　、、　Ｔｒｅｇｅａｒ、　Ｇ　、Ｗ、、　Ｃｏｇｈｌａｎ、　Ｊ　、Ｐ、　ａｎｄ　　Ｍａｒｔｉｎ、Ｔ、Ｊ　、（１９８６）　Ｊ　、Ｃｌ１ｎ、Ｅｎｄ、Ｍｅｔａｂ、６２．１０３７−１０４３）。１７、ネイアン、Ｒ，Ｃ，、フルオレセント・プロティン・トレーシング、第４版、チャーチル・リビンクグストン、ニシンバラ、１９７６　（Ｎａｉｒｎ、　Ｒ、Ｃ、Ｆ　１ｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｔｒａｃｉｎｇ、　４　ｔｈＥ　ｄ、　、　Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ　Ｌ　ｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ、　Ｅ　ｄｉｎｇｂｕｒｇｈ、　ｌ　９７６　）。１８、ロビング、Ｍ、Ｊ、、パール、Ｐ、Ｊ　、（１９８３）；ジャーナル・オブ・オーガニック・ケミストリー、４ｇ、１８５４〜１８６２（Ｒｏｂｉｎｓ、Ｍ、Ｊ　、　ａｎｄ　Ｂａｒｒ、Ｐ、Ｊ　、Ｃ１９８３）　Ｊ　、Ｏｒｇ。Ｃｈｅｍ、４８．１８５４−１８６２）。１９、スブａ−ト、Ｓｌ、ベイト、Ｍ、Ｊ　、（１９８４）；オリゴヌクレオチド・シンセシス（ア・プラクティカル・アプローチ）、ベイト、Ｍ、Ｊ、編、８３〜１１６頁、ＩＲＬプレス、オックスフォード（Ｓｐｒｏａｔ、Ｓ、　ａｎｄ　　Ｂａ１ｔ、Ｍ、Ｊ　、（１９８４）　０１１ｇ。ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　（ａ　ｐｒａｃｔｉｃａｌ　ａｐｐｒｏａｃｈ）、Ｂａ１ｔ、Ｍ。Ｊ　、　ｅｄ、ｐｐ、８３−１１６．　Ｉ　ＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、０ｘｆｏｒｄ）。２０、ベンショー、Ｊ、Ｄ、、ハララムビデイス、Ｊ９、アルドレッド、Ｐ３、トレギア、Ｇ、Ｗ、、：＋−’）５ン、Ｊ、Ｐ、（１９８６）；／ソッズ・イン・エンジモロジー、１２４．５３４〜５４８　（Ｐｅｎｓｃｈｏｗ、　Ｊ　、　Ｄ　、、　Ｈａｒａｌａｍｂｉｄｉｓ、　Ｊ　、　、　Ａ　Ｉｄｒｅｄ、　Ｐ　、、　Ｔ　ｒｅｇｅａｒ。Ｇ、Ｗ、　ａｎｄ　Ｃｏｇｈｌａｎ、　Ｊ　、Ｐ　、ｃ　１９８６　）　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙ＋＋＋０１０ｇ？上λ土、５３４−５４８）。田ｃｏ　　　　　　　　　Ｏ国際調査報告

Claims

【特許請求の範囲】

（１）式（Ｉ） ▲数式、化学式、表等があります▼（Ｉ）［式中、ＹはＨまたはＯＨ、または保護基を有するヒドロキシ基、ＸはＨ、ホスホネート基、または式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （ここで、Ｒ１およびＲ２は同一または異なってもよく、分枝しまたは分枝していないアルキルおよび置換アルキルから選ばれ、Ｑはリン酸保護基である）で示されるホスホアミダイト基、ＺはＨ、ホスフェートまたはトリホスフェート基、またはヒドロキシ保護基、Ｘ′は分枝しまたは分枝していないＣ１〜１６アルキル基、Ｒはアミノ保護基またはけい光団またはその他の非放射性の検出可能なマーカー、またはＹ′ＮＨＡ基（ここで、Ｙ′は分枝しまたは分枝していないアルキル（Ｃ１〜１０）カルボニル基、Ａはアミノ保護基またはけい光団またはその他の非放射性の検出可能なマーカーを表わす）である］で示されるヌクレオシド誘導体。
２．Ｒ１およびＲ２がいずれもイソプロピル基である請求項１記載のヌクレオシド誘導体。
３．Ｘ′はメチレンでＲはＣＯ（ＣＨ２）ｎＡ（ここで、Ａは請求項１と同意義、ｎは１〜１５）である請求項１または請求項２に記載のヌクレオシド誘導体。
４．ｎが５である請求項３に記載のヌクレオシド誘導体。
５．ＹはＨまたはＯＨ、または保護されたヒドロキシ基、ＸはＰ−Ｎ（ＣＨ２（ＣＨ３）２）２ＯＣＨ３Ｚはジメトキシトリチル、Ｘ′はＣＨ３、ＲはＣＨ２ＣＯ（ＣＨ２）５ＮＨＡ（ここで、Ａは請求項１と同意義）である請求項１記載のヌクレオシド誘導体。
６．ＹはＨ、ＯＨ、または保護されたヒドロキシ基、ＸはＨ、Ｚはトリホスフェート、Ｘ′はＣＨ２、ＲはＣＯ（ＣＨ２）５ＮＨＡ（ここで、Ａは請求項１と同意義）である請求項１に記載のヌクレオシド誘導体。
７．Ｑがメチル、フェニル、置換フェニル、ベンジル、およびシアノエチル基から選ばれた請求項１〜６のいずれかに記載のヌクレオシド誘導体。
８．非放射性の検出可能なマーカーがビオチン、アビジン、コロイド金またはコロイド銀、およびフェリチンから選ばれたものである請求項１〜７のいずれかに記載のヌクレオシド誘導体。
９．非放射性の検出可能なマーカーが酵素である請求項１〜７のいずれかに記載のヌクレオシド誘導体。
１０．酵素がβ−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、ペルオキシダーゼ、またはアルカリ性ホスファターゼである請求項９に記載のヌクレオシド誘導体。
１１．けい光団がフルオレセインである請求項１〜７のいずれかに記載のヌクレオシド誘導体。
１２．けい光団がけい光を抑制する１またはそれ以上の基を含んでいるが、これらの基を除くとけい光を発することが可能なけい光団前駆体である請求項１〜７のいずれかに記載のヌクレオシド誘導体。
１３．下記の式： ▲数式、化学式、表等があります▼ を有する請求項１２に記載のヌクレオシド誘導体。
１４．式（ＩＩ）： ▲数式、化学式、表等があります▼（ＩＩ）［式中、ＸおよびＺは請求項１の記載と同意義である〕で示される５−ヨードウリジンまたは５−ヨードデオキシウリジンを式Ｈ−Ｃ≡毎ＣＸ′ＮＲ［式中、Ｘ′およびＲは請求項１の記載と同意義である〕で示されるアミノアルキンと、パラジウム触媒の存在下で反応させることからなる請求項１に記載の式（Ｉ）のヌクレオシド誘導体の製造方法。
１５．式（ＩＩＩ） ▲数式、化学式、表等があります▼（ＩＩＩ）［式中、Ｘ′、ＹおよびＲは請求項１の記載と同意義である］で示される１またはそれ以上のヌクレオチド単位を含んでなるポリヌクレオチド。
１６．個々のヌクレオチドまたはヌクレオチド群を成長しつつあるヌクレオチド鎖へ逐次結合させることからなる請求項１５に記載のポリヌクレオチドの製造法であって、該ヌクレオチドの少なくとも１つが請求項１に記載のヌクレオシド誘導体であることを特徴とする方法。
１７．（ａ）第１のポリヌクレオチド、（ｂ）第１のポリヌクレオチドの一部とハイプリダイズする第２のポリヌクレオチド、（ｃ）１またはそれ以上のヌクレオチドトリホスフェート、（ｄ）ＤＮＡポリメラーゼまたはＲＮＡポリメラーゼを反応させることからなる請求項１６に記載の製造法であり、該第２のポリヌクレオチドの３′末端からポリヌクレオチドが合成され、該ヌクレオチドトリホスフェートの少なくとも一つが請求項１記載の式（Ｉ）のヌクレオシド誘導体（Ｚはトリホスフェート、Ｘは水素）であることを特徴とする方法。
１８．ヌクレオチドを互いにそれぞれの５′および３′によって逐次結合することからなる請求項１６に記載の方法であって、該ヌクレオチドの少なくとも１つが請求項１に記載の式（Ｉ）［式中、Ｘはホスホネート、または式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （ここで、Ｒ１、Ｒ２およびＱは請求項１と同意義である）で示される基から選ばれる］のヌクレオシド誘導体であることを特徴とする方法。
１９．（ａ）（ｉ）ポリデオキシヌクレオチド、（ｉｉ）ポリデオキシヌクレオチド（ｉ）の一部とハイプリダイズし得るポリデオキシヌクレオチドプライマー、（ｉｉｉ）ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、（ｉｖ）ｄｄＡＴＰ、（ｖ）ＤＮＡポリメラーゼまたはＤＮＡポリメラーゼのクレノー断片、からなる第１の反応混合物を用意し、（ｂ）ｄｄＡＴＰをｄｄＧＴＰに置き代えた以外は第１の反応混合物と同一である第２の反応混合物を用意し、（ｃ）ｄｄＡＴＰをｄｄＣＴＰに置き代えた以外は第１の反応混合物と同一である第３の反応混合物を用意し、（ｄ）ｄｄＡＴＰをｄｄＴＴＰに置き代えた以外は第１の反応混合物と同一である第４の反応混合物を用意し、（ｅ）上記の反応混合物を別々にインキュベートして、それぞれのポリデオキシヌクレオチドプライマーをその３′末端から伸長させ、種々の鎖長のポリデオキシヌクレオチド群を作成し、この場合、伸長しつつある鎖へジデオキシヌクレオチドが挿入されることによって新たに合成される各ポリデオキシヌクレオチドにおけるヌクレオチド数が決定され、（ｆ）ゲルマトリックスを通過させることにより反応混合物（ａ）〜（ｄ）を分画する、各工程からなり、ポリデオキシヌクレオチドプライマー（ｉｉ）が１またはそれ以上の請求項１３に記載の式（ＩＩＩ）のヌクレオチド単位（ここで、ＲおよびＡはけい光団またはその他の非放射性の検出可能なマーカーである）を含有するポリデオキシヌクレオチドであり、そして／または上記の各反応混合物が請求項１に記載の式（Ｉ）のヌクレオシド誘導体（ここで、Ｚはトリホスフェート、Ｘは水素、ＲまたはＡはけい光団またはその他の非放射性の検出可能なマーカーである）を含有しており、それによってけい光団またはその他の非放射性の検出可能なマーカーが新たに合成された各ポリデオキシヌクレオチドへ挿入されること、および新たに合成されたポリデオキシヌクレオチドに含まれたけい光団またはその他の非放射性の検出可能なマーカーの検出によって、ゲルマトリックスで分離した新たに合成されたポリデオキシヌクレオチドの相対的な位置を確認し、このようにして第１のポリヌクレオチドのＤＮＡ配列を明らかにすることを特徴とするＤＮＡの配列決定方法。
２０．新たに合成したポリヌクレオチド鎖が光源からの照射によって誘発されたけい光により検出される少なくとも１個のけい光団を含んでいる請求項１９に記載の方法。
２１．反応混合物（Ａ）〜（Ｄ）がそれぞれ異なった発光極大または異なった非放射性の検出可能なマーカーを有している請求項１９または２０に記載の方法。