JPH0260267B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

ａ 産業上の利用分野 本発明はヒト・プロテインＣの活性の測定方法
に関するものである。更に詳しくは、ヒト・プロ
テインＣに対するモノクローナル抗体を用いて、
ヒト・プロテインＣを含む検体中のヒト・プロテ
インＣの活性を測定する方法に関するものであ
る。 ｂ 従来技術 プロテインＣはビタミンＫ依存性血漿蛋白質す
なわちγ−カルボキシグルタミン酸含有蛋白の一
つであり、血管内皮細胞表層のトロンボモジユリ
ン存在下トロンビンにより活性されて［Esmon，
C.T ＆ Owen，W.G：Proc.Natl.Acad.Sci.
USA.78：2249−2251（1981）参照］活性化プロ
テインＣ（APC）となる。活性化プロテインＣは
セリンプロテアーゼの一種であり、血液凝固系の
補酵素である第因子（Ｆ．Ｆａ）と第因
子（Ｆ．Ｆａ）を分解し、強い抗凝固作用
［Suzuki.K.et.al.：J.Biol.Chem.258：1914−1920
（1983），Vehar，G.A.＆ Davie，E.W.：
Biochemistry.19：401−409（1980）参照］を示す
と共に血管壁からプラスミノーゲン・アクチベー
タを放出させ、線溶系を促進させる［Comp，P.
C.＆ Esmon，C.T：J.Clin.Invest.68：1221−
1228（1981）参照］ことが知られている。 さらにプロテインＣ欠損症は重度の血栓症を呈
することも報告されており、［Griffin，J.H.et
al：J.Clin.Invest.，68，1370−1373（1980），
Bertina，R.M.et al：Thromb.Haemostas.，48
１〜５（1982）］プロテインＣは血液凝固線溶系の
重要な制御因子であることが明らかにされてい
る。 したがつてプロテインＣの作用機構を明らかに
すること、また、プロテインＣの血中における抗
原量、活性量を測定し、その動向を把握すること
ができれば、それは基礎医学、臨床医学の領域に
おいて非常に重要な意味を持つと考えられる。 一方モノクローナル抗体は単一の抗原決定基に
たいして特異的であり、かつ同一の特異性を有す
る抗体を安定的に産生できるという利点から抗原
蛋白質の機能および構造の解析、あるいは免疫測
定（EIA，RIA）に近時一般的に広く利用される
ようになつて来た。特に抗原蛋白質の機能解析、
分子解析には抗原蛋白の機能に関与する部位、ま
たは特殊な構造部位を認識する抗体を見出すこと
が有力な手段となり得る。 ヒト・プロテインＣの構造は、分子量約41000
のＨ鎖と分子量約21000のＬ鎖がＳ−Ｓ架橋で結
合されており、Ｈ鎖にセリンプロテアーゼ活性部
位を有し、また、Ｌ鎖アミノ末端には、９個のカ
ルシウムイオン結合性アミノ酸、すなわち、γ−
カルボキシグルタミン酸（Gla）残基を含むGla
ドメインが存在することが知られている。 Glaドメインを有する血液凝固因子は、プロテ
インＣを含め、第因子（プロトロンビン）、第
因子、第因子、第因子いずれもカルシウム
イオン（Ca⁺⁺）存在下でGlaに依存した立体的構
造変化を生じることが知られており、この機構
は、血液凝固系発現の上で重要な役割を果してい
ることが知られている。 従来、ヒト・プロテインＣのモノクロナール抗
体は鈴木らにより作成されたことが報告されてお
り［鈴木宏治 他：“血液と脈管”，15：171−174
（1984）参照］、この抗体はヒト・プロテインＣの
抗原量の測定、活性の測定に利用されているが、
カルシウムイオン（Ca⁺⁺）存在下で構造変化を
受けたヒト・プロテインＣを認識するモノクロナ
ール抗体についての報告はまだなされていない。 そこで本発明者らは、プロテインＣがカルシウ
ムイオン（Ca⁺⁺）存在下で立体的構造変化を受
けることに着目し、カルシウムイオン（Ca⁺⁺）
の存在下で構造変化を受けたプロテインＣを特異
的に認識するモノクローナル抗体について研究を
を行つたところ、カルシウムイオン（Ca⁺⁺）の
非存在下ではヒト・プロテインＣに対して認識せ
ず且つカルシウムイオン（Ca⁺⁺）の存在下では
ヒト・プロテインＣに対して特異的に認識するヒ
ト・プロテインＣに対するモノクローナル抗体を
見出した。 本発明者らは、更に研究を進めたところ、この
新規なヒト・プロテインＣに対するモノクローナ
ル抗体を用いると、ヒト・プロテインＣを含む検
体中のヒト・プロテインＣの活性が簡単にしかも
正確に測定し得ることを見出し本発明に到達し
た。 ｃ 発明の構成 すなわち、本発明は、 (i) カルシウムイオン（Ca⁺⁺）の非存在下では
ヒト・プロテインＣに対して認識せず且つカル
シウムイオン（Ca⁺⁺）の存在下ではヒト・プ
ロテインＣに対して特異的に認識するヒト・プ
ロテインＣに対するモノクローナル抗体を不溶
性担体表面上に結合させた吸着体に、測定すべ
きヒト・プロテインＣを含む検体を、カルシウ
ムイオン（Ca⁺⁺）の存在下に接触させ、 (ii) 次いで、トロンビン−トロンボモジユリン複
合体を加え、 (iii) しかる後、トロンビンを不活性化し、 (iv) 該吸着体上のヒト・プロテインＣ活性を合成
基質を用いて測定する、 ことを特徴とするヒト・プロテインＣ活性の測定
方法である。 本発明のモノクローナル抗体はヒト・プロテイ
ンＣを認識した場合その活性を阻害しないもので
ある。 かかる本発明方法によれば、ヒト・プロテイン
Ｃを含む検体（例えばヒト血漿）中のプロテイン
Ｃ活性を簡単にしかも正確に測定することができ
るので、プロテインＣ欠損症の患者の発見、治療
等に役立つことが期待できる。 本発明方法に用いられる前記ヒト・プロテイン
Ｃに対するモノクローナル抗体は新規であり、本
発明者らによつて見出されたものであつて、その
モノクローナル抗体自体及びそれを産出するハイ
ブリドーマに関しては、既に出願した［特願昭59
−254186号（昭和59年12月３日出願），特開昭61
−134399号（昭和61年６月21日公開），発明の名
称“モノクローナル抗体，ハイブリドーマ，モノ
クローナル抗体の製造方法及びヒト・プロテイン
Ｃの分離方法”］。従つて本発明方法に用いられる
モノクローナル抗体は、その明細書に記載された
方法によつて得られるが、以下その詳細並びに本
発明方法について説明する。 本発明方法に用いられるのモノクローナル抗体
を産生するハイブリドーマ細胞はケーラーとミル
シユタインの方法［Kohler ＆ Milstein，
Nature：256495−497（1975）］として知られた方
法によつて得られる。すなわち、ヒト・プロテイ
ンＣでマウスを免疫した後、このマウスの脾臓細
胞をマウス・ミエローマ細胞と融合させ、得られ
たハイブリドーマ細胞はマイクロタイタープレー
トに固定されたヒト・プロテインＣと反応する抗
体に対し、系統的に検査し、選択される。この際
に、カルシウムイオン（Ca⁺⁺）存在下における
検査と、カルシウムイオン非存在下における検査
を同時に行い前者においてのみ陽性を示すハイブ
リドーマを選別することにより、目的とする抗体
を合成し分泌するハイブリドーマを単離すること
ができる。 本発明に使用されるモノクローナル抗体はかか
る新規なハイブリトーマ細胞が産生する産生物か
ら得られ、カルシウムイオン（Ca⁺⁺）の存在下
におけるヒト・プロテインＣ分子上の特定の抗原
決定基に対して単一特異的に作用する。 本発明のモノクローナル抗体はその特性からヒ
ト・プロテインＣの精製に利用する場合非常に有
利である。すなわち、不溶性担体に前記モノクロ
ーナル抗体を固定化し、カルシウムイオン
（Ca⁺⁺）が存在する溶液中で血漿（カルシウムイ
オン存在下で凝固しないように調製したもの）ま
たは、他のヒト・プロテインＣを含む原料、ある
いはそれらの粗抽出物、粗精製物および溶液から
ヒト・プロテインＣを吸着・分離しカルシウムイ
オン（Ca⁺⁺）存在下で洗浄後、溶液をカルシウ
ムイオンを含まないもの（例えばEDTAが存在
する溶液）に置き換えて、ヒト・プロテインＣを
溶出することができる。この方法によれば、従来
の不溶化抗体による抗原蛋白質の精製のように、
過激な条件下（例えば、0.2Mグリシン塩酸ある
いは8M尿素のような）に蛋白質をさらすことな
く、穏和な条件下で精製を行うことができる。 また、ヒト・プロテインＣその他のγ−カルボ
キシグルタミン酸含有蛋白質にはGlaを含まず、
Glaに依存する構造変化を受けない異常分子が存
在することが知られているが、前記モノクローナ
ル抗体を用いることにより、この異常分子の測定
が可能になると考えられる。すなわち、カルシウ
ムイオン（Ca⁺⁺）の存在の有無に拘らず、ヒ
ト・プロテインＣを認識する抗体を用いて免疫学
的手段（例えばEIA，RIA）により血漿その他の
試料中のヒト・プロテインＣ抗原量を測定し、更
に前記モノクローナル抗体を用いて、血漿、その
他の試料中のヒト・プロテインＣをカルシウムイ
オン存在下で免疫学的手法（EIA，RIA）により
測定すれば、その測定値の差から、異常ヒト・プ
ロテインＣの量を把握することができる。 次に本発明方法に用いるモノクローナル抗体を
作成する具体的方法について詳細に説明する。 Ａ 抗原の単離・精製； 抗原に用いるヒト・プロテインＣは鈴木らの方
法［Suzuki.K.et al，J.Biol.Chem.258：1914−
1920（1983）］によりヒト・血漿から単離・精製さ
れる。 Ｂ ヒト・プロテインＣによるマウスの免疫； 雌Balb／Ｃマウスを用いることができるが他
の系（Strain）のマウスを使用してもよい。その
際、免疫計画、及びヒト・プロテインＣの濃度は
十分な量の抗原刺戟を受けた、リンパ球が形成さ
れるよう選ばれるべきである。例えばマウスに
50μｇのヒト・プロテインＣを２週間間隔で腹腔
に３回投与の後、さらに30μｇを静脈に投与す
る。最終免疫の数日後に融合の為に脾臓細胞をと
り出す。 Ｃ 細胞融合； 上記の如く免疫したマウスの脾臓を無菌的に取
り出し、そこから単細胞懸濁液を調製する。それ
らの脾臓細胞を適当なラインからのマウス骨髄腫
細胞と適当な融合促進剤の使用により、細胞融合
させる。脾臓細胞対、骨髄腫細胞の好ましい比率
は約20：１〜約２：１の範囲である。約10⁸個の
脾臓細胞について0.5〜1.5mlの融合媒体の使用が
適当である。 細胞融合に用いるマウス骨髄腫細胞は、良く知
られているが、本発明では、P3−X63−Ag8−
U1細胞（P3−U1）［Yelton，D.E et al，
Current.Topics in Microbiology and
Immunology，81 １（1978）参照］を用いた。 好ましい融合促進剤としては、例えば、平均分
子量1000〜4000のポリエチレングリコールを有利
に使用できるが、この分野で知られている他の融
合促進剤を使用することもできる。本発明におい
ては、平均分子量1540のポリエチレングリコール
を用いた。 Ｄ 融合した細胞の選択； 別の容器内（例えばマイクロタイタープレー
ト）で未融合の脾臓細胞、未融合のマウス骨髄腫
細胞および融合したハイブリドーマ細胞の混合物
を未融合のマウス骨髄腫細胞を支持しない選択培
地で希釈し、未融合の細胞を死滅させるのに十分
な時間（約１週間）培養する。培地は、未融合の
マウス骨髄腫細胞を支持しないもの、（例えば
HAT培地）が使用される。この選択培地中で
は、未融合の骨髄腫細胞は死滅する。この未融合
の脾臓細胞は非腫瘍性細胞なので、ある一定期間
後（１週間後）死滅する。これらに対して融合し
た細胞は、骨髄腫の親細胞の腫瘍性と、親脾細胞
の性質を合わせ持つため、選択培地中で生存でき
る。 Ｅ 各容器中のヒト・プロテインＣ抗体の確認； かくして、ハイブリドーマ細胞が検出された
後、その培養上清を採取し、ヒト・プロテインＣ
に対する抗体について酵素免疫定量法（Enzyme
Linked Immunosobent Assay）によりスクリー
ニングする。この際、培養上清、酵素標識抗体溶
液および洗浄液に一定濃度のCaCl₂を加えた条件
下の測定と、CaCl₂を加えない条件下の測定の両
方を行い、前者に対してのみ陽性を示すハイブリ
ドーマを選択することにより、カルシウムイオン
非存在下では、ヒト・プロテインＣを認識せず、
カルシウムイオン存在下で、ヒト・プロテインＣ
を認識する抗体を産生、分泌するハイブリドーマ
を選別することができる。 Ｆ 目的の抗体を産生するハイブリドーマ細胞の
クローン化と抗体の産生； 目的の抗体を産生するハイブリドーマ細胞を適
当な方法（例えば限界希釈法）でクローン化する
と、抗体は２つの異なつた方法で産生される。そ
の第１の方法によれば、ハイブリドーマ細胞を一
定時間、適当な培地で培養することにより、その
培養上清からそのハイブリドーマ細胞の産生する
モノクローナル抗体を得ることができる。第２の
方法によれば、ハイブリドーマ細胞は同質遺伝
子、又は半同質遺伝子を持つマウスの腹腔に注射
することができる。一定時間後の宿主動物の血液
中および腹水中より、そのハイブリドーマ細胞の
産生するモノクローナル抗体を得ることができ
る。 Ｇ ヒト・プロテインＣ含有混合物からのヒト・
プロテインＣの分離； 本発明におけるモノクローナル抗体は、前記し
た如く、カルシウムイオン（Ca⁺⁺）の非存在下
ではヒト・プロテインＣに対して認識せず、且つ
カルシウムイオン（Ca⁺⁺）の存在下ではヒト・
プロテインＣに対して特異的に認識するという性
質を有しているので、この性質を利用して、ヒ
ト・プロテインＣを含有している混合物（例えば
ヒト血漿など）からヒト・プロテインＣを簡単に
分離することができる。 そのため、先ず前記ヒト・プロテインＣに対す
るモノクローナル抗体を不溶性担体に固定化又は
結合させて吸着体を得る。その際使用される不溶
性担体としては、モノクローナル抗体を用いた測
定試薬又は測定用キツトの基材として一般的使用
されるものであればよい。例えば材質としてアガ
ロース，ポリアクリルアミド，セルロース，デキ
ストラン，またはマレイン酸ポリマー或いはこれ
らの混合物が好ましく用いられる。これら不活性
担体の形態としては、粉末状，粒状，ペレツト
状，ビーズ状，フイルム状，繊維状など種々の形
態であることができる。また一般に血漿、または
その分画成分の測定や分離に用いられる多数の凹
状のくぼみを有するプレート（例えば、通称マイ
クロタイタープレート）を用いることが有利であ
る。 前記吸着体を用い、これにヒト・プロテインＣ
含有混合物を、カルシウムイオン（Ca⁺⁺）の存
在下に接触せしめると、該吸着体に固定化したモ
ノクローナル抗体とヒト・プロテインＣとが結合
して、結果的にヒト・プロテインＣが該吸着体に
結合する。かくすることによりヒト・プロテイン
Ｃを分離、除去することが可能である。 また前記の如くしてヒト・プロテインＣを吸着
体に結合させ、出来れば残余の混合物を洗滌して
除去し、次いで吸着体に結合したヒト・プロテイ
ンＣをカルシウムイオン（Ca⁺⁺）を実質的に含
まない液体と接触又は洗滌すると、ヒト・プロテ
インＣは該吸着体から離脱し、これを取得するこ
とによつて、ヒト・プロテインＣを単離すること
ができる。 かくして前記本発明のモノクローナル抗体を用
いれば、ヒト・プロテインＣを含有する混合物か
らのヒト・プロテインＣの除去、該混合物からの
ヒト・プロテインＣの分離及び精製、該混合物中
のヒト・プロテインＣの含有量の測定などが極め
て簡単な操作で達成される。 Ｈ ヒト・プロテインＣ活性の測定； 前記の如くしてモノクローナル抗体を不溶性担
体表面上に結合させた吸着体に、ヒト・プロテイ
ンＣを含有する検体を接触させるが、その際カル
シウムイオン（Ca⁺⁺）を存在させることによつ
て、ヒト・プロテインＣは該吸着体に結合する。 次いでこの吸着体にトロンビン−トロンボモジ
ユリン複合体をカルシウムイオン（Ca⁺⁺）の存
在下に加えて吸着体に結合したヒト・プロテイン
Ｃを活性化する。その際トロンビンとしては牛ト
ロンビンを精製して、またトロンボモジユリンと
してはウサギ肺から分離されたものを使用するこ
とができる。 しかる後トロンビンを不活性化するが、その方
法としては、例えば、アンチトロンビン，ヘパ
リン，アプロチニン混合液を用いる。次に、吸着
体上のヒト・プロテインＣ活性を合成基質を用い
て測定する。その際用いられる合成基質として
は、ヒト・プロテインＣ活性により分解を受け、
ヒト・プロテインＣの活性の例えば発色により判
定可能なものであればよく、その例としては、 ［ここでValはＤ形の光学活性のバリン，Leu
はＬ形の光学活性のロイシン，ArgはＬ形の光学
活性のアルギニンを示す。Kabi Vitrum AB（ス
ウエーデン）社製のＳ−2266を用いた。］ ［ここで、PyorGluはピログルタミン，Proは
プロリン，Argはアルギニンを示しこれらは全て
Ｌ形の光学活性である。Kabi Vitrum AB（スウ
エーデン）社製のＳ−2366を用いた］などが挙げ
られる。 以下実施例を掲げ本発明を詳細に説明する。以
下実施例ではプロテインＣをPCと略称すること
がある。 実験例 １ 精製したヒト・PCを雌のBalb／Ｃマウス（４
週齢）２匹に対して14日間隔で４回免疫した。 初回の免疫はPBSに溶解した。50μｇのヒト・
PCを等量のフロイントの完全アジユバント
（Complete Freund，ｓ adjuvant）と混合し、
そのエマルジヨンを、腹腔内に投与した（0.5
mg／head）、２回目，３回目は、同じく50μｇの
ヒト・PCをフロイントの不完全アジユバント
（Freund，ｓ incomplete adjuvant）と混合し、
同じく腹腔内に投与した。最終免疫は30μｇのヒ
ト・PCをPBS溶液のまま、マウス尾静脈から投
与した。最終免疫の３日後に免疫したマウスの脾
臓細胞を細胞融合に用いた。 免疫したマウスの脾臓細胞と、同系マウスの骨
髄腫細胞（P3U1）を約２：１〜約15：１の割合
で混合し、50％ポリエチレングリコール1540（和
光）を融合促進剤としてKohletとMilsteinの方法
に従い細胞融合を行つた。融合後の細胞は、１×
10⁶cell／mlの細胞濃度となるように10％FCS←
RPMI−1640培地に懸濁し、96wellsマイクロプ
レート（Coster）に１ウエル当り100μずつ分
注した。 融合細胞は、CO₂インキユベーター（５％
CO₂，37℃）中で培養し、ヒポキサンチン；アミ
ノプテリン；チミジンを含む培地（HAT培地）
で培地交換を行い、HAT培地中で増殖させて、
脾臓細胞と、骨髄腫細胞から成るハイブリドーマ
のスクリーニングを行つた。 ハイブリドーマの培養上清中の抗体は抗原ヒ
ト・PCをコーテイングしたマイクロタイタープ
レートを用いELISA法により検出した。第２抗
体には、アルカリホスフアターゼ標識ウサギ抗マ
ウスIgG抗体を用い、カルシウムイオン存在下非
存在下におけるヒト・PCとの結合の違いを見る
ため、一方の培養上清には5mMCaCl₂を添加した
TBS（0.02M Tris／HCl，0.14M NaCl，PH7.4）
またもう一方にはTBSを加えた。更に第２抗体
の希釈液、および洗浄液には、5mM CaCl₂添加
TBS，0.05％ Tween 20，0.02％ NaN₃また
はTBS，0.05％ Tween 20，0.02％ NaN₃を
使用した。 融合細胞をまいた合計541のウエルのうち523の
ウエルにコロニーの形成が認められ、このうち抗
体産生陽性ウエルは下記表−１に示すようにカル
シウムイオン存在下で44，カルウシムイオン非存
在下で32であつた。 これらの抗体産生陽性ウエルのうち12のウエル
につてい限界希釈法によるクローニングを２回繰
り返して行ない、13個のクローンを得た。得られ
たクローンは90％FCS−10％DMSO中に懸濁さ
せ液体窒素中に保存した。 各クローンの産生するモノクローナル抗体はク
ローンをBalb／Ｃマウス腹腔内で増殖させ、そ
の腹水からプロテインＡ−Sepharose 4Bカラム
を用いて精製した。

【表】 実験例２ （精製したIgGの性質） マウス腹水から精製した各クローンのIgGにつ
いてサブクラス，ヒト・PC活性への影響Ｌ鎖あ
るいはＨ鎖への結合性を調べた。 サブクラスは、各クラス特異性の抗マウス抗血
清を用いて、オクタロニー法により決定した。ヒ
ト・PC活性への影響は、ヒト・PCにIgGをモル
比１：５で加えて４℃で一夜インキユベーシヨン
し、トロンビン−トロンボモジユリンコンプレツ
クスによりヒトPCを活性化し、その活性は次合
成基質の分解活性を測定することにより測定し
た。この合成基質としては ［ここでVelはＤ形の光学活性のバリン，Leu
はＬ形の光学活性のロイシン，ArgはＬ形の光学
活性のアルギンを示す。Kabi Vitrum AB（スウ
エーデン）社製のＳ−2266を用いた］を使用し
た。Ｌ鎖、Ｈ鎖への結合性は、ヒト・PCを還元
条件で電気泳動し、ニトロセルロース膜及び
HRP標識Goat anti−mDuse IgGを用いたイム
ノブロツテイングを行つて判定した。 各性質について得られた結果を下記表−２に示
した。カルシウムイオン依存性抗体はいずれもＬ
鎖結合性であり、ヒト・PCの活性には影響を及
ぼさなかつた。

【表】 実験例３ （カルシウムイオンの影響） ヒト・PCと精製したIgGとの反応に及ぼすカ
ルシウムイオンの影響について検討した。 ヒト・PCをコーテイングしたELISA法におい
てカルシウムイオン依存性の抗体7B12及び10E12
を5mMCaCl₂添加TBS−Tween（0.02M Tris／
HCl，0.14M NaCl，PH7.4 0.05％Tween20，
0.02％NaN₃）またはTBS−Tweenで希釈してヒ
ト・PCと反応させアルカリホスフアターゼ標識
ウサギ抗マウスIgGを用いた発色から結合量を測
定すると、5mM CaCl₂を添加したバツフアーで
希釈した場合には抗体濃度に依存したヒト・PC
との結合を示したが、CaCl₂を添加しないバツフ
アーで希釈した場合には、抗体濃度を高くしても
結合は認められなかつた。その結集を下記表−３
に示した。 なお、カルシウムイオン非依存性の抗体6B10
−１及び10H11を用いて同様にカルシウムイオン
の影響について調べた結果も同表−３に併記して
示した。

【表】

【表】 実験例４ （カルシウムイオン濃度の影響） 前記実施例３におけるカルシウムイオン依存性
の抗体7B12及び10E12を用い、それらの濃度を一
定（1μｇ／ml）とし、抗体溶液中のカルシウム
イオン濃度を変化させたところ、ヒト・PCとの
結合はCaCl₂濃度が高まるにつれて増加し、約
1mMの濃度で飽和となつた。その結果を下記表
−４に示した。またカルシウムイオン非依存性の
抗体6E2を用い同様にCaCl₂濃度の変化の影響を
調べた結果を、下記表−５に示した。表−５の結
果からカルシウムイオン非存在性の抗体では、カ
ルシウムイオン濃度に影響なく、ヒト・PCとの
結合はほぼ一定の値を示していることがわかる。 なお、測定は、所定濃度のCaCl₂を含むTBS−
Tweenで1μｇ／mlIgG溶液を調製し、100μを、
ヒト・PCをコーテイングしたwellに加えて行つ
た。インキユベーシヨン後のwellの洗浄にも各濃
度のCaCl₂を含むTBS−Tweenを用いた。

【表】

【表】

【表】 実施例１ （ヒト・プロテインＣ活性の測定） 緩衝液（15mM Na₂CO₃，35mM NaHCO₃，
5mM CaCl₂ PH＝9.6）に溶解した濃度20μｇ／
mlのヒト・プロテインＣを特異的に認識する前記
モノクローナル抗体の7B12と10E12のそれぞれを
マイクロタイタープレート上に４℃で一晩放置
し、固定化した。これに２％牛血清アルブミンを
含む上記緩衝液を加え37℃で２時間放置した後洗
浄液（50mMトリス緩衝液，0.15NaCl，5mM
CaCl₂，0.05％Tween20）で５回洗浄した。 次にこのウエルに種々の濃度となるように上記
緩衝液で希釈した健常人血漿又は患者血漿を加
え、37℃で４時間放置した。その後前記洗浄液で
５回洗浄し、さらに緩衝液（0.1％牛血清アルブ
ミン、50mMトリス緩衝液，0.15M NaCl，5mM
CaCl₂ PH7.4）に溶解した牛のトロンビン（２ユ
ニツト／ml）とウサギ肺のトロンボモジユリンか
ら形成された複合体100μを加え37℃で１時間
放置した。さらにこれに緩衝液（50mMトリス緩
衝液，0.1M NaCl，5mM CaCl₂ PH8.0）に溶解
したアンチトロンビン，（５ユニツト／ml），ヘ
パリン（１ユニツト／ml），アプロチニン（10ユ
ニツト／ml）混合液50μを加え37℃で10分間放
置した。その後4mM濃度の合成基質溶液（Ｓ−
2266又はＳ−2366）50μを加えELISA
ANALYZER［東洋測器(株)製ETY−96］で405nm
の波長における１分間当りの吸光度変化を測定し
た。その結果を、合成基質としてＳ−2266を用い
た場合の検量線を第１図に、また合成基質として
Ｓ−2366を場合の検量線を第２図にそれぞれ示し
た。 またプロテインＣ抗原量について既知の正常人
血漿、プロテインＣ欠損ヘテロ接合体患者血漿及
びプロテインＣ欠損ホモ接合患者血漿を検体とし
て用いてプロテインＣ活性量を前記本発明方法に
従つて測定したところ、第３図に示す通りの結果
を得た。 これらの図面からヒト・プロテインＣ活性量と
吸光度変化との関係は、ほぼ直線関係になること
が理解される。従つてヒト・プロテインＣの活性
を阻害せず、かつカルシウムイオン（Ca⁺⁺）存
在下でのみヒト・プロテインＣを認識するモノク
ローナル抗体を使用することによつて検体中のプ
ロテインＣ活性量を容易に測定することができ
る。 実験例 ６ (1) 抗体の不溶性担体への固定化； ブロムシアン活性化セフアロース4B（フアルマ
シア・フアイン・ケミカルズ社製）の乾燥ゲル
0.5ｇを、G3グラスフイルター上で100mlの1mM
HClを用いて膨潤，洗浄し、更にカツプリングバ
ツフアー（0.5M NaClを含む0.1M NaHCO₃
PH8.3）で洗浄した。カツプリングバツフアーを
吸引除去した後、直ちにゲルを抗体（6H2）のカ
ツプリングバツフアー溶液（３mg／ml）２ml中に
加えて懸濁させ、４℃で一夜ゆるやかに振とうし
た。次にゲルを1Mエタノールアミン−HCl（PH
8.0，２ml）中に移し、室温で２時間振とうして
残存する活性基をブロツクした。ブロツキング
後、抗体結合セフアロースゲルをグラスフイルタ
ー上で、0.5M NaClを含む0.1M酢酸バツフアPH
4.0，と0.5M NaClを含む0.1Mホウ酸バツフアー
PH8.0を交互に用いて洗浄した。液の280nmに
おける吸光度が0.01以下になつたところで、
5mM CaCl₂，および1mMベンザミンを含む
0.05M Tris／HCl PH7.4で平衡化し、カラムに
充てんした。このようにして調製した抗ヒトPC
モノクローナル抗体（6H2）結合セフアロース
4Bカラムを用いてアフイニテイクロマトを行つ
た。 (2) プロテインＣの抗体結合セフアロース4Bへ
の吸着，溶出； 血漿100mlに1M BaCl₂溶液８mlを加え４℃で
１時間撹拌した。沈澱を遠心分離して集め5mM
BaCl₂，5mMベンザミジンを含む0.1M NaClで
洗浄した後、15mlの5mMベンザミジンを含む
0.2M EDTA PH7.4で沈澱物を溶解し、バリウ
ム吸着分画を得た。このバリウム吸着分画を
1mMベンザミジンを含む0.05M Tris／HCl PH
7.4に透析し、終濃度5mMとなるようにCaCl₂溶
液を加え、5mM CaCl₂および1mMベンザミジン
を含む0.05M Tris／HClで平衡化した抗体
（6H2）結合カラムにかけた。5mM CaCl₂，
1mMベンザミジンおよび1M NaClを含む0.05M
Tris／HClで洗浄し、50mM EDTAおよび1mM
ベンザミジンを含む0.05M Tris／HClで溶出し
たところ、PCを含むシングルピークが得られた。
抗体セフアロース4B溶出分画中のPCはバリウム
吸着分画に比べ約52倍に精製されており、回収率
は約48.2％であつた。

【図面の簡単な説明】

第１図及び第２図はそれぞれ本発明の実施例に
おいて、検体中の血漿の含有率と吸光度変化（ヒ
ト・プロテイン活性）との関係を示したものであ
る。また第３図ヒト・プロテインＣ抗原量とプロ
テインＣ活性との関係を示したものであり、同第
３図中Ａ群（３例）の結果は正常人血漿、Ｂ群
（６例）の結果はヘテロ接合体患者血漿及びＣ群
（１例）の結果はホモ接合体患者血漿の結果を示
したものである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ (i) カルシウムイオン（Ca⁺⁺）の非存在下
   ではヒト・プロテインＣに対して認識せず且つ
   カルシウムイオン（Ca⁺⁺）の存在下ではヒ
   ト・プロテインＣに対して特異的に認識するヒ
   ト・プロテインＣに対するモノクローナル抗体
   を不溶性担体表面上に結合させた吸着体に、測
   定すべきヒト・プロテインＣを含む検体を、カ
   ルシウムイオン（Ca⁺⁺）の存在下に接触させ、 (ii) 次いでトロンビン−トロンボモジユリン複合
   体を加え、 (iii) しかる後トロンビンを不活性化し、 (iv) 該吸着体上のヒト・プロテインＣ活性を合成
   基質を用いて測定する、 ことを特徴とするヒト・プロテインＣ活性の測定
   方法。