JPS61247384A - 酵母中でプラスミノ−ゲン活性化因子を発現する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は酵母中にプラスミノーゲン活性化因子を表現さ
せる方法、それに有用なりＮＡベクター、およびそれに
より表現されたタンパク質生成物を指向する。

血餅の形成による循環系中の血液流の阻害は疾患および
死゛亡の主原因である。最も重大な問題は血液流が心臓
（心臓発作）、脳（発作）または肺（肺塞栓症）に対し
遮断されるときに生ずる。これらの問題と戦うため、プ
ラスミノーゲン活性化因子といわれる一群の生物学的化
合物が、線維素溶解システムとして知られるものにより
血餅を破壊する作用をする。種々の機構によりプラスミ
ノーゲン活性化因子は活性酵素プラスミンを発生させ、
それが凝塊の線維綱状組織を分解して可溶性生成物を生
成させる。プラスミノーゲン活性化因子として作用する
商業的に血栓崩壊治療に使用できる２つの薬物はストレ
プトキナーゼ、細菌タンパク質、およびウロキナーゼ、
人尿から分離されるセリンプロテアーゼ、である。しか
し、これらの薬物にはともに大きな欠点があり、それら
は血餅に特異的ではない。線維素に加えて、それらは線
維素原、プロトロンビン、因子Ｖおよび因子■のような
血液タンパク質を破壊し、それが治療の副作用として内
出血を生ずることができる。従って、ストレプトキナー
ゼおよびウロキナーゼの投与は通常カテーテルによる凝
塊の部位に対する直接挿入により行なわれる。この手順
はむしろ複雑であるので使用されることは稀である。

一方、プラスミノーゲン活性化因子は正常および腫瘍組
織から抽出され、現在それらの誘導源によって、ウロキ
ナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕ　Ｐ　Ａ）お
よび組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）に分
類される。ｔＰＡはｕＰＡ群の活性化因子に比較して線
維素に対しより高い親和性を有する。従って、利用でき
るｔＰＡの供給および種類を増加させるために遺伝子工
学手法によりｔＰＡを製造することが望まれる。

バウズ（Ｂｏｗｅｓ　）黒色腫細胞からのｍＲＮＡを用
いて大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｔ　）中にクローニングした
ｔＰＡｃＤＮＡのＤＮＡコーディング配列はペニカ（Ｐ
ｅｎｎ１ｃａ　）らにより記載された〔ネーチャ（Ｎａ
ｔｕｒｅ　）、３０１：２１４〜２２１，１９８３）。

ワレン（Ｗａｌｌｅｎ　）ら〔ユーロピアン・ジャーナ
ル・オプ・バイオケミストリー（Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ、）、１３２：６８１〜６８６．１９８３）
はヒト黒色腫細胞系列〔バウズ（Ｂｏｓｍｅｓ　）　）
からプラスミノーゲン活性化因子の１鎖形態の２変種を
精製し、特性表示した。２変種の部分アミノ酸配列分析
により、１つはＮ−末端における付加３アミノ酸残基を
含むのでそれらが異なることが示された。この付加トリ
ペプチド配列、Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｒｇはプラスミンに
より分子から開裂されてペニカ（Ｐｅｎｎｉｃａ）らに
より報告されたヌクレオチド配列から演澤されたものに
相当するアミノ末端アミノ酸配列を有する短かい変種を
生じることが示された。

多（の異種タンパク質生成物がサツカロミセス・セレビ
シェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉ
ａｅ　）　（パン酵母）中に表現されたけれども、同様
の結果を他のタンパク質で得られるかどうかは予測する
ことができない。形質転換細胞中の異種遺伝子の発現は
宿主細胞および外来遺伝子、関連調節遺伝子並びに遺伝
子生成物の間の多くの相互作用による。

そのような相互作用は一部は宿主種により規定される。

遺伝子特異的相互作用にはコドン使用バイアス、プロモ
ーターおよびターミネータ−シグナルの認識、並びに外
来遺伝子を保持する染色体外要素（例えばプラスミド）
の安定性およびコピー数が含まれる。タンパク賞特異的
相互作用にはタンパク賞生成物の酵素修飾、例えば前駆
物質形態のプロセシング、グリコシル化、ジスルフィド
結合形成など、が含まれる。さらに、宿主生物の異なる
種類は異種遺伝子生成物を分泌する能力が異なることが
できる。

当該特定宿主−生成物系により、そのような特異的修飾
が望ましいかまたは望ましくないことができる。種はそ
れらの外来タンパク質の存在あるいは商業規模の特定タ
ンパク質の生成または分離に必要な培養条件に対する耐
性が異なることができる。固有の遺伝子生成物はある場
合に、所望生成物を汚染するので精製が高価および（ま
たは）面倒であろう。

従って、真核生物、サツカロミセス町セレビシｓ　（Ｓ
ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　）
および他の酵母中にプラスミノーゲン活性化因子を生成
させる方法を開発してそのような相互作用を決定するこ
とおよびそれらをプラスミノーゲン活性化因子の商業生
産に活用することが望ましい。一般に、これらの宿主−
生成物相互作用は演澤的に予想することができないで、
研究室または大規模生産環境における多数の研究により
決定しなければならない。

従って本発明の目的は酵母中にｔＰＡを生成させる方法
を提供することである。

本発明の他の目的は酵母中のｔＰＡの表現に有用なりＮ
Ａベクターを提供することである。

本発明のなお他の目的はヒトｔＰＡの活性を有するタン
パク質を酵母中に生成させることである。

本発明は酵母遺伝子プロモーターおよびｔＰＡに対する
構造遺伝子に対しコーディングするセグメントを含むベ
クターにより形質転換され、それによりプラスミノーゲ
ン活性化因子の発現がプロモーターの制御下にある酵母
の培養を成長させる段階を含む酵母中にプラスミノーゲ
ン活性化因子を生成させる方法を指向する。そのような
ベクターの製造に有用なりＮＡ構築体もまた記載される
。

用いた「ベクター」、「プラスミド」およびｒＤＮＡ構
築体」という用語は互変性である。これらの用語はすべ
て自然に存在しない方法で人により組合され並置された
ＤＮＡセグメントを含むように修飾された任意のＤＮＡ
分子、すなわちそのような分子のクロンと規定される。

通常そのようなベクターは宿主生物内に表現させる少く
とも１つの遺伝子、並びに関心遺伝子の表現に必要であ
ることができる遺伝子要素、例えばプロモーター、転写
開始部位および転写ターミネータ−１を宿主生物内に形
質転換させたときにそれ自体の複製を保証する遺伝子情
報を含む。ベクターはまた表現される遺伝子（′Ｒ）の
表現を調節する配列を含むことができる。

「表現」という用語は普通の使用法で、宿主生物内の遺
伝子によりコーディングされたタンパク質生成物が生物
により合成される状態を意味すると規定される。宿主生
物中の必要な制御域のすべてを有する特定遺伝子の存在
は演鐸的に遺伝子が必然的に表現されることを意味しな
い。多くの理由が存在し、その多くは形質転換生物中に
遺伝子の表現を欠゛くために完全には理解されない。さ
らに、ある程度の表現があるとしても、表現の水準を予
想する妥当な方法がない。従って、表現はある場合に生
ずることができるけれども、表現はタンパク質生成物が
有用であることができる量で生成されないような低い水
準であることができる。

「リーダー配列」という用語はシグナルペプチドまたは
プレープロ（ｐｒｅ　−ｐｒｏ　）ペプチドをエンコー
ディングする遺伝子の部分を示す。シグナルペプチドは
新たに合成されるタンパク質を細胞分泌路中へ向かわせ
、−ｉにこのプロセスの間に残余のタンパク質から開裂
される。プレープロペプチドは一般に分泌過程中の後時
点で除去される。

用いた「リーダー配列」という用語は固有的に生ずるり
−ダー配列もまた示すことができる。

酵母中に異種タンパク質を表現させるために、酵母に固
有であるプロモーターの制御下の表現を有することが望
ましい。酵母トリオースホスフェートイソメラーゼ（Ｔ
ＰＩ）遺伝子〔アルバート（八Ｉｂｅｒｔ　ａｎｄ　Ｋ
ａｗａｓａｋｉ　）　　ら＼ジェ、モレク、アプル、ジ
ーニド、　（Ｊ、　Ｍｏ１ｅｃ、　Ａｐｐｌｅ、　Ｇｅ
ｎｅｔ、）、上：４１９〜４３４．１９８２）のプロモ
ーター域は好ましいプロモーターである。酵母ＴＰＩプ
ロモーターを用いる利点の１つは高水準の転写が得られ
、酵母細胞により生産される全タンパク質の実質的な部
分が関心タンパク質に供されることができることである
。

他のプロモーター配列もまた本発明のベクターを修飾し
て前記プロモーターを結合させることによりニス、セレ
ビシェ（Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　）の形質転換培
養においてｔＰＡを生産させるのに利用されることがで
きる。本出願において潜在的に有用な他のプロモーター
には、アルコールデヒドロゲナーゼｌ　〔アンメラー（
＾ｍｍｅｒｅｒ　）、メト、イン・エンチモロジイ（Ｍ
ｅｔｈ、　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　）　、匪：１
９２〜２０１．１９８３］、アルコールデヒドロゲナー
ゼ■　〔ウィリアムソン（讐ｉ１１ｉａｍｓｏｎ　）ら
、ネーチ＋（Ｎａｔｕｒｅ　）２８３　：　２１４〜２
１６．１９８０）、ピルビン酸エステルキナーゼ、ホス
ホグルコースイソメラーゼ、ホスホグリセラードムター
ゼ、°ヘキソキナーゼ１、ヘキソキナーゼ２、グルコキ
ナーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、アルドラーゼなど、
またはそれらの一部をエンコーディングするニス、セレ
ビシェ（Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　）遺伝子のプロ
モーターが含まれる。

本発明のＤＮＡ構築体は好ましくは、さらにｔＰＡ構造
遺伝子の３′側に転写ターミネータ−配列を含む。好ま
しいそのようなターミネータ−はニス、セレビシェ（Ｓ
、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　）　Ｔ　Ｐ　Ｉ遺伝子のタ
ーミネータ−である。

宿主細胞からのｔＰＡの表現、分泌をさせるベクターは
さらに分泌シグナルをエンコーディングする遺伝子配列
、例えばＭＦα１遺伝子〔キュルジャンら（Ｋｕｒｊａ
ｎ　ａｎｄ　Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ　）　、セル（Ｃｅ
ｌｌ　）３０　：　９３３〜９４３．１９８２）により
エンコードされたフェロモンα因子に連れ添う酵母のプ
レープロ域または酵母ＰＨ０５、ＳＵＣ主およびＢＡＲ
１遺伝子のシグナルペプチド域並びにｔＰＡ遺伝子自体
のプレープロ域が含まれる。

記載したベクターは、ニス、セレビシェ（Ｓ。

ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　）中へ形質転換されるとヒト組
織型プラスミノーゲン活性化因子の活性を有するタンパ
ク質の生産を行なう。

本発明により生産されるタンパク質は自然発生ｔＰＡの
２つの主形態の１つの配列を有することができ、あるい
はアミノ酸配列はｔＰＡの生物活性を保持するがしかし
他の所望の特性もまた有するタンパク質を生ずるように
変えることができる。

例えば、酵母中に生ずるｔＰＡポリペプチドのグリコシ
ル化を低下させるためにグリコシル化部位を部位特異的
突然変異誘発により変えることができる。そのような更
改は高い表現水準および（または）高特異的活性を生ず
ることができる。さらに、自然発生変動が例えば遺伝子
多形現象のために存在することができる。

記載したベクターで形質転換した酵母細胞は標準培養条
件下に成長することができる。好ましい成長培地は２〜
６％の濃度にグルコースを補給した一１ｅｕ培地である
。また培養成長中ｐＨ５，０〜６、０に培地のｐＨを安
定化するために培地が緩衝液を含むどとが殊に好ましい
。殊に好ましい緩衝液は０．１　Ｍフタル酸水素カリウ
ムｐＨ５，５および０、１　Ｍコハク酸ナトリウムｐＨ
５，５である。

本発明により生産されるｔＰＡは種々の程度にグリコシ
ル化されまたは非グリコシル化であることができる。炭
水化物の存在が線維素溶解活性を妨害することができる
ので、ある場合には試験管内で炭水化物を除去すること
が望ましいかもしれない。炭水化物を除去する好ましい
方法はエンドグリコシダーゼＨによる処理である。

標準的な生化学手法を全体に用いた。制限エンドヌクレ
アーゼはベテスダ・リサーチ・ラボラトリーズ（Ｂｅｔ
ｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉ
ｅｓ　）、ニュー・イングランド・バイオラブズ（Ｎｅ
ｗ　ｔＥｎｇｌａｎｄＢｉｏＬａｂｓ）およびベーリン
ガー・マンハイム・バイオケミカルズ（Ｂｏｅｈｒｔｎ
ｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　Ｂｉｏｃｈｅ＋＋＋ｉｃａ
１ｇ）から入手し、製造業者の指示に従って、一般に膵
臓ＲＮａｓｅ　（１０、！ｆ　ｇ／ｍ　ｌ）を添加して
使用した。Ｔ４ＤＮＡリガーゼはベテスダ・リサーチ・
ラボラトリーズおよびベーリンガー・マンハイムから入
手し、指示のように使用した。Ｍ１３およびｐＵＣ宿主
株およびベクター（ｐＵｃ１８およびｐＵｃ１９を除く
）はベテスダ・リサーチ・ラボラトリーズから入手した
。Ｍ１３クローニングはメッシング（Ｍｅｓｓｉｎｇ　
）　　（メト、イン、エンチモロジイ（Ｍｅｔｈ、　ｉ
ｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　）　、１０１　：２０〜７
７．１９８３）により記載されたように行なった。ＤＮ
Ａポリメラーゼ■　〔フレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）フラグ
メント〕はマニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら〔分子ク
ローニング（Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｔｎｇ
　）：研究所マニュアル、コールド・スプリング・ハー
バ−・ラボラトリ−（Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒ
ｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　）、１９８２）により記
載されたように使用した。大腸菌（Ｂ、　ｃｏｌｔ　）
培養はポリ−パル（Ｂｏｌｉｖａｒ　）ら〔ジーン（Ｇ
ｅｎｅ）　　２　：　９５〜１１３．１９７７）の方法
により形質転換した。

ニス、セレビシェ（Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　）培
養はマカイ　（Ｍａｃｋａｙ　）　　（メト、イン、エ
ンチモロジイ（Ｍｅｔｈ、　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇ
ｙ　）　、１０１　：　３２５．１９８３）により変形
されたベグス（Ｂｅｇｇｓ　）〔ネーチ−ｗ・　（Ｎａ
ｔｕｒｅ）２７５　：　１０４〜１０８．１９７８）の
方法により形質転換した。

実施例１ 全長プラスミノーゲン活性化因子ｃＤＮＡクロンの構築 Ａ、プラスミドｐＵＣＨの構築 マイケルソン（Ｍｉｃｈｅｌｓｏｎ　）ら〔プロシーデ
ィング・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエ
ンス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、
　）　　Ｕ　Ｓ　Ａ１工：４７２〜４７６．１９８３）
の方法に従い、Ｃ−ティリングしたｃＤＮＡをＧ−ティ
リングしたｐＢＲ３２２にアニーリングすることにより
バラス（Ｂｏ＆４ｅｓ）黒色腫細胞系列（リーケンら（
Ｒｉｊｋｅｎａｎｄ　Ｃｏ１１ｅｎ　）　、ジャーナル
・オプ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、　Ｂｉｏ
ｌ、　Ｃｈｅｆｆｉ、　）　　２５６　ニア０３５〜７
０４１．１９８１）からｃＤＮＡライブラリ　（１ｉｂ
ｒａｒｙ　）を作った。ライブラリをオリゴヌクレオチ
ドプローブでスクリーニングし、その配列を、セリンプ
ロテアーゼに対し普通のアミノ酸配列を基にし、および
ベニ力（Ｐｅｎｎ１ｃａ　）ら（同書）により測定され
たようにｔＰＡ遺伝子のヌクレオチド配列を基にして決
定した。プローブはホスフィツト−トリエステル法〔ボ
ウケージら（Ｂｅａｕｃａｇｅ　ａｎｄ　Ｃａｒｕｔｈ
ｅｒｓ　）　、テトラヘドロン・レターズ（Ｔｅｔｒａ
ｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　）　２２　：１８５９
〜１８６２．１９８１；およびマトイシーら（Ｍａｔｔ
ｅｕｃｃｉ　ａｎｄ　Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ　）、ジャー
ナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサエティ　（Ｊ
。

Ａｍ、　ＣｈｅＩＩｌ、　Ｓｏｃ、　）　１０３　：　
３１８３．１９８１）によりマトイシーら（Ｍａｔｔｅ
ｕｃｃｉ　ａｎｄ　Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ　）（テトラヘ
ドロン・レターズ（ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔｅ
ｒｓ）　２１　：　７１９〜７２２．１９８０）により
記載された固体支持体を用いて合成した。

ｔＰＡ配列によるこのライブラリのスクリーニングに４
オリゴヌクレオチドプローブ：５′プローブ、”　ＴＡ
ＧＴＧＡＡＣＣＡＴＴＣＴ”　（センスストランド、ヌ
クレオチド１９１〜２０４）；中間プローブコ’　ＣＴ
ＡＧＧＡＣＴＡＴＣＣＧＴ”　　（７７チセ７　ス、ヌ
クレオチド８１０〜８２３）；３’プローブ、”ＣＴＡ
ＣＴＧＴＧＡＡＴＧＣＴ”　　（アンチセンス、ヌクレ
オチド１２°８２〜１２９５）；およびセリンプロテア
゛−ゼ普通プローブ、”　ＴＡＣＧＡＣＡＣＡＣＧＡＣ
Ｃ”（アンチセンス、ヌクレオチド１５５２〜１５６５
）を用いた。得られた３つの部分ｔＰＡクロンはクロン
＃２７、ヌクレオチド１４５〜３０３からのｔＰＡ配列
を含む；クロン＃２０、ヌクレオチド７４９〜１０７９
；およびクロン＃４８、ヌクレオチド１１５６〜１６８
５であった。これらのクロンからの切り込み１訳（ｎ１
ｃｋ　ｔｒａｎｓｌａｔｅｄ　）ｔＰＡＤＮＡ配列を下
記のようにｃＤＮＡライブラリのスクリーニングに用い
、−緒に成熟ｔＰＡの完全コーディング配列を作る２つ
のクロンを得た。

第１図について説明すると、位置１８８のＢｇｌ■部位
から８０２のＥｃｏＲＩ部位に伸びるｔＰＡの５′配列
を含むｐＵＣＦがダブル・スペシフィック・ブライマー
伸長（ｄｏｕｂｌｅ　５ｐｅｃｉＨｃ　ｐｒｉｍｅｒｅ
ｘｔｅｎｓｉｏｎ　）　　（ローン（Ｌａｗｎ　）　　
ら、ニュークリーク・アシド・リサーチ（Ｎｕｃ、　Ａ
ｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　）　９　：６１０３〜６１１４．
１９８１）、エンドヌクレアーゼ消化（ｄｉｇｅｓｔｉ
ｏｎ）およびＢａｍＨＩ。

ＥｃｏＲＩ消化ｐＵｃ１３（ビエイラら（Ｖｉｅｉｒａ
ａｎｄ　Ｍｅｓｓｉｎｇ　）　、ジーン（Ｇｅｎｅ　）
　　１９　：　２５９〜２６８．１９８２およびメシン
グ（Ｍｅｓｓｉｎｇ　）、メト、イン、エンチモロジ−
（Ｍｅｔｈ、　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）１０１：
２０〜７７．１９８３３に対する連結（ｌｉｇａｔｉｏ
ｎ　）により構築したライブラリから得られた。第１ス
トランドフ゛ライ−は”　ＴＡＧＴＧＡＡＣＣＡＴＴＣ
Ａ”であり、それは８１０〜８２３の配列に対し丁度８
０２における［！ｃｏＲ１部位の３′側に対し相補的で
ある。第２ストランドは１５５〜１６８の配列であるオ
リゴヌクレオチド”　ＣＴＡＧＧＡＣＴＡＴＣＣＧＴ３
’を用いて丁度１８８におけるＢｇｌ　ＩＩ部位の５′
側に対しプライムした。〔ベニ力（Ｐｅｎｎ１ｃａ　）
ら、同書参照〕。ライブラリーはクロン＃２７の切り込
み翻訳挿入（ｎ１ｃｋ　ｔｒａｎｓｌａｔｅｄ　１ｎｓ
ｅｒｔ　）を用いてスクリーニングした。第１図に示さ
れるように、プラスミドｐＵｃＦを旧ｎｄｌ［［および
Ｅｃｏ　Ｒ１で切断し、プラスミノーゲン活性化因子含
有フラグメントを精製した。

第１図に゛ついて説明すると、２本鎖ＤＮＡ合成後ＤＮ
ＡをＢｇｌ　　■およびＥｃｏ　ＲＩで消化し、ＢａＩ
ＩＩＨｌおよびＥｃｏ　ＲＩで消化したｐＵｃ１３中へ
クローニングしたことを除きマイケルソン（Ｍｉｃｈｅ
ｌｓｏ口）らにより記載されたように構築したライブラ
リからｔＰＡの３　′配列を含むｐｕｃ’ｒを得た。こ
のクロンはクロン＃２０および＃４８からの切り込み翻
訳挿入でライブラリをスクリーニングすることにより得
られた。ｐＵＣＴの部分Ｅｃｏ　ＲＩ消化を用いてプラ
スミドをコーディング配列の上流Ｅｃｏ　Ｒ１部位で切
断した。次にＸｂａ　　Ｉで消化するとＥｃｏ　ＲＩ　
−Ｘｂａ　　Ｉ　３　’プラスミノーゲン活性化因子フ
ラグメントが生じ、それを精製した。

２つのフラグメント、５　’　ｔ　Ｐ　Ａ／ＨｉｎｄＩ
［Ｉ　−ＥｃｏＲＩおよび３　’　ｔ　ＰＡ／　Ｅｃｏ
ＲＩ−χｂａｒ、を第１図に示されるように、旧ｎｄｎ
Ｉ　−Ｘｂａ　Ｉ消化したｐＵｃ１３中へ連結するとプ
ラスミドｐ　ｕｃｗが生じた。

ｐＵｃＷからｔＰＡの３′非コーデイング域を除くため
にそれを、１８８におけるＢａａ　ＨＩ　／Ｂｇｌ　Ｉ
Ｉ部位を認識するＸｈｏ　ＩＩで消化した。このｔＰＡ
ＸｈｏＩＩフラグメントをｐＵｃ１３のＢａｍ　８１部
位中へクローニングした。ｐＵｃ１３のＸｂａ　Ｔ部位
に近いｔＰＡ３’端の配向で分離を選んだ（第２図）。

この構築体をｐＵＣＨと称した。

Ｂ、ｃＤＮＡのシーケンシング（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ
　）所望の配列がクローニングされたことを確認するた
めにｃＤＮＡをシーケンシングした。用いたシーケンシ
ングは表１に略示される。シーケンシングプライマー〔
ベテスダ・リサーチ・ラボラトリーズ（Ｂｏｅｔｈｅｓ
ｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　
）からの商業Ｍ１３ユニバーサル・シーケンシング・プ
ライマーを除く）はホスフィト−トリエステル法〔ボウ
ケージら（Ｂｅａｕｃａｇｅ　ａｎｄ　Ｃａｒｕｔｈｅ
ｒｓ　）　Ｓテトラへドロン・レターズ（Ｔｅｔｒａｈ
ｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ）１又：１８５９〜１８６
２．１９８１；およびマトイシーら（Ｍａｔｔｅｕｃｃ
ｉ　ａｎｄ　Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ　）％ジャーナル・オ
ブ・アメリカン・ケミカル・ソサエティ　　（Ｊ、　　
　Ａｓｈ、　　　Ｃｈｅｗ、　　　Ｓｏｃ、　　　）　
　ｌ　　０　３　　：　　３　１　８　３　．１９８１
）により手動でポリマー支持体〔マトイシーら（Ｍａｔ
ｔｅｕｃｃｉ　ａｎｄ　Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ　）　、テ
トラヘドロン・レターズ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌ
ｅｔｔｅｒｓ　）　２１　ニア１９〜７２２．１９８０
）を用い、またはアプライド・バイオシステムズ（八ｐ
ｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　）モデル３８０−
Ａ　　ＤＮＡシンセサイザーで合成した。ｐＵＣＷから
のＸｈｏ　Ｕ　−Ｘｈｏ　ＩＩ　ｔ　ＰＡフラグメント
をＭ１３ｍｐＨ（メシング（Ｍｅｓｓｉｎｇ　）、メト
、イン・エンチモロジイ（Ｍｅｔｈ、　ｉｎ　Ｅｎｚｙ
ｍｏｌｏｇｙ）１０１；２０〜７７．１９８３）のＢａ
ｎ＋ＨＩ部位に再配向で挿入した。この挿入のフラグメ
ントを表１に示したようにＭ１３ベクター中へサブクロ
ーニングした。シーケンシングはメシング（Ｍｅｓｓｉ
ｎｇ　）（同書）により記載されたように行なった。得
られた配列は第３図に示される。

結果はクローニングした配列が発表〔ベニカ（Ｐｅｎｎ
１ｃａ　）ら、同書〕された配列と４点（表２）で異な
ることを示した。差異ばｃＤＮＡクローニングに対する
原料として用いた細胞系統中の突然変異を含むいくつか
の方法、またはｃＤＮＡの生成における逆転写によりな
された複製過誤により生じたであろう。

実施例２ ヒトゲノムｔＰＡｃＤＮＡのクローニングおよびシーケ
ンシング ヒトｔＰＡ遺伝子の正しい配列を決定するために正常肝
臓組織から誘導したＤＮＡライブラリからゲノムｔＰＡ
クロンを得た。ライブラリーは胎児ヒト肝ｌ１ｌＤＮＡ
フラグメントをバクテリオファージラムダ〔ローン（Ｌ
ａｗｎ　）ら、セル（Ｃｅ１ｌ　）ユ５−：１１５７〜
１１７４．１９７８）中へ挿入することにより構築した
。

そのライブラリを大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｔ　）株ＬＥ３
９２　（ＡＴＣＣ３３５７２）（マニアチス（Ｍａｎｉ
ａｔｉｓ　Ｌ　、同書ｐ、５０４）の感染に用いた。０
．２％マルトースを１０　ｍ　Ｍ　−ＭｇＳＯ４および
５０μｇ　／　ｍ　１チミジンを含有するし一ブイヨン
中の一夜培養細胞を１０　ｒｒｉＭ　　Ｍｇ５Ｏａ中で
２倍に濃縮した。濃縮液７５０μｌをファージライブラ
リ　（２００，０００フアージ／μｌ）の１μβととも
に２２ｃｍＸ２２ｃｍプレートを用いたＮＺＹアミンソ
フト寒°天上層中のし一ブイヨン寒天上で平板培養した
。３７℃で一夜培養後にプレート当り約１ＯＳコロニー
が得られた。コロニーをニトロセルロースに移し、リフ
ト（１ｉｆｔ　）を０．１Ｍ−ＮａＯＨ、１，５Ｍ　−
ＮａＣ１で１０分間処理し、次いで０．２　Ｍ　トリス
ｐＨ７，５，１，５Ｍ−ＮａＣ１中で中和し、風乾し、
８０℃で２時間焼いた。プレバイブリド形成およびバイ
ブリド形成（全長切り込み翻訳ＬＰＡｃＤＮＡプローブ
に対する）をＳＥＴ緩衝液（ＳＥＴは毎リフドル１７５
．２　ｇ　ＮａＣｊ！、７２．７ｇ）リス、１４．８ｇ
ＥＤＴＡを含みＨＣｊ２でｐＨ８，０）中６５℃で行な
った。フィルターを２ｘＳＳＣ，０，１％ＳＤＳ中で洗
浄し、乾燥し、オートラジオグラフにかけた。１３個の
予備ボジテイブが同定された。２回のプラーク精製（前
記のようにスクリーニングした）は１３の群から９ポジ
テイブが同定された。

９ポジテイブゲノムクロンを大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｔ　
）ＬＥ３９２上で平板培養して一夜成長させ、リゼイト
を調製した。ファージをＣｓＣｌ！勾配上で精製し、オ
リゴヌクレオチドプローブ ＺＣ９４（５’　ＴＡＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＡＴＧＣＡ
ＡＴＧＡＡＧＡＧＡＧＧＧＣ３’　）、ＺＣ９６（５’
　ＣＴＧＣＴＧＴＧＴＧＧＡＧＣＡＧＴＣＴＴＣＧＴＴ
ＴＣＧＣＣＣ３’　）、ＺＣ９８（５’　ＴＧＣＣＣＧ
ＡＴＴＣＡＧＡＡＧＡＧＧＡＧＣＣＡＧＡＴＣＴＴＣ３
’　）、ＺＣ８８、ＺＣ８９、ＺＣ９１およびＺＣ４６
に対するバイブリド形成により地図を作った（第３図参
照）。プローブＺＣ９４、ＺＣ９６およびＺＣ９８は発
表系列〔ベニ力（Ｐｅｎｎ１ｃａ　）ら、同書〕を基に
したシグナルペプチドコーディング域にバイブリド形成
し、残りのプローブは成熟ペプチドコーディング域にバ
イブリド形成する。９ポジテイブアイソレートはともに
全ｔＰＡコーディング域に広がる３つの明らかな種類に
属すると認められた。挿入大きさはＥｃｏ　ＲＩで消化
することにより決定された。

それぞれの種類に対し、最大インサートを有するクロン
をＥｃｏ　ＲＩ、Ｂｇｌ　　ＵおよびＥｃｏ　ＲＩ　＋
Ｂｇｌ　　ｎで消化し、制限フラグメントを、代表的な
オリゴヌクレオチドプローブを用いてサチン法（５ｏｕ
ｔｈｅｒｎ　ｂｌｏｔｓ　）　　（サザン（５ｏｕｔｈ
ｅｒｎ　）、ジャーナノσ・オブ・モレキュラル・バイ
オロジー（Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　）、９８：５
０３〜５１７．１９７５）上にプローブした。クロン隘
９は熟成ｔＰＡに対する全コーディング配列を含む（し
かし、シグナルペプチドコーディング域ではない）と認
められた。クロン隘９からのインサートのＥｃｏ　ＲＩ
およびＢｇｌ　　ＩＩ　−Ｅｃｏ　ＲＩフラグメントを
シーケンシングおよび一層の分析のためにＭ１３および
ｐＵｃ１３中へ挿入した。フラグメントはジデオキシ法
〔サンガー（Ｓａｎｇｅｒ　）　ら、ジャーナル・オブ
・モレキュラル・バイオロジー（Ｊ。

ｏｆ　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　）　、１４３　：　１６
１．１９８３およびサンガー（Ｓａｎｇｅｒ　）ら、プ
ロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミイ・オプ
・サイエンス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａ目、　Ａｃａｄ、　Ｓ
ｃｉ、　）　　ＵＳＡユ」ノ５４６３．１９７７）によ
り配列し、位置４０４．６０５．１０６９および１７２
５における正しいヌクレオチドを決定した。プライマー
ＺＣ８９を用いた７ｋｂ　ＥｃｏＲＩフラグメントのシ
ーケンシングはゲノムクロン中の位置６０５におけるヌ
クレオチドがグアニンであることを示し、発表された配
列に一致した。プライマーＺＣ１４８を用いた２、　８
　ｋｂ　ＥｃｏＲＩフラグメントのシーケンシングは位
置１０６９における正しいヌクレオチドがチミンである
ことを示し、ベニ力（Ｐｅｎｎ１ｃａ　）ら（同書）の
ｃ　ＤＮＡ配列に一致した。ワレン（Ｗａｌｌｅｎ　）
ら（同書）により発表された部分アミノ酸配列はさらに
この位置におけるヌクレオチドがチミンであることを示
すデータを与える。位置１７２５においてｃＤＮＡ配列
はベニ力（Ｐｅｎｎ１ｃａ　）ら（同書）により見出さ
れたアデニンとは対照的にシトシンを示した。この変化
はタンパク質生成物のアミノ酸配列に影響を与えない。

位置４０４における正しいヌクレオチドは発表されたデ
ータに基きチミンであると思われる。

ｃＤＮＡ配列は試験内部位特異的突然変異誘発〔シラー
（Ｚｏｌｌｅｒ　）　ら、分子クローニング過程におけ
る進歩技術マニュアル（Ｍａｎｕａｌ　ｆｏｒ　Ａｄ−
ｖａｎｃｅｄ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅ
ｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｃｏｕｒｓｅ）、コール
ド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−（Ｃｏ１ｄ　
Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　
）　、１９８３　〕によりゲノム配列に相当するように
変えることができる。単独でまたは種々の組合せで改変
がなされる配列を発生させることができる。改変された
配列は次いで前記のように表現ベクター中へ挿入するこ
とができる。

実施例３ プラスミドｐＴＥ２６の製造 酵母中のｔＰＡの表現に用いるＴＰＩプロモーターがプ
ラスミドｐＴＥ２６から得られた。

プラスミドＹＲｐ７’（ステインチコム（Ｓｔｉｎｃｈ
ｃｏｍｂ、、　Ｄ、　Ｔ、　）　　ら、ネーチャ（Ｎａ
ｔｕｒｅ　）２８２：３９〜４３．１９７９）はｐＢＲ
３２２のＥｃｏ　ＲＩ部位に挿入された酵母−Ｔ　Ｒ−
Ｆ’　１およびＡＲ３Ｉを含み、２つのＥｃｏ　ＲＩ部
位を有する。

その１つはＥｃｏ　ＲＩエンドヌクレアーゼによる部分
消化により平均で分子当り２部位の１つだけを消化して
削除した。線状分子の生じた不対端をＤＮＡポリメラー
ゼＩ　（フレノウフラグメント）により触媒された反応
により満たし、生じたプラント端をＤＮＡリガーゼ触媒
反応において再連結してクローズドサーキュラ−ＤＮＡ
分子を回復させた。生じたＡＲ３Ｉ域に隣接するＥｃｏ
　Ｒ１部位を保有するプラスミドはｍ工と称される。

酵母ＴＰＩプロモーターはプラスミドｐ　ＴＰＩＣＩＯ
〔アルバーら（＾１ｂｅｒ　ａｎｄ　Ｋａｗａｓａｋｉ
　）　、同書〕から得られた。第１３図について説明す
ると、このプラスミドを部分Ｂｇｌ　ＩＩ消化し、約位
置３０００および１０６００におけるＢｇｌ　ｎ部位間
の領域を精製して再連結させた。ｐＴＢＲとして知られ
るこの構築体をＫｐｎ　　Ｉで切断し、Ｂａ１３１で消
化し、末端をＤＮＡポリメラーゼＩ　（フレノウフラグ
メント）を用いてプラントにした。合成旧ｎｄｎ［リン
カ−ＣＧＣＡＡＧＣＴＴＧＣ）をＴＰＩ構造遺伝子の位
置＋６に付加した。分子を再連結するとｐＴＨ３０が生
成した。次いでこの構築体を旧ｎｄ■で切断し、前記の
ようにＢａ１３１およびＤＮＡポリメラーゼＩ　（フレ
ノウフラグメント）で処理し、合成Ｅｃｏ　ＲＩリンカ
−（ＧＧＡＡＴＴＣＣ）を位置−１０に付加した。ＴＰ
Ｔプロモーター（９００ｂｐ）をＢｇｌ　ｎを用いて除
き、ＥｃｏＲＩ／Ｂｇｌ　ＩＩ消化プラスミドｐＦＲＴ
中へ挿入した。生じたプラスミドはｐＴＥ２６である。

実施例４ プラスミドｐ２１３およびｐ２７９の製造プラスミドｐ
２７９はＴＰＩプロモーター、ＭＦαｌリーダー配列お
よびＴＰＩターミネータ−源であった。

第１４図について説明すると、ヒトブレープロインシュ
リンｃ　ＤＮＡ　（１）ｒｅＢ　ＣＡ）クロン、ｐ２７
は、Ｐｓｔ　Ｉ消化ｐＢＲ３２７をＧ−テーリングし、
ヒト膵臓からの全ＲＮＡを逆転写することにより作った
Ｃ−ティルトＤＮＡを挿入することにより生成される。

プラスミドｐＢＲ３２７はソベロン（５ｏｂｅｒｏｎ　
）ら、ジーン（Ｇｅｎｅ）９：２８７〜３０５　（１９
８０）により記載され、ヒトブレープロインシュリンの
配列はベル（Ｂｅ１ｌ　）ら、ネーチャ（Ｎａｔｕｒｅ
）２３２　：　５２５〜５２７（１９７９）により報告
される。完全翻訳配列をＮｃｏ　　Ｉ　−Ｈｇａ　　Ｉ
フラグメントとして切断した。突出しく　ｐｒｏｔｒｕ
ｄｔｎｇ　）端をＤＮＡポリメラーゼＩ（フレノウフラ
グメント）で満たし、合成Ｅｃｏ　Ｒ１リンカ−（ＧＧ
ＡＡＴＴＣＣ）およびＸｂａ　　Ｉリンカ−（ＣＴＣＴ
ＡＧＡＧ）を同時に付着させた。

フラグメントは、Ｅｃｏ　ＲＩおよびＸｂａ　　Ｉで切
断したベクターｐＵｃ１３（ビエイラら（Ｖｉｅｉｒａ
ａｎｄ　Ｍｅｓｓｉｎｇ　）　、ジーン（Ｇｅｎｅ　）
　　１９　：　２５９〜２６８．１９８２、（その全部
が参照によりこ＼に加入される）によりｐＵＣ８および
ｐＵＣ９について記載されたように構築したがしかし第
１５図に示すポリリンカー配列を含む〕中へサブクロー
ニングした。５′端におけるＥｃｏ　ＲＩリンカ−の付
加が開始コドンにおけるＮｃｏ　　１部位（ＣＣＡＴＧ
Ｇ）を修復するので、プラスミドは３４０ｂｐインサー
トにあるεｃｏＲＩ、Ｎｃｏ　　夏およびＸｂａ　　Ｉ
部位の存在に対してスクリーニングした。

これらの性質を有するプラスミドｐ４７が同定された。

第１６図について説明すると、プラント５′端を有する
ＢＣＡフラグメントをプラスミドｐ４７のプライマ°−
修復合成〔ローン（Ｌａｗｎ　）ら、ニュークリーク・
アシド・リサーチ（Ｎｕｃ、　Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、）９
：６１０３〜６１１４．１９８１）により発生させた。

次のＸｂａ　　Ｉによる消化は２７０ｂｐフラグメント
を生じ、それをｐＵｃ１２（ビエイラら（Ｖｉｅｉｒａ
　ａｎｄ　Ｍｅｓｓｉｎｇ　）　、同書、によりｐＵＣ
８およびｐＵＣ９について記載されたように構築、しか
し第１５図に示したポリリンカー配列を含む）中へ挿入
した。ベクターはＨｔｎｄｕｌで切断し、端をＤＮＡポ
リメラーゼ■　（フレノウフラグメント）でプラントに
し、Ｘｂａ　　Ｉで切断し、ゲル精製により調製した。

プラント端およびＸｂａ　Ｉ粘着性末端を含む生じたベ
クターフラグメントをｐ４７から誘導した前記のフラグ
メントに連結した。

プラスミドはまず旧ｎｄｎ［部位の回復のために、次に
Ｍ１３シーケンシングプライマーを用いる連結を横切る
シーケンシングによりスクリーニングした。プラスミド
ｐ２５４は正しい配列を有した。

α因子（ＭＦα１）に対する遺伝子コーディングはクー
リャン（Ｋｕｒｊａｎ　）ら、セル（Ｃｅ１ｌ　）■、
９３３〜９４３　　（１９Ｂ２）　、により前にクロー
ニングされ特性表示され、後に確認された〔スイング（
Ｓｉｎｇｈ、＾）ら、ニュークリーク・アシド・リサー
チ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　
）、土工：４０４９〜４０６３．１９８３）。ＹＥｐ１
３〔ナスミスら（ＮａｔｈＩｌｙｔｈ　ａｎｄ　Ｔａｔ
ｃｈｅｌｌ　）、セル（Ｃｅｌｌ）１９ニア５３〜７６
４．１９８０）のＲａｍ　Ｈ１部位中へクローニングさ
れた部分５ａｕ３Ａフラグメントの酵母ゲノムライブラ
リから匣［α２突然変異株中にα因子を表現したプラス
ミドが分離された。クロンは初めに特性表示されたＭＦ
αｌ遺伝子と重複するインサートを含有した。第１７図
について説明するとこのプラスミド（ｐＺＡ２）をＵｃ
ｏ　ＲＴで切断し、肚α１遺伝子を含む１７００ｂｐフ
ラグメントを分離した。このフラグメントをさらに旧ｎ
ｆｌエンドヌクレアーゼで消化し、ＤＮＡポリメラーゼ
！　（フレノウフラグメント）でプラントにした。Ｅｃ
ｏＲＩリンカ−（ＧＧＡＡＴＴＣＣ）を端に連結した。

Ｅｃｏ　Ｒ１およびＳａｌ“■で再切断した後、ＭＦα
１遺伝子の転写域の大部分またはすべてを含む精製フラ
グメントをプラスミドｐＴＥ２６中のＴＰＩプロモータ
ーに連結した。生じたプラスミドル２０１中で、肛α１
遺伝子はその当然の調節域（メーティング型位置により
制御される）を失い、ＴＰＩプロモーターによる構築表
現下に置かれる。

酵母ＴＰＩターミネーターフラグメントはプラスミドｐ
Ｆｃ；１　　（アルバーら（Ａｌｂｅｒ　ａｎｄ　Ｋａ
ｗａｓａｋｉ）同書〕から得られた。それはＴＰＩ遺伝
子の終りから２番目のアミノ酸コードンから約７００　
ｈｐＪｌｌ下Ｅｃｏ　ＲＩ部位までの域を含む。第１８
図について説明するとＢａａ＋　Ｈ１部位はｐＦＧｌの
特有Ｅｃ。

Ｒ１部位を、まずＥｃｏ　ＲＩでプラスミドを切断し、
次いでＤＮＡポリメラーゼ■　（フレノウフラグメント
）で端をプラントにし、合成りａＩＩＩＨＩリンカ−（
ＣＧＧＡＴＣＣＡ）を加え、再連結することにより置換
してプラスミドｐ１３６を生成させた。

ＴＰ■ターミネータ−をｐ１３６からＸｂａｌ−Ｂａｍ
　ＨＩフラグメントとして取出した。このフラグメント
をＸｂａ　　［−Ｂａａ＋　ＨＩ消化ＹＥｐ１３（ブロ
ーチ（Ｂｒｏａｃｈ　）ら、ジーン（Ｇｅｎｅ　）　、
８　：１２１〜１３３．１９７９）中へ連結させるとプ
ラスミドｐ２１３が生じた。

第１９図について説明すると、旧ｎｄｌＩＩ　−Ｘｂａ
　　１フラグメントをｐ２５４から切断し、ＴＰＩプロ
モーター−プローα因子融合を含むｐ２０１のＢｇｌ　
ＩＩ−旧ｎｄＩ［［フラグメントに連結させた。これを
Ｘｂａ　　ＩおよびＢｇｌ　ＩＩ部位で切断したプラス
ミドル２１３中へ連結した。生じたプラスミドがｐ２７
９である。

実施例５ ｐＤＲ４０３の構築 プラスミドｐＤＲ４０３（第４図）はワレン（Ｗａｌｌ
ｅｎ　）ら（同書）により記載された長い変種の５′末
端配列を含むｔＰＡ（前記塩基置換した）の完全コーデ
ィング配列をＴＰＩプロモーターおよびターミネータ−
並びにニス、セレビシェ（Ｓ。

ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）肚α１遺伝子のプレープロ配列
とともに含む。このプラスミドはこの表現単位を基にし
た多ぐの酵母表現ベクターの構築により有用な中間体と
して役立つ。ｐＤＲ４０３は酵母中で機能する複製の原
型を欠くが、しかし細菌プラスミドｐＢＲ３２２からの
複製の原型を含むので、それは大腸菌（Ｈ，ｃｏｌｔ　
）の適当な株中に維持される。それはｐＵＣＨからのｔ
ＰＡコーディング配列をオリゴヌクレオチドリンカーと
ともにプラスミドｐＭ２１０の部分に連結させることに
より構築された。

プラスミドｐＭ２１０は酵母ＴＰＩプロモーターおよび
ターミネータ−１ＭＦα１プレープロ配列、およびヒト
プロインシュリン（ＢＣＡ）配列〔ベル（Ｂｅ１ｌ　）
ら、ネーチ＋　（Ｎａｔｕｒｅ　）、２３２：５２５〜
５２７．１９７９）を含む。

それは、以下および第５図に記載するように、実施例３
および４に記載したベクターｐＴＥ２６、ｐ２７９およ
びｐ２１３を用いて構築した。

第５図について説明すると、ｐＴＥ２６はＢｇｌ■およ
びＨｃｏ　ＲＩで消化し９００ｂｐＴＰＩプロモーター
フラグメントを精製した。プラスミドｐ２７９はＥｃｏ
　ＲＩおよびＸｂａ　　Ｉで消化し肛α１およびＢＣＡ
配列を含むａｏｏｂｐフラグメントを同様に精製した。

プラスミドｐ２１３は旧ｎｄｎ［で切断し粘着性末端を
ＤＮＡポリメラーゼＩ　（フレノウフラグメント）を用
いてプラントにし線状分子をＴ４ＤＮＡリガーゼを用い
て再環化してプラスミドｐ２７０を生成させた。ＴＰＩ
ターミネータ−１２μおよびアンピシリン耐性（ａｍｐ
γ）配列を含む約５ｋｂのフラグメントをｐ２７０のＸ
ｂａ　Ｉ　−Ｂｇｌ　ｎダイジェストから精製した。３
フラグメント、ＴＰＩプロモーター、ＭＦα１／ＢＣＡ
およびＴＰ　Ｉ／２ｕ／　ａｒｓ９ｒ、を、Ｔ４ＤＮＡ
リガーゼを用いて連結するとプラスミドｐＭ２１０が生
成された。

第４図について説明するとｐＤＲ４０３を構築するため
にプラスミドｐＵＣＨをＸｂａ　　Ｉで完全に消化し、
Ｘｈｏ　■で部分消化した。Ｘｈｏ　Ｉｆ　−Ｘｂａ　
　１ｔＰＡフラグメントをゲル精製し、オリゴヌクレオ
チドリンカーにより、旧ｎｄｎｌおよびＸｂａ　　Ｉで
切断しＢＣＡ配列を除去した９Ｍ２１０に連結した。

リンカ−。

Ｓ’　ＡＧＣＴＧＧＣＧＣＣＡ” ”　ＣＣＧＣＧＧＴＣＴＡＧＳ′ は９Ｍ２１０フラグメントの旧ｎｄｌ［ｒ粘着性末端に
相補的である５′末端、およびｔＰＡフラグメントのＸ
ｈｏ　ｎ粘着性末端に相補的である３′末端を与える。

それはアミノ酸Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｒｇに対するコドン
の供給によりｔＰＡ〔ワレン（Ｗａｌｌｅｎ　）ら、同
書〕の長変種に対するコーディング配列を完成する。こ
の配列のプレープロＭＦα１配列に対する融合はフレー
ム中のｔＰＡコーディング配列をα因子のＬｙｓ−Ａｒ
ｇ　−Ｇｌｕ　−Ａｌａ　−Ｇｌｕ−Ａｌａポテンシャ
ルプロセシング部位に対するコーディング配列に連結す
る。Ｌｙｓ　−Ａｒｇに続くプレープロα因子−ｔＰＡ
前駆物質タンパク質の開裂は付加４アミノ酸をアミノ末
端に存するｔＰＡ前駆物質を生ずる。プロセシングはま
た２つのアラニン残基の１つまたは両方の後に生じ、ア
ミノ末端にＱ、１また２つのＧｌｕ　−Ａｌａ対を有す
るｔＰＡポリペプチドを生ずることができる。

後の配列分析は上記リンカ−配列が多重リンク複製中に
存在したことを示した。外来リンカ−配列は次に下記の
ように酵母表現ベクターの構築中に除去される。

実施例６ ｐＤＲ５０５の構成 ｐＤＲ４０３からプロモーター、リーダー配列、コーデ
ィング配列およびターミネータ−の表現単位を酵母ベク
ターＹＥｐ１３（ブローチ（Ｂｒｏａｃｈ　）ら、ジー
ン（Ｇｅｎｅ）８：１２１’〜１３３．１９７９）に転
移することにより予備的酵母表現ベクターを構築した。

表現単位はｐＤＲ４０３から完全Ｂａｍ　ＨＴおよび部
分Ｂｇｌ　ＩＩ消化によりとり出した。そのフラグメン
トをゲル精製し、ＹＥｐ　１３のＢａ１ｌＨ１部位中へ
クローニングした。生じたプラスミドをインサートの配
向についてスクリーニングした。第６図に示す配向を有
するプラスミドをｐＤＲ５０５と称した。

ニス、セレビシェ（Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　）株
Ｅ８−１１　Ｃ（Ｍ’ＡＴｃＸＬｅｕ　２−３．１１２
　　匹り土ニュ；交雑Ｅ２−７Ｂ（ＡＴＣＣ２０６８９
）ＸＧＫｌｏｏ　（ＡＴＣＣ２０６６９）のハブロイド
セグメント）をｐＤＲ５０５で形質転換し、ロイシンを
欠く合成培地中で３０℃で成長させた。

被形質転換体の培養から９．５時間（初期ログ）で始め
４８時間までときどき試料をとった。（細胞は１７〜１
９時間で初期定常期に入った。）細胞ペレットを抽出し
、培養上澄みをウェスタン法（Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏ
ｔ　）分析〔タウビン（Ｔｏｗｂｉｎ　）ら、プロセシ
ング・オブ・ナショナル・アカデミイ・オブ・サイエン
ス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、）
ＵＳＡユ、４３５０．１９７９およびバーネット（Ｂｕ
ｒｎｅｔｔｅ　）　、アナリティカル・バイオケミスト
リー（Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、）、１１２：１９
５〜２０３．１９８１）のためアミコン（Ａｍ１ｃｏｎ
　）限外濾過により１００倍濃縮した。ｔＰＡポリペプ
チドは細胞ベレット抽出物または初期上澄み試料中に検
出できなかったが、しかし、２４〜４８時間（２４時間
より多少長い）の上澄み試料中でウェスタン法分析によ
り検出できた。約６３，０００ダルトンにある若干のバ
ンドはポリペプチドのプロセシングまたはグリコシル化
に差異を示すことができた。ｐＤＲ５０５およびＹＥｐ
１３対照培養の２４時間試料からの濃縮上澄みはまたＩ
！ＬＩＳＡ法（実施例１３参照）により検定した。天然
黒色腫ｔＰＡ標準に比較してｐＤＲ５０５試料は非濃縮
上澄みｌ　ｍ　Ｉｌ当り少くともｌｎｇのｔＰＡを含有
した。天然ｔＰＡの検定が酵母上澄みの成分により抑制
されるのでｔＰＡの真の量に対する値は過小評価される
かもしれない。

ｐＤＲ４０３の構築に加えて外来リンカ−配列を除くた
め、ＴＰＩプロモーターの３′域、ＨＰα１配列および
ｔＰＡコーディング配列を含む表現単位をＳｐｈ　　Ｉ
　　Ｘｂａ　ＩフラグメントとしてｐＤＲ５０５から除
き、ｓｐｈ　　ＩおよびＸｂａ　　Ｉで開裂したｐＵｃ
１９　　（ノラングー（Ｎｏｒｒａｎｄｅｒ　）ら、ジ
ーン　（Ｇｅｎｅ）　　　２６　　：　　１０１　〜１
０６　　、　１　９　８　３）中へ挿入した。次いで過
剰のリンカ−をａｇｉ　ｎで切断し、Ｔ４ＤＮＡリガー
ゼでプラスミドを再環化した。正した構築体はｐＤＲ１
２０６として知られる。

実施例７ ｔＰＡの細胞内表現のためのプラスミドの構築ニス、セ
レビシェ（Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　）中のｔＰＡ
の細胞内表現を行なうためにプラスミドを構築した。こ
のプラスミドはｐＤＲＩＯ０５として知られ、ニス、セ
レビシェ（Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　）　Ｔ　Ｐ　
１プロモーターおよびターミネータ−１Ｍｅｔ　−Ｇｌ
ｙ−Ａｌａ　−Ａｒｇ　−５ｅｒ−ｔＰＡに対するコー
ディング配列およびベクターｙＥｐ　１３の一部を含む
。その構築は第７図および第８図に示される。

第７図について説明すると、ｐＤＲ１００５を構築する
ためｐＤＲ４０３をＢｇｌ　ＩｆおよびＸｂａ　　Ｉで
開裂し、ｔＰＡフラグメント（約１．６ｋｂ）を０．７
％アガロースゲル上で電気泳動により精製した。バンド
をゲルから切断し、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリスｐＨ７
，４，５ｍＭ　　ＥＤＴＡ）中で６〜８時間培養し、次
いでＤＮＡをエタノール２体積で沈殿させた。コーディ
ング配列の５′末端をオリゴヌクレオチドリンカー ”　ＣＡＴＧＧＧＣＣ，ＣＣＡ３′ ”　ＣＣＧＣＧＧＴＣＴＡＧ” により修復した。ｔＰＡフラグメントおよびリンカ−を
、Ｎｅｏ　ＩおよびＸｂａ　　Ｉで切断したベクターｐ
ＭＴ２０４に接合させた。〔ベクターｐＭＴ２０４は、
Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用い、プラスミドｐＡＤＨｐｏｌ
　　（ルッセルラら（Ｒｕ５ｓｓｅｌｌ　ａｎｄＨａｌ
ｌ　）、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミスト
リー（Ｊ、旧ｏ１．　Ｃｈｅｍ、）２５８　：　１４３
〜１４９．１９８３）からのＳｂｈ　　Ｔ　−Ｅｃｏ　
ＲＩシゾサツカロミセス・ボンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃ
ｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｐｏｍｂｅ　）　Ａ　Ｄ　Ｈプロ
モーターフラグメント；Ｙｆ！ｐ１３のＳｐｈ　　Ｉ、
Ｘｂａ　　に重消化の大フラグメント〔アンピシリン耐
性、ＬＥＵ２　　、および部分２μ配列を含む〕　；プ
ラスミドｐ１５３　（１９８３年１１月１日に提出した
名称「酵母、Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ−。

中のインシュリンの表現および分泌のための系（Ｓｙｓ
ｔｅｍ　ｆｏｒ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎｄ　５ｅ
ｃｒｅｔｉｏｎ　ｏｆｉｎｓｕｌｉｎ　ｉｎ　ｔｈｅＹ
ｅａｓｔ　Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　）Ｊの同時係
属の共通に譲渡した第５４７，７４８号に記載、参照に
よりこ−に加入される〕からのＥｃｏ　ＲＩ　−Ｘｂａ
　　Ｉプレープロインシュリンフラグメントを接合する
ことにより構築した。従って、ｐＭＴ２０４のＮｃｏ　
　Ｉ　−Ｘｂａ　　Ｉフラグメントはニス、ボンベ（Ｓ
、　ｐｏｍｂｅ　）　ＡＤＨプロモーターおよびＹＥｐ
１３配列を含む（第７図参照〕。生じた構築体はｐＤＲ
６０６として知られ第７図に示される。

ｔＰＡコーディング配列とニス、セレビシェ（Ｓ、　ｃ
ｅｒｅｖｉｓｉａｅ　）中に使用するのに通した表現ベ
クター中のＴＰＩプロモーターおよびターミネータ−と
を結合させるため、第８図について説明すると、プラス
ミドｐＤＲ６０６およびｐ１５３をＮｃｏ　　Ｉおよび
Ｘｂａ　　Ｔで消化し、ダイジェストを０．７％アガロ
ースゲル上で電気泳動した。ｐＤＲ６０６ダイジエスト
から１．６　ｋｂフラグメントを精製した。ｐ１５３ダ
イジェストからｙＥｐ　１３およびＴＰＩプロモーター
配列を含む大きいＮｃｏ　１−ＸｂａＩ’：；’ラグメ
ントおよびＴＰＩターミネータ−を含むＸｂａ　　Ｉ−
Ｘｂａ　　Ｉフラグメントを精製した。

３フラグメントを、次に７４ＤＮＡリガーゼを用いて結
合させた。生じたバイブリドＤＮＡを用いて大腸菌（Ｅ
、　ｃｏｌｉ）株ＬＭ１０３５（株ＨＢ１０１　（ＡＴ
ＣＣ３３６９４）の高形質転換誘導体）を形質転換した
。形質転換はマニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら〔分子
クローニング（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ）　
：研究所マニュアル、コールド・スプリング−ハーバ−
・ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ
　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、１９８２）に開示された塩
化カルシウム法によった。１２の形質転換コロニーを所
望プラスミド構築体の存在についてスクリーニングした
。タマミネーター中の上流Ｘｂａ　Ｉの３′側まで約７
００ｂｐまたは川下ＸｂａＩ部位の５′側まで約１００
０ｂｐに位置するＢａｍ　Ｈ１部位の存在を基にした。

Ｂａｍ　ＨＩを用いた二重制限酵素消化は、従ってＴＰ
Ｉターミネータ−フラグメントの存在および配向につい
てスクリーニングする。正しい構築体のＮｃｏ　　Ｉ　
＋Ｂａｍ　ＨＩダイジェストは　２３００ｂｌ）のフラ
グメントを生ずるが、正しくない構築体は２６００ｂｐ
のフラグメントを生ずる。Ｂａｍ’ＨＩ　＋Ｅｃｏ　Ｒ
Ｉダイジェストは配向が正しければ１３００ｂｐフラグ
メントを、正しくない配向に対しては１６００ｂｐフラ
グメントを生ずる。

コロニーはＹＥｐ　１３、ＴＰＩプロモーターおよびｔ
ＰＡ配列を含むことを示したがＴＰＩターミネータ−を
欠いた。そのようなコロニーの１つから得られたプラス
ミドをｐＤＲｌｏｏｌと称した。次いでプラスミドｐＤ
Ｒ１００１をＸｂａ　Ｉを用いて線状化した。ＴＰｒタ
ーミネータ−配列はｐ１５３からＸｂａＥを用いて開裂
し、フラグメントをゲル精製し、線状ｐＤＲ１００１に
接合させた。連結したＤＮＡを大腸菌（Ｅ、　ｃａｌｆ
）　＆　ＬＭ１０３５の形質転換に用いた。所望のＸｂ
ａｌフラグメントを有するプラスミドを含有するコロニ
ーが見出された。プラスミドを精製しｐＤＲ１００５ど
称した（第８図）。プラスミドｐＤＲ１００５をＴＰＩ
ターミネータ−の配向を立証するため上記のようにスク
リーニングした。ｐＤＲ１００５のＥｃｏ　Ｒ１＋Ｂａ
ｍ　ＨＩおよびＮｃｏ　Ｉ　＋Ｂａｍ　Ｈに重ダイジェ
ストは１３００ｂｐおよび２３００ｂｐフラグメントを
それぞれ生じ、それにより所望のプラスミドが構築され
たことが確認された。

ニス、セレビシェ（Ｓ　、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株
Ｅ２−７　Ｂ　（ＭＡＴａ　　ｌｅｕ　２　　ｈｉｓ　
４　　Ｐ狙」工；　ＡＴＣＣ２０６８９）をプラスミド
ｐＤＲ６０６、ｐＤＲ１００５およびＹＥｐ　１３ベク
ターで形質転換した。細胞を、ロイシンを欠く合成培地
中で成長させ、被形質転換体それぞれの培養成長中に試
料をとった。これらの資料を抽出しウェスタン法で分析
した。ｐＤＲ６０６抽出物中にアンチ−ｔＰＡ抗体によ
って認識されるタンパク賞は検出されなかった。ｐＤＲ
１００５抽出物からの試料は検出できる細胞質ｔＰＡポ
リペプチドを有し、それは後ログ期で最大（５Ｘ１０’
〜１×１０電セル／ｍｌ）であった。ｐＤＲ１００５か
らの抽出物においてｔＰＡ分子は明らかに開裂され、ウ
ェスタン法を基にしてＭｒ＝２７〜２Ｂ、０００ダルト
、ンの２゛つのバンドが検出された。

実施例８ ｐＤＲ１２’０７およびｐＤＲ１°２０８の構築プラス
ミドｐＤＲ５０５は、アミノ酸配列Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇ
ｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−八ｌａ−Ａｒ
ｇ−３ｅｒ−ｔＰＡを有する一次翻訳生成物を生ずるよ
うに構築されたＭＦα１リーダー配列とｔＰＡコーティ
ング配列との融合を含む。カテブシンＢ状プロテアーゼ
によるＬｙｓ−Ａｒｇ対後のそのような前駆物質の生体
内開裂はアミノ末端に４つのエキストラアミノ酸を有す
るｔＰＡ分子を生ずる。ニス、セレビシェ（Ｓ　、　ｃ
ｅｒｅｖｉｓｉａｅ）　Ｓ　Ｔ　Ｅ　１３遺伝子生成物
による一層の部分プロセシングはいずれかのＧｌｕ−Ａ
ｌａの後の開裂を生じ、それにより生成物の混合集団を
生ずると期待される。しかし、ｐＤＲ５０５中のリンカ
−配列の多重コピーの存在が配列Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｒ
ｇ−５ｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｒｇ−５ｅｒ−ｔＰＡ
を含む一次翻訳生成物を生ずる。

報告された２形態の分子〔ワレン（Ｗａｌ　ｆｅｎ）ら
、同書〕に相当するアミノ末端を有する分泌ｔＰＡを生
成させるために、ＭＦＩ！１−ｔＰＡ接合域をさらに修
飾してＧｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａ配列を削除しＭ
Ｆα１のＬｙｓ−Ａｒｇを直接ｔＰＡのアミノ末端（Ｇ
ｌｙまたは５ｅｔ）に融合させた。第９図について説明
すると、プラスミドｐＤＲ５０５をｓｐｈ　ＩおよびＸ
ｂａ　Ｉで開裂し、ＭＦα１およびｔＰＡ配列を含む２
．２ｋｂフラグメントを精製した。このフラグメントを
、ｓｐｈ　ＩおよびＸｂａＩで線状にしたＭ１３ｓ＋ｐ
１９に接合させた。ｍ１９−ＺＶ５２として知られる生
じたバイブリド分子を用いて大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｔ）
　Ｋ　１２　（ＪＭ　１０３）をトランスフェクトし、
１本鎖（ｓｉｎｇｌｅ　５ｔｒａｎｄｅｄ）形態のファ
ージを精製した〔メシング（Ｉｇｅｓｓｉｎｇ）　、メ
ト。

イア−エッチモロジー（Ｍｅｔｈ、　ｉｎ　Ｅｎｚｙｓ
ｏｌｏｇｙ）１０１：２０〜７７．１９８３）、この１
本鎖ＤＮＡを次いで２オリゴヌクレオチドプライマー（
ＺＣ１２６：　　（３’　）ＡＡＣＣＴＡＴＴＴＴＣＴ
ＣＣＴＣＧＧＴＣＴＡＧＡ　（５’　）　　、またはＺ
Ｃ１２７：　（３’　）　ＡＡＣＣＴＡＴＴＴＴＣＴＡ
ＧＡＡＴＣＣＴＴＣＺＣ（５’　）、の１つ、およびＭ
１３ユニバーサルジ−ケンシングルブライマーにバイブ
リド形成させた。生じたヘテロ二重鎖をシラー（Ｚｏｌ
ｌｅｒ）ら（同書）によりオリゴヌクレオチド指向部位
特異的突然変異誘発（Ｏ１ｉｇｏｎｕε１ｅｏｔｉｄｅ
−ｄｉｒｅｃｔｅｄ　５ｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃｎ＋
ｕｔａｇｅｎｏｓｉｉｓ）　（２ブライマー法）に記載
された反応条件を用いてＤＮＡポリメラーゼＩ　（フレ
ノウフラグメント）およびＴ４ＤＮＡリガーゼとともに
培養した。二本鎖生成物を大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）Ｋ
１２　　（ＪＭ１０３）にトランスフェクトし、生した
プラークをそれぞれラベルしたオリゴヌクレオチドプラ
イマーでバイブリド形成することによリスクリーニング
した。ポジティブクロンをプラーク精製し、正しい連結
の存在を立証するためにシーケンシング〔メシング（Ｍ
ｅｓｓｉｎｇ）　、同書〕した。２フアージのそれぞれ
について複製形［ＤＮＡを精製し、Ｓｐｈ　　Ｉおよび
Ｘｂａ　Ｉで開裂し２．２ｋｂＳｐｈ　Ｉ　−Ｘｂａ　
Ｉフラグメントを精製した。次いでｔＰＡフラグメント
を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用い、ｓｐｈ　ＩおよびＸｂ
ａ　Ｉによる開裂により線状化したプラスミドｐＵｃ１
９（ノランダー）ら、ジーン（Ｇｅｎｅ）２６　：　１
０１〜ｌ　０６．１９８３）中へ挿入した。ＺＣ１２６
オリゴヌクレオチドを用いて生じた構築体はｐＤＲ１２
０７として知られ、ＺＣ１２７オリゴヌクレオチドを用
いて生じたものはｐＤＲ１２０Ｂとして知られる（第９
図）。

次のＭＦｃｒｌ−ＬＰＡ接合を横切るシーケンシングは
ルーピングアウト（ｌｏｏｐｉｎｇ−ｏｕｔ）法はｐＤ
Ｒ５０５中に存在するリンカ−の外来コピーが除去され
たことを示した。同様にＧｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌ
ａ（ｐＤＲ１２０？およびｐＤＲ１２０８中）およびｔ
ＰＡ　（ｐＤＲ１２０８のみに対する）のアミノ末端に
おけるＧｌｕ−Ａｌａ−Ａｒｇに対するコドンが削除さ
れた。

ｐＵｃ１９が細菌プラスミドであるので、ｐＤＲ１２０
７およびｐＤＲ１２０８はニス、セレビシェ（Ｓ　、　
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中で作用しない。修飾ＭＦα１
−ｔＰＡ融合をもつ酵母プラスミドを生成させるため、
プラスミドｐＤＲ１２０７およびｐＤＲ１２０８を初め
にｓｐｈ　　ＩおよびＸｂａ　Ｉで消化する。ＴＰＩプ
ロモーターの３′端、ＭＦα１リーダーおよびｔＰＡコ
ーティング配列を含むフラグメントをゲル精製し、実施
例９に記載するｐＤＲ１１０７に接合させそれをまずｓ
ｐｈ　　ＩおよびＸｂａ　１で切断し、ｐＤＲ１２０７
およびｐＤＲ１２０８からそれぞれ誘導したｐＤＲ１３
０７およびｐＤＲ１３０８を形成させる。これらの中間
体は次いで酵母表現ベクターの構築に使用される。

実施例９ ｐＤＲ１１０７の構築 プラスミドｐＤＲ１１Ｑ７（第１０図）はＴＰＩプロモ
ーターの５′部分、ＴＰＩターミネータ−１およびプラ
スミドｐＵｃ１８（ノラングー（Ｎｏｒｒａｎｄｅｒ）
ら、同書〕の部分を含む。従って、それは細菌プラスミ
ドであり、大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）の適当な株、例え
ば株ＪＭ８３（メシング（Ｍｅｓｓｉｎｇ）、レコンビ
ナントＤＮＡ・テクニカル・ビュレチン（Ｒｅｃｏｍｂ
ｉｎａｎｔ　ＤＮＡ　Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ　Ｂｕｌｌｅ
ｔｊｎ）、ＮＩＨパブリケーション隘７９〜９９．２、
Ｎ！Ｌ２．４３〜４８．１９７９）中に複製することが
できる。

第１０図について説明すると、８０　ｏｂｐ’ｒｐ　Ｉ
ターミネータ−フラグメントをｐＤＲ４０３のＸｂａ　
Ｉ　＋Ｂａｍ　ＨＩダイジェストから精製した。このフ
ラグメントを、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用い、Ｘｂａ　Ｉ
およびＢａｇ　ＨＩで線状にしたｐＵｃ１８に連結した
。この構築体を大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）　Ｋ１２（Ｊ
Ｍ８３）の形質転換に用いた。プラスミドを生じた白色
コロニーから分離し、８００　ｂｐＸｂａ　１−Ｂａｎ
＋　ＨＩインサートの存在についてスクリーニングした
。このインサートを有する１つのプラスミドを選び、ｐ
ＤＲｌｌｏｏと称した。

ＴＰＩプロモーターをｐＤＲ４０３から９００ｂｐ　　
Ｂｇｌ　Ｕ　−Ｅｃｏ　ＲＩフラグメントとして精製し
た。このフラグメントを、Ｂｇｌ　　ＩＩおよびＥｃｏ
　Ｒ１で切断したプラスミドｐＩＣ７（ｐＵＣ８を旧ｎ
ｄ■およびＥｃｏＲＩで切断し第１１図に示すポリリン
カー配列を挿入することにより構築した）に接合した。

構築体を大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｔ）　Ｋ　１２（ＪＭ８
３）の形質転換に用い、プラスミドを生じた白色コロニ
ーから分離した。　９０　ｏｂｐ　　Ｂｇｌ■−Ｅｃｏ
ＲＩインサートを有するプラスミドをｐＤＲｌｌｏｌと
称した。

プラスミドｐＤＲ１１０７を構築するため、ｐＤＲｌｌ
ｏｌからＴＰＩプロモーターの部分を次のようばｐＤＲ
ｌｌｏｏに接合した。プラスミドｐＤＲ１１０１をＳｐ
ｈ　ｒおよび旧ｎｄ　ｍで消化し、７００ｂｐ部分子Ｐ
Ｉプロモーターフラグメントを精製した。プラスミドｐ
　ＤＲ１１００ＧＳｐｈ■および旧ｎｄ　ｍで切断し、
ｐＤＲＩＩＯＩからのプロモーターフラグメントを線状
化したプラスミドにＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて接合し
た。連結混合物を用いて大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）　Ｋ
　１２（ＪＭ８３）を形質転換した。白色コロニーから
分離したプラスミドを旧ｎｄ　ｍ　−Ｂａｓ＋　ＨＩイ
ンサ　。

−ト（約１．６　ｋｂ）の存在についてスクリーニング
した。そのようなプラスミドの１つをｐＤＲ１１０７と
称した。

実施例１０ ｔＰＡコーティング配列中の部位特異的変換ｔＰＡｃＤ
ＮＡ配列中の突然変異を実質的にシラー（Ｚｏｌｌｅｒ
）ら（同書）の２プライマー法を用いて試験管内突然変
異誘発により修正した。１本（ポジティブ）鎖ＤＮＡ鋳
型をｍｐ１９　　ＺＶ５２から調製した。２つのオリゴ
ヌクレオチドプライマーを次いで鋳型にアニーリングし
た。最初のプライマーは１塩基誤射合を除き突然変異部
位の周りの域に相補性であった。第２のプライマーは突
然変異部位の５′末端から離れた配列４０塩基対に相補
性であった。典型的にはアニーリング反応は５５℃で１
０分間行ない５分間室温に冷却した。

ＤＮＡポリメラーゼ■　（フレノウフラグメント）およ
びＴ４ＤＮＡリガーゼを次に加え、プライマーを１４℃
で４〜８時間伸長させた。次に混合物を用いて大腸菌（
Ｅ、　ｃｏｌｔ）　ＪＭ８３を形質転換し、細胞を平板
培養し、−夜成長させた。ポジティブプラークを同定す
るため、ＤＮＡを記載されたように〔シラー（Ｚｏ　１
１　ｅｒ）ら、同書）ニトロセルロースフィルターに移
し、フィルターを３７℃で１時間プレバイブリド形成さ
せ、次いで３７℃で１時間適当なｚｚｐラベルした突然
変異プライマーにバイブリド形成させた。室温、５０℃
、および必要なら６０℃で順次洗浄し、洗浄の間にオー
トラジオグラフィー社かけた。高温におけるバイブリド
形成によりポジディプとして同定されたプラークを採電
し、それからＤＮＡを調製した。所望配列の存在はジデ
オキシ（ｄｉｄｅｏｘｙ）法を用いるシーケンシングに
より立証された。

位置６０５における突然変異を修正する第１（突然変異
）プライマーは２１７− ”　ＧＴＴＧＴＧＧＴＴＣＣＣＣＡＧＧＣＣＣＡＧ３′
であった。第２（シーケンシング）プライマーは１７マ
ー ”　ＣＴＴ＾＾ＡＧＡＣＧＴＡＧＣＡＣＣ”であった。

ｍｐ１９−ＺＶ５２のポジティブ鎖を鋳型として用いた
。

位置４０４突然変異を修正するため２策を用いた。第１
策は鋳型として修正した位置６０５突然変異をもつファ
ージクロンのポジティブ鎖を用いた。第２策は非修正１
１１１）１９−ＺＶ５２のポジティブ鎖を鋳型として用
いた。両方の場合に、突然変異プライマーは１８７−”
　ＣＴＧＧＣＡＣＡＣＧＡＡＡＴＣＴＧＡ”であり、シ
ーケンシングプライマーは１８マー”　ＧＧＣＣＣＴＧ
ＧＴＡＴＣＴＡＴＴＴＣ”　’であった。

位置１０６９突然変異は修正した位置６０５突然変異を
有するポジティブ鎖を鋳型として用いて修正された。突
然変異プライマーは ”　ＧＴＴＧＣＴＴＧＧＣＡＡＡＧＡＴＧＧＣＡ３′で
あり、シーケンシングプライマーは”　ＧＣＣＣＣＣＧ
ＣＡＣＡＧＧＡＡＣＣＧ３′であった。

実施例１１ ｔＰＡをコードした塩基配列に修正を加えた発現ベクタ
ーの調製 一つもしくはそれ以上の塩基を修正したｔＰＡの配列を
次の様な方法でいくつかのイースト（酵母）発現ベクタ
ーに挿入した。種々の修正を加えたＭ１３クローンのＲ
Ｆは適当な酵素で切断され、そのｔＰＡ切断を精製した
。これらのフラグメントを、変異したｔＰＡの配列を除
く意味で予めＢｇｌ　ｎとＸｂａ　Ｉで消化したバクテ
リアのベクターｐＤＲ１２０６、ｐＤＲ１２０７および
ｐＤＲ１２０８に挿入した。

プラスミドｐＤＲ１２１６は６０５の位置に修正した変
異をもっているが、これは、その変異配列を修正を加え
たＢｇｌ　ＩＩ　−Ｘｂａ　Ｉフラグメントで置換する
ことによってｐＤＲ１２０６から調製した。プラスミド
ｐＤＲ１２１７とｐＤＲ１２１Ｂも同様に、“各々プラ
スミド１２０７とｐＤＲ１２０８から調製した。

プラスミドｐＤＲ１２２６、ｐＤＲ１２２７およびｐＤ
Ｒ１２２８はその変異配列を４０４の位置に修正をもつ
Ｂｇｌ　　Ｕ−Ｘｂａ　Ｉフラグメントで置換すること
により、各々、ｐＤＲ１２０６、ｐＤＲ１２０７、ｐＤ
Ｒ１２０Ｂから調製した。

プラスミドｐＤＲ１２４６、ｐＤＲ１２４７およびｐＤ
Ｒ１２４８は線状プラスミド中に、６０５番と４０４番
の位置に修正を含むＢｇｌ　　Ｕ　−Ｘｂａ　１フラグ
メントを挿入する方法で各々ｐＤＲ１２０６、ｐＤＲ１
２０７およびｐＤＲ１２，０８から調製した。

プラスミドｐＤＲ１２５６、ｐＤＲ１２５７およびｐＤ
Ｒ１２５８は、線状プラスミドに６０５番及び１０６９
番に修正をもつＢｇｌ　　Ｕ　−Ｘｂａ　Ｉフラグメン
トを挿入する方法でお各々ｐＤＲ１２０６、ｐＤＲ１２
０７およびｐＤＲ１２０８から調製した。

プラスミドｐＤＲ１２７６、ｐＤＲ１２７７およびｐＤ
Ｒ１２７８は、線状プラスミドの中に６０５番と１０６
９番に修正をもつＮａｒ　Ｉ　−ＸｂａＩフラグメント
と４０４番に修正をもつ、そのクローンのＢｇｌ　ＩＩ
　−Ｎａｒ　Ｉフラグメントを挿入することで各々ｐＤ
Ｒ１２０６、ｐＤＲ１２０？およびｐＤＲ１２０８から
調製した。これら３種のプラスミドはＰｅｎｎ１ｃａら
（同誌）や−ａｌｌｅｎら（同誌）によって報告されて
いる様なアミノ酸配列をもつｔＰＡをコードすることが
期待できる。

ｐＤＲ１２７６中のｔＰＡのｃＤＮＡ配列は両鎖の配列
決定を行うために、Ｓｐｈ　Ｉ　−Ｘｂａ　Ｉフラグメ
ントとしてＭ１３ｍｐ１８とＭ１３ｍｐ１９にサブクロ
ーンされた。グイデオキシ法によるシーケンシングによ
りこのｃＤＮＡに８７０．８７３．８７６．８７９の位
置での新しい塩基置換と７２３．７２４の位置での二塩
基欠損があることが分り、４０４．６０５および１０６
９番での塩基置換は修正されていることが示された。

発現ベクターの調製におけるいくつかの中間体のサブク
ローンの配列決定で、それが正しいｔｐ＾配列を組各立
てる際に使用することのできる大兄のＤＮＡフラグメン
トのものと同じであると分った。Ｍ１３ｍｐＨのＢａｍ
ＨＩ部位に挿入した形でプラスミドｐＵｃＷのＸｈｏｌ
Ｉ　−ＸｈｏＴＩ　　ｔ　Ｐ　Ａフラグメントを含むＭ
ｌ　３Ｔ２１は、７２３〜７２４および８７０〜８７９
の位置にいかなる誤りも含まなかったが、４０４．６０
５および１０６９番に塩基置換をもっていた。プラスミ
ドｐＤＲ１２７６は４０４．６０５および１０６９の位
置に修正された塩基置換を含んでいた。

第１２図に示したように、正しい配列をもつイーストの
発現ベクターは次のように調製された。

Ｍｌ　３Ｔ２１のＲＦをＸｈｏ　ＩＩとｓｐｈ　　Ｉで
消化し、５’ｔＰＡフラグメントを精製した。プラスミ
ドｐＤＲ１２７６をＳｃａ　ＩとＸｂａ　Ｉで消化し、
３′ｔＰＡフラグメントを精製した。またプラスミドｐ
ＤＲ１２７６をＢｇｌ　　ＩＩとＸｂａ　Ｉで消化し、
ｐｕｃ１８の配列を含むフラグメントが精製された。こ
れら三つのフラグメントはプラスミドｐＤＲ１２８６を
作るために結合された。これは４０４と６０５番に本来
の変異だけをもつものである。

さらにｐＤＲ１２８６をＸｂａ　Ｉで完全消化し、Ｔａ
ｑ　Ｉによって部分消化することによって１１４５塩基
対のｔＰＡフラグメントを得た。このフラグメントをｐ
ＤＲ１２７６からの４４６塩基対のＢｇｌＩＩ−Ｔａｑ
Ｉフラグメントと、ｐＤＲ１２７６からのＢｇｌ■−Ｘ
ｂａ　Ｉベクターフラグメントと結合し、プラスミドｐ
ＤＲ１２９６を得た。

ｐＤＲ１２９６中にある発現単位にＴＰＩプロモーター
とＴＰＩターミネータ−の５′領域を復帰させる為に、
そのベクターはｓｐｈ　　ＩとＸｂａ　Ｉで消化され、
ＴＰＩプロモーター、ＭＦα１およびｔＰＡ配列を含む
フラグメントが精製された。このフラグメントはＳｐｈ
　　ｒとＸｂａ　Ｉで消化されたｐＤＲ１１０７の中に
挿入した。できあがったプラスミドはｐＤＲ１３９６と
命名した。

さらにＢａｏ＋　ＨＩとＨｉｎｄ　ｍでｐＤＲ１３９６
を消化し、ＴＰＴプロモーター、ＭＦα１、ｔＰＡとＴ
ＰＩターミネータ−をもった発現単位を含むフラグメン
トを精製することによって最終的なイーストの莞現ベク
ターを調製した。

このフラグメントをさらにＢａａ　ＨＩとＨｉｎｄ　ｍ
で消化しＹＥｐ　ｌ　３の中に挿入した。生成したプラ
スミドはｐＤＲ１４９６として知られている。

そのｐＤＲ１４９６の５ｐｈｌ　−Ｘｂａ　Ｉ　　ｔ　
ＰＡ配列をＭ１３ｍｐ１８とＭ１３ｍｐ１９にサブクロ
ーンしてシーケンシングしたと、こるすべての変異が修
正されていることが確かめられた。

プラスミドｐＤＲ１４９７はＮ末端がＧｌｙ−Ａｌａ−
Ａｒｇ−３ｅｒ−の配列をもつ分泌後のｔＰＡをコード
するように調製された。ｔＰＡの配列はＬｙｓ−Ａｒｇ
のプロセッシング部位に対応するコドンのところでＭＦ
α１の配列と結合させた。

ｐＤＲ１４９７を調製するためにｐＤＲ１２１７をＢｇ
ｌ　ＩＩとＸｂａ　Ｉで切断し、そのベクターフラグメ
ントをゲルにより精製した。ｔＰＡをコードする配列は
ｐＤＲ１２９６から除かれ二つのフラグメントを一つに
結合した。生じた調製物（ｐＤＲｌ　２９７）はＥ、ｃ
ｏｌｉ　Ｌ　Ｍ　１０３５に形質転換するのに用いた。

正しい配列ができ上がったかどうかを確めるために一つ
の形質転換体から単離されたプラスミドＤＮＡをｓｐｈ
　　ＩとＸｂａ　Ｉで切断し、ＬＰＡをコードする領域
を含むフラグメントを精製した。このフラグメントはｓ
ｐｈ　　ＩとＸｂａ　Ｉて切断されたＭ１３ｍｐ１９の
ＲＦと精合し、配列解析で、α−ファクターとｔＰＡの
結合部分の配列とｔＰＡをコードする配列は望みどおり
のものになっていることを確認した。

最終的なイースト発現ベクターｐＤＲ１４９７は次のよ
うに調製した。ＴＰＩプロモーターの３′領域と、ＮＦ
α１配列およびｔＰＡをコードする配列をもつｐＤＲ１
２９７のＳｐｈ　Ｉ　−Ｘｂａ　ｒフラグメントをｓｐ
ｈ　ＩとＸｂａ　Ｉで予め切断されたｐＤＲ１１０７に
挿入した。ｐＤＲ１３９７として知られるこの調製物は
さらに旧ｎｄｌｌ［とＢａｍ　Ｈ１で切断され、発現単
位を含むフラグメントがゲルにより精製された。次のこ
のフラグメントを、Ｈ’１ｎｄｌｌ［とＢａｍ＋ＨＩで
予め切断されたＹＥｐ　１３に挿入した。この結果でき
たものがｐＤＲ１４９７である。プラスミドｐＤＲ１４
９８はα−ファクターのＬｙｓ’Ａｒｇ切断信号に対応
するコドンと融合した、より短かい分子をコードした（
Ｓｅｒ−ｔＰＡ）、修正されたｔＰＡの配列をもってい
る。この調製方法は、もともとのベクターフラグメント
の由来をｐＤＲ１２０８とするだけで、上述のｐＤＲ１
４９７のときの調製図式に示されたものと同様である。

プラスミドｐＤＲ１４９９はｔＰＡの細胞内生産をコー
ドするためのＴＩＰプロモーターに直接結合しているＭ
ｅｔ−Ｇｌｙ−＾１ａ−Ａｒｇ−５ｅｒ−ｔＰＡをコー
ドする塩基配列を含んでいる。それは、次のような方法
で調製した。プラスミドｐＤＲ１００５をｓｐｈ　Ｉと
Ｘｂａ　Ｉで切断し、ＴＰＩプロモーターの３′側とｔ
ＰＡをコードする配列を含むフラグメントをゲルによっ
て精製した。さらにこのフラグメントをｓｐｈ　ＩとＸ
ｂａ　Ｉとで線状にしたｐＵｃ１９に結合した。ｐＤＲ
１２０９として知られるこのプラスミドはＢｇｌ　ＩＩ
とＸｂａ　Ｉとで切断され、そのベクターフラグメント
が精製された。６０５番に修正された塩基をもつｔＰＡ
をコードする配列を例１０で述べられているように適当
なＭ１３クローンのＲＦから精製した。このＢｇｌ　Ｕ
　−Ｘｂａ　Ｉフラグメントは、ｐＤＲ１２１９を作る
ためにｐＤＲ１２０９のベクターフラグメントに結合さ
れた。

さらに、プラスミドｐＤＲ１４９９が、ｐＤＲ１２１９
由来のベクターフラグメントを使用することによって、
ｐＤＲ１４９７とｐＤＲ１４９８と同様な方法で調製さ
れた。

イースト中での発現のために、上述のプラスミドを適当
なイースト宿主株に形質転換し、その形質転換体は例１
２で述べられているように培養された。望ましいイース
ト宿主は、Ｅ８−１１ｃ株である。

下記の表には、上述の発現ベクターによってコードされ
ている主要な翻訳生産物の予想される配列を示しである
。

ベクター ｐＤＲ１４９６ＭＦα１−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａ
ｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｓｅ
ｒ−ｔＰＡｐＤＲ１４９７’　　　ＭＦα１−１．ｙｓ
−＾ｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｒｇ−３ｅｒ−ｔＰＡｐ
ＤＲ１４９８ＭＦαｌ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−３ｅｒ−ｔＰ
ＡｐＤＲ１４９９Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｓ
ｅｒ−ｔＰＡス［ Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを使ったｔＰＡの発現ＴＰ
Ｉプロモーター、ＭＦｏｆｌのリーダー配列、Ｇｌｙ−
Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−ｔ　ＰＡをコードする配列お
よびＹＥｐｌ　３中のＴＰｆターミネータ−を含む発現
ベクターｐＤＲ１４９６はＳ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの
Ｅ８−１００株に形質転換された。細胞は停止期まで増
殖され、さらに新鮮な一１ｅｕ培地に植えつがれた。そ
の培地は２５０ｒｐａ＋で撹拌し、３０℃でインキユベ
ートした。ＹＥｐ　１３を形質転換したＥ８−１１ｃ株
の同様な培養をコントロールとして行った。

イノキュレーション後１８．２０．２２および２４時間
目のときに、培地を１００　ｍ　ｌづつ取り出し、遠心
により集菌した。

洗浄したベレット状の菌体はリン酸塩で緩衝された食塩
水中でカラスピースにより破壊した。そしてｔＰＡの生
物学的活性を、フィブリン分解法により測定した。

フィブリン分解試験はＨｉｎｄｅｒ等の方法に基づいて
いる。（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　　２５４　：
　１９９　Ｂ。

１９７９）。ウシのフィブリノーゲン溶液１０ｍ１　　
（３，０ｍｇ／ｍｊ！　；　０．０３６Ｍ酢酸ナトリウ
ムｐＨ８，４，０，０３６Ｍバルビタール酸ナトリウム
、０．１４５Ｍ塩化ナトリウム、１０−’Ｍ塩化カルシ
ウム、０．０２％アジ化ナトリウム）を４０℃で同様の
バッファ中に溶かした低融点アガローズの１．５％溶液
’１０ｍｎと混合し、この溶液に１０μｌのプラスミノ
ーゲンと１０μｌの仔ウシのスロムビン（５００Ｕ／ｍ
ｌ）を加えた。その混合物をゲルボンドアガロース支持
膜（マリーンコロイド社）上に注ぎ冷却した。アガロー
ズにウェルが切られ、そのウェルに被試験試料１０ｔｔ
ｌと０．１％のウシ血清アルブミンを含むリン酸緩衝食
塩水１０μｌを加えた。その結果は精製したｔＰＡを用
いて作られた標準曲線と比較した。ウェルのまわりに鮮
萌な輪ができれば生物学的に活性なプラスミノーゲン活
性化因子の存在を示すことになる。

代表的な一連の実験の結果を表Ａにまとめた。

ｐＤＲ１４９６、ｐＤＲ１４９７、ｐＤＲ１４９８およ
びｐＤＲ１４９９で形質転換したＳ、ｃｅｒｅｖｉｓｉ
ａｅＥ８−１１ｃ株はアメリカ・タイプ・カルチャー・
コレクシランに保管されている。受理番号はそれぞれ２
０７２８．２０７２９および２０７３１である。

去−一一−Ｎ プラスミド　　　豊−一皿　＠！？、（μｇ／ｊりＹＥ
ｐ１３　　　　１８ｈｒ’ｓ　　　　　−”　　　　　
　　　　２０ｈｒｓ　　　　　　　−／／　　　　　　
　　　２２　ｈｒｓ　　　　　　　−”　　　　　　　
　　２４ｈｒｓ　　　　　　　−ｐＤＲ１４９６１８ｈ
ｒｓ　　　　　　１３．２”　　　　　　２０ｈｒｓ　
　　　２７．０〃２２ｈｒｓ　　　　１８．０ 〃　　　　　　　　２４ｈｒｓ　　　　　　１７．２１
　タンパク質濃度は培地１ミリリットル当りで与えられ
ている。

ｐＤＲ１４９６で形質転換した・Ｅ８−１１ｃを同様に
調製した培地をイライザ法によって試験した。（実施例
１３）。結果は以下にまとめである。

１　８　　ｈｒｓ　　　　　　　　　５２．８　　　　
　　　　１　６６．０２０　　ｈｒｓ　　　　　　　１
　０４．０　　　　　　　　２６４．０２２　　ｈｒｓ
　　　　　　　１　２０．０　　　　　　　　２８０．
０２４　　ｈｒｓ　　　　　　　　　８０．０　　　　
　　　　２９６．４＊タンベク濃度は培地１１当りで与
えられている。

ｐＤＲ１４９Ｂで形質転換したＳ、ｃｅｒｅｓｉｖｉａ
ｅＥ８−１１ｃ株をｐＨ５，５の０．１　Ｍフタル酸水
素カリウムを加えたものと加えないものの双方について
、２％グルコースを補った一１ｅｕ培地で増殖した。停
止期の培地からの阻抽出物はイライザ法およびフィブリ
ン分解法により試験した。結果は以下にまとめられてい
る。

ＰＢＳ中のＥ８−１１ｃ／ｐＤＲ１４９８阻抽出物を６
０％飽和の硫酸アンモニウムで沈殿させ、ＰＢＳに再び
サスペンドし、さらにＰＢＳに対して透析した。

タンパク質の最終濃度は１００■／　ｍ　Ａ！であうた
。透析後の抽出物５０μｌに対しＰＢＳもしくはエンド
グリコシダーゼＨ（０，１μｇ）を加え、フィブリン分
解活性試験に供される前に室温で１時間インキュベート
した。以下に示したように、試験管内でのエンドグリコ
シダーゼ処理はイーストの生産するｔＰＡの生物学的活
性を約２から６倍増加させるという結果であった。

５．０　　　　　　　　１７０　　　　　３８０１．０
　　　　　　　　　２５　　　　　１１００、２５　　
　　　　　　　７　　　　　　３００．０５　　　　　
　　　　１．７　　　　　１１ス［ ｔＰＡに対する酵素免疫試験法（ＥＬＩＳＡ）マイクロ
タイタープレート（１ｍｍｕｌｏｎ　２　、Ｄｙｎａｔ
ｅｃｈ）のウェルを、アフィニティで精製したウサギの
抗ｔＰＡ抗体でコーティングした。コーティングには０
．１　Ｍ炭酸ナトリウムで抗体を４００倍に希釈した溶
液を用いた。プレートを４℃で一晩放置し緩衝液Ｂ　（
ＰＢＳ中に０．０５％Ｔｗｅｅｎ　２０　、０．０５％
アジ化ナトリウムを含んだもの）で三回洗浄した。２０
０μｌの緩衝液Ａ　（ＰＢＳ中に０．０５％Ｔｖｅｅｎ
　　２０．　０．０５％アジ化ナトリウム、１％ＢＳＡ
を含むもの）を各ウェルに入れ、プレートは非特異的な
結合を減じるために、３５℃で２ｈｒインキユベートし
た。さらにプレートを緩衝液Ｂで３度洗浄した。

試験試料は被試験物質を緩衝液Ａで希釈して作った。試
料２００μｌを各ウェルに入れ、プレートを室温でｌｈ
ｒインキュベートした。各つ、エルを。

アスピレータによって吸い出し緩衝液Ｂで３度、蒸留水
にで１度洗浄した。緩衝液Ａ中でアルカリホスファター
ゼと結合させた、アフィニティーで精製したウサギ抗ｔ
ＰＡ抗体溶液２００μ！（典型的には結合した抗体を８
００分の１に希釈したもの）を各ウェルに入れ、そのプ
レートを室温で３０分間インキュベートした。その後抗
体溶液を除き、上述のように緩衝液Ｂと蒸留水でプレー
トを洗った。酵素基質の２００μｍ　（ジェタノールア
ミン９６　ｍ　１２　／　１、塩化マグネシウム５６曙
／１ｐＨ９，８の溶液５９　ｍ　ｌにパラニトロフェニ
ルホスフェート試薬〔シグマ〕を６０■とかしたもの）
を加えて、そのプレートを３７℃で３０分間インキュベ
ートした。プレートはＴｉｔｅｒｔｅｋ社の“マルチス
キャン“検出器により測定した。その結果は緩衝液Ａに
５〜１１００ｎ／ｍｌの濃度になるように調製したｎａ
ｔｉｖｅ　ｔ　Ｐ　Ａによる標準曲線と比較した。

実施例１４　プラスミノーゲン活性化因子の部位特異的
変異原性 組織から得られたプラスミノーゲン活性化因子は内在す
る４つのグリシル化部位をもつ（アミノ（Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ、　２３　　；　　３７０　１３７０７、１　９８４
）によると、この部位のうち３つ（Ａｓｎ−１１７、−
１８４、−４４８）はＢｏｎｅｓメラノマ細胞から得ら
れたｔＰＡ中でグリコシル化される。残りの部位（Ａｓ
ｎ’　−２１８）はＢｏｗｅｓ　ｔ　Ｐ　Ａ中でグリコ
シル化されない。

イースト中で生成したプラスミノーゲン活性化因子は数
多くグリコシル化されているようだ（ウェスターンプロ
ット析法による）。このように非常にグリコシル化が進
んでいるということは人間の治療という意味では生産物
の適合性をそこなうかもしれない。何故なら人体はそれ
を外来性タンパク質と認識する可能性があるからだ。そ
こで形質転換したイースト中での修飾型ｔＰＡの生産方
法が与えられることになる。その修飾されたタンパク質
とは野性型イーストの生産するｔＰＡよりはグリコシル
化が少なくしかも生物学的な活性は保持しているという
ものである。また修飾されたプラスミノーゲン活性化因
子はヒトに関する抗原性という意味での活性は減じてい
る。グリコシル化部位の＾ｓｎ残基を他のアミノ酸に置
換することによって、グリコシル化が防げることができ
る。

特にＡｓｎ残基をＧｉｎ残基に変えることが望ましい。

さらに、イースト生産のタンパク質のグリコシル化を防
ぐという目的のためには、配列中の別な部分での修正と
いう方法が導入されるかもしれない。

のプロリン残基はイースト中でのグリコシル化を阻害す
る可能性がある（Ｍａｒｓｈａｌｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、
　Ｓｏｃ。

Ｓｙｍｐ、−先０：１７−２６．１９７４）、またこの
位置での他の置換もなされている。さらにあるグリコシ
ル化部位の３番目のアミノ酸も変えることができる。ｔ
ＰＡをコードしているＤＮＡ配列を変えることは、部位
特異的な突然変異誘発によりなすことができる。この方
法は基本的には、１９８３年Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　
Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ、の分子クローニングに関する先
端技術マニュアルにＺｏｌｌｅｒとＳｍ１ｔｈが述べて
いるものである。ヌクレオチドの交換は単独かもしくは
、それ以上のグリコシル化部位の修正をもたらすかもし
れない。さらにその変異を起こした配列のものを変異を
含むベクターの制限エンドヌクレアーゼによる消化や望
ましい組合せを作るように生成したフラグメント間の結
合によってうまく結合させることもできるし、また１回
の突然変異誘発ステップで多重の変化も導入できる。

具体的に言えば、もともとのグリコシル化部位に対応す
るコドンが望ましいイーストのコドンに変わる様な付加
的なヌクレオチドの置換がなされれば都合がよい。

Ｂ、実験 クローン化したｔＰＡのｃＤＮＡを部位特異的突然変異
誘発のために２つのフラグメントとしてサブクローンし
た。

ｔＰＡの配列の５′領域を得るために約１μｇのプラス
ミドｐＤＲ１２９６をＢｇｌｌＩ緩衝液（ＢＲＬ）中、
３７℃、２ｈｒＳ　１ユ−ットのＢｇｌ　Ｉ［で消化し
た。さらにｌユニットのＥｃｏＲＩを加え、１０分およ
び２０分間インキュベートした結果生じたＤＮＡフラグ
メントは１％のアガローズゲルで分離した。そして１．
０８６塩基対のＢｇｌＩＩ消化およびＨｃｏＲ１部分消
化フラグメントをＮＡ−４５ＤＥＡＥメンブレン（Ｓｃ
ｈｌｅｉｃｈｅｒ　＆　５ｃｈｎｅｌｌ）へ説明書に従
って電気的に溶出させた。

３′側のＤＮＡは０．０５Ｍ１−リス、ｐＨ７，４，６
ｍＭ塩化マグネシウム、０．０５　Ｍ塩化ナトリウムの
緩衝液中で、χｂａｌとＥｃｏＲＩで完全消化して調製
した。そのフラグメントは１％のアガローズゲルで分画
され１．５３２塩基対のＥｃｏ　ＲＩ　−Ｘｂａ　Ｉフ
ラグメントは上述のような方法で流出させた。そのフラ
グメントはクロロホルムおよびフェノールで抽出精製し
、エタノールで沈殿させた。

精製したＢｇｌ　ＩＩ　−ＥｃｏＲＩフラグメントはＭ
１３ｍｐ８（複製型ＲＦ）をＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩで
消化して得られるフラグメントと室温で５時間、Ｔ４Ｄ
ＮＡリガーゼで処理することにより結合させた。Ｅｃｏ
　ＲＩ　−Ｘｂａｌフラグメントは同様な方法でＭＢ　
１３ｍｐ　１９　　（ＲＦ）のＥｃｏ　ＲＩおよびＸｂ
ａ　　Ｉ消化フラグメントと結合させた。

組み換えファージクローンは受溶菌のＥ、ｃｏｌｉＪＭ
ＩＯＩに感染させた。ファージＤＮＡをプラークから精
製し、正しいｃＤＮＡ配列をもつかどうかを確かめる為
にブライマーとしてＺＣ８７を使用して、ダイデオキシ
法により配列決定がなされた。　　“ 部位特異的突然変異の誘発は一本鎖Ｍ１３鋳型上で、変
異性のブライマーＺＣ２９４、ＺＣ２９５およびＺＣ２
９７（表３を参照）をそれぞれＡｓｎ−１１７、−１８
４および−４４８に修正を加えるべく使用して行なわれ
た。それらのブライマー使用によってイーストにとって
望ましいようなＡｓｎコドンのＧｌｎコドンへの変換や
他のグリコシル化部位のコドンの交換がおこるように内
在するグリコシル化部位の修正を計画した。

またそれらのブライマーが無関係な突然変異を生じさせ
る二次的な相同性領域をもたないように鋳型の配列と比
較された。Ａｓｎ−１１７と−１８４のグリコシル化部
位は鋳型としてＢｇｌ　Ｕ　−ＥｃｏＲ１挿入物を含む
Ｍ１３ｍｐ８組み換え体を使って変換した。Ａｓｎ−４
４８の部位は鋳型として、Ｅｃ。

Ｒ１−ＸｂａＩ挿入物を含むＭ１３ｍｐ１９組み換え体
を使用して変換した。全ての突然変異の誘発に、二つ目
のプライマーーとしてＭ１３のユニバーサルブライマー
ＺＣ８７を使った。

２０ｐｍｏｌｅのリン酸化した変異原性プライマーと２
０ｐｍｏｌｅの二次ブライマーを１０μ２の２０ｍＭト
リス、ｐＨ７，５，１０ｍＭ塩化マグネシウム、５０ｍ
Ｍ塩化ナトリウム、１ｍＭのＤＴＴを含む緩衝液中でｌ
　ｐｍｏｌｅの一本鎖の鋳型と混合し６５゛Ｃで１０分
間インキュベートした。それから室温に５分間置きさら
に水中に保存した。１ｍＭの各ｄＮＴＰ、２．５ユ−ッ
トのＫｌｅｎｏｗポリメラーゼ、および３．５ユニツト
のＤＮＡリガーゼを溶かした２０ｍＭ）リスｐＨ７，５
，１０ｍＭ塩化マグネシウム、］、ＯｍＭ　　ＤＴＴの
緩衝液１０μβを、アニールしたＤＮＡに加え、１５℃
で３時間インキュベートした。その後そのＤＮＡを受容
菌Ｅ、ｃｏｌｉＪＭＩＯＩに感染させた。そのＥ、ｃｏ
ｌｉはＹＴ寒天培地上にまかれ、３７℃でインキュベー
トした。

プラークは予め、６ｘＳＳＣ及び１０　ｘ　Ｄｅｎｈａ
ｒｄｔ　’　ｓ緩１１ｉ液中で１時間、変異性プライマ
ーのＴｍである４℃に保ち、同緩衝液中にてＴｍの４℃
で３２ｐでラベルした変異性プライマーとハイブリダイ
ズした。フィルターは一晩Ｘ線フィルムにさらした。

その後行な“われる洗浄操作は変異したプラークを同定
する必要性からさらに５℃高い温度で行なった。次に示
す変異ファージクローンが同定された。

Ｒ２，Ａｓｎ　−１１７の部位に変異をもつ、Ｂｇｌ　
ＩＩと部分的に［ＥｃｏＲＩで消化したフラグメントを
含んだＭ１３ｍｐ８ Ｒ１０，Ａｓｎ　−１８４の部位に変異をもつ、Ｂｇｌ
ｌｌと部分的にＥｃｏ　ＲＴで消化したフラグメントを
含んだＭ１３ｍρ８ Ｒ２４，Ａｓｎ　−４４８の部位に変異をもつ、Ｅｃｏ
　ＲＩとＸｂａ　Ｉで消化したフラグメントを含んだＭ
１３ｍｐ１９ ｐＤＲ１２９８中のｔＰＡをコードした配列を置換する
ことによって、１ケ、２ケおよび３ケの変異をもつｔＰ
ＡのＤＮＡ配列が調製された。次のようなプラスミドが
調製された。

（１）ｐＤＲ１６０１；Ａｓｎ−１１７の部位に変異を
もつ、 （２）ｐＤＲ１６０２；Ａｓｒ＋−１８４の部位に変異
をもつ、 （３１ｐＤＲ１６０３；Ａｓｎ−４４８の部位に変異を
もつ、 （４１ｐＤＲ１６（１４；Ａｓｎ−１１７と−４４８の
部位に変異をもつ、 ｆ５）ｐＤＲ１６０５；Ａｓｎ−１８４と−４４８の部
位に変異をもつ、 （６）ｐＤＲ１６０６；３ケの変異をすべてもつプラス
ミドｐＤＲ１６０１は最初、クローン＃２　（ＲＦ）か
らＡｓｎ−１１７の変異を含む、旧ｎｄ■と部分消化Ｅ
ｃｏＲＩフラグメントを精製し、このフラグメントを旧
ｎｄｎＩとＨｃｏＲＩで消化したｐＵｃ１２へ挿入して
調製した。さらにそのプラスミドをＸｂａで消化し、Ｅ
ｃｏＲＩで部分消化して、ｔＰＡの配列を含む１０８６
塩基対のフラグメントを精製した。このフラグメントは
ｐＤＲ１２９６（３′側のｔＰＡ配列を含む）由来の５
３２塩基対のＥｃｏＲＩ−χｂａＩフラグメントとｐＤ
Ｒ１２９８（ｐＵｏｌＢ、ＴＰＩプロモーター、ＭＦα
１の配列を含む）由来の大きなχｂａｌ−ＢｇｌｌＩフ
ラグメントと竺つを結合した形で結合させ、プラスミド
ｐＤＲ１６０１を調製した。

プラスミドｐＤＲ１６０２は同様な方法でクローン＃１
０（ＲＦ）からの変異した５′側ｔＰＡフラグメント（
Ｈｉｎｄｌｌ［と部分消化のＥｃｏＲＩ）を使って作ら
れた。

プラスミドｐＤＲ１６０３は、３′側の変異ｔＰＡフラ
グメント（クローン＃２４（ＲＦ）のＥｃｏ　ＲＩ　−
Ｘｂａｌ消化物）を精製し、このフラグメントとｐＤＲ
１２９Ｂから（７）　Ｘｂａ　Ｉ　−Ｂｇｌ　Ｉｆ消化
フラグメントと、ｐＤＲ１２９６からのＢｇｌＩＩ及び
部分消化ｔ！ｃｏＲＩの消化物である５′側ｔＰＡフラ
グメントの三つのフラグメントを結合して調製した。

プラスミドｐＤＲ１６０４は、クローン＃２４（ＲＦ）
のＥｃｏＲＩ　−Ｘｂａ　ＩフラグメントとｐＤＲ１２
９６の対応するフラグメントを置換することによって、
ｐＤＲ１６０１の場合と同様な方法で調製した。

プラスミドｐＤＲ１６０５は、クローン＃２４（ＲＦ）
のＥｃｏＲＩ　−Ｘｂａ　ＩフラグメントをｐＤＲ１２
９６の対応するフラグメントと置換することによってｐ
ＤＲ１６０２の場合と同様な方法で調製した。

プラスミドｐＤＲ１６０６は、ｐＤＲ１２９８のＸｂａ
　Ｉ　−Ｂｇｌ　ＩＩフラグメントとｐＤＲ１６０１由
来のＢｇｌ　ＩＩ　−Ｔａｑ　Ｉフラグメント（Ａｓｎ
−１１７部位に変異をもつ）とｐＤＲ１６０５由来の部
分消化したＴａｑ　ＩとＸｂａ　Ｉのフラグメントの三
つを結合することによって調製した。

すべてのｐＤＲ１６００シリースのプラスミドはｓｐｈ
　ＩとＸ′ｂａｌで消化され、そのｔＰＡ配列を精製し
て配列の検証のためにＭ１３ｍｐ１８にクローンした。

希望する配列をもつプラスミドがイーストの発現ベクタ
ーの調製に使用する為に選択された。

ｐＤＲＬ７０１−１７０６は、ｐＤＲ１６００シリーズ
のプラスミドをｓｐｈ　ＩとＸｂａ　１で消化し、ｔＰ
Ａフラグメントを精製しこれらをＳｐｈ　ｒとＸｂａ　
　Ｉで消化したｐＤＲ１１０７に結合することによって
各々ｐＤＲ１６０１−ｐＤＲ１６０６から作られた。そ
のｐＤＲ１７００シリーズのプラスミドをＢａｍＨＩと
ｌｌ１ｎｄｌ［［で消化し、各ｔＰＡ発現ユニットをＢ
ａｍＨＩと旧ｎｄＩ［で消化したＹＢｐ１３に挿入して
プラスミドｐＤＲ１８０１−１８０６を作った。

プラスミドｐＤＲ１８０１，１８０２，１８０３，１８
０４はＳ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　Ｅ　８−１１　ｃ株
に形質転換するのに使われた。形質転換した細胞は、２
％グルコースを含む一１ｅｕ培地をいれた２５Ｏｒｐｍ
で振とうするフラスコ中３０℃で培養した。試料は培養
中に一定時間間隔でサンプリングされ、ｔＰＡポリペプ
チドがＥＬ　Ｉ　ＳＡ法により、また生物学的活性がフ
ィブリン消化法によって試験された。得られたデータは
精製したｔＰＡ標準物質のものと比較した。下に示され
た結果は、三つの単一の変異をもつものの各々（ｐＤＲ
１８０１，１８０２，１８０３）が生物学的活性が増加
していることを示している。

ｐＤＲ１４９８２８６４６４ ｐＯＲ１Ｂ０１　　　３０　　　８０　　　　　４０Ｂ
ｐＤＲ１８０２３０４０，６４０４ ｐＤＲ１８０３３０６４，８７２０ ｐＤＲ１８０４２６８８１３２ 実施例１５：　　ｔＰＡを分泌させるＰ）１０５シグナ
ルペプチドの使用 イーストの遺伝子ＰＨ０５（Ａｒｔ翔ａら、ｈ虹Ａｃ１
ｄｓＲｅｓ、１１．１６５７−１６７２．１９８３）は
分泌されるタンパク質酸ホスファターゼをコードしてい
る。ＰＨ０５のシグナルペプチドをコードする合成りＮ
Ａフラグメントをイースト中で発現したｔＰＡをコード
するＤＮＡと結合させた。

シグナルペプチドをコードする配列を調製する目的でオ
リゴヌクレオチドＺＣ２３１，２３２，２３３，２３４
（表３参照）を合成し、リン酸化した。これらは−末鎖
の５′末端をもつフラグメントを作るために二つ組みに
してアニールした（ＺＣ２３°１＋ＺＣ２３２及びＺＣ
２３３＋ＺＣ２３４）、そのフラグメントは！！ｃｏＲ
ＩとＢａｗＨＩで切断された等モルのｐＵｃ１３と結合
させた。

その結合した混合物をＩＩ！、ｃｏＨのＪＭ８３株に形
質転換し、生じた明るい青色のプラークが選ばれ、配列
決定がされた。正しい挿入をもつプラスミドを選択し９
ＭＰＨ０５と名付けた。

ＰＨ０５配列はＴＰＩプロモーターおよびｔＰＡをコー
ドする配列と次のような方法で結合させた（第２０図）
。プラスミドｐＤＲ１２９６を旧ｎｄ■とＢｇｌ　ＩＦ
で消化し、ＴＰＩプロモーターとＴＦα１の配列を含む
プラスミドを精製して、ＨｉｎｄＩ［［とＢｇｌＩ［で
消化したｐＩＣ７にクローン化した。このクローンはさ
らにＥｃｏＲＩとＢｇｌ　ｆｆで制限処理されＭＦα１
のブリプロ配列を除去した。

プラスミドｐＭＰＨＯ５をＩ！ｃｏＲＩとＸｈｏ　ＩＩ
で消化し、ＰＨ０５のシグナル配列を精製した。そのシ
グナル配列はｐＤＲ１２９６フラグメントと結合させた
。その結果できたプラスミド（ｐＭＴＰＩＰＨ０５と命
名した）をｓｐｈ　ＩとＢｇｌ　ＩＩで消化し、ＴＰＩ
プロモーターとＰＨ０５配列を含むフラグメントが精製
された。そしてさらにｔＰＡ　　ｃＤＮＡ（ｐＤＲ１２
９６由来のＢｇｌ　Ｉｆ　−Ｘｂａ　　！フラグメント
）とｓｐｈ　ＩとＸｂａ　Ｉで消化したｐＵｃｌＢとと
もに三本が結合されｐＤＲ１２９４と命名するプラスミ
ドを生成した（第２０図）。

ＴＰＩプロモーター−ＰＨ０５−ｔＰＡ発現ユニットを
含むイーストの発現ベクターを調製するためにプラスミ
ドｐＤＲ１２９４をＳｐｈ　ｒとＸｂａ■で消化し、Ｔ
ＰＩ−ＰＨ０５−ｔＰＡフラグメントを精製し、ｐＤＲ
１１０７中に挿入することによってプラスミドｐＤＲ１
３９４を作った。さらにその発現ユニットはＢａｍＨ［
と旧ｎｄＩ［による消化によってｐＤＲ１３９４から単
離され、ゲルによって精製した。このフラグメントは実
施例１１に述べられた方法によってＹＥｐ　１３に挿入
され、プラスミド１）ＤＲ１４９４を作った。

Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＥ　８−１１　Ｃ株はｐＤＲ
１４９４で形質転換した。その菌株は６％グルコースと
０．１Ｍのフタル酸水素カリウム、ｐＨ５，５を含む一
１ｕｅ培地中で停止期まで培養した。ｔＰＡはＥＬ　Ｉ
　ＳＡ法およびフィブリン分解法により試験した。各々
の発現レベルは５２．８μｇ／ｌおよび１４．４μｇ／
ｌであった。

ｐＤＲ１４９４を、ｔＰＡ配列５′末端のＧＩｙ−Ａｌ
ａ−Ａｒｇをコードするコドンを欠失させる部位特異的
突然変異の誘発により変化させた。ｐＤＲ１３９４をｓ
ｐｈ　ＩとＸｂａ　Ｉで消化し、約１．９　ＫｂのＴＰ
Ｉ−ＰＨ０５−ｔＰＡのフラグメントをＭ１３ｍｐ１８
にサブクローンした。−末鎖のＤＮＡが調製されオリゴ
ヌクレオチドＺＣ４０３（”ＧＣＣＡＡＴ　　ＧＣＣＴ
ＣＴ　　ＴＡＣＣＡＡ　”）とアニールした。

二本目の鎖が伸長され、その混合物をＥ、ｃｏｌｉのＪ
Ｍ１０７株に感染させた。プラークはラベル化されたオ
リゴヌクレオチドＺＣ４０３とハイブリダイズすること
によってスクリーニングした。ラベルされたクローンか
らＤＮＡを精製し、希望する５′側のｔＰＡ配列の存在
を確証する為に配列決定を行った。変化を受けたｔＰＡ
フラグメントはＲＦを旧ｎｄＩ［ＩとＢａｍＨＩで消化
することによってＭ１３ベクターから除かれ、ｔＰＡ発
現ユニットを含むフラグメントはＹＥｐ１３に挿入され
てプラスミドｐＺＶ８４を作った。

Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＥ　８−１１　ＣはｐＺＶ８
４で形質転換をうけ、その菌株は６％のグルコースとｏ
、ＩＭのフタル酸水素カリウム、ｐＨ５，５を含む一１
ｅｕ培地中で、２８ｈｒ、３０℃で培養した。ＥＬｒＳ
Ａ法およびフィブリン分解試験により測定した発現レベ
ルは各々９６μｇ／ｌｌと６４μｇ／ｌであった。

実施例１６；ｔＰＡの発現の為の５ＵＣ２シグナルペプ
チドの使用 イーストの５ＵＣ２遺伝子は２つの型のインバターゼを
コードしており、その１つはシグナルペプチドをもつ前
駆体として合成されるグリコシル化された分泌タンパク
質である。ｔＰＡの分泌に５ＵＣ２のシグナルペプチド
を使うために、５ＵＣ２をコードする配列の一部をｔＰ
Ａをコードする配列と結合させ遺伝子の融合を行った。

合成オリゴヌクレオチドを使用して、５ＵＣ２のシグナ
ルペプチドの゛切断部位のすぐ隣にｔＰＡ配列の最初の
コドンがくるように間に介在するＤＮＡをとり除いた。

５ＵＣ２遺伝子はＥｃｏＲＩフラグメントとしてプラス
ミドｐ　Ｂ　Ｒ５８（Ｃａｒｌｓｏｎ　＆　Ｂｏｔｓｔ
ｅｆｎ、Ｃｅ１ｌｌ工：１４５−１５４．１９８２）か
ら得た。そのフラグメントは、ＤＮＡポリメラーゼ（Ｋ
ｌｅｎｏｗフラグメント）をつかってなまらされ、Ｂａ
ｍＨＩリンカ−と結合させた。そしてさらにＢａｍＨＩ
で切断しＮｃｏ　Ｉで部分消化した。５ＵＣ２プロモー
ターと５′側をコードした領域を含んでいるこのフラグ
メントは、予めＢａｍＨＩとＸｂａ　Ｉで切断したｐＵ
ｃ１２の中にｐＤＲ１２９９由来のＮｃｏ　１−Ｘｂａ
ＩｔＰＡフラグメントとともに結合させた。

ｐＨＫ１００２　（第２１図）と命名されたこのプラス
ミドはＢａｍＨＩとＸｂａ　Ｉで消化され、５ＵＣ２−
ｔＰＡフラグメントが精製された。このフラグメントを
、ＢａｍＨＩで線状にしたｙＥｐ　１３の中に、ｐＤＲ
１１００由来のＸｂａ　Ｉ　−ＢａｍＨＩＴＰＩターミ
ネータ−フラグメントとともに結合させた。この結合混
合物をＥ、ｃｏｌｉＲＲＩ株への形質転換に使用し、こ
のＡｍｐゝＴｅｔ”の形質転換体からのプラスミドは３
．１　ｋｂのＢａｔｍＨＥ　−ＢａｍＨＩ発現ユニット
の存在と配向に関してスクリーニングされた。ｐＨＫ１
１０２と命名された１つのプラスミドを選択し、Ｂａｍ
ＨＩとＸｂａ　Ｉで消化したのちに５ＵＣ２ｔＰＡフラ
グメントが精製された。

このフラグメントは、正確な５ＵＣ２シグナルペプチド
とｔＰＡの融合体を作るための、試験管内でループアウ
トした鋳型を生成するためにＭ１３ｍｐ１８（ＲＦ）中
に挿入された。その鋳型はすべての５ＵＣ２をコードす
る領域と５ＵＣ２−ｔＰＡ結合部位を正しく含んでいる
か否かを確かめるために配列決定がなされた。

５ＵＣ２とｔＰＡ配列の間の外来性のものをコードする
配列を除き、Ｇｕｙ−ｔＰＡとＳｅｒ　−ｔ　Ｐ、Ａの
部位の正しい融合が起こるようにＭ１３鋳型上での試験
管内ループアウトが作られた。オリゴヌクレオチドＺＣ
２３８およびＺＣ２３９（表３）がループアウトを起こ
すのに使われた。５ＵＣ２−ｔＰＡブラグメントをＢａ
ｎ＋Ｈ［−Ｘｂａ　ＩフラグメントとしてＭ１３ＲＦＤ
ＮＡから単離し、ＢａｍＨｌで切断したＹＥｐ　１３に
ＴＰＩターミネータ−（ｐＤＲｌｌｏｏのＸｂａ　Ｉ　
−ＢａｍＨＩフラグメント）とともに結合した。プラス
ミドｐＨＫ１２０２とｐＨＫ１２０５はＢａ＋ｍＨ１部
位に互いに反対方向の配向で挿入した５ＵＣ２−Ｇｕｙ
　ｔＰＡユニットを含んでおり、プラスミドｐＨＫＬ３
０２とｐＨＫ１００２ ＳｅｒｔＰＡユニットを含んでいる。

ＴＰＩプロモーターは上述の調製物の中の５ｕＣ２プロ
モーターと置換された。そのような融合物を含むプラス
ミドは旧ｎｄＩ［ｒとＸｂａ　Ｉで消化し、その５ＵＣ
２−ｔＰＡフラグメントを精製した。そしてこのフラグ
メントをＮｃｏ　Ｉ−旧ｎｄｌアダプター（配列：　（
ＣＡＴＧＣＴＴＴＴＧＣＡＧ’　Ａ’　Ａ’　Ａ’　Ａ
’　Ｃ’　ＧＴＴ（とｐＤＲ１３９９からのＮｅｏ　Ｉ
　−Ｘｂａ　Ｉベクターフラグメント（ＴＰＩプロモー
ターとターミネータ−配列を含む）とに結合した。

その結果できた中間体をＳｐｈ　ｒとＸｂａ　Ｉで消化
しＴＰＩプロモーター−ｔＰＡのフラグメントが精製さ
れＭ１３ｍｐ８にサブクローンした。そしてその結合部
分の配列を確かめる意味で配列決定がなされた。その中
間体からの発現ユニットがＢａａＨＩによる消化とＢｇ
ｌ　ＩＩによる部分消化によって除かれＹＥｐ　１３に
サブクローンされた。その結果生じたイーストのベクタ
ーをｐＨＫ１２１２（Ｇｌｙ−Ａｌａ　−Ａｒｇ　−５
ｅｒ　−ｔＰＡの発現ユニットをもつ）およびｐＨＫ１
３１２（Ｓｅｔ−ｔＰＡの発現ユニットをもつ）と命名
した。

ＴＰＩプロモーターは種々の調製のためにＥｃ。

ＲＩ部位の付加という変化を受けているので、本来のＴ
ＰＩプロモーターの配列もしくは強力なイストプロモー
ターに一般にみられる共通した配と著しく異なる配列を
もつ。それゆえ、Ｉ）ＨＫ、ＧＡ）３１２由来のプロモ
ーター配列は各々オリゴヌレオチドＺＣ３７５とＺＣ３
７６（表３）を使して天然の、もしくは共通の配列への
試験管内の変異を起こされた。この変異は配列決定にょ
て検証され、変化を受けたプロモーター配列はＥｐ　１
３中の発現ユニットの残りの部分に結合部た。ｐＨＫ１
３２２及びｐＨＫ１３２２と命したこれらのプラスミド
は天然のＴＰＴ配列とｄのプロモーター配列を各々含ん
でいる。

プラスミドｐＨＫ１２１２、ｐＨＫ１３１２、ＨＫ１３
２２およびｐＨＫ１，３２２はＳ。

ｒｅｖｉｓｉａｅ　Ｅ　８−１１　Ｃ株に形質転換され
た。

の菌株は２％グルコースを含む一１ｅｕ培地中で殖した
。阻菌株抽出物はＥＬｒＳＡ法およびツブリン分解法に
よって発現レベルが測定され、果は以下にまとめた。

ｐＨＫ　１２１２　　　　２０　ｈｏｕｒｓ　　　　　
１８．４　　　　０ｐＨＫ　　１３１２　　　　２０　
ｈｏｕｒｓ　　　　　３２　　　　　５４ｐＨＫ　　１
３２２　　　　２０　ｈｏｕｒｓ　　　　　３８　　　
　　４０ｐＨＫ　　１３３２　　　　２０　ｈｏｕｒｓ
　　　　　３２．８　　　３８実施例１７；遺伝子内ｔ
ＰＡのプレプロ配列の使用 成熟ｔＰＡは細胞内で合成され分泌の過程でとり除かれ
るリーダーペプチドを含む一次！ｌｉ１訳生成物からつ
くられる。成熟したタンパクをコードする配列とともに
ｔＰＡのシグナル配列を含むイーストの発現ベクターを
調製した。

シグナル配列の最初のコドン（ＡＴＧ）の５′側に隣接
してＢａｍＨＩとＮｃｏ　Ｉの切断部位がある。、そし
て５′末端にはＢｇｌＩＩに（５ａｕ３　Ａ、　Ｘｈｏ
ｌＩ）の切断部位がある。天然のリーダー配列はその中
央付近にうまい制限部位をもたないが、ＣＧＡＣＣＡ（
アノミ酸２０と１９のＧｌｙ−Ａｌａをコードする）を
ＧＧＣＧＣＣに変えればアミノ酸配列を変えずにＨａｓ
　ｍとＮａｒ　Ｉの制限部位が導入できる。

Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のモデル３８
０−Ａ合成機を使って次に示すオリゴマーを合成した。

ＺＣ１３１：　”　ＧＧＡ　ＴＣＣＡＴＧ　ＧＡＴ　Ｇ
ＣＡ　ＡＴＧ　ＡＡＧ　ＡＧＡＧＧＧ　ＣＴＣＴＧＣＴ
ＧＴ　ＧＴＧ″′ＺＣ１３２：　’　”ＴＧＧ　ＣＧＣ
ＣＡＣＡＣＡ　ＧＣＡ　ＧＣＡ　ＧＣＡ　ＣＡＣＡＧＣ
ＡＧＡＧ３′ ＺＣ１３３：　”　ＧＧＣＧＣＣＧＴＣＴＴＣＧＴＴ　
ＴＣＧ　ＣＣＣＡＧＣＣＡＧ　　ＧＡＡ　　ＡＴＣＣＡ
ＴＧ”ＺＣ１３４：　　”　　ＡＧＡ　　ＴＣＴ　　Ｇ
ＧＣＴＣＣＴＣＴ　　ＴＣＴ　　ＧＡＡ　　ＴＣＧＧＧ
ＣＡＴＧ　ＧＡＴ　ＴＴＣＣＴ３’１２塩基が重複する
ようにオリゴマーＺＣ１３１とＺＣ１３２をアニールし
たくセクション１）。

また１２塩基が重複するようにオリゴマーＺｃ１３３と
ＺＣ１３４をアニールした（セクションン２）。

オリゴマーをＰｏｌ　Ｉ緩衝液（ＢＲＬ）にとがし６５
℃で５分間保温した。それからゆっくり室温にもどして
アニールのために４ｈｒ放置した。ＤＮＡエリメレース
１０ユニットを加えて室温で２ｈｒ反応させた。その反
応液は生成物を大きさ別に分画するために８％アクリル
アミドの尿素変性シーフェンシングゲルで１００ＯＶ、
０．５〜２時間電気泳動した。正しい大きさのフラグメ
ント（ポリメレース反応が完結したもの）をゲルから切
り出し、抽出した。

アニールの後、セクション１をＢａｇ　ＨＩとＮａｒＩ
で切断し、Ｂａ１ｌＩＨＩとＮａｒ　Ｉで切断したｐＵ
Ｃ８にクローンした（ＶｉｅｉｒａとＭｅｓｓｉｎｇＳ
Ｇｅｎｅｓ１９ｉ２５９−２６８．１９８２およびＭｅ
ｓｓｉｎｇ　。

Ｍｅｔｈａｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙ＋＋ｏｌｏｇｙ　ｓ　
Ｉ　Ｇ　１　；　２０−７７．１９８３）、セクション
２はアニール後、Ｎａｒ　１とＢｇｌＩ［で切断し、Ｂ
ａｎ＋　ＨＩとＮａｒ　Ｉで切られたｐＵｃ８にクロー
ンした。コロニーは適切にラベル化したオリゴヌクレオ
チドでスクリーニングした。コロニーハイブリダイゼー
シツンでポジティブなプラスミドの配列を解析し、正し
い配列がクローンされたかどうかを検証した。

セクション１は適切なｐＵＣクローンをＢａＩＩＨＩと
Ｎａｒ　Ｉで切断して精製され、セクション２はＮａｒ
ＩとＸｈｏ　ｆ［の消化物から精製された。２つのフラ
グメントをＮａｒ　Ｉ切断部位で結合しＢａｍＨＩで切
断したｐＵＣ８にクローンした。

プリプロ配列をＮｃｏｌ　−５ａｎ３Ａフラグメントと
してｐＵＣベクターからとり除き、ｐ　Ｄ　Ｒ１２９６
由来のＢｇｌ’ＩＩ　−Ｘｂａ　Ｉ　　ｔＰＡ　ｃＤＮ
ＡフラグメントおよびｐＤＲ１２９６由来のＳｐｈ　Ｉ
　−Ｎｃｏ　Ｉ　ＴＰＩプロモーターフラグメントと結
合した。生じたフラグメントをｓｐｈ　ＩとＸｂａ　Ｉ
で切断したｐＵＣ８に挿入し、その調製物をｐＤＲ１２
９５と命名した。

イーストの発現ベクターｐＤＲ１４９５をｐＤＲ１２９
５から、例１５でｐＤＲ１４９４に対して述べたのと同
様な方法で調製した。このプラスミドをＳ、ｃｅｒｅｖ
ｉｓｉａｅのＥ８−１１ｃ株に形質転換し、その菌株は
２％のグルコースを含む一１ｅｕ培地で増殖した。１６
時間後、細胞抽出物はＥＬ　Ｉ　ＳＡ法およびフィブリ
ン分解法によってｔＰＡの試験に課せられた。発現レベ
ルは各々４．０μｇ／ｌと５．２μｇｅｌであった。

実施例１８１ＢＡＲ１−ｔＰＡの融合体を含む発現ベク
ター ｔＰＡをコードする配列をＳ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの
ＢＡＲ１遺伝子に結合した。この調製物は、適正なジス
ルフィド結合を生じ、分泌経路へと導びくシグナルペプ
チドを含む一次翻訳生成物をコードしている。

イーストのＢＡＰＩ遺伝子はバリヤーとして知られる分
泌ポリペプチドをコードしている。グリコシル化されて
いると考えられているこのポリペプチドは接合型の細胞
を、α−ファクターによって誘導されるＧＥによる捕縛
に打ち勝たせることができる。ＢＡＲ１の一次翻訳生成
物の最初の２０から２４番目のアミノ酸配列は、既知の
イーストや捕乳類のシグナルペプチドの配列と同じよう
だ。いくつかの切断部位が一次翻訳生成物の中に潜在的
に存在している。

ｔＰＡをコードする配列をＢＡＲＬのアミノ酸１７７−
１７８　（潜在的なプロセッシング部位）の部位もしく
は便利なりｇｌＩＩの切断部位（ＢＡＲ上の１１４１４
番目ミノ酸）のＡｒｇ　−Ａｒｇ配列に融合させた様な
りＮＡ１！ｉ製物の生成を計画した。

ＢＡＲ１遺伝子を、ＹＥｐ　ｌ　３のベクターに全イー
ストの遺伝子をクローンしたものを含むプラスミド・プ
ールから単離した（　Ｎａｓｍｙｔｈ　　＆Ｔａｔｃｈ
ｅ１１ＳＣｅｌｌ上９；７５３−７６４．１９８０）。

そのプラス゛ミドブールをＳ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの
ｘＰ６３５−１０株（ＭＡＴａ　　ｌｅｕ　２−３　１
ｅｕ　２−１１２ｂａｒ　１−２　ｇａｌ　２　；　Ａ
ＴＣＣ＃２０６７９）に形質転換し、そのうちロイシン
プロトトロフィーがあるものを選択し、さらにバリヤー
活性体を分泌する能力のあるものがスクリーニングされ
た（α−ファクターによる阻害とは逆に）。２つのコロ
ニーがこれらの性質をもっているとわかり、そこからプ
ラスミドを単離してｐＢＡＲ２とｐＢＡＲ３と命名した
。

これら２つの形質転換体から単離したプラスミドＤＮＡ
をＥ、ｃｏｌｉのＲＲＩ・株に形質転換した（ＡＴＣＣ
＃３１３４３）。形質転換体はアンピシリン耐性で選択
された。プラスミドｐ　ＢＡＲ２とｐＢＡＲ３をＬｃｏ
ｌｉの形質転換体から精製し、制限酵素による消化とア
ガロースもしくはアクリルアミドゲル電気泳動により特
性づけた。プラスミドｐＢＡＲ２は約９．２ｋｂの挿入
物を含むことが分った。プラスミドｐＢＡＲ２で形質転
換したＥ、ｃｏｌｉのＲＲＩ株は受理番号３９４１０で
八ＴＣＣに保管されている。サブクローニングによって
ｐＢＡＲ３はｐＢＡＲ２の挿入物の一部を含むがベクタ
ー中で逆方向の配向をもつことが分り、さらにサブクロ
ーニングとバリヤー分泌によるスクリーニングで機能性
のＢＡＲ１遺伝子配列が約２．７５ｋｂの領域に存在す
ることが分った。このフラグメントはタンパクコード配
列、非翻訳転写配列、プロモーター、制御領域、転写タ
ーミネータ−及びブランキング染色体配列を含む。

プラスミドｐＢＡＲ２を制限エンドヌクレアーゼ旧ｎｄ
ｌ［［とＸｈｏ　Ｉで消化し、およそ３ｋｂのフラグメ
ントをアガローズゲル電気泳動で精製した。このフラグ
メントを、旧ｎｄｌ［ＩとＳａｌ　Ｉで消化したプラス
ミドｐＩＪｃ１３に挿入した。でき上った組み換えプラ
スミドをｐＺＶ９と命名し、Ｅ、ｃｏｌｉの形　。

質転換に使うことができたがイーストベクターにとって
必要な複製オリジンと選択マーカーを欠いている。

ｔＰＡを発現させるのにＢＡＰＩ配列を使うため、まず
ＢＡＲＩ遺伝子をイーストのＡＤＨ１プロモーター“と
結合させた。（第２２図）プラスミドｐＡ　Ａ　Ｈ５（
Ａａｍｅｒｅｒ　ｓ　Ｍｅｔｈ、　ｉｎ　Ｅｎｚｙｎ＋
ｏｌｏｇｙ　。

１０１．１９２−２０１．１９８３）を旧ｎｄｕ［とＢ
ａｍＨＩで消化し、約１．４ｋｂのフラグメントを単離
した。それをｐＵｃ１２由来のｔ！ｃｏＲＩ　−Ｈｔｎ
ｄＩＩ［ポリリンカーとともに、ＥｃｏＲＩとＢａａ＋
ＨＩで消化したｐＢＲ３２２の中に挿入し、プラスミド
ｐＡＭ５を作った。ｐＡＭ５をｓｐｈ　ＩとＸｂａ　Ｉ
で切断し、約４５０ｂｐのＡＤＨＩプロモーターフラグ
メントを単離した。プラスミドｐＺＶ９をＸｂａ　Ｉで
切断し、約２ｋｂのＢＡＲ１フラグメントを精製した。

それら２つのフラグメントを、予めＳｐｈ　ｒとＸｂａ
Ｉで線状にしておいたＹＥｐ　１３と結合した。

ＡＤＨＩプロモーター由来のＢＡＲ１配列の発現にとっ
て、正しい配向のフラグメントをもつプラスミドはｐＺ
Ｖ２４と命名した（第２２図）。

さらにＢＡＲｌのＢｇｌＩＩ部位でＳｅｔ　−ｔＰＡを
コードする配列と結合したＢＡＲ１配列をもつプラスミ
ドを調製した（第２３図）。ｐＤＲ１１０７とｐＤＲ１
２９６はＥ、ｃｏｌｉＧ　−４８（ｄａｍ　−）に形質
転換された。プラスミドの精製後、Ｘｂａ　Ｉ用緩衝液
中Ｘｂａ　ＩとＢａｍＨＩで切断した。ｐＤＲ１１０７
由来の６００ｂｐのＴＰＩターミネータ−フラグメント
とｐＤＲ１２９６由来の４．３ｋｂの（ｔＰＡ＋ベクタ
ー）フラグメントをゲルにより精製し、この２つのフラ
グメントを室温、１晩反応させて結合させ、Ｅ、ｃｏｌ
ｔＲＲｌへの形質転換に使用した。形質転換体よりプラ
スミドＤＮＡを精製し、そのＤＮＡをＸｂａ　Ｉ用緩衝
液中、Ｘｂａ　１とＢａｍ　ＩＩで消化し誤りのないこ
とを確かめた。そのうちひとつのクローンをｐＪＨ３３
と命名した。

プラスミドｐＪＨ３３をユニ緩衝液中Ｂｇｌ　ＩＩとｓ
ｐｈ　Ｉで消化した。また、ｔＰＡ−ＴＰＩターミネー
タ−とベクターを含む５．１ｋｂのフラグメントをゲル
により精製した。ｐＺＶ２４をユニ緩衝液（０，０５Ｍ
）リスｐＨ７，４，０，００６Ｍ塩化マグネシウム、０
．０５Ｍ塩化ナトリウム）ｔ７ｓｐｈｌとＢｇｌ　ｎで
切断し、ＡＤＨＩプロモーターとＢＡＲＩ領域を含む８
００ｂρのフラグメントをゲルにより精製した。５．１
　ｋｂのＢｇｌ　Ｉ　−ｓｐｈ　Ｉフラグメントと８０
０’ｂｐ（ＤｐＺＶ２４由来ＡＤＨ１プロモーター−Ｂ
ＡＲ１フラグメントとを室温で１晩結合反応させ、その
結合反応物をＥ、ｃｏｌｉ　ＲＲｌに形質転換した。プ
ラスミドＤＮＡはｓｐｈ　Ｉ　＋　Ｂｇｌ　ＩＩおよび
Ｓｐｈ　Ｉ　＋　ＢａｍＨＩによる消化によってスクリ
ーニングした。正しいプラスミドがひとつ選らばれｐ　
ＪＨ３５と命名された。

ＢＡＲＩの１０２５番の位置（１１４番目のアミノ酸）
でＢＡＲ１配列を融合させたＬＰＡ配列を含むイースト
のプラスミドｐＪＨ３９が調製された。この融合体は、
ｔＰＡのＳｅｔの５′側の部位に＾ｒｇ残基の再生を伴
うべ（、、５ｅｔ−ｔＰＡに結合したバリヤーポリペプ
チドの一部分を含む一次翻訳生成物を作る。ｐＪＨ３９
を調製するためにユニ緩衝液中でｐＪＨ３５とＹＥｐ　
１３をｓｐｈ　ＩとＢａｍ　ＨＩで切断した。ＹＥｐ　
１３フラグメントとｐ　ＪＨ３５由来の３ｋｂ挿入物（
ＡＤＨＩプロモーター、ＢＡＲ１−ｔ　ＰＡ結合配列お
よびＴＰＩターミネータ−を含む）をゲルにより精製し
、１晩結合反応を行った。生成したプラスミドはｐＪｌ
（３９と命名した（第２３図）。

ＢＡＲＩのＡｒｇ　　Ａｒｇのところの潜在的なプロセ
ッシング部位でＧｌｙ　−Ａｌａ　−Ａｒｇ　−Ｓｅｒ
　−ｔＰＡの配列と結合したＢＡＲＩ配列をもつ２ケ目
の発現ベクターが調製された（第２４図と２５を参照）
。

ｐＤＲ１２１９をＮｃｏ　Ｉで切断し、そのフラグメン
トをＤＮＡポリメラーゼＩ　　（Ｋｌｅｎｏ−フラグメ
ント）とｄＮＴＰでなまらし、リン酸化した５ａｌＩリ
ンカ−と結合した。結合反応物はＸｂの■用緩衝液中、
５ａｉｌとＸｂａ　Ｉで一晩インキユベートし消化した
。１．６　ｋｂのフラグメントがＮＡ４５メンブレンを
使ってゲルにより精製された。またｐＵＣ１３をＸｂａ
　Ｉ用緩衝液中５ａｌＩとＸｂａ　Ｉで切断し、ＮＡ４
５メンブレンを使用してゲルにより精製した。２．７ｋ
ｂのｐＵｃ１３フラグメントと１．６ｋｂのｔＰＡフラ
グメントの結合を室温で１晩行ない、Ｅ、ｃｏｌｉのＪ
Ｍ８３に形質転換させた。２ｍβスケールの迅速なプラ
スミドの調製が各形質転換体に対して行なわれた。これ
らをＸｂａ　ｒ用緩衝液中Ｘｂａ　Ｉと５ａｌＩで切断
し、正しいクローンであることを確認′した。１つの正
しいプラスミドが選ばれｐ　ＪＨ６と命名された。

ＢＡＲＩとｔＰＡの配列を結合させた。ｐＺＶ９を旧ｎ
ｄｌｌｒ用緩衝液中旧ｎｄｌＩ［と５ａｌＩで切断した
。

そして、１．７５ｋｂのＢＡＲ１フラグメントをゲルに
より、ＮＡ４５メンブレンを使用して精製した。

ｐＪＨ６をユニ緩衝液（０，０５Ｍ）リスｐＨ７，４，
０，００６Ｍ塩化マグネシウム、０．０５Ｍ塩化ナトリ
ウム）中、旧ｎｄＩＩ［とＳａｌ　Ｉで切断し、ＮＡ４
５メンブレンを使ってゲルにより精製した。１．７５ｋ
ｂのＢＡＲ１フラグメントと４．３ｋｂのｔ　ＰＡ＋ｐ
Ｕｃ１３フラグメントの結合を室温で一晩行ない、Ｅ、
ｃｏｌｉ　Ｊ　Ｍ　８３に形質転換させた。プラスミド
ＤＮＡを精製したのち、正しいクローンであることの確
認のためにユニ緩衝液中Ｂｇｌｆｆで切断した。１つの
クローンが選ばれ、ｐＪＨ１８と名づけられた。Ｂｇｌ
Ｉｉによる消化でｐＪ）（１８から発生した４００ｂｐ
のフラグメントをＮＡ４５メンブレンを使ってゲルによ
り精製した。ｐＩｃ１９Ｈをユニ緩衝液中Ｂｇｌｎで切
断し、４００ｂｐのＢＡＲ１−ｔ　ＰＡフラグメントと
の結合を室温で一晩行ない、Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｊ　Ｍ　８
３に形質転換した。

形質転換体からの’１ｍｌプラスミド精製が行なわれた
。そのＤＮＡをユニｌｌｌ上液中ＨｉｎａＴＩＩとＢａ
ＩＩＩＨＩで切断し、また同緩衝液中ＢａｍＨＩと５ａ
ｉｌで切断することによって正しいクローンであること
のｂｍ認と挿入物の配向が決定された。正しいクローン
がひとつ選ばれｐ　ＪＨ２０と命名された。

ＢＡＲｌとＧｌｙ−Ａｌａ−Ａｒｇ−５ｅｒ−ｔＰＡの
配列を正確に結合した。ｐ　ＪＨ２０をユニ緩衝液中旧
ｎｄｌｌｌとＢａｍ　ＨＩで切断し、４００ｂｐのＢＡ
Ｒ１−ｔ　ＰＡフラグメントをＮＡ４５メンブレンを使
ってゲルにより精製した。Ｍ　１．３　ｍρ１８をユニ
緩衝液中旧ｎｄ［［とＲａｍ　Ｈ１により切断し、ＮＡ
４５メンブレンを使用してゲルにより精製した。このベ
クターフラグメントと４ｏｏｂｐのＢＡＲ１−ｔ　ＰＡ
フラグメントの結合反応を室温で一晩行った。この結合
反応物をＥ、ｃｏｌｔ　Ｊ　Ｍ　１０１に形質転換した
。

プラークからＲＥＤＮＡを調製して、正しいクローンで
あることの検証のためにユニ緩衝液中Ｂｇｌ■で消化し
°た。１つのクローンが選ばれｍｐ１９−ＪＨ２３と命
名された（第２４図）。ｍｐ１９−ＪＨ２３から鋳型Ｄ
ＮＡが調製され、配列が決められた。ブライマーとして
オリゴヌクレオチドＺＣ３５４とＺＣ８７（表３）を使
ってｍｐ１９−ＪＨ２３にループアウト突然変異の誘発
がなされた。正しいと思われるプラークからＲＦを調製
し、その正当性を確かめるためにＢｇｌ　ＩＩで切断し
た。

正しいと思われるプラークは配列決定がなされ望ましい
ＢＡＲｌ　−ｔ　ＰＡの結合配列をもつクローンをｍｐ
１９−ＪＨ４２と命名した。

第２５図に示したように、ＢＡＲＩ−ｔＰＡ融合調製物
が、ひき続き種々の取扱いができるようにｐＵＣ型のプ
ラスミドに挿入された。ファージｍｐｌ９−ＪＨ４２と
プラスミドｐＩｃ１９Ｈ（ｐＵｃ９のＥｃｏ　ＲＩ部位
に挿入した、第１１図に示すポリリンカー配列を含む）
をＢｇｌｎで切断し、線状化されたプラスミドとおよそ
２００ｂｐのＢＡＲ１−ｔＰＡフラグメントをゲルによ
り精製した。線状化したプラスミドが再び結合しないよ
うに、子牛の腸由来のホスファターゼで処理され、ＢＡ
Ｒｌ−ｔＰＡ融合フラグメントと結合させた。できたプ
ラスミドはｐＪＨ４６と命名した。Ａｒｇ−Ａｒｇコド
ンの部位でｃｔｙ−＾１ａ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−ｔＰＡ配
列と融合したＢＡＲＩ配列を含むイーストベクターを調
製した。それは次のような方法で作った。ユニ緩衝液中
、プラスミドｐＪＨ４６をＢｇｌｌＩで切断し、およそ
２００ｂｐのＢＡＲＩ−ｔＰＡ融合フラグメントをゲル
で精製した。プラスミドｐＪＨ３５をＢｇｌｍで線状に
し、ゲルで精製し、子牛の腸ホスファターゼで処理した
。この二つのフラグメントの結合反応を一晩行ない、そ
のクローンが制限エシドヌクレーアーゼ消化によりスク
リーニングされた。望ましいパターンを示すプラスミド
をｐＪＨ５１と命名した。プラスミドｐＪＨ５１とＹＥ
ｐ１３をユニ緩衝液中、ｓｐｈ　ＩとＢａｍＨＩで消化
した。ＹＥｐ１３ベクターフラグメントと３．１　ｋｂ
のＡＤＨｌ−ＢＡＲｌ−ｔＰＡ−ＴＰ　Ｉターミネータ
−フラグメントをゲルで精製し、１晩結合反応を行って
発現ベクターｐＪＨ５２を作った（第２５図）。

三番目のＢＡＲｌ−ｔ　ＰＡ発現ベクターが調製された
（第２６図）、それは、＾ｒｇ−Ａｒｇの潜在的なプロ
セッシング部位でｔＰＡのＳｅｔ型と結合するＢＡＲ１
配列をコードしている。

ユニ緩衝液中、プラスミドｐＪＨ６をＸｂａ　ＩとＢｇ
ｌｎで切断し、約２．７ｋｂのベクター−ｔＰＡフラグ
メントをゲルにより精製した。ｐＤＲ１２９６ＤＮＡを
Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｇ　−４８（ｄａｍ−）の形質転換体か
ら精製し、Ｘｂａ　ｒ用の緩衝液中Ｘｂａ　ｒとＢｇｌ
ｎで切断した。１．６ｋｂのｔＰＡフラグメントをＮＡ
４５ペーパー使ってゲルにより精製した。

２、７　ｋｂのベクター−ｔＰＡフラグメントと１．６
　ｋｂのｔＰＡフラグメントの結合反応は室温で一晩行
なわれ、Ｅ、ｃｏｌｉのＲＲＩに形質転換させた。生成
したプラスミドはｐ　ＪＨ３２と命名した。

ｍｐｌ９−ＪＨ２３とｐ　ＪＨ３２をユニ緩衝液中、Ｂ
ａｍ　ＨＩとＳａｌ　Ｉで切断した。ｍｐｌ９−ＪＨ２
３由来の６．５ｋｂのＢＡＲ１−ｔ　ＰＡ−ｍｐｌ　９
フラグメントと１．６　ｋｂのｐＪＨ３２由来のｔＰＡ
フラグメントをゲルで精製した。この２つのフラグメン
トの結合反応を室温で一晩行い、その結合反応物はＥ、
ｃｏｌｉ　Ｊ　Ｍ　１　（）　１に形質転換された。Ｒ
Ｆが調製され、クローンの正しさを確認検証するために
ユニ緩衝液中、５ａｉｌとＢａｍＨＩで切断された。

クローンのひとつが選択され、ｍｐｌ９−ＪＨ３Ｂと命
名された。このクローンの配列決定を行ってもう一度こ
のクローンの正当性を確認した。ＢＡＲｌとｔＰＡの配
列の望ましい結合を得るために、。

変異性のプライマーとしてオリゴヌクレオチドＺＣ３６
５および２つ目のプライマーとしてＺＣ１５１（表３）
を使って、ｍｐｌ９−ＪＨ３８上にループアウト突然変
異が誘発された。ＲＦＤＮＡが正しいと思われるクロー
ンから調製され、Ｈｔｎｄ■用緩衝液中、Ｎａｒ　Ｉお
よびχｂａＩ＋８ｇ１ｌＴによる消化によってスクリー
ニングされた。ひとつの正しいクローンをｍｐｌ９−、
ＪＨ４３と命名した。

ｍｐｌ９−ＪＨ４３から鋳型ＤＮＡを調製し、配列解析
によってループアウトを確認した。ファージ１Ｉｐ１９
−ＪＨ４３とプラスミドｐＵｃ１３をユニ緩衝液中、“
Ｘｂａ　ｒと１ｌｉｒｒｄｌｌｌで切断した。そのプラ
スミドと１．８　ｋｂの融合フラグメントを上述の方法
で精製し、両者を結合してｐＪＨ４７を調製した。

ＢＡＲＩのＡｒｇ−Ａｒｇコドンの部位（１２１２番）
で５ｅｔ−ｔＰＡの配列を結合させたＢＡＲＩ配列を含
むイーストのプラスミドをｐ　ＪＨ４９と命名した。

それは次のような方法で行なわれた。１．８ｋｂのＢＡ
Ｒ１−ｔ　ＰＡ融合フラグメントをＮＡ４５ペーパーを
使って、ゲル電気泳動によりｐＪＨ４７のＸｂａ　Ｉ　
＋　ＢｇＩ　ｎ消化物から精製した。８００ｂｐの５ｐ
ｈｌ　−ＢｇｌｌＩ　（ＡＤＨｌプロモーター−ＢＡＲ
ｌ）フラグメントを同様の方法でｐＺＶｊ４から単離し
た。これらのフラグメントと、ｐＪＨ３５由来のＳｐｈ
　Ｔ　−Ｘｂａ　Ｉの二重消化物から精製したベクター
−ＴＰ　Ｉターミネータ−フラグメントの三つのフラグ
メントが結合された。生成したプラスミドをｐＪＨ４８
と命名した。さらにユニ緩衝液中、プラスミドｐＪＨ４
８をｓｐｈ　ＩとＢａｍＨＩで切断した。３．４ｋｂの
（ＡＤＨＩプロモーター−ＢＡＲ１−ｔ　ＰＡ−ＴＰ　
Ｉターミネータ−）フラグメントをゲルにより精製し、
Ｓｐｈ　ｒとＢａ＋ｗＨＩで消化したＹＥｐ１３に結合
させた。生成した発現ベクターはｐＪＨ４９である（第
２６図）。

イーストの発現ベクターｐＪＨ３９、ｐＪＨ４９および
ｐＪＨ５２はＳ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＨ８−１１
Ｃ株への形質転換に使用した。菌株は０．１Ｍフタル酸
水素カリウムｐＨ５，５と６％のグルコースを含む−Ｌ
ｅｎ培地で増殖され、阻抽出物はＥＬ　Ｉ　ＳＡ法及び
フィブリン分解法により試験された。得られた結果を以
下に示す。

Ｈ８−１１Ｃ／ｐＪＨ３９２６ｈｏｕｒｓ　　　　２０
．８　　　　２２．４Ｅ８−ＬＩＣ／ｐＪｌ（４９２６
ｈｏｕｒｓ　　　　　４．９　　　　９．４８８−１１
Ｃ／ｐＪＨ５２２６ｈｏｕｒｓ　　　　　４．０　　　
　１１．Ｑ配　ｉ　　　　配ピ　令 ＧＡ２０　　　　１９０−２５９ Ｚ２９　　　　２１１−３７８ Ｚ８８　　　　３６２−５２７ Ｚ８９　　　　５１８−６８７ ＴＣ４８−６８２３−９９０ ｚ９１　　　　１１３６−１２８９ Ｃ，３４８−７ＲＥＶ　　１２０２−１０１８Ｚ９２　
　　　１１３６−１２８９ ＲＩ−ＨＩＮＤＩＩＩ　　１２７９−１４８９Ｚ９３　
　　　１４７９−１６４８ ＬＡＣ１８０５−１６３０ １６配列は、ｐｔｒｃｗのＸｈｏ　ＩＩ消化物由来のｔ
ＰＡ！２３　　内部のｔＰＡＥｃｏＲＩフラグメントは
ＥｃｏＲＩ　゛。

３、　　Ｅｃｏ　ＲＴ−ＨｉｎｄｎＩフラグメントは（
ＥｃｏＲＩ　＋１４、プライマーの向きは５’−３’の
方向で書かれ−・ニバーサル・シークエンジングプライ
マーのこく刹−賜 Ｘｈｏ　　ＩＩ−Ｘｈｏ　　ＩＩ’　　　　　　　　　
　　　　　　　Ｍ　１　３Ｘｈｏ　　ＩＩ−Ｘｈｏ　　
ＩＩ’　　　　　　　　ＴＣＴＴＡＣＣＡＡＧＴＧＸｈ
ｏ　　ＩＩ−Ｘｈｏ　　ＩＩ’　　　　　　　　ＴＧＣ
ＡＧＣＧＡＧＣＣＡＡＧＧＸｈｏローＸｈｏ　ＩＩ’　
　　　　ＡＣＧＴＧＧＡＧＣＡＣＡＧＣＧＸｈｏ　　Ｉ
Ｉ−Ｘｈｏ　　ＩＩ’　　　　　　　　ＣＣＡＩＣＡＣ
Ｔ　ＣＡＡＡＧＣＣＣＥｃｏ　Ｒ１−Ｅｃｏ　ＲＩ”　
　　　　　　　　　　　　　　　Ｍ　Ｌ　３Ｘｈｏ　　
ＩＩ−Ｘｈｏ　　ＩＩ’　　　　　　　　ＣＣＣＴＣＣ
ＴＧＣＴＣＣＡＣＣＥｃｏ　Ｒ１−ＩＥｃｏ　ＲＩ”　
　　　　　　　　　　　　　　　　Ｍ　１３Ｘｈｏ　　
ＩＩ−Ｘｈｏ　　ＩＩ’　　　　　　　　ＧＧＧＧＧＣ
ＡＴＡＣＴ　ＣＡＴＣＥｃｏ　Ｒ１−旧ｎｄ　ＩＩＩ’
　　　　　　　　　　　Ｍ　１３Ｘｈｏ　　ＩＩ−Ｘｈ
ｏ　　ＩＩ’　　　　　　　　ＴＡＴＴＣＧＧＡＧＣＧ
ＧＣＴＧＸｈｏ　　ＩＩ−Ｘｈｏ　　ＩＩ’　　　　　
　　　　　　　　　　　　Ｍ　１　３己列をＭ１３ｍｐ
ＩＩ中に挿入して作った調製物から得られた。

コ消化したＭ１３ｍｐＨにサブクローンされた。

１ｎｄｎＩ）で消化したＭ１３ｍｐＨにサブクローンし
た。

：いる。Ｍ１３とはＢｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃ
ｈ　Ｌａｂ、のＭ１３の為のユ＝である。

ζコ　　　（り ｌ＋Ｉ　　Ｃ５（Ｊ　　　？　　　（ｊ　　　ω　　Ｑ
　　−←　　ロ　　υ　　く　　←　　←（昭←ω（コ
←ζり（り（Ｃ（り←←−り（ζコ←　　←　　ω　　
←　　←　　←　　←　　Ｑ　　＋、！Ｉ　　ｌ−Ｉ　
　ｔ−３ロ　　υ　　←く←ｃ５（＜ωく口←くωく口
← ←Ｑ（コ（（輻ζコ（り（コ←←ζコ←くく口８口ω〈
←く←←←ω口くω 口←（く−ロくυＱ←口ｕく口 ←　　υ　　←　　ω　　Ｑ　　Ｃ５←　　＜＜＜　　
　ロ　　←　　く　　くｃ＋）ｔ＋！５０←ωロロく←
ω←←Ｑく（りω←←ζコ←（りυω（昭ωωζコ−Ｃ
←（り−昭＜（りυ←ｌ＋）−り（＃−１（！−ｔ−ｇ
トロ（Ｊ　＜　ｕ←←−←ＣＪ　４　ＣＪ←υ−一〜り
寸ψ■呻叩ト啼りの口 Ｌ！３ののりののの■口■のＣトド −へ〜〜〜へ〜６〜へのののの ｕｕｕｕＯＱｕωｕｕＱｕｕ口 ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ　　　凶　　ＮＮＮ

【図面の簡単な説明】

第１図はプラスミドｐｕｃｗの製造を、第２図はプラス
ミドｐＵＣＨの製造を、それぞれ示す図であり、 第３図はｐＵＣＨ中にクローニングされたｔＰＡＣＤＮ
Ａに対して決定されたヌクレオチド配列およびヌクレオ
チド配列から演鐸されたアミノ酸配列を示す図である。 発表された配列データ〔ベニカ（Ｐｅｎｎ１ｃａ　）ら
、およびワレン（Ｗａｌｌｅｎ　）ら〕からの偏差は＊
により示され、シーケンシング手順に用いたオリゴヌク
レオチドの配列が示される。 第４図はプラスミドｐＤＲ４０３の構築を、第５図はプ
ラスミドｐＭ２１０の構築を、第６図はプラスミドｐＤ
Ｒ５０５の構造を、第７図はプラスミドｐＤＲ６０６の
構築を、第８図はプラスミドｐＤＲ１００５の構築を、
第９図はプラスミドｐＤＲ１２０７およびｐＤＲ１２０
８の構築を、 第１０図はプラスミドｐＤＲ１１０７の構築を、第１１
図はプラスミドｐｌｃ７およびｐｌｃ１９Ｈの部分を、 第１２ａ図および第１２ｂ図はプラスミドｐＤＲ１４９
６の構築を、 第１３図はプラスミドｐＴＥ２６の製造を、第１４図は
プラスミドｐ４７の製造を、第１５図はプラスミドｐＵ
ｃ１２およびｐＵＣ１３の多重クローニング部位配列を
、 第１６図はプラスミドｐ２５４の製造を、第１７図はプ
ラスミドｐ２０１の製造を、第１８図はプラスミドｐ２
１３の製造を、第１９図はプラスミドｐ２７９の製造を
、第２０図はプラスミドｐＤＲ１２９４の構築を、第２
１図は５ＵＬ２リ一ダー配列を含む表現べ。 フタ−の構築を、 第２２図はプラスミドｐＺＶ２４の構築を、第２３図は
表現ベクターｐ　ＪＨ３９の構築を、第２４図は組換え
ファージｍｐ１９−ＪＨ２３の構築を、 第２５図は表現ベクターｐＪＨ５２の構築を、第２６図
は表現ベクターｐＪＨ４９の構築を、それぞれ示す図で
ある。 図面の浄吉（内容１剖り更なし） ０争　　　　−１Φコ　　　　　−に 淀、！ｉＩ　　　６芝　　　＜′　　　て芝Ｃ５ ０■　　　ｏ＜ｏ　　　　　　　＜ｈ　　　　　　Ｃり
＞○−Ｆ’ｌ（Ｊ絢　　　　ＱＱ　　　０−Ｑぺ　　　
１Ｑ山　　　　　　ト切　　　　００ＯＮ　　　　　ｕ
ｂ　　　　　　　ＣＪ−１−のり−Ｌ）６１　　１”’
ｌ−ぶ （！Ｉｃ！ｌ　　　り５　　　べ。　　、−１淋ぶ　囃
Ｅ　　°“　°′ ＜Ｎ　　　　　＜ト ｔ−ｔｈ　　　　　　ｈｒ−ｔ Ｑ絢　　　　　υΦ　　　　　いＵψ　　　　　Ｑφモ
≧　　旨ご　　；≦片　　？汐 （ＪＯＣＪｌ、ｌ　　　　　　　Ｇ＞　　　　　υ偽ｕ
ｓ−＋　　　　＜＞　　　　　ａＰ＠＜ψＣＪ偽　　　
　−ｈ　　　　　　　ｏ＋、ｐ　　　　　ｃに００　　
　喰υα　　　　　　Ｑ−−−ＣＪＦ−１じΦ 乏ご　叱Ｕ　　　。６　　べ。 ０日　　　　　ＱＱ　　　　　　０φ　　　ロυ−＜Ｉ
　　＜″　　　乏、５′　　叱録 Ｑ０　　　　０ニ ー〇醍　　　　ＱＱ　　　　　　−ω　　　　　く洲Ｅ
−ＩＪ：　　　　ａ− ス８２　　≦５　　　ト山　　。Ｕ Ｃ５コ　　　Φコ　　　ｃｓ＜）ｓ　　　　Ｌ）プく− 号Ｓ　　己ｒ　　１斥　　ｃｔｐ Φｄ　　　Φり　　　　０絢　　　トー＜：ｌ＋ｌ０ａ
ｔ ８冒　　　む３　　　トド　　　−ψ ０φ　　　□ｗ ８毎　　呂８々　　　Ｃ！ｌ＞　　　ｃｐｈべ鴫　　埴
ｔｐｏ　　　　　）ＩｃＪ　　　　）ＩＣＪ（Ｊ−Φり
　　　　Ｑｌ　　昨ａｍ ＯΦ　　　トΦ　　　　Ｑ−〇〇− ＜ｔｎ　　　　　Ｌ）＋Ｊ　　　　　　　１−ＩＥ−１
ｐ−ｒＪ＜口ＱＣ：　　　　Φｔｙｔ　　　　ＣＪＯｈ
。 啓鎗　　足・詞　　　ＣＪＩ−＋　　　ＣＪＩ′１（Ｊ
ｌｌ１４ＣＪｌｋ Ｏ−ＱＱ　　　哨Ｕ中　　　、ＣＪ　１４８μ　　ミロ
　　ご認３　　足浜 υ（：　　　　ａｍ　　　　　＜ｕ　　　　ｏ陶（Ｊ（
１１Ｃりの て：＜　　８四　　　かψ　　　ベク ＣＪｋ　　　ｌｌ’ｌυＱ′　　　足片　　８乱ＱＪ：
　　　のべ哨 ＜Ｅ−ＩＬＬ′ＩＣ！ｌ＜Ｑべ　　　−０ＣＪＩ１１　
　　’＜ｏ　　　　　ぺｅｒｔ　　　ＯＣＪΦｃｐ＞　
　　　υ−Ｃ＋ｌｌ−Φ−≦ ｈａ　　　　ｕ＋＞　　　　　０＜　　　Φ−−１＋ｌ
リ　　　　　　　ｌ＋１ｌＪＩ　　　　　　　　り輛　
　　　　　　り楠　　　　　リ１すＮ　　　　　　　リ
ＮυＱ、　　　　　　（Ｊ１４ ０Ｅ−Ｉの　　　り一　　　臣コ　　　　＜鳴　　　。 Φ寸ト一　　　−弓 、−＋＜Ｈ（！ｌ＞　　　　Ｌ）Ｃり　　　、Ｃ！ｌべ
　　　くΦ−＠Ｑ＋　　　ｅｌｌ　　　カＢ。　　　　
計。　　　Ｑ８０　ω （ｊ１４　　　（ＪＪ：　　ゞト１　　１浣　　べ。 Ｅ−ＩＥ−１＜Ｅ−１へＥ＋１山 〜Ｉ＋１　　　　リー　　　リー　　ＩＮｌ、Ｊリ　　
　　−Ｎ　　　リ悄ＦＩＧ、　−ＩＩ ｐＤＲ１２９６ ＹＥｐ１３ｐｏｏｌ ↓ すｃｏＲ＋− ↓フレノウ １＋　８０　ｆｆｉ　ＨＥリンｊ− １片ｌ！オ≦ ＦＩＧ、−１９ ＦＩＧ、−２１ ｐＤＲ＋２１９ ↓ ↓ 暴

Claims (23)

【特許請求の範囲】
1. （１）ＤＮＡ構築体により形質転換された酵母の培養を
   成長させる段階を含み、前記構築体が酵母遺伝子プロモ
   ーターおよび組織プラスミノーゲン活性化因子をエンコ
   ーディングするＤＮＡ配列を含み前記プラスミノーゲン
   活性化因子ＤＮＡ配列の発現が前記プロモーターの制御
   下にある酵母の組織プラスミノーゲン活性化因子を生成
   させる方法。
2. （２）前記プロモーターがトリオースホスファートイソ
   メラーゼプロモーターおよびアルコールデヒドロゲナー
   ゼＩプロモーターからなる群から選ばれる、特許請求の
   範囲第（１）項記載の方法。
3. （３）構築体がプラスミドｐＤＲ５０５、ｐＤＲ１００
   ５、ｐＤＲ１４９６、ｐＤＲ１４９７、ｐＤＲ１４９８
   およびｐＤＲ１４９９からなる群から選ばれる、特許請
   求の範囲第（２）項記載の方法。
4. （４）構築体がさらに前記プロモーターと前記ＤＮＡ配
   列との間に位置するリーダー配列を含む、特許請求の範
   囲第（１）項記載の方法。
5. （５）リーダー配列が￥ＭＦ￥α１、￥ＰＨ０５￥、￥
   ＳＵＣ２￥および￥ＢＡＲ１￥遺伝子からなる群から選
   ばれる酵母遺伝子から誘導される、特許請求の範囲第（
   ４）項記載の方法。
6. （６）リーダ配列がヒトｔＰＡ遺伝子のプレープロ域か
   ら誘導される、特許請求の範囲第（４）項記載の方法。
7. （７）培養を５．０〜６．０のｐＨに維持された培地中
   で成長させる、特許請求の範囲第（１）項記載の方法。
8. （８）培地が０．１Ｍフタル酸水素カリウムｐＨ５．５
   および０．１Ｍコハク酸ナトリウムｐＨ５．５からなる
   群から選ばれる緩衝液を含む、特許請求の範囲第（７）
   項記載の方法。
9. （９）さらに、 前記培養から組織プラスミノーゲン活性化因子を分離す
   る段階、および、 前記分離した組織プラスミノーゲン活性化因子を処理し
   て炭水化物を除去する段階、 を含む、特許請求の範囲第（１）項記載の方法。
10. （１０）前記処理段階が前記分離した組織プラスミノー
    ゲン活性化因子のエンドグリコシダーゼＨの存在下の培
    養を含む、特許請求の範囲第（９）項記載の方法。
11. （１１）特許請求の範囲第（１）項記載の方法により生
    産された生成物。
12. （１２）特許請求の範囲第（１１）項記載の実質的に純
    粋なポリペプチド。
13. （１３）アミノ酸位置１１７、１８４、２１８および４
    ４８からなる群から選ばれる位置にグルタミン残基を含
    む、特許請求の範囲第（１２）項記載のポリペプチド。
14. （１４）酵母遺伝子プロモーターおよび、プラスミノー
    ゲン活性化因子遺伝子が酵母中に前記プロモーターの調
    節下にあるように位置する組織プラスミノーゲン活性化
    因子のための遺伝子を含むＤＮＡ構築体。
15. （１５）該プロモーターがトリオースホスフェートイソ
    メラーゼプロモーターおよびアルコールデヒドロゲナー
    ゼＩプロモーターからなる群から選ばれる、特許請求の
    範囲第（１４）項記載のＤＮＡ構築体。
16. （１６）プラスミドｐＤＲ５０５、ｐＤＲ１００５、ｐ
    ＤＲ１４９６、ｐＤＲ１４９７、ｐＤＲ１４９８および
    ｐＤＲ１４９９からなる群から選ばれる、プラスミドの
    ＤＮＡ配列を含む、特許請求の範囲第（１４）項記載の
    ＤＮＡ構築体。
17. （１７）さらに、前記プロモーターと前記遺伝子との間
    に位置するリーダー配列を含む、特許請求の範囲第（１
    ４）項記載のＤＮＡ構築体。
18. （１８）リーダー配列が￥ＭＦ￥α１、￥ＰＨ０５￥、
    ￥ＳＵＣ２￥および￥ＢＡＲ１￥遺伝子からなる群から
    選ばれる酵母遺伝子かから誘導される、特許請求の範囲
    第（１７）項記載のＤＮＡ構築体。
19. （１９）リーダ配列がヒトｔＰＡ遺伝子のプレープロ域
    から誘導される、特許請求の範囲第（１７）項記載のＤ
    ＮＡ構築体。
20. （２０）組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子が突然
    変異したグリコシル化部位コーディング配列を含む、特
    許請求の範囲第（１４）項記載のＤＮＡ構築体。
21. （２１）コーディング配列がＧｌｎ−Ｘ−（＾Ｓ＾ｅ＾
    ｒ＿Ｔ＿ｈ＿ｒ）であり、Ｇｌｎコドンがプラスミノー
    ゲン活性化因子遺伝子中にコドン１１７、１８４、２１
    ８および４４８からなる群から選ばれる位置に配置され
    る、特許請求の範囲第（２０）項記載のＤＮＡ構築体。
22. （２２）特許請求の範囲第（１４）項記載のＤＮＡ構築
    体を含む酵母の形質転換株。
23. （２３）サッカロミセス・セレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒ
    ｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を含む、特許請求
    の範囲第（２２）項記載の形質転換体。