JPH0257181A - 耐熱型ｒｎアーゼｔ１ - Google Patents
耐熱型ｒｎアーゼｔ１Info
- Publication number
- JPH0257181A JPH0257181A JP63208905A JP20890588A JPH0257181A JP H0257181 A JPH0257181 A JP H0257181A JP 63208905 A JP63208905 A JP 63208905A JP 20890588 A JP20890588 A JP 20890588A JP H0257181 A JPH0257181 A JP H0257181A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- rnase
- heat
- sequence
- cysteine
- tyrosine
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
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Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明は新規な耐熱型ＲＮアーゼＴ１、さらに詳しくは
、天然型ＲＮアーゼＴ１のアミノ末端から２４番目のチ
ロシンと８４番目のアスパラギンをそれぞれシスティン
に置換してその耐熱性を向上させた耐熱型ＲＮアーゼＴ
１、該耐熱型ＲＮアーゼＴ１をコードしているＤＮＡ配
列、該ＤＮＡ配列を含有する組み換えＤＮＡ発現ベクタ
ー、該ベクターで形質転換した宿主細胞、ならびに該耐
熱型ＲＮアーセＴ１の製造方法に関する。
、天然型ＲＮアーゼＴ１のアミノ末端から２４番目のチ
ロシンと８４番目のアスパラギンをそれぞれシスティン
に置換してその耐熱性を向上させた耐熱型ＲＮアーゼＴ
１、該耐熱型ＲＮアーゼＴ１をコードしているＤＮＡ配
列、該ＤＮＡ配列を含有する組み換えＤＮＡ発現ベクタ
ー、該ベクターで形質転換した宿主細胞、ならびに該耐
熱型ＲＮアーセＴ１の製造方法に関する。
技術的背景および先行技術
リボヌクレアーゼＴ Ｉ（ＥＣ３，１，２７，３、以下
ＲＮアーゼＴ１という）はコウジカビ、アスペルギルス
・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）
が産生ずる菌体外リボ核酸分解酵素であり、極めて厳密
な基質特異性を有し、１本鎖のリボ核酸およびリボヌク
レオチド中のグアノシン３°−リン酸部分のホスホジエ
ステル結合のみを選択的に切断すギンをそれぞれシステ
ィンに置換した耐熱型ＲＮアーゼＴ１を提供するもので
ある。更に本発明は、該耐熱型ＲＮアーゼＴ１をコード
しているＤＮＡ配列、該ＤＮＡ配列を含有する組み換え
ＤＮＡ発現ベクター、該ベクターで形質転換した宿主細
胞、ならびに該耐熱型ＲＮアーゼＴ１の製造方法を提供
するものである。
ＲＮアーゼＴ１という）はコウジカビ、アスペルギルス
・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）
が産生ずる菌体外リボ核酸分解酵素であり、極めて厳密
な基質特異性を有し、１本鎖のリボ核酸およびリボヌク
レオチド中のグアノシン３°−リン酸部分のホスホジエ
ステル結合のみを選択的に切断すギンをそれぞれシステ
ィンに置換した耐熱型ＲＮアーゼＴ１を提供するもので
ある。更に本発明は、該耐熱型ＲＮアーゼＴ１をコード
しているＤＮＡ配列、該ＤＮＡ配列を含有する組み換え
ＤＮＡ発現ベクター、該ベクターで形質転換した宿主細
胞、ならびに該耐熱型ＲＮアーゼＴ１の製造方法を提供
するものである。
発明の構成および効果
本発明の耐熱型ＲＮアーゼＴ１は以下のようにして製造
することができる。
することができる。
始めに、耐熱型ＲＮアーゼＴ１をコードしているＤＮＡ
配列を含有し、かつ５”側に旦ｇｌＩＩ部位および３゛
側にもＢｇ１１１部位を有する変換体遺伝子を調製する
。このフラグメントの５′側には、ＢｇｌｌＴ部位を作
製するためＴて始まるコドンたとえば今回の場合Ｐｈｅ
に対応するＴＴＣと、後に融合蛋白からの切断に必要な
Ｍｅｔに対応するコドンＡＴＧを、耐熱型ＲＮアーセＴ
１をコードしているＤＮＡ配列の前に入れた。また３”
側には、この耐熱型ＲＮアーゼＴ１の構造遺伝子の後ろ
に、る。この極めて厳密なグアニン特異性の故に、ＲＮ
アーゼＴ１はＲＮＡの構造解析において極めて重要な役
割を果たしている。
配列を含有し、かつ５”側に旦ｇｌＩＩ部位および３゛
側にもＢｇ１１１部位を有する変換体遺伝子を調製する
。このフラグメントの５′側には、ＢｇｌｌＴ部位を作
製するためＴて始まるコドンたとえば今回の場合Ｐｈｅ
に対応するＴＴＣと、後に融合蛋白からの切断に必要な
Ｍｅｔに対応するコドンＡＴＧを、耐熱型ＲＮアーセＴ
１をコードしているＤＮＡ配列の前に入れた。また３”
側には、この耐熱型ＲＮアーゼＴ１の構造遺伝子の後ろ
に、る。この極めて厳密なグアニン特異性の故に、ＲＮ
アーゼＴ１はＲＮＡの構造解析において極めて重要な役
割を果たしている。
このＲＮアーゼＴ１の１次構造は既に決定されており、
この酵素がアミノ酸残基１０４個からなり、分子内に２
個のジスルフィド結合を有する、第１図に示したような
ポリペプチドであることが知られている（文献１および
２）。またＸ線結晶構造解析により、このＲＮアーゼＴ
１の立体構造も明らかにされている（文献３．４および
５）。
この酵素がアミノ酸残基１０４個からなり、分子内に２
個のジスルフィド結合を有する、第１図に示したような
ポリペプチドであることが知られている（文献１および
２）。またＸ線結晶構造解析により、このＲＮアーゼＴ
１の立体構造も明らかにされている（文献３．４および
５）。
発明の目的
本発明者等は、ＲＮＡの構造解析に有用なこのＲＮアー
ゼＴ１を修飾して、さらに有用な酵素を得るべく種々検
討を行なった結果、天然型ＲＮアーゼＴ１のアミノ末端
から２４番目のチロシンと８４番目のアスパラギンをそ
れぞれシスティンに置換することにより、その耐熱性を
向上させうることを見い出し本発明を完成するに至った
。すなわち本発明は、天然型ＲＮアーゼＴｌのアミノ末
端から２４番目のチロシンと８４番目のアスパラＭｅｔ
−Ｇｌｎに対応するコドンを付け、更にＢｇ１１１部位
を設けた。このフラグメントの全ＤＮＡ配列および該Ｄ
ＮＡ配列がコードしているアミノ酸配列を以下の配列式
１に示す。尚、天然型ＲＮアーゼＴ１を所望の場合には
、２４番目のアミノ酸残基ニ対応するコドンＴＧＴおよ
びその相補的な配列ＡＣＡをそれぞれＴＡＣおよびＧＴ
Ａに、又、８４番目のアミノ酸残基に対応するコドンＴ
ＧＴおよびその相補的な配列ＡＣＡをそれぞれＡＡＣお
よびＧＴＴに置換すればよい（これにより、２４番目並
びに８４番目のアミノ酸、システィンがそれぞれチロシ
ン、アスパラギンに変わる。）。
ゼＴ１を修飾して、さらに有用な酵素を得るべく種々検
討を行なった結果、天然型ＲＮアーゼＴ１のアミノ末端
から２４番目のチロシンと８４番目のアスパラギンをそ
れぞれシスティンに置換することにより、その耐熱性を
向上させうることを見い出し本発明を完成するに至った
。すなわち本発明は、天然型ＲＮアーゼＴｌのアミノ末
端から２４番目のチロシンと８４番目のアスパラＭｅｔ
−Ｇｌｎに対応するコドンを付け、更にＢｇ１１１部位
を設けた。このフラグメントの全ＤＮＡ配列および該Ｄ
ＮＡ配列がコードしているアミノ酸配列を以下の配列式
１に示す。尚、天然型ＲＮアーゼＴ１を所望の場合には
、２４番目のアミノ酸残基ニ対応するコドンＴＧＴおよ
びその相補的な配列ＡＣＡをそれぞれＴＡＣおよびＧＴ
Ａに、又、８４番目のアミノ酸残基に対応するコドンＴ
ＧＴおよびその相補的な配列ＡＣＡをそれぞれＡＡＣお
よびＧＴＴに置換すればよい（これにより、２４番目並
びに８４番目のアミノ酸、システィンがそれぞれチロシ
ン、アスパラギンに変わる。）。
配列式 １
■
Ｇｌｕ Ｔｒｐ Ｐｒｏ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｓ
ｅｒ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｖａｌ ＴｙｒＧＡＡ ＴＧＧ
ＣＣＧ ＡＴＣＣＴＧ ＴＣＴ ＡＧＣＧＧＣＧＡＣ
ＧＴＴ ＴＡＣｌｏ
２゜Ｃｙｓ Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｓｅｒ
Ａｓｐ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｇｉｎ
ＡｌａＵ３ Ｕ４ ＴＧＣＴＡＣＴＣＴ ＡＧＣＴＣＴ ＧＡＣＧＴＴ Ｔ
ＣＴ ＡＣＣＧＣＴ ＣＡＧ ＣｊＣＴＡＣＧ ＡＴＧ
ＡＧＡ ＴＣＧ ＡＧＡ ＣＴＧ ＣＡＡ ＡＧＡ
ＴＧＧ ＣＧＡ ＧＴＣＣＣＡ處 １，４
處 Ｌ５Ａｌａ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｇｌｎ Ｌ
ｅｕ Ｈｉｓ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｔｈ
ｒ Ｖａ１ＭＵ５ １ Ｕ６ （
Ｕ７ＧＣＴ ＧＧＣＴＧＴ ＣＡＧ ＣＴＧ ＣＡＣＧ
ＡＧ ＧＡＣＧＧＣＧＡＡ ＡＣＣＧＴＴＣＧＡ ＣＣ
Ｇ ＡＣＡ ＧＴＣＧＡＣＧＴＧ ＣＴＣＣＴＧ ＣＯ
Ｇ ＣＴＴ ＴＧＧ ＣＡＡｊＭＬ６ｊＬ７１ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｐｒｏ Ｈ
ｉｓ Ｌｙｓ Ｔｙｒ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｔｙｒｆ
Ｕ８ １ Ｕ９ マＧＧ
ＣＴＣＴ ＡＡＣＴＣＴ ＴＡＣＣＣＧ ＣＡＣＡＡＡ
ＴＡＣＡＡＣＡＡＣＴＡＴＣＣＧ ＡＧＡ ＴＴＧ
ＡＧＡ ＡＴＧ ＧＧＣＧＴＧ ＴＴＴ ＡＴＧ ＴＴ
Ｇ ＴＴＧ ＡＴＡＬ８ ｊ Ｌ９
ｊ ＬＬＯＧｌｕ Ｇｌｙ Ｐｈｅ
Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｓｅｒ
Ｐｒｏ Ｔｙｒ ＴｙｒＭＵＩＯ’ｌ ［１１
１１ ＧＡＧ ＧＧＴ ＴＴＣＧＡＣＴＴＴ ＡＧＣＧＴＴ
ＴＣＴ ＴＣＴ ＣＣＧ ＴＡＧ ＴＡＣＣＴＣＣＣＡ
ＡＡＧ ＣＴＧ ＡＡＡ ＴＣＧ ＣＡＡ ＡＧＡ
ＡＧＡ ＧＧＣＡＴＧ ＡＴＧｊ Ｌｌｌ
Ｉ Ｌ１２Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓ
ｅｒ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ａｌａ ＡＧＰ Ａｒｇ Ｖａ
ｌ Ｖａｌ口１４ マ
［１１５ＦＴＣＣＧＧＴ ＧＧＴ ＡＧＣＣＣＡ ＧＧ
Ｔ ＧＣＴ ＧＡＣＣＧＴ ＧＴＡ ＧＴＡＰｈｅ Ａ
ｓｎ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｃｙｓ Ｇｉｎ Ｌｅｕ Ａｌ
ａＵ１６ １ ＭＵ１７ ＴＴＣＡＡＣＧＡＡ ＡＡＣＴＧＴ ＣＡＧ ＣＴＣＧ
ＣＴＡＡＧ ＴＴＧ ＣＴＴ ＴＴＧ ＡＣＡ ＧＴＣ
ＧＡＧ ＣＣＡ息 ＭＬ１７
１Ｇｌｙ Ｖａｌ ＧＧＣＧＴＴ ＣＣＧ ＣＡＡ Ｉｃｅ Ｔｈｒ Ｈｉｓ ＡＴＣＡＣＣＣＡＣ ＴＡＧ ＴＧＧ ＧＴＧ 轟 Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ａ
ｓｎｆ Ｕ３Ｏ１ ＡＣＣＧＧＣＧＣＴ ＴＣＴ ＧＧＣＡＡＣＡＡＣＴＧ
Ｇ ＣＣＧ ＣＧＡ ＡＧＡ ＣＣＧ ＴＴＧ ＴＴＧ
Ｌ１９ 鳳 Ｌ２０ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ｍｅｔ Ｇ
ｌｎこのＤＮＡフラグメントの調製は、たとえば以下の
ようにして行なうことができる。すなわち、全ＤＮＡ配
列をいくつかのオリゴヌクレオチド単位に分割し、各オ
リゴヌクレオチドをリン酸トリエステル法あるいはボス
ファイト法等の既知の方法（文献６および７）によ−、
１て合成する。次いで、得られたオリゴヌクレオチドを
第２図に示したようにしてライゲートしく文献６および
１０）、５゛側、３゛側共にＢｇｌＵ部位を有する目的
のＤＮＡフラグメントを得ることができる。
ｅｒ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｖａｌ ＴｙｒＧＡＡ ＴＧＧ
ＣＣＧ ＡＴＣＣＴＧ ＴＣＴ ＡＧＣＧＧＣＧＡＣ
ＧＴＴ ＴＡＣｌｏ
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１１ ＧＡＧ ＧＧＴ ＴＴＣＧＡＣＴＴＴ ＡＧＣＧＴＴ
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Ｉ Ｌ１２Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓ
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ａＵ１６ １ ＭＵ１７ ＴＴＣＡＡＣＧＡＡ ＡＡＣＴＧＴ ＣＡＧ ＣＴＣＧ
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ＧＡＧ ＣＣＡ息 ＭＬ１７
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Ｌ１９ 鳳 Ｌ２０ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ｍｅｔ Ｇ
ｌｎこのＤＮＡフラグメントの調製は、たとえば以下の
ようにして行なうことができる。すなわち、全ＤＮＡ配
列をいくつかのオリゴヌクレオチド単位に分割し、各オ
リゴヌクレオチドをリン酸トリエステル法あるいはボス
ファイト法等の既知の方法（文献６および７）によ−、
１て合成する。次いで、得られたオリゴヌクレオチドを
第２図に示したようにしてライゲートしく文献６および
１０）、５゛側、３゛側共にＢｇｌＵ部位を有する目的
のＤＮＡフラグメントを得ることができる。
次に、上記フラグメントを組み込んだ組み換えＤＮＡ発
現ベクターを第３図のようにして構築する。すなわち、
プラスミドｐＩＧＦ８（文献１１）を文献１６の条件に
従いＢｇｌＨ制限酵素で消化し、得られた直鎖状ベクタ
ーと、上記のＢｇｌＩＩフラグメントをライゲートして
プラスミドｐＴＩ Ｓを得る。ここで用いるプラスミド
ｐｌＧＦ８は大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏ
ｌｉ、以下Ｅ、コリと称する）ｔｒｐプロモーター遺伝
子、ヒト成長ホルモン（以下ｈＧＨと称する）遺伝子の
一部分、インスリン様成長因子（以下ＩＧＦ−■と称す
る）遺伝子およびアンピシリン耐性遺伝子（Ａｐｒ）を
含有している。ＩＧＦ−Ｉ遺伝子はｈＧＨ遺伝子の５°
側から２／３の位置にある旦ｇ１１１部位を介してつな
がっている（第３図参照）このｈＧＨ遺伝子の旦１■部
位より上流側がコードしているアミノ酸配列をｈＧＨの
ＡＢ部分と称する。従って、得られるプラスミドｐＴ１
Ｓは、耐熱型ＲＮアーゼＴ１が２つノメチオニンを介し
てｈＧＨのＡＢ部分とＩＧＦ−Ｊにはさまれたサンドイ
ッチ状融合タンパク質を発現する（第４図参照）。ＲＮ
Ｎアゼ４１分子はメチオニンを含有していないので、こ
の融合タンパク質を、後に、メチオニンのＣ末端部で特
異的に切断させる臭化シアンを作用させることにより、
融合タンパク質から分離することができる。尚、上記プ
ラスミドｐＴ Ｉ Ｓの構築にプラスミドｐｌＧＦ８を
用いたのは、Ｅ、コリｔｒｐプロモーターにょるＲＮア
ーゼＴ１遺伝子の直接発現がうまくぃがず、〜方ｈＧＨ
の合成遺伝子がＥ、コリｔｒｐプロモーターの制御下で
安定かつ効率的に発現されるという知見に基づいている
。
現ベクターを第３図のようにして構築する。すなわち、
プラスミドｐＩＧＦ８（文献１１）を文献１６の条件に
従いＢｇｌＨ制限酵素で消化し、得られた直鎖状ベクタ
ーと、上記のＢｇｌＩＩフラグメントをライゲートして
プラスミドｐＴＩ Ｓを得る。ここで用いるプラスミド
ｐｌＧＦ８は大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏ
ｌｉ、以下Ｅ、コリと称する）ｔｒｐプロモーター遺伝
子、ヒト成長ホルモン（以下ｈＧＨと称する）遺伝子の
一部分、インスリン様成長因子（以下ＩＧＦ−■と称す
る）遺伝子およびアンピシリン耐性遺伝子（Ａｐｒ）を
含有している。ＩＧＦ−Ｉ遺伝子はｈＧＨ遺伝子の５°
側から２／３の位置にある旦ｇ１１１部位を介してつな
がっている（第３図参照）このｈＧＨ遺伝子の旦１■部
位より上流側がコードしているアミノ酸配列をｈＧＨの
ＡＢ部分と称する。従って、得られるプラスミドｐＴ１
Ｓは、耐熱型ＲＮアーゼＴ１が２つノメチオニンを介し
てｈＧＨのＡＢ部分とＩＧＦ−Ｊにはさまれたサンドイ
ッチ状融合タンパク質を発現する（第４図参照）。ＲＮ
Ｎアゼ４１分子はメチオニンを含有していないので、こ
の融合タンパク質を、後に、メチオニンのＣ末端部で特
異的に切断させる臭化シアンを作用させることにより、
融合タンパク質から分離することができる。尚、上記プ
ラスミドｐＴ Ｉ Ｓの構築にプラスミドｐｌＧＦ８を
用いたのは、Ｅ、コリｔｒｐプロモーターにょるＲＮア
ーゼＴ１遺伝子の直接発現がうまくぃがず、〜方ｈＧＨ
の合成遺伝子がＥ、コリｔｒｐプロモーターの制御下で
安定かつ効率的に発現されるという知見に基づいている
。
次いで、常法によりプラスミドｐ’ｒ ｌ Ｓをアンピ
シリン感受性の大腸菌、たとえばＥ、コリＨＢ１０１
（Ｆ−、ｈｓｄＳ ２０ ［ｒＢ−、ｍＢ−） 、ｒｅ
ｃＡ １３゜ａｒａ −１４，ｐｒｏＡ２，１ａｃＹ
１．ｇａｌＫ２．ｒｐｓＬ２０（Ｓ ｍ ｒ）＋ ｘｙ
ｌ ５ ＋ ｍｔｌ ｌ ＋ ５ｕｐＥ ４４ ＋
λ−）に導入し、アンピシリン含有培地で形質転換体を
選択する。この形質転換体をアンピシリンを含有する適
当な増早培地で増殖させ、プラスミドｐＴ１Ｓを取り出
し、このプラスミドが正しい塩基配列を有していること
をジデオキシ法（文献１４）により確認する。この様に
して確認されたプラスミドｐＴ１Ｓを含有する形質転換
体、即ち大腸菌ＨＢＩＱ１／ｐＴ１Ｓは工業技術院微生
物工業研究所に寄託されている（寄託臼：昭和６３年８
月２日、微工研菌寄第１０１６７号）。
シリン感受性の大腸菌、たとえばＥ、コリＨＢ１０１
（Ｆ−、ｈｓｄＳ ２０ ［ｒＢ−、ｍＢ−） 、ｒｅ
ｃＡ １３゜ａｒａ −１４，ｐｒｏＡ２，１ａｃＹ
１．ｇａｌＫ２．ｒｐｓＬ２０（Ｓ ｍ ｒ）＋ ｘｙ
ｌ ５ ＋ ｍｔｌ ｌ ＋ ５ｕｐＥ ４４ ＋
λ−）に導入し、アンピシリン含有培地で形質転換体を
選択する。この形質転換体をアンピシリンを含有する適
当な増早培地で増殖させ、プラスミドｐＴ１Ｓを取り出
し、このプラスミドが正しい塩基配列を有していること
をジデオキシ法（文献１４）により確認する。この様に
して確認されたプラスミドｐＴ１Ｓを含有する形質転換
体、即ち大腸菌ＨＢＩＱ１／ｐＴ１Ｓは工業技術院微生
物工業研究所に寄託されている（寄託臼：昭和６３年８
月２日、微工研菌寄第１０１６７号）。
上記形質転換体を増殖させ、適当なｏＩ）ｅｅｏ値とな
った時に３−インドールアクリル酸を加えることにより
、融合タンパク質を発現させる。
った時に３−インドールアクリル酸を加えることにより
、融合タンパク質を発現させる。
耐熱型ＲＮアーゼＴ１の精製の概略を以下に述測定結果
を後記第２表に示すが、本発明の耐熱型ＲＮアーゼＴ１
は天然型ＲＮアーゼＴ１に比べて５５°Ｃ，６０’Ｃの
高温でその活性が１０倍以上高いことがわかった。
を後記第２表に示すが、本発明の耐熱型ＲＮアーゼＴ１
は天然型ＲＮアーゼＴ１に比べて５５°Ｃ，６０’Ｃの
高温でその活性が１０倍以上高いことがわかった。
以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明する。
実施例で使用したポリヌクレオチドキナーゼ、Ｄ Ｎ
Ａ ！Ｊガーゼ、ＢｇｌＩＩ制限酵素は（株）宝酒造よ
り入手した。ＤＮＮアーゼはベーリンガー・マンハイム
社より入手した。リゾチームはシグマ社より人手した。
Ａ ！Ｊガーゼ、ＢｇｌＩＩ制限酵素は（株）宝酒造よ
り入手した。ＤＮＮアーゼはベーリンガー・マンハイム
社より入手した。リゾチームはシグマ社より人手した。
基質ｐＧ ｐｃは、オーツカ等の方法（文献８）に従っ
てジヌクレオチドＧｐＣを合成した後、その５”水酸基
をポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化して調製した（
文献９）。
てジヌクレオチドＧｐＣを合成した後、その５”水酸基
をポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化して調製した（
文献９）。
実施例１ オリゴデオキシヌクレオチドの合成以下のフ
ローチャート１に示すようにしてヌクべる。
ローチャート１に示すようにしてヌクべる。
先ず菌体を凍結融解法で破砕する。遠心分離操作で沈澱
画分と可溶性画分にわける。沈澱画分に回収される融合
蛋白質を７Ｍ尿素を含む緩衝液に溶解させ、陰イオン交
換カラムクロマトグラフィー（ワットマンＤＥ５２）で
分離し、融合蛋白質部分を回収する。透析により尿素を
除いた後、臭化シアン処理でメチオニンの所で切断し、
融合蛋白質から耐熱型ＲＮアーゼＴ１を切り出す。透析
後、陰イオン交換カラムクロマトグラフィー（ファルマ
シア、Ｑセファロース）で分離し、＋ＴＭ熱型ＲＮアー
ゼＴ１を回収する。集めた分画を更にＨＰＬＣ（ファル
マシア、モノＱ）で精製する。
画分と可溶性画分にわける。沈澱画分に回収される融合
蛋白質を７Ｍ尿素を含む緩衝液に溶解させ、陰イオン交
換カラムクロマトグラフィー（ワットマンＤＥ５２）で
分離し、融合蛋白質部分を回収する。透析により尿素を
除いた後、臭化シアン処理でメチオニンの所で切断し、
融合蛋白質から耐熱型ＲＮアーゼＴ１を切り出す。透析
後、陰イオン交換カラムクロマトグラフィー（ファルマ
シア、Ｑセファロース）で分離し、＋ＴＭ熱型ＲＮアー
ゼＴ１を回収する。集めた分画を更にＨＰＬＣ（ファル
マシア、モノＱ）で精製する。
酵素活性の測定は、５°水酸基を［γｊ１２ Ｐ］Ａ
ＴＰおよびポリヌクレオチドキナーゼでラベルした基質
３１ｐＧｐＣに耐熱型ＲＮアーゼＴ１を加え種々の温度
で反応させ、ホモクロマトグラフィー法（文献１２）に
よって３２ｐＧｐの初期生成量を測定し、これを時間に
対してプロットし、その傾きから初速度を求めることに
よって酵素活性測定を行なう。
ＴＰおよびポリヌクレオチドキナーゼでラベルした基質
３１ｐＧｐＣに耐熱型ＲＮアーゼＴ１を加え種々の温度
で反応させ、ホモクロマトグラフィー法（文献１２）に
よって３２ｐＧｐの初期生成量を測定し、これを時間に
対してプロットし、その傾きから初速度を求めることに
よって酵素活性測定を行なう。
レオシト樹脂１０を合成した。
（以下余白）
ｌ５
の合成
３’−（５°−０−ジメトキシトリチルチミジンル）モ
ノサクシネートの合成例を示す。
ノサクシネートの合成例を示す。
ジメトキシトリチルチミジン２．７２ｇ（５ｍモル）を
ピリジンと共沸した後、塩化メチレン２０ｍ１に溶解し
、無水コハク酸７５０ｍｇ（７，５ｍモル）および４−
ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡ Ｐ）９１６ｍｇ（７
，５ｍモル）を加えて２時間撹拌した。ＴＬＣ（ＣＨＣ
Ｉ ｓ ： Ｍ ｅｏ Ｈ＝ ２０ ： １ ）で原料
の消失を確認し、０．５Ｍ ＫＨ，ＰＯ，（ｐＨ５）（
２０ｍｌＸ２回）で洗浄した後、水洗（２０ｍｌＸ２回
）し溶媒を留去した。精製はＣ１８シラン化シリカゲル
カラムにより行なった。収量３．１４ｇ（４，８８ｍモ
ル）、収率９７．５％。
ピリジンと共沸した後、塩化メチレン２０ｍ１に溶解し
、無水コハク酸７５０ｍｇ（７，５ｍモル）および４−
ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡ Ｐ）９１６ｍｇ（７
，５ｍモル）を加えて２時間撹拌した。ＴＬＣ（ＣＨＣ
Ｉ ｓ ： Ｍ ｅｏ Ｈ＝ ２０ ： １ ）で原料
の消失を確認し、０．５Ｍ ＫＨ，ＰＯ，（ｐＨ５）（
２０ｍｌＸ２回）で洗浄した後、水洗（２０ｍｌＸ２回
）し溶媒を留去した。精製はＣ１８シラン化シリカゲル
カラムにより行なった。収量３．１４ｇ（４，８８ｍモ
ル）、収率９７．５％。
ペンタクロロフェニル３’（５’−０−シメトキシトリ
チルチミジニル）サクシネートの合成例を示す。
チルチミジニル）サクシネートの合成例を示す。
ジメトキシトリチルチミジニルモノサクシネート３．１
４ｇ（４，９ｍモル）をＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミド
３４．１ｍｌに溶解し、ペンタクロロフェノール１．４
３ｇ（５，４ｍモル）とＮ、Ｎ’−ジシクロへキシルカ
ルボジイミド１．５１ ｇ（７，３ｍモル）を加えて室
温で一晩撹拌した。ＴＬＣ（ＣＨＣ１３：ＭｅＯＨ＝１
０：１）で反応の完結を確認した後、沈澱を濾別し溶媒
を留去した。残査にベンゼン１５ｍ１を加えて析出する
不溶物を濾別した後、ベンゼンを留去した。この残査を
クロロホルム１５ｍ１に溶解し、ｎ−ペンタン中に滴下
して粉末化した。
４ｇ（４，９ｍモル）をＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミド
３４．１ｍｌに溶解し、ペンタクロロフェノール１．４
３ｇ（５，４ｍモル）とＮ、Ｎ’−ジシクロへキシルカ
ルボジイミド１．５１ ｇ（７，３ｍモル）を加えて室
温で一晩撹拌した。ＴＬＣ（ＣＨＣ１３：ＭｅＯＨ＝１
０：１）で反応の完結を確認した後、沈澱を濾別し溶媒
を留去した。残査にベンゼン１５ｍ１を加えて析出する
不溶物を濾別した後、ベンゼンを留去した。この残査を
クロロホルム１５ｍ１に溶解し、ｎ−ペンタン中に滴下
して粉末化した。
収量３．８９ｇ（４，３５ｍモル）、収率８９，２％。
チミ゛ジンーポリスチレン樹脂（Ｎ−Ｔ）の合成例を示
す。
す。
アミノメチル化ポリスチレン（９，１％ジビニルベンゼ
ン、ＮＨｓ：０．２０ｍモル／ｇ）２．５ｇ（０゜５ｍ
モル）をＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミド１５ｍ１に懸濁
し、ペンタクロロフェニル３”（５”−〇ジメトキシト
リチルチミンニル）サクシネート１．３４．ｇ（１，５
ｍモル）とトリエチルアミン０．２３ｍ１０．１５ｍモ
ル）を加えて一晩振盪した。反応液を濾過し、樹脂をＮ
、Ｎ−ジメチルホルムアミド（２０ｍｌＸ２回）および
ピリジン（２０ｍｌＸ２回）で洗浄した後、０．１Ｍ４
−ジメチルアミノピリジンのピリジン溶液４．５ｍｌと
無水酢酸０．５ｍｌを加えて１０分間振盪した。反応液
を濾過し、樹脂をピリジン（２０ｍｌｘ３回）、ジクロ
ロメタン（２０ｍｌＸ３回）およびエーテル（２０ｍｌ
Ｘ３回）で順次洗浄後乾燥させた。
ン、ＮＨｓ：０．２０ｍモル／ｇ）２．５ｇ（０゜５ｍ
モル）をＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミド１５ｍ１に懸濁
し、ペンタクロロフェニル３”（５”−〇ジメトキシト
リチルチミンニル）サクシネート１．３４．ｇ（１，５
ｍモル）とトリエチルアミン０．２３ｍ１０．１５ｍモ
ル）を加えて一晩振盪した。反応液を濾過し、樹脂をＮ
、Ｎ−ジメチルホルムアミド（２０ｍｌＸ２回）および
ピリジン（２０ｍｌＸ２回）で洗浄した後、０．１Ｍ４
−ジメチルアミノピリジンのピリジン溶液４．５ｍｌと
無水酢酸０．５ｍｌを加えて１０分間振盪した。反応液
を濾過し、樹脂をピリジン（２０ｍｌｘ３回）、ジクロ
ロメタン（２０ｍｌＸ３回）およびエーテル（２０ｍｌ
Ｘ３回）で順次洗浄後乾燥させた。
ヌクレオシドの定量は、チミジン−ポリスチレン樹脂１
０ ｍｇに２％ベンゼンスルホン酸の塩化メチレン−メ
タノール（７：３ｖ／ｖ）溶液２ｍｌを加えて１分間振
盪し、反応液の１／１００をとって溶媒を留去した後、
残査にＨＣｌ０４−ＥｔＯＨ（３：２ ｖ／ｖ）３ｍ＋
を加え、λ−５００ｎｍにおける吸光度を測定すること
により行なった。以上、塩基がチミンであるヌクレオシ
ドについて記載したが、他の塩基を持つヌクレオシド樹
脂の場合も同様の方法で調製した。
０ ｍｇに２％ベンゼンスルホン酸の塩化メチレン−メ
タノール（７：３ｖ／ｖ）溶液２ｍｌを加えて１分間振
盪し、反応液の１／１００をとって溶媒を留去した後、
残査にＨＣｌ０４−ＥｔＯＨ（３：２ ｖ／ｖ）３ｍ＋
を加え、λ−５００ｎｍにおける吸光度を測定すること
により行なった。以上、塩基がチミンであるヌクレオシ
ドについて記載したが、他の塩基を持つヌクレオシド樹
脂の場合も同様の方法で調製した。
Ａ−２，オリゴデオキシヌクレオチドの合成Ａ−１で得
たヌクレオシド樹脂２０〜３０ｍｇ（３〜５μモル）に
対し下記の第１表の操作を繰り返すことにより行なった
。工程１〜５で、塩化メチレン−メタノール（７：３
ｖ／ｖ）中の２％ベンゼンスルホン酸により５゛水酸基
の保護基であるジメトキシトリチル基を除去し、次に工
程６〜９で、常法により合成したダイマーブロックまた
はモノマーを樹脂に対して３〜４当量用いて縮合した。
たヌクレオシド樹脂２０〜３０ｍｇ（３〜５μモル）に
対し下記の第１表の操作を繰り返すことにより行なった
。工程１〜５で、塩化メチレン−メタノール（７：３
ｖ／ｖ）中の２％ベンゼンスルホン酸により５゛水酸基
の保護基であるジメトキシトリチル基を除去し、次に工
程６〜９で、常法により合成したダイマーブロックまた
はモノマーを樹脂に対して３〜４当量用いて縮合した。
縮合剤メシチレンスルホニルニトロトリアゾリドは樹脂
に対して１５〜２０当量用い、縮合反応は、４０°Ｃで
２０分間、３０℃で３０分間、室温（２０〜２５°Ｃ）
で４０分間行なった。縮合させた後、前記フローチャー
トの工程ｌＯ〜１２で未反応の５″−水酸基を、４−ジ
メチルアミノピリジン触媒下、無水酢酸でキャッピング
を行なった。この一連の操作を目的鎖長に達するまで行
なった。（フローチャート１の化合物番号１１〜１３参
照）。
に対して１５〜２０当量用い、縮合反応は、４０°Ｃで
２０分間、３０℃で３０分間、室温（２０〜２５°Ｃ）
で４０分間行なった。縮合させた後、前記フローチャー
トの工程ｌＯ〜１２で未反応の５″−水酸基を、４−ジ
メチルアミノピリジン触媒下、無水酢酸でキャッピング
を行なった。この一連の操作を目的鎖長に達するまで行
なった。（フローチャート１の化合物番号１１〜１３参
照）。
目的鎖長に達したヌクレオチド樹脂をジオキサンで洗浄
した後、０．５Ｍ １，１，３．３−テトラメチルグ
アニジウム−５ｙｎ−ピリジン−２−アルドキシメート
のジオキサン−・ｋ（９：ｌ）溶液ｌ１１１を加え、３
０℃で一晩振盪した。溶液を濾過した後、樹脂を５０％
ピリジン水で洗浄した。濾液と洗液を留去し、残査にピ
リジンＱ、５ｍｌとアンモニア水（２８％ＮＨ，０Ｈ）
ｌ Ｏｍｌを加えて封管し、５５℃で５時間加熱した後
、溶媒を留去し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー
により精製した。
した後、０．５Ｍ １，１，３．３−テトラメチルグ
アニジウム−５ｙｎ−ピリジン−２−アルドキシメート
のジオキサン−・ｋ（９：ｌ）溶液ｌ１１１を加え、３
０℃で一晩振盪した。溶液を濾過した後、樹脂を５０％
ピリジン水で洗浄した。濾液と洗液を留去し、残査にピ
リジンＱ、５ｍｌとアンモニア水（２８％ＮＨ，０Ｈ）
ｌ Ｏｍｌを加えて封管し、５５℃で５時間加熱した後
、溶媒を留去し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー
により精製した。
目的物を含むフラクションについて溶媒を留去した後、
８０％酢酸１ｍｌを加えた。２０分後溶媒を留去し、水
で共沸を行なった。残査を水３ｍｌに溶解し、酢酸エチ
ル（３ｍｉｘ３回）でトリタノールを抽出除去した後、
水層を留去した。得られた完全脱保護遺伝子断片をＣ１
８ＨＰＬＣにより分析分取を行なった。更にこれをイオ
ン交換ＨＰ 、Ｌ Ｃにより分析し、不純物が認められ
る時は分取し、ＨＰ Ｌ Ｃて単一ピークとなるまで精
製を行なった。
８０％酢酸１ｍｌを加えた。２０分後溶媒を留去し、水
で共沸を行なった。残査を水３ｍｌに溶解し、酢酸エチ
ル（３ｍｉｘ３回）でトリタノールを抽出除去した後、
水層を留去した。得られた完全脱保護遺伝子断片をＣ１
８ＨＰＬＣにより分析分取を行なった。更にこれをイオ
ン交換ＨＰ 、Ｌ Ｃにより分析し、不純物が認められ
る時は分取し、ＨＰ Ｌ Ｃて単一ピークとなるまで精
製を行なった。
精製した遺伝子断片は二次元ホモクロマトグラフィ（Ｍ
ｏｂｉｌｉｔｙ ５ｈｉｆｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ）およ
び５°−末端分析によりその塩基配列が正しいことを確
認した。
ｏｂｉｌｉｔｙ ５ｈｉｆｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ）およ
び５°−末端分析によりその塩基配列が正しいことを確
認した。
１Ｃの合成
オリゴヌクレオチドの合成はアプライド・バイオンステ
ム社のＤＮＡシンセサイｆ−（Ｍｏｄｅ１３８０Ａ）を
用いて行なった。原料、試薬はアプライド・バイオシス
テム社から購入した。
ム社のＤＮＡシンセサイｆ−（Ｍｏｄｅ１３８０Ａ）を
用いて行なった。原料、試薬はアプライド・バイオシス
テム社から購入した。
脱保護は５”水酸基の保護基であるジメトキシトリチル
基以外の保護基についてＤＮＡシンセサイザー中で行い
、以後、上記Ａ−３と同様にしてオリゴヌクレオチドの
精製、同定を行なった。
基以外の保護基についてＤＮＡシンセサイザー中で行い
、以後、上記Ａ−３と同様にしてオリゴヌクレオチドの
精製、同定を行なった。
実施例２ ′Ｍ熱型ＲＮアー七Ｔ１をコードしているＤ
ＮＡフラグメントの調製 Ａ ５”リン酸化 Ｕｌ、Ｌ２１Ｃ以外の各オリゴヌクレオチド０１ＩＯＤ
（′；７５０ｐモル、５μｇ）を、５０ｍＭ トリ２
ま た。この後１５°Ｃで１０分間保った後、β−ＭＥを１
０ｍＭになるように加え、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを３０Ｕ
加え、１５°Ｃで１２〜１５時間反応させた（セグメン
ｌ−１１１については反応の収率を上げるため２つにわ
けそれぞれをアニーリングさせ、２〜３時間結合反応を
行なわせた後、１つに混和した）。反応後、６５℃で５
分間加熱して酵素を失活させ、続いてエタノール沈澱に
よりＤＮＡを回収した。１０％ＰＡＧＥ（ポリアクリル
アミド電気泳動、サイズ（０，１Ｘ２０Ｘ２０ｃｍ）、
ＣＶ１７５■、３〜４時間）を行ない、目的の鎖長のセ
グメントのバンド部から電気溶離によりＤＮＡを回収し
、フェノール処理、エタノール沈澱を行ない、各セグメ
ント１５〜２５μｇ（２２５〜３７５ｐモル）を得た。
ＮＡフラグメントの調製 Ａ ５”リン酸化 Ｕｌ、Ｌ２１Ｃ以外の各オリゴヌクレオチド０１ＩＯＤ
（′；７５０ｐモル、５μｇ）を、５０ｍＭ トリ２
ま た。この後１５°Ｃで１０分間保った後、β−ＭＥを１
０ｍＭになるように加え、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを３０Ｕ
加え、１５°Ｃで１２〜１５時間反応させた（セグメン
ｌ−１１１については反応の収率を上げるため２つにわ
けそれぞれをアニーリングさせ、２〜３時間結合反応を
行なわせた後、１つに混和した）。反応後、６５℃で５
分間加熱して酵素を失活させ、続いてエタノール沈澱に
よりＤＮＡを回収した。１０％ＰＡＧＥ（ポリアクリル
アミド電気泳動、サイズ（０，１Ｘ２０Ｘ２０ｃｍ）、
ＣＶ１７５■、３〜４時間）を行ない、目的の鎖長のセ
グメントのバンド部から電気溶離によりＤＮＡを回収し
、フェノール処理、エタノール沈澱を行ない、各セグメ
ント１５〜２５μｇ（２２５〜３７５ｐモル）を得た。
Ｃ６変換体遺伝子の調製
各セグメントを３，３μｇ（５０ｐモル）用いて前述の
緩衝液中、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを１５Ｕ加えて結合反応
を行なった。この際アニーリングは行なわず、２０℃で
１２〜１５時間反応させた。反ス・ＨＣＩ（ｐＨ８，０
）、１０ ｍＭ ＭｇＣ１２，１０ｍＭβ−ＭＥ、１ｍ
Ｍスペルミン緩衝液中、１０μモルのＡＴＰと６Ｕのポ
リヌクレオチドキナーゼを加えて１０μｌとし、３７℃
で１時間反応させ、５′水酸基をリン酸化した（Ｕｌと
Ｌ２ＩＣの５°水酸基は制限酵素部位となっているので
、先にリン酸化してから結合反応を行なうとダイマーに
なるため、結合反応を行なってからリン酸化を行なった
）。反応後９０°Ｃで３分間加熱して酵素を失活させた
。
緩衝液中、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを１５Ｕ加えて結合反応
を行なった。この際アニーリングは行なわず、２０℃で
１２〜１５時間反応させた。反ス・ＨＣＩ（ｐＨ８，０
）、１０ ｍＭ ＭｇＣ１２，１０ｍＭβ−ＭＥ、１ｍ
Ｍスペルミン緩衝液中、１０μモルのＡＴＰと６Ｕのポ
リヌクレオチドキナーゼを加えて１０μｌとし、３７℃
で１時間反応させ、５′水酸基をリン酸化した（Ｕｌと
Ｌ２ＩＣの５°水酸基は制限酵素部位となっているので
、先にリン酸化してから結合反応を行なうとダイマーに
なるため、結合反応を行なってからリン酸化を行なった
）。反応後９０°Ｃで３分間加熱して酵素を失活させた
。
Ｂ、セグメントの調製
Ｕｌ、Ｌ２ＩＣおよび５′リン酸化したオリゴヌクレオ
チドを、第２図に示した各セグメント（Ｉ〜ＩＶｃ）の
構成要素ごとに１本のチューブに集めて混和し、６６ｍ
Ｍ トリス・ＨＣＩ（ｐＨ７，６）、６ 、６ ｍＭ
ＭｇＣＩ、、０．５ｍＭＡＴＰ緩衝液１５０μｌとな
るようにして９０’Ｃで３分間熱処理を行ない、直ちに
氷につけて急冷した。１０分後再び７５°Ｃに加熱して
から室温（２０°Ｃ〜２５°Ｃ）まで１〜２時間かけて
放冷し、アニーリングを行なっ応後６５℃で５分間処理
し、エタノール沈澱後、５％ＰＡＧＥ（サイズ０．ＩＸ
２０Ｘ２０ｃｍ）を行なった。ＲＮアーゼＴ１遺伝子の
鎖長に対応する部分のバンドを電気溶離により回収し、
フェノール処理、エタノール沈澱を行なった。さらに前
述の条件下、６Ｕのポリヌクレオチドキナーゼを用いて
フラグメントの両５°末端部をリン酸化して、耐熱型Ｒ
ＮアーゼＴ１をコードしているＤＮＡ配列を含有するフ
ラグメント約１μｇ（３，８ｐモル）を得た。
チドを、第２図に示した各セグメント（Ｉ〜ＩＶｃ）の
構成要素ごとに１本のチューブに集めて混和し、６６ｍ
Ｍ トリス・ＨＣＩ（ｐＨ７，６）、６ 、６ ｍＭ
ＭｇＣＩ、、０．５ｍＭＡＴＰ緩衝液１５０μｌとな
るようにして９０’Ｃで３分間熱処理を行ない、直ちに
氷につけて急冷した。１０分後再び７５°Ｃに加熱して
から室温（２０°Ｃ〜２５°Ｃ）まで１〜２時間かけて
放冷し、アニーリングを行なっ応後６５℃で５分間処理
し、エタノール沈澱後、５％ＰＡＧＥ（サイズ０．ＩＸ
２０Ｘ２０ｃｍ）を行なった。ＲＮアーゼＴ１遺伝子の
鎖長に対応する部分のバンドを電気溶離により回収し、
フェノール処理、エタノール沈澱を行なった。さらに前
述の条件下、６Ｕのポリヌクレオチドキナーゼを用いて
フラグメントの両５°末端部をリン酸化して、耐熱型Ｒ
ＮアーゼＴ１をコードしているＤＮＡ配列を含有するフ
ラグメント約１μｇ（３，８ｐモル）を得た。
実施例３ プラスミドｐＴｌｓの構築
耐熱型ＲＮアーゼＴ１をコードしているＤＮＡ配列を含
有する組み換えＤＮＡ発現ベクター、プラスミドｐ’ｒ
ｌ Ｓは、ニジカワ等の方法（文献１６）に従い、以
下のようにして調製した（第３図参照）。
有する組み換えＤＮＡ発現ベクター、プラスミドｐ’ｒ
ｌ Ｓは、ニジカワ等の方法（文献１６）に従い、以
下のようにして調製した（第３図参照）。
緩衝液（２０ｍＭ）リス−ＨＣＩ（ｐｆ（７，６）、７
ｍＭ ＭｇＣｌ７．１０ｍＭβ−ＭＥ、１７５ｍＭＮａ
Ｃ１）１００μ１２中のプラスミドｐ［ＧＦ８（５μｇ
）を、３７°Ｃで１．５時間、旦ｇｌＩＩ制限酵素１２
単位で消化した。更に、子牛小腸のアルカリホスファタ
ーセ（０，０４ユニツト）で処理し、５“末端のリン酸
基を除いた。この溶液をフェノール抽出し、次いでエー
テル洗浄することによって酵素を除去した。次いで直鎖
状ｐｌＧＦ８をエタノール沈殿させ、１０ｍＭ）リス〜
ＨＣＱＣｐＨ７，５）および１ｍＭのＥＤＴＡ溶液２５
μｇに溶解した。この直鎖状ｐｌＧＦ８（０，６７ｐモ
ル）と実施例２で調製した変換体遺伝子（２〜５ｐモル
）を、２０°Ｃで一晩、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（１，
２単位）を用いてライゲートした（合計容量２０μの。
ｍＭ ＭｇＣｌ７．１０ｍＭβ−ＭＥ、１７５ｍＭＮａ
Ｃ１）１００μ１２中のプラスミドｐ［ＧＦ８（５μｇ
）を、３７°Ｃで１．５時間、旦ｇｌＩＩ制限酵素１２
単位で消化した。更に、子牛小腸のアルカリホスファタ
ーセ（０，０４ユニツト）で処理し、５“末端のリン酸
基を除いた。この溶液をフェノール抽出し、次いでエー
テル洗浄することによって酵素を除去した。次いで直鎖
状ｐｌＧＦ８をエタノール沈殿させ、１０ｍＭ）リス〜
ＨＣＱＣｐＨ７，５）および１ｍＭのＥＤＴＡ溶液２５
μｇに溶解した。この直鎖状ｐｌＧＦ８（０，６７ｐモ
ル）と実施例２で調製した変換体遺伝子（２〜５ｐモル
）を、２０°Ｃで一晩、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（１，
２単位）を用いてライゲートした（合計容量２０μの。
この溶液をフェノール抽出した後、ＤＮＡをエタノール
沈殿させ、得られた沈殿ペレットをＥ、コリの形質転換
に用いた。
沈殿させ、得られた沈殿ペレットをＥ、コリの形質転換
に用いた。
実施例４ Ｅ、コリＨＢ１０１の形質転換モリソン等
の方法（文献１５）により予め調製したコンピテントな
細胞１００μｌおよび実施例３で調製したベクターＤＮ
Ａ溶液１０μｍを混合し、１時間放置した後、４２°Ｃ
で７５秒間処理し、室温で５分間放置した。これにＬＢ
培地９００μｍを加え、３７℃で１時間培養した。これ
を集菌し、のブドウ糖、１ｍＭのＭｇ５Ｏ，、および０
．１ｍＭのＣａＣ１２ｐコ２００ｍＱに、前前培養液５
ＭＱを加え、３７°Ｃで約１５時間振盪培養した（前培
養液）。次いで、この前培養液４０７Ｎｆｆを、上記の
カザミノ酸およびアンピシリン含有のＭ９培地１１２に
加え、３７°Ｃで振盪培養した。１〜１．５時間後、Ｏ
Ｄ、ｏｏ＝ｏ、０１〜０．０２となった時にＩＡＡ（３
−インドールアクリル酸）を終濃度が４０μ９／ ｍ（
１になるように加え、ｈＧＨのＡＢ部分と耐熱型ＲＮア
ーゼＴ１とＩＧＦ−Ｉの融合タンパク質の発現を誘導し
、さらに７時間培養した。
の方法（文献１５）により予め調製したコンピテントな
細胞１００μｌおよび実施例３で調製したベクターＤＮ
Ａ溶液１０μｍを混合し、１時間放置した後、４２°Ｃ
で７５秒間処理し、室温で５分間放置した。これにＬＢ
培地９００μｍを加え、３７℃で１時間培養した。これ
を集菌し、のブドウ糖、１ｍＭのＭｇ５Ｏ，、および０
．１ｍＭのＣａＣ１２ｐコ２００ｍＱに、前前培養液５
ＭＱを加え、３７°Ｃで約１５時間振盪培養した（前培
養液）。次いで、この前培養液４０７Ｎｆｆを、上記の
カザミノ酸およびアンピシリン含有のＭ９培地１１２に
加え、３７°Ｃで振盪培養した。１〜１．５時間後、Ｏ
Ｄ、ｏｏ＝ｏ、０１〜０．０２となった時にＩＡＡ（３
−インドールアクリル酸）を終濃度が４０μ９／ ｍ（
１になるように加え、ｈＧＨのＡＢ部分と耐熱型ＲＮア
ーゼＴ１とＩＧＦ−Ｉの融合タンパク質の発現を誘導し
、さらに７時間培養した。
Ｂ、耐熱型ＲＮアーゼＴ１の精製
集菌後、菌体を生理食塩水で洗浄し、次いで、５０ｍＭ
１−リス−ＨＣｆ２（ｐＨ８，０）、３０ｍＭＮａＣＣ
１１ｍＭＥＤＴＡからなる溶液に１ｇ菌体／１０１１ｇ
になるように懸濁した。これにリゾチームを１ｍｇ／ｙ
ｔｒＱになるように加え、０°Ｃで１時間放置した。次
いで凍結融解の操作を５回繰り返し、更に全容量の１１
５０（容量／容量）の１５０ｍＭトリス−ＨＣρ（ｐＨ
７，５）、２８Ｑ ｍＭ ＭｇＣ＋Ｌ、 ４ ｍＬＢ培
地１００μｌに懸濁し、寒天培地シ１，５％（Ｗ／Ｖ）
寒天、ＬＢ、４０μｇ／ｎ＋１アンピシリン］ニまいて
３７°Ｃで一晩培養した。次いで、形質転換体を２０μ
９／顧のアンピシリンを含有するＭ９カザミ／酸培地で
増殖させた。菌体を集めて溶菌し、プラスミドを回収し
た。ジデオキシ法（文献１４）によってこのプラスミド
の塩基配列を調べ、変換体遺伝子が正しく挿入されてい
ることを確認し、このプラスミドをｐＴｌｓと命名した
。
１−リス−ＨＣｆ２（ｐＨ８，０）、３０ｍＭＮａＣＣ
１１ｍＭＥＤＴＡからなる溶液に１ｇ菌体／１０１１ｇ
になるように懸濁した。これにリゾチームを１ｍｇ／ｙ
ｔｒＱになるように加え、０°Ｃで１時間放置した。次
いで凍結融解の操作を５回繰り返し、更に全容量の１１
５０（容量／容量）の１５０ｍＭトリス−ＨＣρ（ｐＨ
７，５）、２８Ｑ ｍＭ ＭｇＣ＋Ｌ、 ４ ｍＬＢ培
地１００μｌに懸濁し、寒天培地シ１，５％（Ｗ／Ｖ）
寒天、ＬＢ、４０μｇ／ｎ＋１アンピシリン］ニまいて
３７°Ｃで一晩培養した。次いで、形質転換体を２０μ
９／顧のアンピシリンを含有するＭ９カザミ／酸培地で
増殖させた。菌体を集めて溶菌し、プラスミドを回収し
た。ジデオキシ法（文献１４）によってこのプラスミド
の塩基配列を調べ、変換体遺伝子が正しく挿入されてい
ることを確認し、このプラスミドをｐＴｌｓと命名した
。
実施例５ 融合タンパク質の発現および粗酵素の調製
Ａ、融合タンパク質の発現
４０μＱ／ｄアンピシリンを含有するＬＢ培地５ＲＱに
実施例４で調製したＥ、コリＨＢ１０１／ｐＴ１Ｓを植
え、３７°Ｃで約８時間振盪培養した（前前培養）。
実施例４で調製したＥ、コリＨＢ１０１／ｐＴ１Ｓを植
え、３７°Ｃで約８時間振盪培養した（前前培養）。
０．２％（重量／容量）カザミノ酸および４０μ９／顧
アンピシリンを含有するＭ９培地［５，５ｇ／ＱのＮａ
２ＨＰＯ，，３ｇ＃！のＫＨ２ＰＯ，，５９／ρのＮａ
Ｃｌ２．１９／ＱのＮＨ４Ｃｌ２．０．４％（重量／容
量）Ｍ ＣａＣＱ２溶液を加え、１ｍ９／ｍ（ＩＤＮア
ーゼＩ溶液１００μρを加え、０°Ｃで６０分間放置し
た。
アンピシリンを含有するＭ９培地［５，５ｇ／ＱのＮａ
２ＨＰＯ，，３ｇ＃！のＫＨ２ＰＯ，，５９／ρのＮａ
Ｃｌ２．１９／ＱのＮＨ４Ｃｌ２．０．４％（重量／容
量）Ｍ ＣａＣＱ２溶液を加え、１ｍ９／ｍ（ＩＤＮア
ーゼＩ溶液１００μρを加え、０°Ｃで６０分間放置し
た。
これを３５，０００Ｘｇ、４０分間遠心分離し、沈澱を
回収した。この沈澱を７Ｍ尿素、２０ｍＭトリス−ＨＣ
＋２（ｐＨ７，５）、１０ｍＭ２−メルカプトエタノー
ルを含む溶液８０蛙に溶かし、同溶液で平衡化したＤＥ
５２カラムクロマトグラフィー（φ３ ｃｍＸ ５ ｃ
ｍ）にアプライして、０から０．３Ｍの食塩濃度勾配で
溶出した。目的とする融合蛋白質は０．１ＭからＱ、２
ＭＮａＣρの範囲に溶出されていることを５ＤＳ−ＰＡ
ＧＥ（文献１７）で認めた。この両分を回収し、透析脱
塩後凍結乾燥した。総蛋白質量は、２４７ｍｇであった
。これを７０％ギ酸８２酎に溶かし、臭化シアン６５６
ｍｇを加え、溶解後４°Ｃで２０時間、放置した。反応
後、５０〜１０ｍＭのＮ Ｈ４ＨＣＯ３に対して透析を
行ない、ギ酸および臭化シアンを除いた後、減圧濃縮し
た。これを次に２０ｍＭ）リス−ＨＣｆｆ（ｐＨ７，５
）、０．１５Ｍ Ｎａ（Ｊ！で平衡化したＱ セフ ７
０−スカラムク口マトグラフィ−（φ２．４ｃｍＸｌ３
．５ｃｍ）にアプライし、０．１５Ｍから０．４５Ｍの
ＮａＣｌ２ａ度勾配で溶出した。目的の耐熱型ＲＮアー
ゼＴ１は０．２８Ｍから０．３１ Ｍ ＮａＣ（ｌにか
けて溶出されていることを５ＤＳ−ＰＡＧＥで認めた。
回収した。この沈澱を７Ｍ尿素、２０ｍＭトリス−ＨＣ
＋２（ｐＨ７，５）、１０ｍＭ２−メルカプトエタノー
ルを含む溶液８０蛙に溶かし、同溶液で平衡化したＤＥ
５２カラムクロマトグラフィー（φ３ ｃｍＸ ５ ｃ
ｍ）にアプライして、０から０．３Ｍの食塩濃度勾配で
溶出した。目的とする融合蛋白質は０．１ＭからＱ、２
ＭＮａＣρの範囲に溶出されていることを５ＤＳ−ＰＡ
ＧＥ（文献１７）で認めた。この両分を回収し、透析脱
塩後凍結乾燥した。総蛋白質量は、２４７ｍｇであった
。これを７０％ギ酸８２酎に溶かし、臭化シアン６５６
ｍｇを加え、溶解後４°Ｃで２０時間、放置した。反応
後、５０〜１０ｍＭのＮ Ｈ４ＨＣＯ３に対して透析を
行ない、ギ酸および臭化シアンを除いた後、減圧濃縮し
た。これを次に２０ｍＭ）リス−ＨＣｆｆ（ｐＨ７，５
）、０．１５Ｍ Ｎａ（Ｊ！で平衡化したＱ セフ ７
０−スカラムク口マトグラフィ−（φ２．４ｃｍＸｌ３
．５ｃｍ）にアプライし、０．１５Ｍから０．４５Ｍの
ＮａＣｌ２ａ度勾配で溶出した。目的の耐熱型ＲＮアー
ゼＴ１は０．２８Ｍから０．３１ Ｍ ＮａＣ（ｌにか
けて溶出されていることを５ＤＳ−ＰＡＧＥで認めた。
この画分を回収し、１０ｍＭＮＨ，ＨＣＯ３に対して透
析後、減圧濃縮し、更にＭｏｎｏＱカラムクロマトグラ
フィー（φ５ Ｘ ５０ ｍｍ）で分離精製し、５ＤＳ
−ＰＡＧＥで単一バンド（純度９０％以上）の耐熱型Ｒ
ＮアーゼＴ１を得た。
析後、減圧濃縮し、更にＭｏｎｏＱカラムクロマトグラ
フィー（φ５ Ｘ ５０ ｍｍ）で分離精製し、５ＤＳ
−ＰＡＧＥで単一バンド（純度９０％以上）の耐熱型Ｒ
ＮアーゼＴ１を得た。
Ｃ，ＲＮアーゼＴ１活性の測定
５°水酸基を［γ〜”Ｐ］ＡＴＰとポリヌクレオチドキ
ナーゼでラベルした基質３２ｐＧｐＣの濃度を１５０μ
Ｍ１耐熱型ＲＮアーゼＴ１の濃度を０．５ｎｇ／ μ１
２（４５，１ｎＭ）にし、トリス−ＨＣｆｆ（ｐＨ７−
５）およびＥＤＴＡの濃度をそれぞれ５０ｍＭおよび１
ｎ＋Ｍにした全量２０ｔｔＱの溶液を３７°０１４５℃
、５５℃、６０°０１７０°Ｃでそれぞれ反応させた。
ナーゼでラベルした基質３２ｐＧｐＣの濃度を１５０μ
Ｍ１耐熱型ＲＮアーゼＴ１の濃度を０．５ｎｇ／ μ１
２（４５，１ｎＭ）にし、トリス−ＨＣｆｆ（ｐＨ７−
５）およびＥＤＴＡの濃度をそれぞれ５０ｍＭおよび１
ｎ＋Ｍにした全量２０ｔｔＱの溶液を３７°０１４５℃
、５５℃、６０°０１７０°Ｃでそれぞれ反応させた。
反応開始からＯ１２，５、ｌ０１１５分後に３μρづつ
分取し、それに１規定ＨＣρ０．６μρを加え、反応を
止めた。これをＤＥＡＥ−セル口オブ・バイオロジカル
・ケミストリー（Ｊ、Ｂｉｏｌ。
分取し、それに１規定ＨＣρ０．６μρを加え、反応を
止めた。これをＤＥＡＥ−セル口オブ・バイオロジカル
・ケミストリー（Ｊ、Ｂｉｏｌ。
Ｃｈｅｍ、 ）、２４０．２１１７（１９６５）２、タ
カハシ（Ｋ 、 Ｔ ａｋａｈａｓｈｉ）、ジャーナル
・オブ・バイオケミストリー（Ｊ 、 Ｂ ｉｏｃｈｅ
ｍ、 ）、１旦、３、ハイネマン等（Ｕ、Ｈｅｉｎｅｍ
ａｎｎ ｅｔ ａｌ、）、ネイチャ（Ｎ ａｔｕｒｅ）
、２９９．２７（１９８２）４、スギオ等（Ｓ 、 Ｓ
ｕｇｉｏ ｅｔ ａｌ、 ）、ＦＥＢＳレターズ（Ｆ
Ｅ Ｂ Ｓ Ｌｅｔｔ、）、１旦↓、１２９（１９
５、スギオ等（Ｓ 、 Ｓ ｕｇｉｏ ｅｔ ａｌ、
）、ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ 、
Ｂ ｉｏｃｈｅｍ、 ）、↓立旦、３５４（１９８８） ６、イケハラ等（Ｍ、 Ｉ ｋｅｈａｒａ ｅｔ ａｔ
、）、プロシーデインゲス・オプ・ナショナル・アカデ
ミ−・オブ・サンエンシーズ・米国（Ｐ ｒｏｃ、 Ｎ
ａｔｌ、 Ａ ｃａｄ。
カハシ（Ｋ 、 Ｔ ａｋａｈａｓｈｉ）、ジャーナル
・オブ・バイオケミストリー（Ｊ 、 Ｂ ｉｏｃｈｅ
ｍ、 ）、１旦、３、ハイネマン等（Ｕ、Ｈｅｉｎｅｍ
ａｎｎ ｅｔ ａｌ、）、ネイチャ（Ｎ ａｔｕｒｅ）
、２９９．２７（１９８２）４、スギオ等（Ｓ 、 Ｓ
ｕｇｉｏ ｅｔ ａｌ、 ）、ＦＥＢＳレターズ（Ｆ
Ｅ Ｂ Ｓ Ｌｅｔｔ、）、１旦↓、１２９（１９
５、スギオ等（Ｓ 、 Ｓ ｕｇｉｏ ｅｔ ａｌ、
）、ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ 、
Ｂ ｉｏｃｈｅｍ、 ）、↓立旦、３５４（１９８８） ６、イケハラ等（Ｍ、 Ｉ ｋｅｈａｒａ ｅｔ ａｔ
、）、プロシーデインゲス・オプ・ナショナル・アカデ
ミ−・オブ・サンエンシーズ・米国（Ｐ ｒｏｃ、 Ｎ
ａｔｌ、 Ａ ｃａｄ。
Ｓ ｃｉ、 Ｕ Ｓ Ａ）、及１．５９５６（１９８４
）７、バロン等（Ａ、 Ｄ、 Ｂａｒｏｎｅ ｅｔ ａ
ｌ、）、ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、 ）、１２．４０５１（１
９８４）−スプレートにスポットし、ホモミックス■を
用いてホモクロマトグラフィー（文献１２）を行なった
。Ｘ線フィルムを感光させ、それをもとにしてプレート
の各スポット部分を切り取ってバイアルに入れ、液体シ
ンチレーションカウンターによって放射能を測定した。
）７、バロン等（Ａ、 Ｄ、 Ｂａｒｏｎｅ ｅｔ ａ
ｌ、）、ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、 ）、１２．４０５１（１
９８４）−スプレートにスポットし、ホモミックス■を
用いてホモクロマトグラフィー（文献１２）を行なった
。Ｘ線フィルムを感光させ、それをもとにしてプレート
の各スポット部分を切り取ってバイアルに入れ、液体シ
ンチレーションカウンターによって放射能を測定した。
３！ｐＱｐの生成量を時間に対してプロットし、その傾
きから初速度を求めた。
きから初速度を求めた。
得られた結果を、天然型ＲＮアーゼＴ１について同様に
試験して得た結果と合わせ第２表に示す。
試験して得た結果と合わせ第２表に示す。
箪λ嚢
引用文献
１、タカハシ（Ｋ、 Ｔ ａｋａｈａｓｈｉ）、リサー
チ／Ｌ７−８、オーツカ等（Ｅ、０ｈｔｓｕｋａ ｅｔ
ａｔ、）、テトラヘドロン（Ｔ ｅｔｒａｈｅｄｒｏ
ｎ）、４０．４７（１９８４）９、リチャードソン（Ｃ
、Ｃ、Ｒ１ｃｈａｒｄｓｏｎ）、プロシーデインゲス・
オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サンエンシーズ
・米国（Ｐ ｒｏｅ、 Ｎ ａｔ ｌ。
チ／Ｌ７−８、オーツカ等（Ｅ、０ｈｔｓｕｋａ ｅｔ
ａｔ、）、テトラヘドロン（Ｔ ｅｔｒａｈｅｄｒｏ
ｎ）、４０．４７（１９８４）９、リチャードソン（Ｃ
、Ｃ、Ｒ１ｃｈａｒｄｓｏｎ）、プロシーデインゲス・
オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サンエンシーズ
・米国（Ｐ ｒｏｅ、 Ｎ ａｔ ｌ。
Ａｃａｄ、 Ｓ ｃｉ、 Ｕ Ｓ Ａ）、５４．１５８
（１９６５）１０、イケハラ等（Ｍ、 １ ｋｅｈａｒ
ａ ｅｔ ａｌ、）、プロシーデインゲス・オブ・ナシ
ョナル・アカデミ−・オブ・サンエンシーズ（Ｐｒｏｃ
、 Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。
（１９６５）１０、イケハラ等（Ｍ、 １ ｋｅｈａｒ
ａ ｅｔ ａｌ、）、プロシーデインゲス・オブ・ナシ
ョナル・アカデミ−・オブ・サンエンシーズ（Ｐｒｏｃ
、 Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。
）、１旦、４６９５（１９８６）
１１、 ニジカワ等（Ｓ 、 Ｎ ｉｓｈｉｋａｗａ
ｅｔ ａｌ、 ）、プロティン・エンジニアリング（
Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）、上、４８
７（１９８７） １２、ジェイ等（Ｅ、 Ｊ ａｙ ｅｔ ａｌ、）、ヌ
クレイツク・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａ
ｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、）、１．３３７（１９７４） ｔａ、草間慶−、トレーサー実験法（上）（生化学実験
講座６）、日本生化学会編、東京化学同人、１４、サン
ガー等（Ｆ 、 Ｓ ａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ、 ）、
プロシ−デインゲス・オブ・ナショナル・アカデミ−・
オブ・サンエンシーズ（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、Ａｃａ
ｄ、Ｓｃｉ。
ｅｔ ａｌ、 ）、プロティン・エンジニアリング（
Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）、上、４８
７（１９８７） １２、ジェイ等（Ｅ、 Ｊ ａｙ ｅｔ ａｌ、）、ヌ
クレイツク・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａ
ｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、）、１．３３７（１９７４） ｔａ、草間慶−、トレーサー実験法（上）（生化学実験
講座６）、日本生化学会編、東京化学同人、１４、サン
ガー等（Ｆ 、 Ｓ ａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ、 ）、
プロシ−デインゲス・オブ・ナショナル・アカデミ−・
オブ・サンエンシーズ（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、Ａｃａ
ｄ、Ｓｃｉ。
）、１土、５４６３（１９７７）
１５、モリソン等（Ｐ、Ａ、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ
ａｌ、）、メソッズ・オブ・エンザイモロジ−（Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ Ｅ ｎｚｙｍｏｌ、 ）、６８．３２６（１
９７９）１６、ニジカワ等（Ｓ、 Ｎ ｉｓｈｉｋａｗ
ａ ｅｔ ａｌ、 ）、ヨーロピアン・ジャーナル・オ
ブ・バイオケミストリー（Ｅ ｕｒ、 Ｊ、 Ｂ ｉｏ
ｃｈｅｍ、 ）、１７３．３８９（１９８１７、 レ
ムリ（Ｕ 、 Ｋ 、 Ｌ ａｅｍｍｌｉ）、ネイチ＋
−（Ｎａｔｕｒｅ）、λλヱ、６８０（１９７０）
ａｌ、）、メソッズ・オブ・エンザイモロジ−（Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ Ｅ ｎｚｙｍｏｌ、 ）、６８．３２６（１
９７９）１６、ニジカワ等（Ｓ、 Ｎ ｉｓｈｉｋａｗ
ａ ｅｔ ａｌ、 ）、ヨーロピアン・ジャーナル・オ
ブ・バイオケミストリー（Ｅ ｕｒ、 Ｊ、 Ｂ ｉｏ
ｃｈｅｍ、 ）、１７３．３８９（１９８１７、 レ
ムリ（Ｕ 、 Ｋ 、 Ｌ ａｅｍｍｌｉ）、ネイチ＋
−（Ｎａｔｕｒｅ）、λλヱ、６８０（１９７０）
第１図は天然型ＲＮアーゼＴ１の１次構造を示す模式図
であり、第２図は耐熱型ＲＮアーゼＴ１をコードしてい
るＤＮＡ配列を含有する旦１■フラグメント調製の工程
図であり、第３図は組み換えＤＮＡ発現ベクター、プラ
スミドｐＴ１Ｓ構築の工程図であり、第４図は耐熱型Ｒ
ＮアーゼＴ１を含むサンドイッチ状融合タンパクの融合
部を示す模式図である。 特許出願人 株式会社蛋白工学研究所 代 理 人 弁理士 青白 葆 （外１名）２図 ＵＩ Ｕ２ Ｕ３ Ｕ４ ＭＵ５０−←←番−−
トー ２ Ｌ３ Ｌ４ Ｌ５ ＭＬ６ ＩＪ６ Ｕ７ Ｌ１８ Ｕ９ ＵＩＯ−一一一
番−一 ・−−−・−−一・−一一し１０ １ｌ Ｕｌｌ Ｕ１２ ＵＩ３ ＵＩ４ ＵＩ５ Ｕ
Ｉ６ ＭＵ１７ＵＩ８ ＵＩ９ Ｕ２０Ｕ２１ｃｍ□□
□・−□□□・−・−ト ー嗜−−噂−−４−−４−−４−→→→−→−０ＬＩ２
Ｌｉ３ Ｌ１２ Ｌｉ２ Ｌ、Ｉ６ ＭＬ１７
Ｌ１８ＬＩ９Ｌ２０Ｌ２１ｃ号０
であり、第２図は耐熱型ＲＮアーゼＴ１をコードしてい
るＤＮＡ配列を含有する旦１■フラグメント調製の工程
図であり、第３図は組み換えＤＮＡ発現ベクター、プラ
スミドｐＴ１Ｓ構築の工程図であり、第４図は耐熱型Ｒ
ＮアーゼＴ１を含むサンドイッチ状融合タンパクの融合
部を示す模式図である。 特許出願人 株式会社蛋白工学研究所 代 理 人 弁理士 青白 葆 （外１名）２図 ＵＩ Ｕ２ Ｕ３ Ｕ４ ＭＵ５０−←←番−−
トー ２ Ｌ３ Ｌ４ Ｌ５ ＭＬ６ ＩＪ６ Ｕ７ Ｌ１８ Ｕ９ ＵＩＯ−一一一
番−一 ・−−−・−−一・−一一し１０ １ｌ Ｕｌｌ Ｕ１２ ＵＩ３ ＵＩ４ ＵＩ５ Ｕ
Ｉ６ ＭＵ１７ＵＩ８ ＵＩ９ Ｕ２０Ｕ２１ｃｍ□□
□・−□□□・−・−ト ー嗜−−噂−−４−−４−−４−→→→−→−０ＬＩ２
Ｌｉ３ Ｌ１２ Ｌｉ２ Ｌ、Ｉ６ ＭＬ１７
Ｌ１８ＬＩ９Ｌ２０Ｌ２１ｃ号０
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、天然型ＲＮアーゼＴ１のアミノ末端から２４番目の
チロシンと８４番目のアスパラギンをそれぞれシステイ
ンに置換した耐熱型ＲＮアーゼＴ１。 ２、天然型ＲＮアーゼＴ１のアミノ末端から２４番目の
チロシンと８４番目のアスパラギンをそれぞれシステイ
ンに置換した耐熱型ＲＮアーゼＴ１をコードしているＤ
ＮＡ配列。３、配列式１で示される請求項２に記載のＤ
ＮＡ配列。 ４、天然型ＲＮアーゼＴ１のアミノ末端から２４番目の
チロシンと８４番目のアスパラギンをそれぞれシステイ
ンに置換した耐熱型ＲＮアーゼＴ１をコードしているＤ
ＮＡ配列を含有する組み換えＤＮＡ発現ベクター。 ５、プラスミドｐＴ１Ｓである請求項４に記載のベクタ
ー。 ６、天然型ＲＮアーゼＴ１のアミノ末端から２４番目の
チロシンと８４番目のアスパラギンをそれぞれシステイ
ンに置換した耐熱型ＲＮアーゼＴ１をコードしているＤ
ＮＡ配列を含有する組み換えＤＮＡ発現ベクターで形質
転換した微生物。 ７、Ｅ、コリＨＢ１０１／ｐＴ１Ｓである請求項６に記
載の微生物。 ８、天然型ＲＮアーゼＴ１のアミノ末端から２４番目の
チロシンと８４番目のアスパラギンをそれぞれシステイ
ンに置換した耐熱型ＲＮアーゼＴ１の製造方法であって
、 （ａ）該耐熱型ＲＮアーゼＴ１をコードしているＤＮＡ
配列を調製し、 （ｂ）該ＤＮＡ配列を含有する組み換えＤＮＡ発現ベク
タ−を調製し、 （ｃ）次いで、該組み換えＤＮＡ発現ベクターで宿主細
胞を形質転換して耐熱型ＲＮアーゼＴ１を融合タンパク
質として発現させ、 （ｄ）該融合タンパク質を切断して耐熱型ＲＮアーゼＴ
１を得ることからなる方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63208905A JP2641263B2 (ja) | 1988-08-23 | 1988-08-23 | 耐熱型ｒｎアーゼｔ１ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63208905A JP2641263B2 (ja) | 1988-08-23 | 1988-08-23 | 耐熱型ｒｎアーゼｔ１ |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0257181A true JPH0257181A (ja) | 1990-02-26 |
| JP2641263B2 JP2641263B2 (ja) | 1997-08-13 |
Family
ID=16564068
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63208905A Expired - Lifetime JP2641263B2 (ja) | 1988-08-23 | 1988-08-23 | 耐熱型ｒｎアーゼｔ１ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2641263B2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5268289A (en) * | 1991-12-27 | 1993-12-07 | Epicentre Technologies Corp. | Thermostable ribonuclease H |
| US5459055A (en) * | 1991-12-27 | 1995-10-17 | Epicentre Technologies Corporation | Thermostable ribonuclease H isolated from Thermus flavus |
-
1988
- 1988-08-23 JP JP63208905A patent/JP2641263B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5268289A (en) * | 1991-12-27 | 1993-12-07 | Epicentre Technologies Corp. | Thermostable ribonuclease H |
| US5459055A (en) * | 1991-12-27 | 1995-10-17 | Epicentre Technologies Corporation | Thermostable ribonuclease H isolated from Thermus flavus |
| US5500370A (en) * | 1991-12-27 | 1996-03-19 | Epicentre Technologies | Thermostable ribonuclease H and genetic constructs therefore |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2641263B2 (ja) | 1997-08-13 |
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