JPH0251151B2 - - Google Patents
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、反応媒体の表面積を拡大せしめる媒
体用エレメント担体を用いてなる微量の生体成分
の多成分同時測定法に関する。従来より、抗原
（パプテンを含む）と抗体とに基く免疫反応や薬
物やホルモン等の物質とレセプターとに基くレセ
プター反応など（以下、免疫反応と略す）により
定量的に測定する手段は数多く知られている。 このような方法としては、主として血清、尿、
唾液などの体液中に微量に存在する成分の定量、
定性などに応用されてきた。 微量の成分としては、生体内成分としての種々
のホルモン類、それらに対するレセプター、生体
内酵素、病態における特異的成分、投与された薬
物やそれらに対するレセプター、さらにこれらの
代謝物、その他、細菌やウイルスなどの微生物、
これらに対する抗体など種々の生体内に存在する
微量成分が挙げられる。 そのような微量成分は、主として抗原抗体反応
などの免疫反応、例えばホルモンとそれに対する
抗体またはレセプターを応用して測定されてい
る。 免疫反応の結果、それらの結合物が不溶性にな
つたり、多数の抗原−抗体分子からなる大きな集
合体が形成されることを利用する方法は、すでに
古典的な方法として知られている。 これらは反応管内に沈澱する量を直接測定する
方法や、ゲル内で沈降される免疫拡散法、あるい
は補体を用いる方法などの種々の方法により測定
されている。また、抗原、抗体やレセプターを何
んらかの方法で標識しておき、免疫反応せしめた
後その標識活性を測定する種々の方法もよく知ら
れている。これらの内でも高感度測定法として広
く用いられる方法に放射性物質を標識物質とする
ラジオイミユノアツセイ（RIA）がよく知られて
おり、また、RIAは放射性物質を利用するもので
あるがより安全な代りうる方法としてこの放射性
物質標識の代りに酵素で標識したものを用いる測
定法、即ち酵素免疫測定法（EIA）が近年広く利
用されている。 EIAは、抗原または、抗体やレセプターなどの
受容体に酵素を結合させておき、その酵素活性を
標識として免疫反応の程度を測定し、その結果か
ら抗原または受容体の量を測定しようとするもの
である。このような場合、測定すべき成分に対し
て特異的結合能を有する受容体または抗原を用
い、これに測定すべき成分としての抗原または受
容体と酵素標識した抗原または受容体を競争反応
せしめ、次いで免疫反応によつて生じた結合物と
非結合物とを分離し、または分離することなくそ
の酵素活性を測定する場合や、測定すべき物質に
対して特異的結合能を有する受容体または抗原を
用い、これに測定すべき抗原または受容体を反応
せしめ、次いでその結合物に酵素標識した抗原に
対して結合能を有する化合物または受容体に対し
て結合能を有する化合物を反応せしめてサンドイ
ツチせしめその後、その酵素活性を測定する場合
などがある。 このような種々の免疫反応を利用するに当つ
て、従来では、測定すべき成分の１つに対して１
つの反応を行なつているにすぎず、多種の成分を
測定するには非常の多くの欠点があつた。即ち、
多種成分測定に当つては、目的とする成分の個数
相当分の血清等の多量の試料を必要とし、かつ各
測定を各々行なうために用いる試薬類も多種多様
のものとなり、さらに長時間を要するものであつ
た。これに対し、担体に２種の抗体を固定化した
固相体を用い、これに測定すべき２種類の抗原を
含む試料を加えて反応せしめ、まずその間の１種
の抗原の標識化合物を反応せしめ、その標識活性
を測定し、次いでその後、他の１種の抗原の標識
化合物を反応せしめ、この標識活性を測定してな
る方法（特開昭56−78598号同52−15815号、同56
−96248号参照）が知られている。これらの測定
法では、従来から固相体として使用されていたビ
ーズと試験管を抗体として利用するか、区別し得
る種々の粒子径の微粒子を担体として利用する
か、またはビーズや微粒子の代わりに複数のフイ
ンを有する担体を用いて、この担体上に２種また
はそれ以上の抗体を固定化せしめた固相体を用い
るために、微量成分を極めて少量の試料を対象と
して反応せしめることが困難であり、かつこの固
定化された抗体の力価の算出が極めて困難であ
り、また測定に当つても、各々の成分を順次測定
するための反応を要することから、従来に比べ、
より長時間の測定時間を必要とする欠点を生じる
ものであつた。 本発明者らは、生体内の種々の微量成分を、簡
便かつ短時間に正確に多成分にわたつて同時測定
し得る方法について研究開発したものであつて、
その目的とするところは免疫反応のための反応管
を１つの担体とし、かつ免疫反応の反応媒体に加
えられる担体として、その担体が反応管の免疫反
応部に挿入可能な形状であつて、外径が反応管の
内径と僅かな間〓を保つように形成され、反応管
とエレメント担体と間〓が同一となるように形成
されたもので、反応媒体の表面を拡大せしめる媒
体用エレメント担体であつて、この担体を１以上
の担体として用いることにより、少量の試料を対
象として反応せしめるに当たり、媒体用エレメン
ト担体により微少量の試料液を含む反応媒体の表
面積を拡大せしめながら反応せしめる得ることが
できるもので、微少量の試料液にて測定でき、簡
便で、良好な多成分同時測定法を提供するもので
ある。 本発明は、EIAおよびRIAにも応用でき、また
競争反応やサンドイツチ免疫反応にも応用できる
ものである。まず本発明に使用される担体の１つ
の反応管としては、従来より種々のEIAやRIAに
おいて用いられる免疫反応用の反応試験管等のも
のであればよく、例えば、ガラス製やプラスチツ
ク製のものが任意の形にて用いられているもので
ある。また、エレメント担体としては、その担体
が反応管の免疫反応部に挿入可能な形状であつ
て、外径が反応管の内径と僅かな間〓を保つよう
に形成され、反応管とエレメント担体と間〓が同
一となるように形成されたもので、反応媒体の表
面積を拡大せしめる媒体用エレメント担体であつ
て、適宜１以上の分割可能な形状であればよく、
また免疫反応の際、測定すべき成分と特異的結合
能を有してなる受容体または抗原を固定化し得る
もので、前記反応管内に加える形状のものであれ
ばよく、通常、ガラス製、不溶性多糖類、不溶性
蛋白質など種々のものが、粒状、板状、弾丸状、
槍形状などの形状にて用いられる。 本発明で使用されるこのような担体としては、
一般のEIAやRIAに用いられる不溶性担体が使用
される。特に抗体や抗体のフラグメントである
Fab′などを不溶化するに当つては、一般的に云
つて不溶性担体に結合させる対象が抗体蛋白質で
あるから、酵素蛋白質を固定化する固定化酵素の
製造の場合に用いられる担体の様なものが使用さ
れる。この担体としては、例えばグルタルアルデ
ヒドなどにて処理してなるアルブミンやゼラチン
などの不溶性蛋白質担体、アガロース、セルロー
スやデキストリンなどのエピクロルヒドリン処理
または臭化シアン処理、さらにそれらのアミノ化
試薬処理してなる不溶性半合成高分子担体（多糖
類）、アクリロニトリル、アクリル酸、アクリル
酸エステル、メタアクリル酸、メチルメタアクリ
ル酸、ビニルアルコール、酢酸ビニル、スチレ
ン、アミノスチレン、ジビニルベンゼン、アクリ
ルアミド、エチレン、無水マレイン酸、クロトン
酸などのポリマーまたはコポリマー、さらにそれ
らのアミノ化試薬処理してなる不溶性合成高分子
担体（高分子樹脂）、その他アミノ化試薬処理し
てなるシラン化合物などの不溶性無機担体などの
官能基に基いて結合せしめて使用してもよい。ま
たこの不溶性担体にアミノ基などを導入する手段
としては公知の種々の手段を用いればよく、例え
ばニトリル基の還元によるアミノ化、水酸基のγ
−アミノプロピルトリエトキシシランの反応によ
るアミノアルキル基の導入、またはヒドロキシメ
チル基の過ヨウ素酸酸化によるアルデヒド基への
変換、さらにそのアルデヒド基にジアミンを反応
せしめてなるアミノ基の導入、多糖類水酸基の臭
化シアン反応によるイミドカルボナート基への変
換、アミド基のハロゲン化リン化合物によるイミ
ノハロゲニド基への変換、さらにこの官能基を官
能基導入試薬にて処理して新たに官能基を適宜導
入してもよい。これらの不溶性担体において、ナ
イロン、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、塩
化ビニル等の高分子樹脂、セルロース、デキスト
ランなどの不溶化多糖体、ガラス等の無機材質等
が加工するのに好適なものとして例示される。こ
のような担体におけるエレメント担体は、弾丸状
あるいは槍形状その他これに類する形状のもので
もよいが、他の固体成形物例えば金属、プラスチ
ツクの表面に本発明のエレメントの形状が保持さ
れるように付着形成されたもので、用いる免疫反
応管と同形状の反応媒体の表面積を拡大せしめる
ための媒体用エレメントが好ましい。 次に本発明のエレメント担体について図面を参
照しながら説明する。 第１図はエレメント担体としての媒体用エレメ
ント担体を符号１として総括的に示してある。エ
レメント担体１は、例えばナイロン６，６の高分
子樹脂材料から成り、エレメント本体２と該本体
２の上面部２ａの中央部に突出して設けられた取
付脚３とから構成されている。取付脚３には、他
の操作棒（図示せず）が取付けられるが、取付脚
３自体を操作棒として使用するために延長させた
形状であつてもよい。エレメント本体２は弾丸状
に成型されていて、その外径は反応管４の内径と
僅かな隙間を保つ様な径に形成してある。エレメ
ント本体２の下周面の頂部にはクサビ状の突起５
が設けてあつて、該突起５により、エレメント本
体２の弧状外周面２ｂと反応管４との弧状内周面
４ａとの間に一定の間隙部６が保持されているよ
うになつている。また、このクサビ状の突起５の
代わりに凸状の突起としてもよい。要は突起５に
より、エレメント本体２が反応管４の弧状内周面
４ａと密着状態となることを防止し得る形状であ
ればよい。この突起部の高さとしては、エレメン
ト本体２と反応管４の管内壁面との幅とが同一と
なればよい。エレメント本体２の上面部２ａに
は、第２図に示すように、取付脚３を中心にして
四角形状に切り込み溝８が付設してあつてもよ
い。切り込み溝８の終端はエレメント本体２の周
縁部に開口させてあつて、上面部２ａの延長線上
での反応液の表面張力を弱めるように考慮してあ
る。またこの切り込み溝８の溝形状としては、断
面形状が半円状、楕円状、台形状、三角形状、四
角形状などのいずれの形状であつてもよい。 本発明のエレメント担体は、上記の様な構造で
あるため、反応管に入れた反応液中にエレメント
本体を浸漬させれば、エレメント本体の突起が反
応管の内底面に接触してエレメント本体の外周面
とそれに対応する反応管の内周面との間に僅かな
隙間が形成される（第１図参照）。したがつて、
反応液量が少量であつてもエレメント本体の浸漬
によつて、その液が隙間部に案内されるとともに
エレメント本体の上面部にまで上昇された反応液
は切り込み溝内を流れてそれ自体の表面張力作用
を失う。それ故、反応液はエレメント本体の外周
面に均一な条件（一定厚の層の形態）で接触する
ことになる。 上記の様な切り込み溝８の変形例としては、第
３図イに示すように、エレメント本体２の上面部
２ａの半径方向に放射状に配設してもよい。ま
た、他の変形例としては、第３図ロに示すよう
に、エレメント本体２の上面部２ａの直径方向に
直線状に配設してもよい。更に他の変形例として
は、第３図ハに示すように、エレメント本体２の
上面部２ａの円周方向に左右対称の形に配設して
もよい。このように、切り込み溝８は、その終端
が上面部２ａの周縁部に開口されている形状であ
ればよく、また如何なる形状に付設することもで
きる。 第４図はエレメント１の他の変形例を示したも
のである。この例におけるエレメント本体２は槍
形状に成形してある。したがつて、反応管４もエ
レメント本体２に沿うテーパー形状のものが使用
されるもので、種々市販の反応管の形状に従つ
て、そのエレメントを変形、加工すればよい。な
お、エレメント本体２のその他の構造について
は、前記第１図で示した例のものと同じであるた
め、それと構造を同じくする部分には同じ番号を
付し、説明は省略する。 さらに上述の如く、少量の反応液の表面積の増
大を兼用することなく複数の免疫反応を行なわせ
しめるには、複数のエレメントを板状または棒状
の形状になした担体を固相体として用いればよ
い。 この様な反応管やエレメント等の担体に通常公
知の手段を適用して化学的または物理的に抗体ま
たはそのフラグメントもしくは抗原、その他の薬
物の受容体を結合して不溶性抗体等（抗原、受容
体）となし、固相体を調製する。 固相体の調製法としては、前記担体にあらかじ
め抗体等を結合せしめるための官能基を導入して
特定の形状に加工してもよく、または加工した後
に官能基を導入してもよいもので、例えば反応管
やエレメントの担体がナイロン６，６の場合は、
あらかじめ前述の形状に加工し、次いでジメチル
硫酸あるいはイミクロ法による活性化をおこな
い、へキサメチレンジアミン処理、グルタルアル
デヒド処理をおこなつて、抗体等例えば第２抗体
を結合させ、更に第１抗体を免疫反応により固定
化して固相体を得ればよい。また、抗体がデキス
トランゲル、例えばセフアデツクスの場合も、あ
らかじめ前述の形状に加工し、次いでブブロムシ
アン（BrCN）による活性化をおこない、これに
抗体を結合させて固定化する。更にまた、ポリス
チレン等の場合加工後、硫酸で化学的処理した後
固定化するか、または物理的吸着による固定化を
おこなえばよい。またガラス等の場合はγ−アミ
ノアルキルトリエトキシシラン化合物などの有機
アミノ基導入シラン試薬によりアミノアルキルシ
リル化せしめ、このアミノ基に基いて公知の固定
化手段により固定化せしめればよい。さらに一般
に化学的に固定化するに当つては、担体の分子内
の官能基または導入された官能基と、抗体等の分
子内に有する官能基、例えばアミノ基、水酸基、
カルボキシル基、チオール基、アルデヒド基等の
官能基に基いて両者を結合し得る多官能性化合物
が用いられる。この公知の種々の多官能性化合物
としては、例えばヘキサメチレンジイソシアナー
ト、２，４−トルエンジイソシアナートなどのジ
イソシアナート化合物、ヘキサメチレンジイソチ
オシアナートなどのジイソチオシアナート、スク
シンアルデヒド、グルタルアルデヒド、アジポア
ルデヒドなどのジアルデヒド、Ｎ，N′−エチレ
ンビスマレイミド、Ｎ，N′−０−フエニレンジ
マレイミド、ビビスジアゾベンジン、Ｎ，N′−
ポリメチレンビスヨードアセトアミド、ジエチレ
ンマロンイミデート、ジメチルアジピンイミデー
ト、３−（2′−ベンゾチアゾリルージチオ）−プロ
ピオン酸、３−（2′−ピリジル−Ｎ−オキサイド
−ジチオ）プロピオン酸、６−Ｎ〔３−（2′−ベン
ゾチアゾリル−ジチオ）プロピオニル〕カプロン
酸などのスルフイドカルボン酸類またはそのスク
シンイミドエステル、ｐ−ニトロフエニルエステ
ル、酸クロライド、イミデートなどの反応性誘導
体（特願昭53−85900号参照）、マレイミド安息香
酸、マレイミドフエニル酢酸、マレイミドフエニ
ルプロピオン酸などのマレイミドカルボン酸類ま
たはその反応性誘導体などが挙られる。 またこの多官能性化合物は、担体に官能基を導
入するための官能基導入試薬としても使用できる
ものである。 さらにまた、一般的に固相体を得るに当つて
は、例えばPH６〜８の緩衝液やアセトン、メタノ
ール、エタノール、ジオキサン、ジメチルスルホ
キサイド、ジメチルアセトアミド、テトラヒドロ
フランまたはそれらの混合媒体などの不活性媒体
を用いて、冷却または室温にて、担体と多官能性
化合物を反応せしめる。その後必要に応じて洗浄
し、さらに同様の不活性媒体を用いて、さらに抗
体等を加え反応せしめて不溶性担体と抗体等を反
応せしめる。 さらに第２抗体を用いて第１抗体を結合せしめ
てなる抗体−第２抗体−第１抗体結合物を得るに
当つては、例えば目的の形状に加工した抗体を用
いて、上述の如くの固相体を得る手段に基いて、
まず第２抗体を結合せしめる。次いでこれに、第
１抗体を加えて免疫反応に基いて結合せしめれば
よく、このようにして得られた第１抗体の免疫活
性はほとんど劣化されないために特に好ましい固
相体である。 このようにして得られた固相体において、固相
体の２以上を用いるに当つては、例えば反応管固
相体と、１つのエレメント固相体または２以上に
分別可能なエレメント固相体との組合せ、また
は、２以上に分別可能なエレメント固相体の複数
組合せである。特に２以上に分別可能なエレメン
ト固相体としては、例えば第１図に示すエレメン
ト担体の複数を用い、その１つのエレメントに目
的とする抗体等を固定化し、さらに別のエレメン
トには異なる目的の抗体等を固定化して、複数の
異なる抗体等を固定化した固相体を得る。次いで
これらの固相体は、各々の大きさに切断する。例
えば２種のエレメント固相体とする際は、組合せ
た結果において１つのエレメントを構成するもの
であれば適当な大きさにて切断してよく簡単には
各々対称的な半分の大きさに切断したフラグメン
トとすればよく、また面者の濃度が異なる場合に
は、その濃度に準じた比率によつて切断した各フ
ラグメントを用いてエレメントを構成せしめても
よく、例えば1/4の大きさのエレメントフラグメ
ントと3/4の大きさのエレメントフラグメントと
を用いて低濃度部は3/4のフラグメントとし、高
濃度部は1/4のフラグメントとなして接着せしめ
てエレメントとなせばよい。また３種以上のエレ
メント固相体とする際は、各々その数に応じて切
断したフラグメントとすればよく、次いでこれら
のフラグメントを合せて元の形状のエレメントと
して用いればよい。またエレメント固相体のフラ
グメントを組合せるに当つては、単にエレメント
本体の切断面に従つて分別可能な形状として一体
化してもよく、また、各々のエレメントのフラグ
メントの切断面の接合部位にエレメント本体と反
応管との間隙距離を保持せしめるための接合部位
をもつて各フラグメントにより一体化せしめても
よい。 特に、後者の際には、あらかじめエレメント本
体のフラグメントを担体として用い、これに抗体
等を固定化せしめて固相体となすことが好まし
い。さらに前述の複数の板状または棒状のエレメ
ントによる分別可能な担体からなる固相体を用い
るに当つても、各担体の表面全体を固相体として
利用可能なようにその全面に抗体等を固定化せし
めることが好ましく、また各々の固相体において
も接触近辺部位に、間隙距離を保持せしめるため
の接合部位を形成せしめればよい。 さらに測定に当つて用いられる酵素を結合させ
た成分、例えば抗体、抗原、ハプテンなどや放射
性同位元素を結合させた成分は、公知のEIAや
RIAに用いられる標識のための手段が利用され
る。また標識物質としての酵素としては、公知の
種々の酵素、例えば酸化還元酵素、加水分解酵
素、転位酵素、リアーゼ、イソメラーゼ、リガー
ゼに属する酵素が利用できる。 この様にして担体に固定化した不溶性抗体等の
２以上を用いて、この抗原等に対して特異的結合
性を有する測定すべき成分、例えば抗原、抗体の
２以上を測定するためには、公知のEIAまたは
RIAによる測定法が適用される。 例えば使用される小試験管が15×105mm（内径
12.8mm±0.1mm）の場合、エレメントは第５図に
符号ＡないしＩで示す各部寸法のものが使用され
る。すなわち、Ａ：半径６mmの半球部、Ｂ：円柱
部の高さ10mm、Ｃ：円錐状突起部の高さ0.4mm、
Ｄ：円錐状突起の円錐の半径0.5mm、Ｅ：半径
0.75mmの半円状溝、Ｆ：対向する溝間の中心部距
離7.5mm、Ｇ：操作棒を挿着するための凸部の直
径４mm、Ｈ：操作棒挿着孔の直径２mm、Ｉ：操作
棒挿着のための凸部の高さ３mmの寸法にて示され
る円柱部、（高さ10mm、直径12mm）と半径６mmの
半球部から成るエレメント本体で、また分別もし
くは分割可能なものとしたものでもよく、またこ
の条件下では、免疫反応用緩衝液の量は100μ
程度、標識物質を結合させた成分を含有する液は
100μ程度および被検液（血清、尿等）は100μ
程度を用いればよい。また、この際反応液の幅
（厚み）は0.4mmと均一に形成されるものである。
この前述のエレメント本体においては、一つのエ
レメント本体にはインシユリン抗体を固定化せし
め、また他の同一形状のエレメント本体にはグル
カゴン抗体を固定化せしめ、次いで各々のエレメ
ントを同一の形状、即ち第１図の切断形状に切断
した上面形状をして半円形状を有するエレメント
フラグメントとなし、得られた半円形状のインシ
ユリン抗体の固相体のフラグメントと半円形状の
グルカゴン抗体の固相体のフラグメントとを一体
化せしめて分別可能なエレメント本体の固相体と
して用いる。その他の同時測定としての例示とし
ては、例えばα−フエトプロテイン、CEA、フ
エリチンとの同時測定、T3、T4の同時測定、そ
の他種々のステロイド系ホルモンやペプチド系ホ
ルモンなどの適宜な組み合せや種々の特異的抗体
における一体化せしめた分割可能な固相体を用い
ることによりなし得る。また反応管壁を１つの分
割可能な固相体として用いてもよいことも、前述
の記載から明らかである。また反応温度時間は対
象物によつて変るが、例えばインシユリンとグル
カゴンの同時測定の場合は５℃、８−48時間であ
る。一般に測定すべき成分に応じて適当に時間、
温度および測定すべき成分の濃度を選択すればよ
い。さらに、使用される小試験管およびそれに用
いるエレメント大きさに基いて、使用する各液量
を調整すればよい。 血清中のインシユリンおよびグルカゴン含有測
定法を例に挙げると以下のごとくである。 グルカゴン抗体の固相体である反応管用小試験
管（15×105mm、内径12.8mm±0.1mm）に緩衝液
100μ、酵素標識インシユリン液50μおよび酵
素標識グルカゴン液50μおよび一定濃度のイン
シユリンおよびグルカゴン含有液100μを加え、
次いでこれに前記の大きさ、形状のインシユリン
抗体の固相体であるエレメントを加え、５℃で15
時間インキユベーシヨンをおこなう。反応終了後
蒸留水または生理食塩水５mlを加え、このエレメ
ントを洗滌した後、あらかじめ酵素基質液500〜
1000μを分注してある別の小試験管にエレメン
トを移し換え、37℃で30−120分間酵素反応をお
こなう。反応停止液1.5〜2.0mlを加え、反応を停
止させて、エレメントを除き、次いで酵素反応に
基いて消費される成分や生成される成分を測定す
る。また反応管用試験管は、洗浄液をアスピレー
ターまたはデカンテイシヨンにて除去後、上記と
同様に酵素基質液約２〜３mlを加えて酵素反応を
行なわせしめ、次いでその液の吸光度を測定す
る。既知濃度の標識液の吸光度より求めた標識曲
線より被検体試料のインシユリンおよびグルカゴ
ンの量を求める。 以上のようにして測定されるのであるが、更に
詳しく説明を加える。 ６，６−ナイロンを本発明のエレメントの形状
（第５図参照）のもの（以下６，６ナイロン−測
定用エレメントという）を５塩化リンを用いるイ
ミクロ法により活性化し、ヘキサメチレンジアミ
ン、グルタルアルデヒド処理してスペーサー導入
６，６ナイロン−測定用エレメントを得る。この
ものにウサギ抗モルモツトIgG血清のIgG画分を
反応させIgGを固定化する。次いで、これにモル
モツトインシユリン抗体血清を反応させて、６，
６−ナイロン製エレメント−抗モルモツトIgG−
インシユリン抗体を調製する。同様に、ウサギ抗
モルモツトIgG血清のIgG分画を反応せしめて
IgGを固定化せしめた抗体にモルモツトグルカゴ
ン抗体血清を反応せしめて６，６−ナイロン製エ
レメント−抗モルモツトIgG−グルカゴン抗体を
調製する。 次いでこの６，６−ナイロン製エレメント−抗
モルモツトIgG−インシユリン抗体、および６，
６−ナイロン製エレメント−抗モルモツトIgG−
グルカゴン抗体の各固相体をステンレス製カツタ
ーにて半分に切断して半円形状となす。次いで
各々のエレメントフラグメントを合体せしめてエ
レメント本体となす。次いでこのエレメント本体
をβ−ガラクトシダーゼ−インシユリン結合物お
よびβ−ガラクトシダーゼ−グルカゴン結合体お
よび種々の濃度の標識インシユリンおよびグルカ
ゴンまたは両者を含有する血清などと反応させ、
洗滌後このエレメント本体を取り出し、次いで各
フラグメントを分離し、β−ガラクトシダーゼ活
性を測定して標準曲線を作成する。標準インシユ
リンおよびグルカゴンを用いる標準曲線より試料
中のインシユリンおよびグルカゴン含量を同時に
測定する。 このように本発明の分別可能な標識化合物を使
用することにより、極めて少量の試料反応液量で
２以上の免疫反応を短時間で行うことができる結
果、微量の成分を少量の試料量で正確かつ短時間
に測定することができる。 次に測定法の実施例を挙げて説明するが本発明
はこれに限定されるものでないことはいうまでも
ない。 実施例 １ インシユリンとグルカゴンのEIAによる同時測
定 〔固相体［試験管］−Ａの調製法〕 ポリスチレン試験管（15×105mm、内径12.8±
0.1mm）に硫酸２mlを加え、５℃で６時間反応さ
せ、SO3C-基を導入しこれに抗モルモツトIgGウ
サギ血清のIgG画分20μｇを含有する0.1Mリン酸
緩衝液（PH8.0）２mlを加え、５℃で１夜反応せ
しめ、１本当り8μｇ固定せしめた試験管を得た。
次いでこの試験管に抗 16-29グルカゴンフラグメ
ント血清（モルモツト）の30000倍希釈液（0.25
％BSA、５ｍＭ EDTA、３ｍＭ MgCl2、0.15
ｍＭ NaOl、0.1％NaN3含有0.01Mリン酸緩衝
液（PH7.4）よりなる希釈液）２mlを加えて、５
℃で１夜反応して［試験管−抗モルモツトIgG−
16-29グルカゴンフラグメント抗体］結合物を得
た。 〔固相体［エレメント］−Ｂの調製法〕 第５図で示される大きさ、および形状のポリス
チレン製エレメントを硫酸で活性化し、SO3 -基
を導入し、これを抗モルモツトIgGウサギ血清の
IgG画分20μｇを含有する0.1Mリン酸緩衝液（PH
8.0）１mlに浸し、５℃で１夜反応せしめ、１本
当り10μｇのIgGを固定せしめたポリスチレン製
エレメント固相体を得た。 次いでこのエレメント固相体をモルモツトのイ
ンシユリンの抗体を含有する血清の23200倍希釈
液（前項記載）１mlに浸し、５℃で１夜反応せし
めて〔エレメント−抗モルモツトIgG−インシユ
リン抗体〕結合物の固相体を得た。 〔β−ガラクトシダーゼ−インシユリンの調製
法〕 インシユリン60mgを0.1Mリン酸緩衝液（PH
8.0）17mlに溶解し、３−（2′−ベンゾチアゾリル
−ジチオ）プロピオン酸スクシンシイミドエステ
ル6.5mg含有ジメチルホルムアミド1.7mlを加え
て、冷却下１時間反応せしめ、反応後PH5.0とな
して沈澱物を回収し、この沈澱物を0.1Mリン酸
緩衝液（PH7.0）4.0mlに溶解し（インシユリンと
して8.9mg／ml）、このうち10.0μを分取し、こ
れにβ−ガラクトシダーゼ６mgを加えて１時間反
応せしめ、その後この反応液をセフアデツクスＧ
−100を充填したカラム（1.5×120cm）にて
0.15M NaCl含有0.01Mリン酸緩衝液（PH7.4）で
溶出せしめ、その65〜73mlの画分を集めて〔（イ
ンシユリン）−CO−（CH2）2−Ｓ−（β−ガラクト
シダーゼ）〕で略示されるインシユリンのアミノ
基とβ−ガラクトシダーゼのチオール基とによる
インシユリン−β−ガラクトシダーゼ結合物（β
−Gal標識インシユリン）を含有する溶出区分
（インシユリン2.4μｇ／ml、かつβ−ガラクトシ
ダーゼ１分子当り１分子のインシユリンの結合物
であり、かつインシユリン抗体に対し、インシユ
リン結合物の95％の活性を有しているもの）を得
た。 〔β−ガラクトシダーゼ− 19-29グルカゴンフラ
グメントの調製法〕 グルカゴンフラグメント（19−29）0.4mgを50
ｍＭリン酸緩衝液（PH8.0）0.4mlに溶解し、これ
に100ｍＭ EDTA水溶液10μおよび0.1％３−
（2′−ベンゾチアゾリル−ジチオ）プロピオン酸
スクシンシイミドエステル含有ジメチルホルムア
ミド溶液625μを加えて５℃１時間反応せしめ
た。反応後これをセフアデツクスＧ−15（1.5×40
cm）のカラムでゲル過して、その素通り区分を
得た〔グルカゴンフラグメント（19−29）のＮ末
端に３−（2′−ベンゾチアゾリル−ジチオ）プロ
ピオニル基を導入した誘導体を含む〕。次いで、
この３−（2′−ベンゾチアゾリル−ジチオ）プロ
ピオニル基を導入した誘導体20μｇを含有する50
ｍＭリン酸緩衝液（PH7.0）２mlに、β−ガラク
トシダーゼ6.19mg含有50ｍＭリン酸緩衝液（PH
7.0）を加え、室温で１時間反応した。反応液を
セフアデツクスＧ−150（1.5×90cm）のカラムで
ゲル過してその素通り区分を回収してグルカゴ
ンフラグメント（19−29）のＮ末端とβ−ガラク
トシダーゼのチオール基とをもつて結合せしめた
β−ガラクトシダーゼ−グルカゴンフラグメント
（19−29）結合体（純度95％）（β−Gal標識グル
カゴン）を得た。 インシユリンとグルカゴンのEIAによる同時測
定法 固相体−Ａ（試験管）に免疫反応用緩衝液
（0.25％BSA、５ｍＭ EDTA、３ｍＭ MgCl2、
0.15M NaCl、0.1％NaN3含有0.01Mリン酸緩衝
液（PH7.4））100μ、β−Gal標識インシユリン
（インシユリンとして20.0pg）50μ、β−Gal標
識グルカゴン（グルカゴンフラグメントとして
2.0pg）50μ、および標準液（インシユリンとし
て５〜640μ／ml、及びグルカゴンとして25〜
3200pg／mlを有する液）100μを加え、これに
固相体−Ｂ（エレメント）を１個加え、５℃で１
夜反応を行なつた。終了後、蒸留水５mlを加えま
ず固相体Ｂを洗滌しながら引き抜き、あらかじめ
β−ガラクトシダーゼ活性測定液［Ｏ−ニトリフ
エニール−β−Ｄ−ガラクトピラノシド５mg／ml
を有する0.1％BSA、0.15M NaCl、１ｍＭ
MgCl2、0.1％NaN3含有0.01Mリン酸緩衝液（PH
6.7）85部および200ｍＭメルカプトエタノール含
有メタノール溶液15部よりなる溶液］500μを
加えた小試験管に固相体−Ｂを加え、37℃で１時
間反応させた。反応終了後、反応停止液［100ｍ
Ｍグリシン−NaOH緩衝液（PH11.0）］２mlを加
え、反応を停止させ、固相体−Ｂを除いた後、そ
の液の420nｍの吸光度を測定した。次に、固相
体−Ａは、洗滌液をデカンテーシヨンで取り除い
た後、β−ガラクトシダーゼ活性測定液（前記）
２mlを加え、37℃で2.5時間反応させ、反応終了
後、反応停止液［400ｍＭグリシン−NaOH緩衝
液（PH11.0）］500μを加え、反応を停止させ反
応液の420nｍの吸光度を測定しグルカゴンの定
量曲線を作成した。 その結果は、第７図に示す通りで、また第７図
中、〇−〇はインシユリンの定量曲線を示し、△
−△はグルカゴンの定量曲線を示すものであり、
本発明のインシユリン、グルカゴンの同時測定系
はきわめて良好な定量曲線を示すものであつた。
なお、被検試料（血清、血漿等）中のインシユリ
ン、グルカゴンを測定する場合は、標準液100μ
の代わりに試料100μを加え、前記と同様の
操作を行ない、定量曲線と対照することにより試
料中のインシユリン、グルカゴン量を求めた。 実施例 ２ インシユリンとグルカゴンのRIAによる同時測
定 〔固相体［試験管］−Ａの調製法〕 前記と同様に調整した。 〔固相体［エレメント］−Ｂの調製法〕 第５図に示される大きさおよび形状の６，６ナ
イロン製エレメント50個を５塩化リン４ｇとピリ
ジン４ｇを含むベンゼン60ml中で２日間撹拌した
後、４回ベンゼンにて洗滌し、イミクロライド化
した６，６ナイロン製エレメントを得、これに
100ｍＭのヘキサメチレンジアミンを含有する水
溶液（PH11.5）50mlを加えて室温下、１時間反応
せしめ、0.1Mリン酸緩衝液（PH8.0）で充分洗滌
し、さらにこれに４％グルタルアルデヒド含有
0.1Mリン酸緩衝液（PH8.0）50mlを加え、室温下
で１時間反応せしめ、0.1Mリン酸緩衝液（PH
8.0）で洗滌し、スペーサーを６，６ナイロン製
エレメント（50個）を抗モルモツトIgG血清（ウ
サギ）のIgG画分５mgを含有する0.1Mリン酸緩衝
液（PH8.0）50ml中に加えて、５℃１夜反応せし
めて１個当りIgG50μｇを固定せしめたナイロン
製エレメント固相体を得た。 次いで、このエレメント固相体にモルモツトの
インシユリンの抗体を含有する血清の23200倍希
釈液〔0.25％BSA、５ｍＭ EDTA、３ｍＭ
MgCl2、0.15M NaCl、0.1％NaN3含有0.01Mリ
ン酸緩衝液（PH7.4）よりなる希釈液〕50ml（250
mgのインシユリン抗体を含む）を加えて、５℃で
一夜反応して〔ナイロン製エレメント−抗モルモ
ツトIgG−インシユリン抗体〕結合物の固相体−
Ｂを得た。 〔 125I−インシユリンの調製法〕 125I−インシユリンの調製は、W.M.Hunter、
F.C.Greenwoodらの方法〔Nature （London）
194、495（1962）〕に順じておこない、セフアデツ
クスＧ−25のカラム（0.9×20cm）を用いてゲル
過して、 125I−インシユリンを得た。 〔 125I−〔Tyr18〕−グルカゴン（18−29）の調製
法〕 (A) ［Tyr18］−グルカゴン（18−29）の製造 Ｈ−Tyr−Ala−Gln−Asp−Phe−Val−
Gln−Trp−Leu−Met−Asn−Thr−OHの製
造 Boc−Tyr−（Bzl−Cl2）−Ala−Gln−Asp
（OBzl）−Phe−Val−Gln−Trp−Leu−Met−
Asn−Thr（Bzl）−OBzl2.04ｇ（１ｍＭ）にア
ニソール６ml、エタンジチオール0.94mm（10ｍ
Ｍ）、スカトール131mg（１ｍＭ）、ジメチルス
ルフイド0.62ml（10ｍＭ）を加えた。これに、
無水弗化水素（HF）70mlを導入し、０℃で１
時間撹拌後、減圧下でHFを速やかに留去し
た。残査にEt2O100mlを加え生じた沈澱を集め
た。これを、50％酢酸100mlに溶解し、遠心分
離し、上清液を凍結乾燥する。これを8M尿素
溶液20mlと酢酸20mlにて溶解しチオグリコール
酸２mlを加え、45℃で20時間、還元した後、セ
フアデツクスLH−20のカラム（4.2×137cm）
にチヤージし、50％酢酸で溶出した。溶出液を
７mlづつ分画し、74−80本目を集め、凍結乾燥
して［Tyr18］−グルカゴン（18−29）を得た。
収量120mg、Rf20.73（セルロース）、アミノ酸分
析値：Asp1.97(2)、Thr0.95(1)、Gln2.07(2)、
Ala0.98(1)、Val0.94(1)、Met0.98(1)、Leu1(1)、
Phe0.97(1)、Tyr0.94(1)、Trp1.05(1)、上記の原
料は次のようにして製造された。 (1) Ｐ（19−29）Boc−Ala−Gln−Asp（OBzl）
−Phe−Val−Gln−Trp−Leu−Met−Asn
−Thr（Bzl）−OBzl〔１〕 Ｐ（20−29）（特開昭56−81540号公報 実
施例１ 中で合成報告済）12.4ｇ（7.5ｍＭ）
をTFA40ml、ジメチルスルフイド20ml、エ
タンジチオール20ml、およびスカトール983
mgの混液に加え、室温で50分撹拌した後、減
圧下TFAを留去する。残査にエーテルを加
え、生じた沈澱を乾燥DMF150mlとＮ−メチ
ルピロリドン50mlの混液に溶解した。これに
Boc−Ala−OH2.0ｇ（1.4倍当量）HOBt1.4
ｇ（1.4倍当量）およびWSCD1.92ml（1.4倍
当量）を加え、NMMでPH７に調整後、一夜
かきまぜ、さらにDMF50ml、HOBt0.51ｇ、
Boc−Ala−OH0.71ｇ、WSCD0.69mlを加
え、一夜撹拌した。DMFを減圧留去後、氷
水中に投入し、生じた沈澱を熱エタノールで
２回洗浄して目的物11.35ｇ（収率87.8％）
を得た。 TLC；Rf10.75（シリカゲル） アミノ酸分析；Asp1.92(2)、Thr0.88(1)、
Glu1.94(2)、Ala0.88(1)、Val0.91(1)、Met0.95
(1)、Leu1、Phe0.93(1)、Trp0.71(1)、 (2) ［Tyr18］Ｐ（18−29）Boc−Tyr（Bzl−
Cl2）−Ala−Gln−Asp（OBzl）−Phe−Val−
Gln−Trp−Leu−Met−Asn−Thr（Bzl）−
OBzl〔２〕 Ｐ（19−29）〔１〕8.61ｇ（５ｍＭ）を
TFA40ml、ジメチルスルフイド20ml、エタ
ンジチオール20ml、およびスカトール983mg
の混液に加え、室温で50分撹拌した後減圧下
TFAを留去した。残査にエーテルを加え生
じた沈澱をDMF150mlとＮ−メチルピロリド
ン50mlの混液に溶解した。これにBoc−Tyr
（Bzl−Cl2）−OH3.08ｇ（1.4倍当量）
HOBt0.95ｇ（1.4倍当量）、WSCD1.28ml
（1.4倍当量）を加え、NMMにてPH７に調整
後、室温にて48時間撹拌した。DMFを減圧
留去後、氷水を投入し、生じた沈殿を熱エタ
ノールで３回洗浄して目的物9.00ｇ（収率
88.0％）を得た。 TLC；Rf10.76（シリカゲル） アミノ酸分析値；Asp1.90(2)、Thr0.91(1)、
Glu1.96(2)、Ala0.89(1)、Val0.90(1)、Met0.93
(1)、Leu(1)、Phe0.95(1)、Tyr0.92(1)、
Tvp0.68.(1)、 なお、本明細書中に記載の略記号は次の意味
を有する。 Ala；Ｌ−アラニン Gln；Ｌ−グルタミン Asp；Ｌ−アスパラギン酸 Asn；Ｌ−アスパラギン Phe；Ｌ−フエニルアラニン Val；Ｌ−バリン Trp；Ｌ−トリプトフアン Leu；Ｌ−ロイシン Met；Ｌ−メチオニン Thr；Ｌ−スレオニン Boc；ｔ−ブトキシカルボニン Bzl；ベンジル OBzl；ベンジルエステル TFA；トリフルオロ酢酸 NMM；Ｎ−メチルモルホリン DMF；ジメチルホルムアミド HOBt；１−ヒドロキシベンゾトリアゾール WSCD；Ｎ−エチル、N′−３−ジメチルアミ
ノプロピル−カルボジイミド Bzl−Cl2；２，６−ジクロロベンジル また薄層クロマトグラフイー（TLC）の担
体および展開溶媒は、以下のものを用いた。 １；クロロホルム−メタノール−酢酸
（80：25：２）メルク社製シリカゲル
Avt5721、 ２；１−ブタノール−ピリジン−酢酸−
水（15：10：３：12）メルク社製セルロース
Avt5716 (B) 125I−〔Tyr18〕−グルカゴン（18−29）の調
製 前記(A)で得られた［Tyr18］−グルカゴン
（18−29）を用いて、W.M.Hunter、F.C.
Greenwoodらの方法〔Nature（London）194、
495（1962）〕に順じて行ない、セフアデツクス
Ｇ−25のカラム（0.9×20cm）にてゲル過し、
125I−［Tyr18］−グルカゴン（18−29）を得
た。 〔RIAによるインシユリン、グルカゴン同時測
定〕 固相体［試験管］−Ａに免疫反応用緩衝液（前
記）100μ、 125I−インシユリン（インシユリ
ンとして10.0pg）50μ 125I−［Tyr18］−グルカ
ゴン（18−29）（グルカゴンとして4.5pg）50μ、
および標準液（インシユリンとして５〜640μU／
ml）、グルカゴンとして25〜3200pg／ml含有）
100μを加え、これに固相体（エレメント）−Ｂ
を１個加え、５℃で１夜反応をおこなつた。終了
後、生理食塩水５mlを加え、まず固相体−Ｂを洗
滌しながら引き抜き、新しい試験管に移し、その
放射能を測定した。また別に、固相体−Ａは洗滌
液をデカンテーシヨンで取り除いた後、その放射
能を測定した。その結果は第８図に示す通りで、
また第８図中、〇−〇はインシユリンの定量曲線
を示し、△−△はグルカゴンの定量曲線を示すも
ので、本発明のインシユリン、グルカゴン同時測
定系は、きわめて良好な定量曲線を示した。な
お、第８図において横軸は、インシユリン、グル
カゴン濃度、縦軸は、Ｂ／Bo（％）で示した。 実施例 ３ CEAとフエリチンのサンドイツチ法による
EIAでの同時測定 〔固相体［試験管］−Ａの調製法〕 ポリスチレン試験管（15×105mm、内径12.8±
0.1mm）に濃硫酸２mlを加え、５℃で６時間反応
させ、−SO3 -基を導入し、これに抗CEAウサギ血
清のIgG画分50μｇを含有する0.1Mリン酸緩衝液
（PH8.0）２mlを加え、５℃で１夜反応せしめ、
［試験管−EIA抗体］結合物の固相体−Ａを得た。 〔固相体［エレメント］−Ｂの調製法〕 ６，６ナイロン製エレメント50個を30％（Ｖ／
Ｖ）ジメチル硫酸含有メタノール溶液50mlに加
え、37℃で50分間反応し、メタノールで充分洗滌
後、これに100ｍＭヘキサメチレンジアミン含有
水溶液（PH11.5）50mlを加え、室温下１時間反応
せしめ、0.1Mリン酸緩衝液（PH8.0）で充分洗滌
し、さらにこれに４％（Ｖ／Ｖ）グルタルアルデ
ヒド含有0.1Mリン酸緩衝液（PH8.0）50mlを加
え、室温下で１時時反応せしめ0.1Mリン酸緩衝
液（PH8.0）で洗滌し、スペーサーを６，６ナイ
ロン製エレメントに導入せしめた。このエレメン
ト（50個）を抗フエリチンウサギ血清のIgG画分
５mgを含有する0.1Mリン酸緩衝液（PH8.0）50ml
に加えて、５℃１夜反応せしめて［エレメント−
フエリチン抗体］結合物の固相体−Ｂを得た。 〔β−Gal標識フエリチン抗体の調製法〕 フエリチン抗血清より硫安分画でIgG画分を
得、さらにフエリチンを固定化せしめたセフアロ
ース4B抗体を用い、アフイニテイークロマトグ
ラフイーで抗体を精製した。精製抗体４mgを
0.1Mリン酸緩衝液（PH8.0）1.8mlに溶解し、３−
（2′−ベンゾチアゾリル−ジチオ）プロピオン酸
スクシンシイミドエステル14.88μｇ含有ジメチル
ホルムアミド液200μ、及び100ｍＭ EDTA水
溶液20μを加えて、５℃で１時間反応せしめ
た。反応後、これをセフアデツクスＧ−15（1.5×
40cm）のカラムでゲル過して、その素通り画分
を得た［フエリチン抗体のアミノ基に３−（2′−
ベンゾチアゾリル−ジチオ）プロピオニル基を導
入した誘導体を含む］。次いで、この３−（2′−ベ
ンゾチアゾリル−ジチオ）プロピオニル基を導入
した誘導体1.5mgを含有する50ｍＭリン酸緩衝液
（PH7.0）２mlにβ−ガラクトシダーゼ3.33mg含有
50ｍＭリン酸緩衝液（PH7.0）２mlを加え、室温
で２時間反応した。反応液をセフアデツクスＧ−
150（1.5×90cm）のカラムでゲル過してその素
通り画分を回収して、β−ガラクトシダーゼ標識
フエリチン抗体結合体（純度98％）（β−Gal標
識フエリチン抗体）を得た。 〔β−Gal標識CEA抗体の調製法〕 CEA抗血清より硫安分画でIgG画分を得て、さ
らにCEAを固定化せしめたセフアロース4B抗体
を用い、アフイニテイークロマトグラフイーで抗
体を精製した。 精製抗体４mgを0.1Mリン酸緩衝液（PH8.0）1.8
mlに溶解し、３−（2′−ベンゾチアゾリル−ジチ
オ）ピロピオン酸・スクシンシイミドエステル
14.88μｇ含有ジメチルホルムアミド200μ、及び
100ｍＭ EDTA水溶液20μを加えて、５℃で
１時間反応せしめた。反応後、これをセフアデツ
クスＧ−15（1.5×40cm）のカラムでゲル過し
て、その素通り画分を得た［CEA抗体のアミノ
基に３−（2′−ベンゾチアゾリル−ジチオ）プロ
ピオニル基を導入した誘導体を含む］。次いで、
この３−（2′−ベンゾチアゾリル−ジチオ）プロ
ピオニル基を導入した誘導体1.5mgを含有する50
ｍＭリン酸緩衝液（PH7.0）２mlにβ−ガラクト
シダーゼ3.33mg含有50ｍＭリン酸緩衝液（PH7.0）
２mlを加え、室温で１時間反応した。反応液をセ
フアデツクスＧ−150（1.5×90cm）のカラムでゲ
ル過してその素通り画分を回収してβ−ガラク
トシダーゼ標識CEA抗体結合体（純度98％）（β
−Gal標識CEA抗体）を得た。 〔EIAによるCEAとフエリチンの同時測定〕 固相体［試験管］−Ａに免疫反応用緩衝液（前
記）200μ、および標準液（CEAとして2.5〜
160ng／ml、およびフエリチンとして、５〜
320ng／mlを含有）100μを加え、これを固相体
［エレメント］−Ｂを１個加え、37℃で５時間反応
を行なつた。終了後内溶液を吸引除却し、生理食
塩水５mlを加え、固相体−Ａ、Ｂを洗滌した。こ
れにβ−Gal標識フエリチン抗体、およびβ−
Gal標識CEA抗体を含有する免疫反応用緩衝液
300μを含え、室温で18時間反応を行なつた。
終了後、生理食塩水５mlを加え、まず固相体−Ｂ
を洗滌しながら引き抜き、あらかじめβ−ガラク
トシダーゼ活性測定液（前記）500μを加えて
ある小試験管に加え、37℃で３時間反応させた。
反応停止液（100ｍＭグリシン−NaOH緩衝液
（PH11.0）２mlを加え、反応を停止させ、固相体
−Ｂを除いた後、その液の420nｍの吸光度を測
定した。また別に固相体−Ａは、洗滌液をデカン
テーシヨンで取り除いた後β−ガラクトシダーゼ
活性測定液（前記）２mlを加え、37℃で５時間反
応させた。反応停止液（400ｍＭグリシン−
NaOH緩衝液（PH11.0）］0.5mlを加え、反応を停
止させ、反応液の420nｍの吸光度を測定した。
第９図に示す通りで、また第９図中、〇−〇は
CEAの定量曲線を示し、△−△はフエリチンの
定量曲線を示すもので、本発明のCEA、フエリ
チン同時測定系はきわめて良好な定量曲線を示す
ものであつた。 実施例 ４ サイロキシン［T4］とサイロニン［T3］の
EIAによる同時測定 〔固相体［エレメント］−Ａの調製法〕 第６図に示すポリスチレン製エレメントフラグ
メント（第５図にしエレメントを４等分割したエ
レメントフラグメント）を、４個合体（分割可
能）させたエレメントを硫酸で活性化し、SO3 -
基を導入し、これに抗ウサギIgGヤギ血清のIgG
画分20μｇを含有する100ｍＭリン酸緩衝液（PH
8.0）１mlに浸し、５℃で１夜反応せしめ、１本
当り8.4μｇのIgGを固定せしめたポリスチレン製
エレメント固相体を得た。 次いでこのエレメント固相体を抗T4−OMe血
清（ウサギ）の8000倍希釈液（前項記載）１mlに
浸し、５℃で一夜反応せしめて［エレメント−抗
ウサギIgG−T4抗体］結合物の固相体−Ａを得
た。 〔固相体［エレメント］−Ｂの調製法〕 第６図に示す形状と全く同じポリスチレン製エ
レメント（成型時にフタロシアニンブルーを混入
し、淡青色に着色）を前記と同様に処理し抗ウサ
ギIgG−固定化エレメント固相体を得た。次いで
固相体をT3−OEt血清（ウサギ）の20000倍希釈
液１mlに浸し、５℃で一夜反応せしめて［エレメ
ント−抗ウサギIgG−T3抗体〕結合物の固相体−
Ｂを得た。 〔固相体［エレメント］−Ｃの調製〕 再び分割した固相体エレメント−Ａのフラグメ
ント１個と、固相体エレメント−Ｂのフラグメン
ト３個を両端縁が鋭利状で、かつ中央部にストツ
パーを有する連結機にて合体させ、T4、T3−同
時測定用固相体［エレメント］−Ｃを調製した。 〔T4−OMeの調製法〕 T4（シグマ社製）600mgをメタノール15mlに懸
濁し、−10℃で乾燥塩化水素ガスを飽和するまで
吹きこんだ後、室温で20時間撹拌した。さらに０
℃で乾燥塩化水素ガスを吹きこんだ後、析出した
沈殿をろ取し、塩化水素ガス含有メタノールで洗
滌後固体水酸化ナトリウムを入れたデシケーター
で、減圧乾燥後、メタノール−エーテルで再結晶
して、目的のT4−OMe582.5mg（収率91.2％）を
得た。 〔β−Gal標識T4−OMeの調製法〕 T4−OMe2mgを90％ジメチルホルムアミド、10
％100ｍＭリン酸緩衝液（PH8.0）２mlに溶解し、
３−（2′−ベンゾチアゾリルジチオ）プロピオン
酸スクシンシイミドエステル1.78mg含有ジメチル
ホルムアミド1.78mlを加えて、冷却下１時間反応
せしめた。反応液をLH−20（1.5×40cm）のカラ
ムに添加し、90％ジメチルホルムアミド、10％
100ｍＭリン酸緩衝液（PH5.0）の溶媒でゲル過
を行なつた。溶出液を２mlづつ分画し、T4のア
ミノ基に３−（2′−ベンゾチアゾリル−ジチオ）
プロピオニル基を導入した誘導体を含む画分（12
〜15本目）を集めた。 次いで、この３−（2′−ベンゾチアゾリル−ジ
チオ）プロピオニル基を導入した誘導体8μｇを
含有する90％リン酸緩衝液（PH8.0）10％ジメチ
ルホルムアミド液２mlにβ−ガラクトシダーゼ２
mgを加え、室温で２時間反応せしめた。反応液を
セフアデツクスＧ−150（1.5×90cm）のカラムに
添加し、0.15M NaClを含有する10ｍＭリン酸緩
衝液（PH7.4）でゲル過を行ない、その素通り
画分を回収して、T4のアミノ基とβ−ガラクト
シダーゼのチオール基とをもつて結合せしめたβ
−ガラクトシダーゼ−T4−OMe結合体（純度93
％）（β−Gal標識T4−OMe）を得た。 〔T3−OEtの調製法〕 T3（シグマ社製）500mgをエタノール15mlに懸
濁し、−10℃で乾燥塩化水素ガスを飽和するまで
吹きこんだ後、室温で20時間撹拌した。反応液を
ろ過し、ろ液を減圧濃縮し、ベンゼンを加え、析
出した沈殿を集め乾燥した。さらにベンゼンに懸
濁洗滌して、目的のT3−OEt515mg（収率93.7％）
を得た。 〔β−Gal標識T3−OEtの調製法〕 T3−OEt2mgを90％ジメチルホルムアミド、10
％リン酸緩衝液（PH8.0）２mlに溶解し、３−
（2′−ベンゾチアゾリルジチオ）プロピオン酸ス
クシンシイミドエステル2.06mg含有ジメチルホル
ムアミド2.06mlを加えて、冷却下１時間反応せし
めた。反応液をLH−20（1.5×40cm）のカラムに
添加し、90％ジメチルホルムアミド、10％100ｍ
Ｍ酢酸緩衝液（PH5.0）の溶媒でゲル過を行な
つた。溶出液を２mlづつ分画し、T3のアミノ基
に３−（2′−ベンゾチアゾリル−ジチオ）プロピ
オニル基を導入した誘導体を含む画分（12〜15本
目）を集めた。 次いで、この３−（2′−ベンゾチアゾリル−ジ
チオ）プロピオニル基を導入した誘導体7.2μｇを
含有する90％リン酸緩衝液（PH8.0）10％ジメチ
ルホルムアミド溶液２mlにβ−ガラクトシダーゼ
２mgを加え、室温で２時間反応せしめた。反応液
をセフアデツクスＧ−150（1.5×90cm）のカラム
に添加し、0.15M NaClを含有する10ｍＭリン酸
緩衝液（PH7.4）でゲル過を行ない、その素通
り画分を回収して、T3のアミノ基とβ−ガラク
トシダーゼのチオール基とをもつて結合せしめた
β−ガラクトシダーゼ−T3−OEt結合体（純度
95％）（β−Gal標識T3−OEt）を得た。 〔T4−BSA結合物の調製法〕 T4−OMe25mgをジメチルホルムアミド17.5ml
に溶解し、撹拌下、グルタルアルデヒド６mg含む
10ｍＭリン酸緩衝液（PH8.0）16mlを加え室温で
30分間反応させた。次いでこれにBSA113.6mgを
含む10ｍＭリン酸緩衝液（PH8.0）20mlを加え、
さらに室温で２時間反応させた。反応液を蒸留水
に対し十分に透析を行ない、透析内液を凍結乾燥
して、BSA−T4−OMe結合体（結合モル比１：
8.6）を得た。 〔T3−BSA結合物の調製法〕 T3−OEt25mgをジメチルホルムアミド17.5mlに
溶解し、撹拌下グルタルアルデヒド７mg含む10ｍ
Ｍリン酸緩衝液（PH8.0）16mlを加え、室温で30
分間反応させた。次いでこれにBSA118mgを含む
10ｍＭリン酸緩衝液（PH8.0）20mlを加え、さら
に室温で２時間反応させた。反応液を蒸留水に対
し透析内液を凍結乾燥してBSA−T3−OEt結合
体（結合モル比１：12.6）を得た。 〔抗体の作製〕 各々BSA−T4−OMeおよびBSA−T3−OEt結
合体１mg（T4−OMeとして95μｇ、T3−OEtと
して116μｇ）を0.15M NaCl含有10ｍＭリン酸緩
衝液（PH7.4）１mlに溶解し、これにフロイン
ト・コンプリート・アジユバント（Freund′s
Complete adjuvant）1.0mlを加えて充分混和し
て乳剤を得た。次いでウサギ１匹に乳剤２mlを四
肢指の皮中、および背中の皮下数ケ所に注射し
た。２週間おきに同量の乳剤を８回皮下注射し、
最終免疫より10日後にその全血を採取し、60分間
室温に放置して凝固せしめた後に、3000rpm、10
分間遠心して、各々抗T4−OMe血清（ウサギ）、
抗T3−OEt血清（ウサギ）を得た。 〔T4とT3のEIAによる同時測定〕 試験管（15×105mm、内径12.8±0.1mm）に免疫
反応用緩衝液（前記）100μ、β−Gal標識T4−
OMe（T4として約2.0ng）50μ、β−Gal標識T3
−OEt（T3として約0.1mg）50μ、および標準液
（T4として10〜640mg／ml、T3として0.5〜32ng／
mlを含有する液）100μを加え、これに固相体
［エレメント］−Ｃを１個加え、37℃で30分間隔で
固相を回転させながら、３時間反応を行なつた。
終了後、蒸留水を５ml加え、固相体−Ｃを洗滌し
ながら引き抜いた。洗滌固相体をT4用固相体フ
ラグメント１個とT3用固相体フラグメント３個
とに分割し、あらかじめβ−ガラクトシダーゼ活
性測定液２mlを加えてある試験管にそれぞれ浸積
し、T4用固相体フラグメントは37℃で30分、T3
固相体フラグメントは２時間反応させた。反応終
了後、反応停止液［400ｍＭグリシン−NaOH緩
衝液（PH11.0）］を0.5ml加え、反応を停止させ、
固相体を取り除いた後、それぞれの液の420nｍ
における吸光度を測定した。その結果第１０図に
示す通りで、第１０図中、〇−〇はT4の定量曲
線を示し、△−△はT3の定量曲線を示すもので、
本発明のT4とT3の同時測定系は、きわめて良好
な定量曲線を示すものであつた。なお、被検試料
（血清、血漿等）中のT4、T3を測定する場合は、
標準液100μの代わりに試料100μ加え、前記
と同様の操作を行ない、定量曲線と対照すること
により試料中のT4、T3量を求めた。
体用エレメント担体を用いてなる微量の生体成分
の多成分同時測定法に関する。従来より、抗原
（パプテンを含む）と抗体とに基く免疫反応や薬
物やホルモン等の物質とレセプターとに基くレセ
プター反応など（以下、免疫反応と略す）により
定量的に測定する手段は数多く知られている。 このような方法としては、主として血清、尿、
唾液などの体液中に微量に存在する成分の定量、
定性などに応用されてきた。 微量の成分としては、生体内成分としての種々
のホルモン類、それらに対するレセプター、生体
内酵素、病態における特異的成分、投与された薬
物やそれらに対するレセプター、さらにこれらの
代謝物、その他、細菌やウイルスなどの微生物、
これらに対する抗体など種々の生体内に存在する
微量成分が挙げられる。 そのような微量成分は、主として抗原抗体反応
などの免疫反応、例えばホルモンとそれに対する
抗体またはレセプターを応用して測定されてい
る。 免疫反応の結果、それらの結合物が不溶性にな
つたり、多数の抗原−抗体分子からなる大きな集
合体が形成されることを利用する方法は、すでに
古典的な方法として知られている。 これらは反応管内に沈澱する量を直接測定する
方法や、ゲル内で沈降される免疫拡散法、あるい
は補体を用いる方法などの種々の方法により測定
されている。また、抗原、抗体やレセプターを何
んらかの方法で標識しておき、免疫反応せしめた
後その標識活性を測定する種々の方法もよく知ら
れている。これらの内でも高感度測定法として広
く用いられる方法に放射性物質を標識物質とする
ラジオイミユノアツセイ（RIA）がよく知られて
おり、また、RIAは放射性物質を利用するもので
あるがより安全な代りうる方法としてこの放射性
物質標識の代りに酵素で標識したものを用いる測
定法、即ち酵素免疫測定法（EIA）が近年広く利
用されている。 EIAは、抗原または、抗体やレセプターなどの
受容体に酵素を結合させておき、その酵素活性を
標識として免疫反応の程度を測定し、その結果か
ら抗原または受容体の量を測定しようとするもの
である。このような場合、測定すべき成分に対し
て特異的結合能を有する受容体または抗原を用
い、これに測定すべき成分としての抗原または受
容体と酵素標識した抗原または受容体を競争反応
せしめ、次いで免疫反応によつて生じた結合物と
非結合物とを分離し、または分離することなくそ
の酵素活性を測定する場合や、測定すべき物質に
対して特異的結合能を有する受容体または抗原を
用い、これに測定すべき抗原または受容体を反応
せしめ、次いでその結合物に酵素標識した抗原に
対して結合能を有する化合物または受容体に対し
て結合能を有する化合物を反応せしめてサンドイ
ツチせしめその後、その酵素活性を測定する場合
などがある。 このような種々の免疫反応を利用するに当つ
て、従来では、測定すべき成分の１つに対して１
つの反応を行なつているにすぎず、多種の成分を
測定するには非常の多くの欠点があつた。即ち、
多種成分測定に当つては、目的とする成分の個数
相当分の血清等の多量の試料を必要とし、かつ各
測定を各々行なうために用いる試薬類も多種多様
のものとなり、さらに長時間を要するものであつ
た。これに対し、担体に２種の抗体を固定化した
固相体を用い、これに測定すべき２種類の抗原を
含む試料を加えて反応せしめ、まずその間の１種
の抗原の標識化合物を反応せしめ、その標識活性
を測定し、次いでその後、他の１種の抗原の標識
化合物を反応せしめ、この標識活性を測定してな
る方法（特開昭56−78598号同52−15815号、同56
−96248号参照）が知られている。これらの測定
法では、従来から固相体として使用されていたビ
ーズと試験管を抗体として利用するか、区別し得
る種々の粒子径の微粒子を担体として利用する
か、またはビーズや微粒子の代わりに複数のフイ
ンを有する担体を用いて、この担体上に２種また
はそれ以上の抗体を固定化せしめた固相体を用い
るために、微量成分を極めて少量の試料を対象と
して反応せしめることが困難であり、かつこの固
定化された抗体の力価の算出が極めて困難であ
り、また測定に当つても、各々の成分を順次測定
するための反応を要することから、従来に比べ、
より長時間の測定時間を必要とする欠点を生じる
ものであつた。 本発明者らは、生体内の種々の微量成分を、簡
便かつ短時間に正確に多成分にわたつて同時測定
し得る方法について研究開発したものであつて、
その目的とするところは免疫反応のための反応管
を１つの担体とし、かつ免疫反応の反応媒体に加
えられる担体として、その担体が反応管の免疫反
応部に挿入可能な形状であつて、外径が反応管の
内径と僅かな間〓を保つように形成され、反応管
とエレメント担体と間〓が同一となるように形成
されたもので、反応媒体の表面を拡大せしめる媒
体用エレメント担体であつて、この担体を１以上
の担体として用いることにより、少量の試料を対
象として反応せしめるに当たり、媒体用エレメン
ト担体により微少量の試料液を含む反応媒体の表
面積を拡大せしめながら反応せしめる得ることが
できるもので、微少量の試料液にて測定でき、簡
便で、良好な多成分同時測定法を提供するもので
ある。 本発明は、EIAおよびRIAにも応用でき、また
競争反応やサンドイツチ免疫反応にも応用できる
ものである。まず本発明に使用される担体の１つ
の反応管としては、従来より種々のEIAやRIAに
おいて用いられる免疫反応用の反応試験管等のも
のであればよく、例えば、ガラス製やプラスチツ
ク製のものが任意の形にて用いられているもので
ある。また、エレメント担体としては、その担体
が反応管の免疫反応部に挿入可能な形状であつ
て、外径が反応管の内径と僅かな間〓を保つよう
に形成され、反応管とエレメント担体と間〓が同
一となるように形成されたもので、反応媒体の表
面積を拡大せしめる媒体用エレメント担体であつ
て、適宜１以上の分割可能な形状であればよく、
また免疫反応の際、測定すべき成分と特異的結合
能を有してなる受容体または抗原を固定化し得る
もので、前記反応管内に加える形状のものであれ
ばよく、通常、ガラス製、不溶性多糖類、不溶性
蛋白質など種々のものが、粒状、板状、弾丸状、
槍形状などの形状にて用いられる。 本発明で使用されるこのような担体としては、
一般のEIAやRIAに用いられる不溶性担体が使用
される。特に抗体や抗体のフラグメントである
Fab′などを不溶化するに当つては、一般的に云
つて不溶性担体に結合させる対象が抗体蛋白質で
あるから、酵素蛋白質を固定化する固定化酵素の
製造の場合に用いられる担体の様なものが使用さ
れる。この担体としては、例えばグルタルアルデ
ヒドなどにて処理してなるアルブミンやゼラチン
などの不溶性蛋白質担体、アガロース、セルロー
スやデキストリンなどのエピクロルヒドリン処理
または臭化シアン処理、さらにそれらのアミノ化
試薬処理してなる不溶性半合成高分子担体（多糖
類）、アクリロニトリル、アクリル酸、アクリル
酸エステル、メタアクリル酸、メチルメタアクリ
ル酸、ビニルアルコール、酢酸ビニル、スチレ
ン、アミノスチレン、ジビニルベンゼン、アクリ
ルアミド、エチレン、無水マレイン酸、クロトン
酸などのポリマーまたはコポリマー、さらにそれ
らのアミノ化試薬処理してなる不溶性合成高分子
担体（高分子樹脂）、その他アミノ化試薬処理し
てなるシラン化合物などの不溶性無機担体などの
官能基に基いて結合せしめて使用してもよい。ま
たこの不溶性担体にアミノ基などを導入する手段
としては公知の種々の手段を用いればよく、例え
ばニトリル基の還元によるアミノ化、水酸基のγ
−アミノプロピルトリエトキシシランの反応によ
るアミノアルキル基の導入、またはヒドロキシメ
チル基の過ヨウ素酸酸化によるアルデヒド基への
変換、さらにそのアルデヒド基にジアミンを反応
せしめてなるアミノ基の導入、多糖類水酸基の臭
化シアン反応によるイミドカルボナート基への変
換、アミド基のハロゲン化リン化合物によるイミ
ノハロゲニド基への変換、さらにこの官能基を官
能基導入試薬にて処理して新たに官能基を適宜導
入してもよい。これらの不溶性担体において、ナ
イロン、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、塩
化ビニル等の高分子樹脂、セルロース、デキスト
ランなどの不溶化多糖体、ガラス等の無機材質等
が加工するのに好適なものとして例示される。こ
のような担体におけるエレメント担体は、弾丸状
あるいは槍形状その他これに類する形状のもので
もよいが、他の固体成形物例えば金属、プラスチ
ツクの表面に本発明のエレメントの形状が保持さ
れるように付着形成されたもので、用いる免疫反
応管と同形状の反応媒体の表面積を拡大せしめる
ための媒体用エレメントが好ましい。 次に本発明のエレメント担体について図面を参
照しながら説明する。 第１図はエレメント担体としての媒体用エレメ
ント担体を符号１として総括的に示してある。エ
レメント担体１は、例えばナイロン６，６の高分
子樹脂材料から成り、エレメント本体２と該本体
２の上面部２ａの中央部に突出して設けられた取
付脚３とから構成されている。取付脚３には、他
の操作棒（図示せず）が取付けられるが、取付脚
３自体を操作棒として使用するために延長させた
形状であつてもよい。エレメント本体２は弾丸状
に成型されていて、その外径は反応管４の内径と
僅かな隙間を保つ様な径に形成してある。エレメ
ント本体２の下周面の頂部にはクサビ状の突起５
が設けてあつて、該突起５により、エレメント本
体２の弧状外周面２ｂと反応管４との弧状内周面
４ａとの間に一定の間隙部６が保持されているよ
うになつている。また、このクサビ状の突起５の
代わりに凸状の突起としてもよい。要は突起５に
より、エレメント本体２が反応管４の弧状内周面
４ａと密着状態となることを防止し得る形状であ
ればよい。この突起部の高さとしては、エレメン
ト本体２と反応管４の管内壁面との幅とが同一と
なればよい。エレメント本体２の上面部２ａに
は、第２図に示すように、取付脚３を中心にして
四角形状に切り込み溝８が付設してあつてもよ
い。切り込み溝８の終端はエレメント本体２の周
縁部に開口させてあつて、上面部２ａの延長線上
での反応液の表面張力を弱めるように考慮してあ
る。またこの切り込み溝８の溝形状としては、断
面形状が半円状、楕円状、台形状、三角形状、四
角形状などのいずれの形状であつてもよい。 本発明のエレメント担体は、上記の様な構造で
あるため、反応管に入れた反応液中にエレメント
本体を浸漬させれば、エレメント本体の突起が反
応管の内底面に接触してエレメント本体の外周面
とそれに対応する反応管の内周面との間に僅かな
隙間が形成される（第１図参照）。したがつて、
反応液量が少量であつてもエレメント本体の浸漬
によつて、その液が隙間部に案内されるとともに
エレメント本体の上面部にまで上昇された反応液
は切り込み溝内を流れてそれ自体の表面張力作用
を失う。それ故、反応液はエレメント本体の外周
面に均一な条件（一定厚の層の形態）で接触する
ことになる。 上記の様な切り込み溝８の変形例としては、第
３図イに示すように、エレメント本体２の上面部
２ａの半径方向に放射状に配設してもよい。ま
た、他の変形例としては、第３図ロに示すよう
に、エレメント本体２の上面部２ａの直径方向に
直線状に配設してもよい。更に他の変形例として
は、第３図ハに示すように、エレメント本体２の
上面部２ａの円周方向に左右対称の形に配設して
もよい。このように、切り込み溝８は、その終端
が上面部２ａの周縁部に開口されている形状であ
ればよく、また如何なる形状に付設することもで
きる。 第４図はエレメント１の他の変形例を示したも
のである。この例におけるエレメント本体２は槍
形状に成形してある。したがつて、反応管４もエ
レメント本体２に沿うテーパー形状のものが使用
されるもので、種々市販の反応管の形状に従つ
て、そのエレメントを変形、加工すればよい。な
お、エレメント本体２のその他の構造について
は、前記第１図で示した例のものと同じであるた
め、それと構造を同じくする部分には同じ番号を
付し、説明は省略する。 さらに上述の如く、少量の反応液の表面積の増
大を兼用することなく複数の免疫反応を行なわせ
しめるには、複数のエレメントを板状または棒状
の形状になした担体を固相体として用いればよ
い。 この様な反応管やエレメント等の担体に通常公
知の手段を適用して化学的または物理的に抗体ま
たはそのフラグメントもしくは抗原、その他の薬
物の受容体を結合して不溶性抗体等（抗原、受容
体）となし、固相体を調製する。 固相体の調製法としては、前記担体にあらかじ
め抗体等を結合せしめるための官能基を導入して
特定の形状に加工してもよく、または加工した後
に官能基を導入してもよいもので、例えば反応管
やエレメントの担体がナイロン６，６の場合は、
あらかじめ前述の形状に加工し、次いでジメチル
硫酸あるいはイミクロ法による活性化をおこな
い、へキサメチレンジアミン処理、グルタルアル
デヒド処理をおこなつて、抗体等例えば第２抗体
を結合させ、更に第１抗体を免疫反応により固定
化して固相体を得ればよい。また、抗体がデキス
トランゲル、例えばセフアデツクスの場合も、あ
らかじめ前述の形状に加工し、次いでブブロムシ
アン（BrCN）による活性化をおこない、これに
抗体を結合させて固定化する。更にまた、ポリス
チレン等の場合加工後、硫酸で化学的処理した後
固定化するか、または物理的吸着による固定化を
おこなえばよい。またガラス等の場合はγ−アミ
ノアルキルトリエトキシシラン化合物などの有機
アミノ基導入シラン試薬によりアミノアルキルシ
リル化せしめ、このアミノ基に基いて公知の固定
化手段により固定化せしめればよい。さらに一般
に化学的に固定化するに当つては、担体の分子内
の官能基または導入された官能基と、抗体等の分
子内に有する官能基、例えばアミノ基、水酸基、
カルボキシル基、チオール基、アルデヒド基等の
官能基に基いて両者を結合し得る多官能性化合物
が用いられる。この公知の種々の多官能性化合物
としては、例えばヘキサメチレンジイソシアナー
ト、２，４−トルエンジイソシアナートなどのジ
イソシアナート化合物、ヘキサメチレンジイソチ
オシアナートなどのジイソチオシアナート、スク
シンアルデヒド、グルタルアルデヒド、アジポア
ルデヒドなどのジアルデヒド、Ｎ，N′−エチレ
ンビスマレイミド、Ｎ，N′−０−フエニレンジ
マレイミド、ビビスジアゾベンジン、Ｎ，N′−
ポリメチレンビスヨードアセトアミド、ジエチレ
ンマロンイミデート、ジメチルアジピンイミデー
ト、３−（2′−ベンゾチアゾリルージチオ）−プロ
ピオン酸、３−（2′−ピリジル−Ｎ−オキサイド
−ジチオ）プロピオン酸、６−Ｎ〔３−（2′−ベン
ゾチアゾリル−ジチオ）プロピオニル〕カプロン
酸などのスルフイドカルボン酸類またはそのスク
シンイミドエステル、ｐ−ニトロフエニルエステ
ル、酸クロライド、イミデートなどの反応性誘導
体（特願昭53−85900号参照）、マレイミド安息香
酸、マレイミドフエニル酢酸、マレイミドフエニ
ルプロピオン酸などのマレイミドカルボン酸類ま
たはその反応性誘導体などが挙られる。 またこの多官能性化合物は、担体に官能基を導
入するための官能基導入試薬としても使用できる
ものである。 さらにまた、一般的に固相体を得るに当つて
は、例えばPH６〜８の緩衝液やアセトン、メタノ
ール、エタノール、ジオキサン、ジメチルスルホ
キサイド、ジメチルアセトアミド、テトラヒドロ
フランまたはそれらの混合媒体などの不活性媒体
を用いて、冷却または室温にて、担体と多官能性
化合物を反応せしめる。その後必要に応じて洗浄
し、さらに同様の不活性媒体を用いて、さらに抗
体等を加え反応せしめて不溶性担体と抗体等を反
応せしめる。 さらに第２抗体を用いて第１抗体を結合せしめ
てなる抗体−第２抗体−第１抗体結合物を得るに
当つては、例えば目的の形状に加工した抗体を用
いて、上述の如くの固相体を得る手段に基いて、
まず第２抗体を結合せしめる。次いでこれに、第
１抗体を加えて免疫反応に基いて結合せしめれば
よく、このようにして得られた第１抗体の免疫活
性はほとんど劣化されないために特に好ましい固
相体である。 このようにして得られた固相体において、固相
体の２以上を用いるに当つては、例えば反応管固
相体と、１つのエレメント固相体または２以上に
分別可能なエレメント固相体との組合せ、また
は、２以上に分別可能なエレメント固相体の複数
組合せである。特に２以上に分別可能なエレメン
ト固相体としては、例えば第１図に示すエレメン
ト担体の複数を用い、その１つのエレメントに目
的とする抗体等を固定化し、さらに別のエレメン
トには異なる目的の抗体等を固定化して、複数の
異なる抗体等を固定化した固相体を得る。次いで
これらの固相体は、各々の大きさに切断する。例
えば２種のエレメント固相体とする際は、組合せ
た結果において１つのエレメントを構成するもの
であれば適当な大きさにて切断してよく簡単には
各々対称的な半分の大きさに切断したフラグメン
トとすればよく、また面者の濃度が異なる場合に
は、その濃度に準じた比率によつて切断した各フ
ラグメントを用いてエレメントを構成せしめても
よく、例えば1/4の大きさのエレメントフラグメ
ントと3/4の大きさのエレメントフラグメントと
を用いて低濃度部は3/4のフラグメントとし、高
濃度部は1/4のフラグメントとなして接着せしめ
てエレメントとなせばよい。また３種以上のエレ
メント固相体とする際は、各々その数に応じて切
断したフラグメントとすればよく、次いでこれら
のフラグメントを合せて元の形状のエレメントと
して用いればよい。またエレメント固相体のフラ
グメントを組合せるに当つては、単にエレメント
本体の切断面に従つて分別可能な形状として一体
化してもよく、また、各々のエレメントのフラグ
メントの切断面の接合部位にエレメント本体と反
応管との間隙距離を保持せしめるための接合部位
をもつて各フラグメントにより一体化せしめても
よい。 特に、後者の際には、あらかじめエレメント本
体のフラグメントを担体として用い、これに抗体
等を固定化せしめて固相体となすことが好まし
い。さらに前述の複数の板状または棒状のエレメ
ントによる分別可能な担体からなる固相体を用い
るに当つても、各担体の表面全体を固相体として
利用可能なようにその全面に抗体等を固定化せし
めることが好ましく、また各々の固相体において
も接触近辺部位に、間隙距離を保持せしめるため
の接合部位を形成せしめればよい。 さらに測定に当つて用いられる酵素を結合させ
た成分、例えば抗体、抗原、ハプテンなどや放射
性同位元素を結合させた成分は、公知のEIAや
RIAに用いられる標識のための手段が利用され
る。また標識物質としての酵素としては、公知の
種々の酵素、例えば酸化還元酵素、加水分解酵
素、転位酵素、リアーゼ、イソメラーゼ、リガー
ゼに属する酵素が利用できる。 この様にして担体に固定化した不溶性抗体等の
２以上を用いて、この抗原等に対して特異的結合
性を有する測定すべき成分、例えば抗原、抗体の
２以上を測定するためには、公知のEIAまたは
RIAによる測定法が適用される。 例えば使用される小試験管が15×105mm（内径
12.8mm±0.1mm）の場合、エレメントは第５図に
符号ＡないしＩで示す各部寸法のものが使用され
る。すなわち、Ａ：半径６mmの半球部、Ｂ：円柱
部の高さ10mm、Ｃ：円錐状突起部の高さ0.4mm、
Ｄ：円錐状突起の円錐の半径0.5mm、Ｅ：半径
0.75mmの半円状溝、Ｆ：対向する溝間の中心部距
離7.5mm、Ｇ：操作棒を挿着するための凸部の直
径４mm、Ｈ：操作棒挿着孔の直径２mm、Ｉ：操作
棒挿着のための凸部の高さ３mmの寸法にて示され
る円柱部、（高さ10mm、直径12mm）と半径６mmの
半球部から成るエレメント本体で、また分別もし
くは分割可能なものとしたものでもよく、またこ
の条件下では、免疫反応用緩衝液の量は100μ
程度、標識物質を結合させた成分を含有する液は
100μ程度および被検液（血清、尿等）は100μ
程度を用いればよい。また、この際反応液の幅
（厚み）は0.4mmと均一に形成されるものである。
この前述のエレメント本体においては、一つのエ
レメント本体にはインシユリン抗体を固定化せし
め、また他の同一形状のエレメント本体にはグル
カゴン抗体を固定化せしめ、次いで各々のエレメ
ントを同一の形状、即ち第１図の切断形状に切断
した上面形状をして半円形状を有するエレメント
フラグメントとなし、得られた半円形状のインシ
ユリン抗体の固相体のフラグメントと半円形状の
グルカゴン抗体の固相体のフラグメントとを一体
化せしめて分別可能なエレメント本体の固相体と
して用いる。その他の同時測定としての例示とし
ては、例えばα−フエトプロテイン、CEA、フ
エリチンとの同時測定、T3、T4の同時測定、そ
の他種々のステロイド系ホルモンやペプチド系ホ
ルモンなどの適宜な組み合せや種々の特異的抗体
における一体化せしめた分割可能な固相体を用い
ることによりなし得る。また反応管壁を１つの分
割可能な固相体として用いてもよいことも、前述
の記載から明らかである。また反応温度時間は対
象物によつて変るが、例えばインシユリンとグル
カゴンの同時測定の場合は５℃、８−48時間であ
る。一般に測定すべき成分に応じて適当に時間、
温度および測定すべき成分の濃度を選択すればよ
い。さらに、使用される小試験管およびそれに用
いるエレメント大きさに基いて、使用する各液量
を調整すればよい。 血清中のインシユリンおよびグルカゴン含有測
定法を例に挙げると以下のごとくである。 グルカゴン抗体の固相体である反応管用小試験
管（15×105mm、内径12.8mm±0.1mm）に緩衝液
100μ、酵素標識インシユリン液50μおよび酵
素標識グルカゴン液50μおよび一定濃度のイン
シユリンおよびグルカゴン含有液100μを加え、
次いでこれに前記の大きさ、形状のインシユリン
抗体の固相体であるエレメントを加え、５℃で15
時間インキユベーシヨンをおこなう。反応終了後
蒸留水または生理食塩水５mlを加え、このエレメ
ントを洗滌した後、あらかじめ酵素基質液500〜
1000μを分注してある別の小試験管にエレメン
トを移し換え、37℃で30−120分間酵素反応をお
こなう。反応停止液1.5〜2.0mlを加え、反応を停
止させて、エレメントを除き、次いで酵素反応に
基いて消費される成分や生成される成分を測定す
る。また反応管用試験管は、洗浄液をアスピレー
ターまたはデカンテイシヨンにて除去後、上記と
同様に酵素基質液約２〜３mlを加えて酵素反応を
行なわせしめ、次いでその液の吸光度を測定す
る。既知濃度の標識液の吸光度より求めた標識曲
線より被検体試料のインシユリンおよびグルカゴ
ンの量を求める。 以上のようにして測定されるのであるが、更に
詳しく説明を加える。 ６，６−ナイロンを本発明のエレメントの形状
（第５図参照）のもの（以下６，６ナイロン−測
定用エレメントという）を５塩化リンを用いるイ
ミクロ法により活性化し、ヘキサメチレンジアミ
ン、グルタルアルデヒド処理してスペーサー導入
６，６ナイロン−測定用エレメントを得る。この
ものにウサギ抗モルモツトIgG血清のIgG画分を
反応させIgGを固定化する。次いで、これにモル
モツトインシユリン抗体血清を反応させて、６，
６−ナイロン製エレメント−抗モルモツトIgG−
インシユリン抗体を調製する。同様に、ウサギ抗
モルモツトIgG血清のIgG分画を反応せしめて
IgGを固定化せしめた抗体にモルモツトグルカゴ
ン抗体血清を反応せしめて６，６−ナイロン製エ
レメント−抗モルモツトIgG−グルカゴン抗体を
調製する。 次いでこの６，６−ナイロン製エレメント−抗
モルモツトIgG−インシユリン抗体、および６，
６−ナイロン製エレメント−抗モルモツトIgG−
グルカゴン抗体の各固相体をステンレス製カツタ
ーにて半分に切断して半円形状となす。次いで
各々のエレメントフラグメントを合体せしめてエ
レメント本体となす。次いでこのエレメント本体
をβ−ガラクトシダーゼ−インシユリン結合物お
よびβ−ガラクトシダーゼ−グルカゴン結合体お
よび種々の濃度の標識インシユリンおよびグルカ
ゴンまたは両者を含有する血清などと反応させ、
洗滌後このエレメント本体を取り出し、次いで各
フラグメントを分離し、β−ガラクトシダーゼ活
性を測定して標準曲線を作成する。標準インシユ
リンおよびグルカゴンを用いる標準曲線より試料
中のインシユリンおよびグルカゴン含量を同時に
測定する。 このように本発明の分別可能な標識化合物を使
用することにより、極めて少量の試料反応液量で
２以上の免疫反応を短時間で行うことができる結
果、微量の成分を少量の試料量で正確かつ短時間
に測定することができる。 次に測定法の実施例を挙げて説明するが本発明
はこれに限定されるものでないことはいうまでも
ない。 実施例 １ インシユリンとグルカゴンのEIAによる同時測
定 〔固相体［試験管］−Ａの調製法〕 ポリスチレン試験管（15×105mm、内径12.8±
0.1mm）に硫酸２mlを加え、５℃で６時間反応さ
せ、SO3C-基を導入しこれに抗モルモツトIgGウ
サギ血清のIgG画分20μｇを含有する0.1Mリン酸
緩衝液（PH8.0）２mlを加え、５℃で１夜反応せ
しめ、１本当り8μｇ固定せしめた試験管を得た。
次いでこの試験管に抗 16-29グルカゴンフラグメ
ント血清（モルモツト）の30000倍希釈液（0.25
％BSA、５ｍＭ EDTA、３ｍＭ MgCl2、0.15
ｍＭ NaOl、0.1％NaN3含有0.01Mリン酸緩衝
液（PH7.4）よりなる希釈液）２mlを加えて、５
℃で１夜反応して［試験管−抗モルモツトIgG−
16-29グルカゴンフラグメント抗体］結合物を得
た。 〔固相体［エレメント］−Ｂの調製法〕 第５図で示される大きさ、および形状のポリス
チレン製エレメントを硫酸で活性化し、SO3 -基
を導入し、これを抗モルモツトIgGウサギ血清の
IgG画分20μｇを含有する0.1Mリン酸緩衝液（PH
8.0）１mlに浸し、５℃で１夜反応せしめ、１本
当り10μｇのIgGを固定せしめたポリスチレン製
エレメント固相体を得た。 次いでこのエレメント固相体をモルモツトのイ
ンシユリンの抗体を含有する血清の23200倍希釈
液（前項記載）１mlに浸し、５℃で１夜反応せし
めて〔エレメント−抗モルモツトIgG−インシユ
リン抗体〕結合物の固相体を得た。 〔β−ガラクトシダーゼ−インシユリンの調製
法〕 インシユリン60mgを0.1Mリン酸緩衝液（PH
8.0）17mlに溶解し、３−（2′−ベンゾチアゾリル
−ジチオ）プロピオン酸スクシンシイミドエステ
ル6.5mg含有ジメチルホルムアミド1.7mlを加え
て、冷却下１時間反応せしめ、反応後PH5.0とな
して沈澱物を回収し、この沈澱物を0.1Mリン酸
緩衝液（PH7.0）4.0mlに溶解し（インシユリンと
して8.9mg／ml）、このうち10.0μを分取し、こ
れにβ−ガラクトシダーゼ６mgを加えて１時間反
応せしめ、その後この反応液をセフアデツクスＧ
−100を充填したカラム（1.5×120cm）にて
0.15M NaCl含有0.01Mリン酸緩衝液（PH7.4）で
溶出せしめ、その65〜73mlの画分を集めて〔（イ
ンシユリン）−CO−（CH2）2−Ｓ−（β−ガラクト
シダーゼ）〕で略示されるインシユリンのアミノ
基とβ−ガラクトシダーゼのチオール基とによる
インシユリン−β−ガラクトシダーゼ結合物（β
−Gal標識インシユリン）を含有する溶出区分
（インシユリン2.4μｇ／ml、かつβ−ガラクトシ
ダーゼ１分子当り１分子のインシユリンの結合物
であり、かつインシユリン抗体に対し、インシユ
リン結合物の95％の活性を有しているもの）を得
た。 〔β−ガラクトシダーゼ− 19-29グルカゴンフラ
グメントの調製法〕 グルカゴンフラグメント（19−29）0.4mgを50
ｍＭリン酸緩衝液（PH8.0）0.4mlに溶解し、これ
に100ｍＭ EDTA水溶液10μおよび0.1％３−
（2′−ベンゾチアゾリル−ジチオ）プロピオン酸
スクシンシイミドエステル含有ジメチルホルムア
ミド溶液625μを加えて５℃１時間反応せしめ
た。反応後これをセフアデツクスＧ−15（1.5×40
cm）のカラムでゲル過して、その素通り区分を
得た〔グルカゴンフラグメント（19−29）のＮ末
端に３−（2′−ベンゾチアゾリル−ジチオ）プロ
ピオニル基を導入した誘導体を含む〕。次いで、
この３−（2′−ベンゾチアゾリル−ジチオ）プロ
ピオニル基を導入した誘導体20μｇを含有する50
ｍＭリン酸緩衝液（PH7.0）２mlに、β−ガラク
トシダーゼ6.19mg含有50ｍＭリン酸緩衝液（PH
7.0）を加え、室温で１時間反応した。反応液を
セフアデツクスＧ−150（1.5×90cm）のカラムで
ゲル過してその素通り区分を回収してグルカゴ
ンフラグメント（19−29）のＮ末端とβ−ガラク
トシダーゼのチオール基とをもつて結合せしめた
β−ガラクトシダーゼ−グルカゴンフラグメント
（19−29）結合体（純度95％）（β−Gal標識グル
カゴン）を得た。 インシユリンとグルカゴンのEIAによる同時測
定法 固相体−Ａ（試験管）に免疫反応用緩衝液
（0.25％BSA、５ｍＭ EDTA、３ｍＭ MgCl2、
0.15M NaCl、0.1％NaN3含有0.01Mリン酸緩衝
液（PH7.4））100μ、β−Gal標識インシユリン
（インシユリンとして20.0pg）50μ、β−Gal標
識グルカゴン（グルカゴンフラグメントとして
2.0pg）50μ、および標準液（インシユリンとし
て５〜640μ／ml、及びグルカゴンとして25〜
3200pg／mlを有する液）100μを加え、これに
固相体−Ｂ（エレメント）を１個加え、５℃で１
夜反応を行なつた。終了後、蒸留水５mlを加えま
ず固相体Ｂを洗滌しながら引き抜き、あらかじめ
β−ガラクトシダーゼ活性測定液［Ｏ−ニトリフ
エニール−β−Ｄ−ガラクトピラノシド５mg／ml
を有する0.1％BSA、0.15M NaCl、１ｍＭ
MgCl2、0.1％NaN3含有0.01Mリン酸緩衝液（PH
6.7）85部および200ｍＭメルカプトエタノール含
有メタノール溶液15部よりなる溶液］500μを
加えた小試験管に固相体−Ｂを加え、37℃で１時
間反応させた。反応終了後、反応停止液［100ｍ
Ｍグリシン−NaOH緩衝液（PH11.0）］２mlを加
え、反応を停止させ、固相体−Ｂを除いた後、そ
の液の420nｍの吸光度を測定した。次に、固相
体−Ａは、洗滌液をデカンテーシヨンで取り除い
た後、β−ガラクトシダーゼ活性測定液（前記）
２mlを加え、37℃で2.5時間反応させ、反応終了
後、反応停止液［400ｍＭグリシン−NaOH緩衝
液（PH11.0）］500μを加え、反応を停止させ反
応液の420nｍの吸光度を測定しグルカゴンの定
量曲線を作成した。 その結果は、第７図に示す通りで、また第７図
中、〇−〇はインシユリンの定量曲線を示し、△
−△はグルカゴンの定量曲線を示すものであり、
本発明のインシユリン、グルカゴンの同時測定系
はきわめて良好な定量曲線を示すものであつた。
なお、被検試料（血清、血漿等）中のインシユリ
ン、グルカゴンを測定する場合は、標準液100μ
の代わりに試料100μを加え、前記と同様の
操作を行ない、定量曲線と対照することにより試
料中のインシユリン、グルカゴン量を求めた。 実施例 ２ インシユリンとグルカゴンのRIAによる同時測
定 〔固相体［試験管］−Ａの調製法〕 前記と同様に調整した。 〔固相体［エレメント］−Ｂの調製法〕 第５図に示される大きさおよび形状の６，６ナ
イロン製エレメント50個を５塩化リン４ｇとピリ
ジン４ｇを含むベンゼン60ml中で２日間撹拌した
後、４回ベンゼンにて洗滌し、イミクロライド化
した６，６ナイロン製エレメントを得、これに
100ｍＭのヘキサメチレンジアミンを含有する水
溶液（PH11.5）50mlを加えて室温下、１時間反応
せしめ、0.1Mリン酸緩衝液（PH8.0）で充分洗滌
し、さらにこれに４％グルタルアルデヒド含有
0.1Mリン酸緩衝液（PH8.0）50mlを加え、室温下
で１時間反応せしめ、0.1Mリン酸緩衝液（PH
8.0）で洗滌し、スペーサーを６，６ナイロン製
エレメント（50個）を抗モルモツトIgG血清（ウ
サギ）のIgG画分５mgを含有する0.1Mリン酸緩衝
液（PH8.0）50ml中に加えて、５℃１夜反応せし
めて１個当りIgG50μｇを固定せしめたナイロン
製エレメント固相体を得た。 次いで、このエレメント固相体にモルモツトの
インシユリンの抗体を含有する血清の23200倍希
釈液〔0.25％BSA、５ｍＭ EDTA、３ｍＭ
MgCl2、0.15M NaCl、0.1％NaN3含有0.01Mリ
ン酸緩衝液（PH7.4）よりなる希釈液〕50ml（250
mgのインシユリン抗体を含む）を加えて、５℃で
一夜反応して〔ナイロン製エレメント−抗モルモ
ツトIgG−インシユリン抗体〕結合物の固相体−
Ｂを得た。 〔 125I−インシユリンの調製法〕 125I−インシユリンの調製は、W.M.Hunter、
F.C.Greenwoodらの方法〔Nature （London）
194、495（1962）〕に順じておこない、セフアデツ
クスＧ−25のカラム（0.9×20cm）を用いてゲル
過して、 125I−インシユリンを得た。 〔 125I−〔Tyr18〕−グルカゴン（18−29）の調製
法〕 (A) ［Tyr18］−グルカゴン（18−29）の製造 Ｈ−Tyr−Ala−Gln−Asp−Phe−Val−
Gln−Trp−Leu−Met−Asn−Thr−OHの製
造 Boc−Tyr−（Bzl−Cl2）−Ala−Gln−Asp
（OBzl）−Phe−Val−Gln−Trp−Leu−Met−
Asn−Thr（Bzl）−OBzl2.04ｇ（１ｍＭ）にア
ニソール６ml、エタンジチオール0.94mm（10ｍ
Ｍ）、スカトール131mg（１ｍＭ）、ジメチルス
ルフイド0.62ml（10ｍＭ）を加えた。これに、
無水弗化水素（HF）70mlを導入し、０℃で１
時間撹拌後、減圧下でHFを速やかに留去し
た。残査にEt2O100mlを加え生じた沈澱を集め
た。これを、50％酢酸100mlに溶解し、遠心分
離し、上清液を凍結乾燥する。これを8M尿素
溶液20mlと酢酸20mlにて溶解しチオグリコール
酸２mlを加え、45℃で20時間、還元した後、セ
フアデツクスLH−20のカラム（4.2×137cm）
にチヤージし、50％酢酸で溶出した。溶出液を
７mlづつ分画し、74−80本目を集め、凍結乾燥
して［Tyr18］−グルカゴン（18−29）を得た。
収量120mg、Rf20.73（セルロース）、アミノ酸分
析値：Asp1.97(2)、Thr0.95(1)、Gln2.07(2)、
Ala0.98(1)、Val0.94(1)、Met0.98(1)、Leu1(1)、
Phe0.97(1)、Tyr0.94(1)、Trp1.05(1)、上記の原
料は次のようにして製造された。 (1) Ｐ（19−29）Boc−Ala−Gln−Asp（OBzl）
−Phe−Val−Gln−Trp−Leu−Met−Asn
−Thr（Bzl）−OBzl〔１〕 Ｐ（20−29）（特開昭56−81540号公報 実
施例１ 中で合成報告済）12.4ｇ（7.5ｍＭ）
をTFA40ml、ジメチルスルフイド20ml、エ
タンジチオール20ml、およびスカトール983
mgの混液に加え、室温で50分撹拌した後、減
圧下TFAを留去する。残査にエーテルを加
え、生じた沈澱を乾燥DMF150mlとＮ−メチ
ルピロリドン50mlの混液に溶解した。これに
Boc−Ala−OH2.0ｇ（1.4倍当量）HOBt1.4
ｇ（1.4倍当量）およびWSCD1.92ml（1.4倍
当量）を加え、NMMでPH７に調整後、一夜
かきまぜ、さらにDMF50ml、HOBt0.51ｇ、
Boc−Ala−OH0.71ｇ、WSCD0.69mlを加
え、一夜撹拌した。DMFを減圧留去後、氷
水中に投入し、生じた沈澱を熱エタノールで
２回洗浄して目的物11.35ｇ（収率87.8％）
を得た。 TLC；Rf10.75（シリカゲル） アミノ酸分析；Asp1.92(2)、Thr0.88(1)、
Glu1.94(2)、Ala0.88(1)、Val0.91(1)、Met0.95
(1)、Leu1、Phe0.93(1)、Trp0.71(1)、 (2) ［Tyr18］Ｐ（18−29）Boc−Tyr（Bzl−
Cl2）−Ala−Gln−Asp（OBzl）−Phe−Val−
Gln−Trp−Leu−Met−Asn−Thr（Bzl）−
OBzl〔２〕 Ｐ（19−29）〔１〕8.61ｇ（５ｍＭ）を
TFA40ml、ジメチルスルフイド20ml、エタ
ンジチオール20ml、およびスカトール983mg
の混液に加え、室温で50分撹拌した後減圧下
TFAを留去した。残査にエーテルを加え生
じた沈澱をDMF150mlとＮ−メチルピロリド
ン50mlの混液に溶解した。これにBoc−Tyr
（Bzl−Cl2）−OH3.08ｇ（1.4倍当量）
HOBt0.95ｇ（1.4倍当量）、WSCD1.28ml
（1.4倍当量）を加え、NMMにてPH７に調整
後、室温にて48時間撹拌した。DMFを減圧
留去後、氷水を投入し、生じた沈殿を熱エタ
ノールで３回洗浄して目的物9.00ｇ（収率
88.0％）を得た。 TLC；Rf10.76（シリカゲル） アミノ酸分析値；Asp1.90(2)、Thr0.91(1)、
Glu1.96(2)、Ala0.89(1)、Val0.90(1)、Met0.93
(1)、Leu(1)、Phe0.95(1)、Tyr0.92(1)、
Tvp0.68.(1)、 なお、本明細書中に記載の略記号は次の意味
を有する。 Ala；Ｌ−アラニン Gln；Ｌ−グルタミン Asp；Ｌ−アスパラギン酸 Asn；Ｌ−アスパラギン Phe；Ｌ−フエニルアラニン Val；Ｌ−バリン Trp；Ｌ−トリプトフアン Leu；Ｌ−ロイシン Met；Ｌ−メチオニン Thr；Ｌ−スレオニン Boc；ｔ−ブトキシカルボニン Bzl；ベンジル OBzl；ベンジルエステル TFA；トリフルオロ酢酸 NMM；Ｎ−メチルモルホリン DMF；ジメチルホルムアミド HOBt；１−ヒドロキシベンゾトリアゾール WSCD；Ｎ−エチル、N′−３−ジメチルアミ
ノプロピル−カルボジイミド Bzl−Cl2；２，６−ジクロロベンジル また薄層クロマトグラフイー（TLC）の担
体および展開溶媒は、以下のものを用いた。 １；クロロホルム−メタノール−酢酸
（80：25：２）メルク社製シリカゲル
Avt5721、 ２；１−ブタノール−ピリジン−酢酸−
水（15：10：３：12）メルク社製セルロース
Avt5716 (B) 125I−〔Tyr18〕−グルカゴン（18−29）の調
製 前記(A)で得られた［Tyr18］−グルカゴン
（18−29）を用いて、W.M.Hunter、F.C.
Greenwoodらの方法〔Nature（London）194、
495（1962）〕に順じて行ない、セフアデツクス
Ｇ−25のカラム（0.9×20cm）にてゲル過し、
125I−［Tyr18］−グルカゴン（18−29）を得
た。 〔RIAによるインシユリン、グルカゴン同時測
定〕 固相体［試験管］−Ａに免疫反応用緩衝液（前
記）100μ、 125I−インシユリン（インシユリ
ンとして10.0pg）50μ 125I−［Tyr18］−グルカ
ゴン（18−29）（グルカゴンとして4.5pg）50μ、
および標準液（インシユリンとして５〜640μU／
ml）、グルカゴンとして25〜3200pg／ml含有）
100μを加え、これに固相体（エレメント）−Ｂ
を１個加え、５℃で１夜反応をおこなつた。終了
後、生理食塩水５mlを加え、まず固相体−Ｂを洗
滌しながら引き抜き、新しい試験管に移し、その
放射能を測定した。また別に、固相体−Ａは洗滌
液をデカンテーシヨンで取り除いた後、その放射
能を測定した。その結果は第８図に示す通りで、
また第８図中、〇−〇はインシユリンの定量曲線
を示し、△−△はグルカゴンの定量曲線を示すも
ので、本発明のインシユリン、グルカゴン同時測
定系は、きわめて良好な定量曲線を示した。な
お、第８図において横軸は、インシユリン、グル
カゴン濃度、縦軸は、Ｂ／Bo（％）で示した。 実施例 ３ CEAとフエリチンのサンドイツチ法による
EIAでの同時測定 〔固相体［試験管］−Ａの調製法〕 ポリスチレン試験管（15×105mm、内径12.8±
0.1mm）に濃硫酸２mlを加え、５℃で６時間反応
させ、−SO3 -基を導入し、これに抗CEAウサギ血
清のIgG画分50μｇを含有する0.1Mリン酸緩衝液
（PH8.0）２mlを加え、５℃で１夜反応せしめ、
［試験管−EIA抗体］結合物の固相体−Ａを得た。 〔固相体［エレメント］−Ｂの調製法〕 ６，６ナイロン製エレメント50個を30％（Ｖ／
Ｖ）ジメチル硫酸含有メタノール溶液50mlに加
え、37℃で50分間反応し、メタノールで充分洗滌
後、これに100ｍＭヘキサメチレンジアミン含有
水溶液（PH11.5）50mlを加え、室温下１時間反応
せしめ、0.1Mリン酸緩衝液（PH8.0）で充分洗滌
し、さらにこれに４％（Ｖ／Ｖ）グルタルアルデ
ヒド含有0.1Mリン酸緩衝液（PH8.0）50mlを加
え、室温下で１時時反応せしめ0.1Mリン酸緩衝
液（PH8.0）で洗滌し、スペーサーを６，６ナイ
ロン製エレメントに導入せしめた。このエレメン
ト（50個）を抗フエリチンウサギ血清のIgG画分
５mgを含有する0.1Mリン酸緩衝液（PH8.0）50ml
に加えて、５℃１夜反応せしめて［エレメント−
フエリチン抗体］結合物の固相体−Ｂを得た。 〔β−Gal標識フエリチン抗体の調製法〕 フエリチン抗血清より硫安分画でIgG画分を
得、さらにフエリチンを固定化せしめたセフアロ
ース4B抗体を用い、アフイニテイークロマトグ
ラフイーで抗体を精製した。精製抗体４mgを
0.1Mリン酸緩衝液（PH8.0）1.8mlに溶解し、３−
（2′−ベンゾチアゾリル−ジチオ）プロピオン酸
スクシンシイミドエステル14.88μｇ含有ジメチル
ホルムアミド液200μ、及び100ｍＭ EDTA水
溶液20μを加えて、５℃で１時間反応せしめ
た。反応後、これをセフアデツクスＧ−15（1.5×
40cm）のカラムでゲル過して、その素通り画分
を得た［フエリチン抗体のアミノ基に３−（2′−
ベンゾチアゾリル−ジチオ）プロピオニル基を導
入した誘導体を含む］。次いで、この３−（2′−ベ
ンゾチアゾリル−ジチオ）プロピオニル基を導入
した誘導体1.5mgを含有する50ｍＭリン酸緩衝液
（PH7.0）２mlにβ−ガラクトシダーゼ3.33mg含有
50ｍＭリン酸緩衝液（PH7.0）２mlを加え、室温
で２時間反応した。反応液をセフアデツクスＧ−
150（1.5×90cm）のカラムでゲル過してその素
通り画分を回収して、β−ガラクトシダーゼ標識
フエリチン抗体結合体（純度98％）（β−Gal標
識フエリチン抗体）を得た。 〔β−Gal標識CEA抗体の調製法〕 CEA抗血清より硫安分画でIgG画分を得て、さ
らにCEAを固定化せしめたセフアロース4B抗体
を用い、アフイニテイークロマトグラフイーで抗
体を精製した。 精製抗体４mgを0.1Mリン酸緩衝液（PH8.0）1.8
mlに溶解し、３−（2′−ベンゾチアゾリル−ジチ
オ）ピロピオン酸・スクシンシイミドエステル
14.88μｇ含有ジメチルホルムアミド200μ、及び
100ｍＭ EDTA水溶液20μを加えて、５℃で
１時間反応せしめた。反応後、これをセフアデツ
クスＧ−15（1.5×40cm）のカラムでゲル過し
て、その素通り画分を得た［CEA抗体のアミノ
基に３−（2′−ベンゾチアゾリル−ジチオ）プロ
ピオニル基を導入した誘導体を含む］。次いで、
この３−（2′−ベンゾチアゾリル−ジチオ）プロ
ピオニル基を導入した誘導体1.5mgを含有する50
ｍＭリン酸緩衝液（PH7.0）２mlにβ−ガラクト
シダーゼ3.33mg含有50ｍＭリン酸緩衝液（PH7.0）
２mlを加え、室温で１時間反応した。反応液をセ
フアデツクスＧ−150（1.5×90cm）のカラムでゲ
ル過してその素通り画分を回収してβ−ガラク
トシダーゼ標識CEA抗体結合体（純度98％）（β
−Gal標識CEA抗体）を得た。 〔EIAによるCEAとフエリチンの同時測定〕 固相体［試験管］−Ａに免疫反応用緩衝液（前
記）200μ、および標準液（CEAとして2.5〜
160ng／ml、およびフエリチンとして、５〜
320ng／mlを含有）100μを加え、これを固相体
［エレメント］−Ｂを１個加え、37℃で５時間反応
を行なつた。終了後内溶液を吸引除却し、生理食
塩水５mlを加え、固相体−Ａ、Ｂを洗滌した。こ
れにβ−Gal標識フエリチン抗体、およびβ−
Gal標識CEA抗体を含有する免疫反応用緩衝液
300μを含え、室温で18時間反応を行なつた。
終了後、生理食塩水５mlを加え、まず固相体−Ｂ
を洗滌しながら引き抜き、あらかじめβ−ガラク
トシダーゼ活性測定液（前記）500μを加えて
ある小試験管に加え、37℃で３時間反応させた。
反応停止液（100ｍＭグリシン−NaOH緩衝液
（PH11.0）２mlを加え、反応を停止させ、固相体
−Ｂを除いた後、その液の420nｍの吸光度を測
定した。また別に固相体−Ａは、洗滌液をデカン
テーシヨンで取り除いた後β−ガラクトシダーゼ
活性測定液（前記）２mlを加え、37℃で５時間反
応させた。反応停止液（400ｍＭグリシン−
NaOH緩衝液（PH11.0）］0.5mlを加え、反応を停
止させ、反応液の420nｍの吸光度を測定した。
第９図に示す通りで、また第９図中、〇−〇は
CEAの定量曲線を示し、△−△はフエリチンの
定量曲線を示すもので、本発明のCEA、フエリ
チン同時測定系はきわめて良好な定量曲線を示す
ものであつた。 実施例 ４ サイロキシン［T4］とサイロニン［T3］の
EIAによる同時測定 〔固相体［エレメント］−Ａの調製法〕 第６図に示すポリスチレン製エレメントフラグ
メント（第５図にしエレメントを４等分割したエ
レメントフラグメント）を、４個合体（分割可
能）させたエレメントを硫酸で活性化し、SO3 -
基を導入し、これに抗ウサギIgGヤギ血清のIgG
画分20μｇを含有する100ｍＭリン酸緩衝液（PH
8.0）１mlに浸し、５℃で１夜反応せしめ、１本
当り8.4μｇのIgGを固定せしめたポリスチレン製
エレメント固相体を得た。 次いでこのエレメント固相体を抗T4−OMe血
清（ウサギ）の8000倍希釈液（前項記載）１mlに
浸し、５℃で一夜反応せしめて［エレメント−抗
ウサギIgG−T4抗体］結合物の固相体−Ａを得
た。 〔固相体［エレメント］−Ｂの調製法〕 第６図に示す形状と全く同じポリスチレン製エ
レメント（成型時にフタロシアニンブルーを混入
し、淡青色に着色）を前記と同様に処理し抗ウサ
ギIgG−固定化エレメント固相体を得た。次いで
固相体をT3−OEt血清（ウサギ）の20000倍希釈
液１mlに浸し、５℃で一夜反応せしめて［エレメ
ント−抗ウサギIgG−T3抗体〕結合物の固相体−
Ｂを得た。 〔固相体［エレメント］−Ｃの調製〕 再び分割した固相体エレメント−Ａのフラグメ
ント１個と、固相体エレメント−Ｂのフラグメン
ト３個を両端縁が鋭利状で、かつ中央部にストツ
パーを有する連結機にて合体させ、T4、T3−同
時測定用固相体［エレメント］−Ｃを調製した。 〔T4−OMeの調製法〕 T4（シグマ社製）600mgをメタノール15mlに懸
濁し、−10℃で乾燥塩化水素ガスを飽和するまで
吹きこんだ後、室温で20時間撹拌した。さらに０
℃で乾燥塩化水素ガスを吹きこんだ後、析出した
沈殿をろ取し、塩化水素ガス含有メタノールで洗
滌後固体水酸化ナトリウムを入れたデシケーター
で、減圧乾燥後、メタノール−エーテルで再結晶
して、目的のT4−OMe582.5mg（収率91.2％）を
得た。 〔β−Gal標識T4−OMeの調製法〕 T4−OMe2mgを90％ジメチルホルムアミド、10
％100ｍＭリン酸緩衝液（PH8.0）２mlに溶解し、
３−（2′−ベンゾチアゾリルジチオ）プロピオン
酸スクシンシイミドエステル1.78mg含有ジメチル
ホルムアミド1.78mlを加えて、冷却下１時間反応
せしめた。反応液をLH−20（1.5×40cm）のカラ
ムに添加し、90％ジメチルホルムアミド、10％
100ｍＭリン酸緩衝液（PH5.0）の溶媒でゲル過
を行なつた。溶出液を２mlづつ分画し、T4のア
ミノ基に３−（2′−ベンゾチアゾリル−ジチオ）
プロピオニル基を導入した誘導体を含む画分（12
〜15本目）を集めた。 次いで、この３−（2′−ベンゾチアゾリル−ジ
チオ）プロピオニル基を導入した誘導体8μｇを
含有する90％リン酸緩衝液（PH8.0）10％ジメチ
ルホルムアミド液２mlにβ−ガラクトシダーゼ２
mgを加え、室温で２時間反応せしめた。反応液を
セフアデツクスＧ−150（1.5×90cm）のカラムに
添加し、0.15M NaClを含有する10ｍＭリン酸緩
衝液（PH7.4）でゲル過を行ない、その素通り
画分を回収して、T4のアミノ基とβ−ガラクト
シダーゼのチオール基とをもつて結合せしめたβ
−ガラクトシダーゼ−T4−OMe結合体（純度93
％）（β−Gal標識T4−OMe）を得た。 〔T3−OEtの調製法〕 T3（シグマ社製）500mgをエタノール15mlに懸
濁し、−10℃で乾燥塩化水素ガスを飽和するまで
吹きこんだ後、室温で20時間撹拌した。反応液を
ろ過し、ろ液を減圧濃縮し、ベンゼンを加え、析
出した沈殿を集め乾燥した。さらにベンゼンに懸
濁洗滌して、目的のT3−OEt515mg（収率93.7％）
を得た。 〔β−Gal標識T3−OEtの調製法〕 T3−OEt2mgを90％ジメチルホルムアミド、10
％リン酸緩衝液（PH8.0）２mlに溶解し、３−
（2′−ベンゾチアゾリルジチオ）プロピオン酸ス
クシンシイミドエステル2.06mg含有ジメチルホル
ムアミド2.06mlを加えて、冷却下１時間反応せし
めた。反応液をLH−20（1.5×40cm）のカラムに
添加し、90％ジメチルホルムアミド、10％100ｍ
Ｍ酢酸緩衝液（PH5.0）の溶媒でゲル過を行な
つた。溶出液を２mlづつ分画し、T3のアミノ基
に３−（2′−ベンゾチアゾリル−ジチオ）プロピ
オニル基を導入した誘導体を含む画分（12〜15本
目）を集めた。 次いで、この３−（2′−ベンゾチアゾリル−ジ
チオ）プロピオニル基を導入した誘導体7.2μｇを
含有する90％リン酸緩衝液（PH8.0）10％ジメチ
ルホルムアミド溶液２mlにβ−ガラクトシダーゼ
２mgを加え、室温で２時間反応せしめた。反応液
をセフアデツクスＧ−150（1.5×90cm）のカラム
に添加し、0.15M NaClを含有する10ｍＭリン酸
緩衝液（PH7.4）でゲル過を行ない、その素通
り画分を回収して、T3のアミノ基とβ−ガラク
トシダーゼのチオール基とをもつて結合せしめた
β−ガラクトシダーゼ−T3−OEt結合体（純度
95％）（β−Gal標識T3−OEt）を得た。 〔T4−BSA結合物の調製法〕 T4−OMe25mgをジメチルホルムアミド17.5ml
に溶解し、撹拌下、グルタルアルデヒド６mg含む
10ｍＭリン酸緩衝液（PH8.0）16mlを加え室温で
30分間反応させた。次いでこれにBSA113.6mgを
含む10ｍＭリン酸緩衝液（PH8.0）20mlを加え、
さらに室温で２時間反応させた。反応液を蒸留水
に対し十分に透析を行ない、透析内液を凍結乾燥
して、BSA−T4−OMe結合体（結合モル比１：
8.6）を得た。 〔T3−BSA結合物の調製法〕 T3−OEt25mgをジメチルホルムアミド17.5mlに
溶解し、撹拌下グルタルアルデヒド７mg含む10ｍ
Ｍリン酸緩衝液（PH8.0）16mlを加え、室温で30
分間反応させた。次いでこれにBSA118mgを含む
10ｍＭリン酸緩衝液（PH8.0）20mlを加え、さら
に室温で２時間反応させた。反応液を蒸留水に対
し透析内液を凍結乾燥してBSA−T3−OEt結合
体（結合モル比１：12.6）を得た。 〔抗体の作製〕 各々BSA−T4−OMeおよびBSA−T3−OEt結
合体１mg（T4−OMeとして95μｇ、T3−OEtと
して116μｇ）を0.15M NaCl含有10ｍＭリン酸緩
衝液（PH7.4）１mlに溶解し、これにフロイン
ト・コンプリート・アジユバント（Freund′s
Complete adjuvant）1.0mlを加えて充分混和し
て乳剤を得た。次いでウサギ１匹に乳剤２mlを四
肢指の皮中、および背中の皮下数ケ所に注射し
た。２週間おきに同量の乳剤を８回皮下注射し、
最終免疫より10日後にその全血を採取し、60分間
室温に放置して凝固せしめた後に、3000rpm、10
分間遠心して、各々抗T4−OMe血清（ウサギ）、
抗T3−OEt血清（ウサギ）を得た。 〔T4とT3のEIAによる同時測定〕 試験管（15×105mm、内径12.8±0.1mm）に免疫
反応用緩衝液（前記）100μ、β−Gal標識T4−
OMe（T4として約2.0ng）50μ、β−Gal標識T3
−OEt（T3として約0.1mg）50μ、および標準液
（T4として10〜640mg／ml、T3として0.5〜32ng／
mlを含有する液）100μを加え、これに固相体
［エレメント］−Ｃを１個加え、37℃で30分間隔で
固相を回転させながら、３時間反応を行なつた。
終了後、蒸留水を５ml加え、固相体−Ｃを洗滌し
ながら引き抜いた。洗滌固相体をT4用固相体フ
ラグメント１個とT3用固相体フラグメント３個
とに分割し、あらかじめβ−ガラクトシダーゼ活
性測定液２mlを加えてある試験管にそれぞれ浸積
し、T4用固相体フラグメントは37℃で30分、T3
固相体フラグメントは２時間反応させた。反応終
了後、反応停止液［400ｍＭグリシン−NaOH緩
衝液（PH11.0）］を0.5ml加え、反応を停止させ、
固相体を取り除いた後、それぞれの液の420nｍ
における吸光度を測定した。その結果第１０図に
示す通りで、第１０図中、〇−〇はT4の定量曲
線を示し、△−△はT3の定量曲線を示すもので、
本発明のT4とT3の同時測定系は、きわめて良好
な定量曲線を示すものであつた。なお、被検試料
（血清、血漿等）中のT4、T3を測定する場合は、
標準液100μの代わりに試料100μ加え、前記
と同様の操作を行ない、定量曲線と対照すること
により試料中のT4、T3量を求めた。
図面は本発明の好適な数個の実施例を示したも
のであり、第１図はエレメントの拡大部分断面
図、第２図はその平面図、第３図イ，ロ，ハはエ
レメント本体の上面部に形成する切込み溝のそれ
ぞれ異つた実施例を示す平面図、第４図は第２実
施例のエレメントの拡大断面図、第５図はエレメ
ント製作のための１例の実測図、第６図は４等分
したエレメントフラグメント、第７図はEIAによ
るインシユリンとグルカゴンの同時測定の定量曲
線、第８図はRIAによるインシユリンとグルカゴ
ンの同時測定の定量曲線、第９図はEIAによる
CEAとフエリチンの同時測定の定量曲線、第１
０図はEIAによるT4とT3の同時測定の定量曲線
を示す。 符号の説明、１はエレメント担体、２はエレメ
ント本体、４は反応管、５は突起、６は隙間部、
８は切込み溝である。
のであり、第１図はエレメントの拡大部分断面
図、第２図はその平面図、第３図イ，ロ，ハはエ
レメント本体の上面部に形成する切込み溝のそれ
ぞれ異つた実施例を示す平面図、第４図は第２実
施例のエレメントの拡大断面図、第５図はエレメ
ント製作のための１例の実測図、第６図は４等分
したエレメントフラグメント、第７図はEIAによ
るインシユリンとグルカゴンの同時測定の定量曲
線、第８図はRIAによるインシユリンとグルカゴ
ンの同時測定の定量曲線、第９図はEIAによる
CEAとフエリチンの同時測定の定量曲線、第１
０図はEIAによるT4とT3の同時測定の定量曲線
を示す。 符号の説明、１はエレメント担体、２はエレメ
ント本体、４は反応管、５は突起、６は隙間部、
８は切込み溝である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 反応媒体の表面積を拡大せしめ、反応管の免
疫反応部に挿入可能な形状であつて、外径が反応
管の内径と僅かな間〓を保つように形成され、こ
の間〓と同一間〓を形成する突起部を底部に構成
して反応管とエレメント担体と間〓が同一となる
ように形成された１以上の分別可能な担体として
用いることできる媒体用エレメント担体と反応管
担体を用いて、その担体の各々に測定すべき成分
に対して特異的結合能を有する物質を固定化せし
めてなる固相体の２以上を用い、反応において反
応媒体の表面積を拡大せしめて反応せしめること
を特徴とする多成分同時測定法。 ２ １以上の分別可能な担体として用いることで
きる媒体用エレメント担体が、２以上に分別可能
な媒体用エレメント担体である特許請求の範囲第
１項記載の多成分同時測定法。 ３ 反応媒体中、反応媒体の表面積を拡大せし
め、反応管の免疫反応部に挿入可能な形状であつ
て、外径が反応管の内径と僅かな間〓を保つよう
に形成され、この間〓と同一間〓を形成する突起
部を底部に構成して反応管とエレメント担体と間
〓が同一となるように形成された１以上の分別可
能な担体として用いることできる媒体用エレメン
ト担体と反応管担体を用いて、その担体の各々に
測定すべき成分に対して特異的結合能を有する物
質を固定化せしめてなる固相体の２以上に、測定
すべき成分を含有する液および結合能を有する標
識化合物を反応せしめ、次いでそれらの固相体を
回収し、それらの固相体に結合した標識化合物の
標識活性を測定することを特徴とする特許請求の
範囲第１項記載の多成分同時測定法。 ４ 測定すべき成分に対して特異的結合能を有す
る物質が受容体であり、測定すべき成分が抗原で
あり、結合能を有する標識化合物が標識抗原であ
るか、または、測定すべき成分に対して特異的結
合能を有する物質が抗原であり、測定すべき成分
が受容体であり、結合能を有する標識化合物が標
識受容体であるか、または、測定すべき成分に対
して特異的結合能を有する物質が受容体であり、
測定すべき成分が抗原であり、結合能を有する標
識化合物が受容体と抗原とが反応した後に反応せ
しめるための抗原に対して結合能を有する標識受
容体であるか、または、測定すべき成分に対して
特異的結合能を有する物質が抗原であり、測定す
べき成分が受容体であり、結合能を有する標識化
合物が抗原と受容体が反応した後に反応せしめる
ための受容体に対して結合能を有する標識抗原で
ある、同一または異なる測定にて測定してなる特
許請求の範囲第３項記載の多成分同時測定法。 ５ 標識が、酵素または放射性物質である特許請
求の範囲第３項または第４項記載の多成分同時測
定法。 ６ 固相体が、担体−第２抗体−第１抗体である
特許請求の範囲第１項、第３項または第４項記載
の多成分同時測定法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57058612A JPS58174851A (ja) | 1982-04-08 | 1982-04-08 | 多成分同時測定法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57058612A JPS58174851A (ja) | 1982-04-08 | 1982-04-08 | 多成分同時測定法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS58174851A JPS58174851A (ja) | 1983-10-13 |
| JPH0251151B2 true JPH0251151B2 (ja) | 1990-11-06 |
Family
ID=13089357
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP57058612A Granted JPS58174851A (ja) | 1982-04-08 | 1982-04-08 | 多成分同時測定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS58174851A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0546128U (ja) * | 1991-11-13 | 1993-06-18 | 株式会社精工舎 | 電界強度表示装置 |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE9302423U1 (de) * | 1993-02-19 | 1993-04-15 | Müller, Frank Joachim, 4150 Krefeld | Mikrotitrationseinheit |
| JPH08178926A (ja) * | 1994-10-25 | 1996-07-12 | Sumitomo Pharmaceut Co Ltd | イムノアッセイプレートおよびその用途 |
| JP5465758B2 (ja) * | 2011-09-26 | 2014-04-09 | 富士フイルム株式会社 | 蛍光粒子を用いたサイロキシン免疫アッセイ |
-
1982
- 1982-04-08 JP JP57058612A patent/JPS58174851A/ja active Granted
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0546128U (ja) * | 1991-11-13 | 1993-06-18 | 株式会社精工舎 | 電界強度表示装置 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS58174851A (ja) | 1983-10-13 |
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