NO173340B - Humant protein c antistoff - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse omhandler et monoklonalt antistoff som binder selektivt til humant protein C til anvendelse in vitro, samt anvendelse av et slikt monoklonalt antistoff til in vitro bestemmelse av tilstedeværelse av humant protein C eller in vitro separasjon av humant protein C, slik som angitt i henholdsvis krav 2 og 3.

Protein C som nylig har fremskaffet interesse som kontroll-erende faktor ved koagulering og fibrinolytiske systemer, er et vitamin K avhengig plasmaprotein, en av de gamma-karbok-syl-glutaminsyre (Gla)-inneholdende proteiner og er kjent for å vise sterk antikoagulerende aktivitet og fibrinolyse-fremskaffende aktivitet [se Kisiel et al, Biochemistry, 16, 5824-5831 (1977); og P. C. Comp & C. T. Esmon: J. Clin. Invest., 68/ 1221-1228 (1977)].

Humant protein C dannes i leveren. Det produseres ved gamma-karboksylering av glutaminsyre (Glu) som ligger i nærheten av aminoterminalen av en human protein C precursor dannet i leveren, til Gla (gamma-karboksylglutaminsyre) i nærvær av vitamin K. Det resulterende humane protein C blir deretter utskilt i blodet. I blodet eksisterer mesteparten som en to-kjedet struktur bestående av en L-kjede med en molekylvekt på 21.000 og en H-kjede med en molekylvekt på 41.000, og som har et Gla-doméne inneholdende 9 Gla residier ved L-kjede-aminoterminalen.

Det er kjent at Gla-doménet har et kalsiumbindende sete, og når et kalsiumion (Ca<++>) binder til dette setet undergår protein C en konformasjonsforandring, og denne forandring er viktig ved manifestering av aktivitet in vivo. [Se N. L. Esmon et al.: J. Bil. Chem., 258. 5548-5553 (1983)].

Når vitamin K er i underskudd eller en antagonist av vitamin K (warfarin, dicoumarol, etc.) tilføres, går ikke gamma-karboksyleringen av den humane protein C precursor. I dette tilfellet blir Glu i nærheten av aminoterminalen til den humane protein C precursor ikke konvertert til Gla, men utskilt i blodet. Et slikt protein utskilt i blodet som har samme struktur som den humane protein C precursor, vil bli forkortet som PIVKA-PC som betyr protein C som protein indu-sert ved vitamin K-fravær eller antagonister. Siden PIVKA-PC ikke har et fullstendig Gla-doméne som i protein C, undergår det ikke fullstendig Gla-avhengig forandring i sterisk struktur selv ved nærvær av kalsiumioner (Ca<++>) og er ikke biologisk aktivt. Av denne grunn behandles PIVKA-PC som et abnormalt protein i en levende organisme. Ingen metode har tidligere vært tilgjengelig for å måle eller bestemme PIVKA-PC og protein C med et Gla-doméne adskilt fra hverandre ved å bruke et monoklonalt antistoff.

Siden humant protein C har kort halveringstid i en levende organisme, har effektene av fravær av vitamin K og tilføring av en vitamin K-antagonist en tendens til å opptre tidlig. Videre, ulikt andre Gla-inneholdende koaguleringsfaktorer (prothrombin, FVII, FIV, og FX) som virker på koagulerings-forløpet, har protein C inhiberende virkning på koagulerin-gen. Således, for å bestemme PIVKA-PC og normal protein C diskriminerende, blir en meget viktig parameter å bestemme fraværstilstanden eller mangelen på vitamin K eller effekter ved tilføring av en vitamin K-antagonist (såsom warfarin og dicumarol).

På den annen side har et monoklonalt antistoff nylig fått bred godkjennelse ved analyse av funksjon og struktur av et antigenprotein eller i immunoassay såsom enzym-immunoassay (E.I.A.) eller radioimmunoassay (RIA), fordi de har fordelen at de er spesifikke overfor en enkelt antigendeterminant, og antistoff med samme spesifisitet kan bli stabilt produsert. For funksjonsanalyse og molekylæranalyse av et antigenprotein vil dette være en effektiv metode for å velge ut et antistoff som gjenkjenner et sete involvert i funksjonen av det antigene protein eller et spesielt strukturelt sete. Monoklonale antistoff overfor humant protein C som et antigenprotein, har blitt foreslått (Blood & Vessel, 1984, vol. 15, nr. 2, side 171-174; J. Biochem., vol. 97, nr. 1, 1985, side 127-138; og japansk utlagt patentpublikasjon nr. 120.825/1985). Disse dokumenter angir totalt 13 monoklonale antistoff overfor humant protein C. Seks av disse binder seg til L-kjeden av protein C; fem til H-kjeden av protein C og to gjenkjenner et område mellom L-kjeden og H-kjeden til protein C. J. Biochem, Vol. 97 nr. 1, 1985, side 127-138 angir mot slutten; "av de foreliggende dannede antistoff kan enkelte være konformasjonsspesifikke antistoff rettet mot den metallion-avhengige struktur hos proteinet". Dette er imidlertid en spekulasjon og denne publikasjon beskriver ikke det faktum at slike konformasjons-spesifikke antistoff faktisk ble erholdt. Et slikt faktum har heller ikke blitt rapportert senere.

I tillegg er de bindende seter til de ovenfor nevnte 13 monoklonale antistoff overfor humant protein C vanlige hos protein C og PIVKA-PC. Følgelig kan protein C og PIVKA-PC ved disse monoklonale antistoff ikke måles eller bestemmes avgrensende.

Det er følgelig et mål for denne oppfinnelsen å gi et nytt monoklonalt antistoff mot humant protein C, hvilket monoklonale antistoff har de særtrekk som er angitt i krav l<*>s karakteriserende del. ;Et annet mål for oppfinnelsen er å fremskaffe et monoklonalt antistoff mot humant protein C som spesifikt gjenkjenner humant protein C i Gla-doméne. ;Et annet mål for denne oppfinnelse er å fremskaffe et monoklonalt antistoff ovenfor humant protein C som spesifikt gjenkjenner humant protein C i Gla-doméne som har undergått konformasjonsforandring ved et kalsiumion. ;Et annet mål for denne oppfinnelse er å fremskaffe et monoklonalt antistoff mot humant protein C som diskriminerende kan gjenkjenne protein C og PIVKA-PC uten fullstendige Gla-doméner som i protein C. ;Det monoklonale antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse produseres av et hybridom dannet ved cellefusjon mellom human protein C antistoff-dannende celler fra ikke-humane dyr, andre enn mus og vanlige tilgjengelige myelomceller. ;Et annet mål for denne oppfinnelsen er å anvende det monoklonale antistoffet in vitro for å bestemme humant protein C og som omfatter å bestemme innholdet av protein C i en blanding inneholdende humant protein C gjennom en antigen-antistoffreaksjon. ;Et annet mål for denne oppfinnelse er å anvende det monoklonale antistoff in vitro for å innfange humant protein C ved å sette en blanding inneholdende det humane protein C i kontakt med det monoklonale antistoff ifølge oppfinnelsen, fiksert til et uløselig bæremiddel ved å anvende egenskapen til det monoklonale antistoff ifølge oppfinnelsen til å gjenkjenne spesifikt humant protein C som binder kalsiumion. ;Ytterligere mål og fordeler av denne oppfinnelsen vil bli anskueliggjort fra følgende beskrivelse. ;I henhold til denne oppfinnelsen oppnås ovenfor nevnte mål og fordeler for det første ved et monoklonalt antistoff mot humant protein C som ikke gjenkjenner humant protein C som ikke binder et kalsiumion ved Gla-doméne, men som gjenkjenner humant protein C som binder et kalsiumion i Gla-doméne, hvilket monoklonale antistoff er produsert av et hybridom dannet ved cellefusjon mellom human protein C antistoffdan-nende celler fra ikke-humane dyr andre enn mus og vanlig tilgjengelige myelomceller. ;I henhold til denne oppfinnelsen kan det monoklonale antistoffet mot humant protein C dannes ved å separere og gjen-vinne et monoklonalt antistoff mot humant protein C fra produktet av et hybridom som nevnt ovenfor, som er i stand til å danne et monoklonalt antistoff mot humant protein C, som ikke gjenkjenner humant protein C, som ikke binder et kalsiumion ved Gla-doménet, men som gjenkjenner humant protein C som har et kalsiumion ved Gla-doménet. ;Hybridomcellene som er i stand til å danne det monoklonale antistoff ifølge oppfinnelsen, kan erholdes ved en fremgangsmåte kjent som Kohler-Milstein-metoden [Kohler og Milstein: Nature, 256, 495-497 (1975)]. Spesielt immuniseres andre ikke-humane dyre enn mus med humant protein C og miltceller ekstraheres fra de immuniserte dyr. Miltcellene blir så fusert med vanlig tilgjengelige myelomceller. De resulterende hybridomceller blir systematisk undersøkt og utvalgt i forhold til et antistoff som reagerer med humant protein C fiksert til mikrotiterplater. Undersøkelsen utføres både i nærvær av kalsiumion (Ca<+>+) og ved fravær av kalsiumion. De hybridomceller som viser seg å være positive kun i først-nevnte reaksjon i nærvær av kalsiumion, velges ut og isoleres. Disse hybridomceller syntetiserer og utskiller det ønskede antistoff. ;Det monoklonale antistoff ifølge oppfinnelsen er et produkt dannet av disse nye hybridomceller, og virker monospesifikt på en spesifikk antigendeterminant på det humane protein C molekyl i nærvær av et kalsiumion. ;En spesiell fremgangsmåte for å danne det monoklonale anti-stoff ifølge oppfinnelsen vil nå bli beskrevet i detalj. Beskrivelsen refererer til museforsøk, men andre ikke-humane dyr enn mus kan i prinsippet benyttes. ;A. ISOLERING OG OPPRENSING AV ET ANTIGEN. ;Humant protein C brukt som antigen, isoleres fra humant plasma og renses ved metoden til Suzuki et al., J. Biol. Chem., 258, 1914-1920 (1983). ;B. IMMUNISERING AV MUS MED HUMANT PROTEIN C ;Balb/C hunnmus kan brukes, men mus av andre stammer er også anvendelige. Immuniseringsplanen og konsentrasjonen av humant protein C bør velges for å danne en tilstrekkelig mengde av antigenisk stimulerte lymfocyter. F.eks. immuniseres en mus intraperitonialt med 50 pg av humant protein C tre ganger i to ukers intervaller og endelig tilføres 30 jjg av humant protein C intravenøst. Flere dager etter den endelige immunisering, ekstraheres miltcellene fra dyret for fusjon. ;C. CELLEFUSJON ;Milten ble aseptisk tatt ut fra den immuniserte mus, og en suspensjon av miltcellene ble fremstilt. Miltcellene fuseres med musemyelomceller fra en passende cellelinje i nærvær av en passende fusjonpromotor. Det foretrukne forhold av miltceller og myelomceller er fra 20:1 til 2:1 og et fusjons-medium er passende anvendt i en mengde på 0,5 til 1,5 ml per ca. IO<8> miltceller. ;Musemyelomcellene brukt for cellefusjon er velkjent. I foreliggende oppfinnelse anvendes P3-X63-Ag 8-U1 celler (P3-U1) ;[se D. E. Yelton et al., Current Topics in Microbiology and Immunology, 81/ 1 (1978)]. ;Fusjonspromotoren er fortrinnsvis polyetylenglykol med en gjennomsnitlig molekylvekt på 1000 til 4000. Andre fusjons-promotorer kjent i faget kan også anvendes. I foreliggende oppfinnelse anvendes fortrinnsvis polyetylenglykol med en gjennomsnittlig molekylvekt på 1540. ;D. SKJERMING AV FUSERTE CELLER. ;I en separat beholder (såsom en mikrotiterplate) fortynnes en blanding bestående av ikke-fuserte miltceller, ikke-fuserte musemyelomceller og fuserte hybridomceller med et selektivt medium som ikke opprettholder de ikke-fuserte musemyelomceller, og dyrkes over en tidsperiode som er tilstrekkelig for å drepe de ikke-fuserte musemyelomcellene (ca. 1 uke). Et kulturmedium med legemiddelresistens (f.eks. resistens for 8-azaguanin) og som ikke opprettholder de ikke-fuserte musemyelomceller så som et HAT-medium anvendes. I det selektive medium dør de ikke-fuserte myelomceller. Siden de ikke-fuserte miltceller ikke er transformerte celler, dør de etter en viss tidsperiode (1 uke). De fuserte celler på den annen side kan overleve i det selektive medium siden de både har den tumorale natur til de opprinnelige myelomceller, og naturen til de opprinnelige miltceller. ;E. BESTEMMELSE AV HUMANT PROTEIN C ;Etter at hybridomcellene således har blitt funnet, samles en kultursupernatant opp og avskjermes for et antistoff mot humant protein C ved enzymforbundet immusorbent assay (ELISA). Forsøket utføres ved å tilsette CaCl2 i en viss konsentrasjon til kultursupernatanten, en enzymmerket anti-stoff oppløsning og en vaskeoppløsning, og også ved nærvær av CaC162* De hybridomer som viser seg å være positive kun ved fravær av CaCl2 velges ut. Disse hybridomer danner og utskiller et antistoff som ikke gjenkjenner humant protein C i fravær av kalsiumion, men gjenkjenner humant protein C i nærvær av et kalsiumion.

F. KLONING AV HYBRIDOMCELLENE SOM DANNER DET ØNSKEDE ANTI-STOFF OG PRODUKSJON AV ANTISTOFFET.

Hybridomcellene som er i stand til å danne det ønskede anti-stoff, klones ved hjelp av en passende metode, så som en begrensende fortynningsmetode og det ønskede antistoff kan dannes ved følgende to forskjellige metoder. I henhold til en første metode blir hybridomcellene dyrket i et passende medium i en viss tidsperiode, og det monoklonale antistoff dannet av hybridomcellene, kan isoleres fra supernatanten til kulturen. I henhold til en annen metode, injiseres hybridomcellene intraperitonialt i syngeniske mus. Etter en viss tidsperiode kan de monoklonale antistoff, dannet av hybridomcellene, isoleres fra blod og bukvæske hos verts-dyret .

G. SEPARERING AV HUMANT PROTEIN FRA DEN HUMANE PROTEIN C-INNEHOLDENDE BLANDING.

Det monoklonale antistoff ifølge oppfinnelsen som angitt ovenfor har den egenskap ikke å gjenkjenne humant protein C ved fravær av kalsiumion (Ca<++>), men spesifikt å gjenkjenne humant protein C ved nærvær av kalsiumion (Ca<+>+). Ved å benytte denne egenskap kan humant protein C lett separeres fra en blanding inneholdende humant protein C (f.eks. humant plasma).

For dette formål blir det monoklonale antistoff mot humant protein C først fiksert eller bundet til et uoppløselig bærestoff. Det uoppløselige bærestoff brukt denne gang kan være ethvert av de som generelt brukes som substrater for assay-reagenser eller kit basert på bruk av monoklonale antistoff. F.eks. kan det uoppløselige bærestoff være dannet av et slikt materiale som sepharose, polyakrylamid, cellu-lose, dextran, en maleinsyrepolymer eller blandinger av disse. Det uoppløselige bærestoff kan være i forskjellige former såsom pulver, granuler, pelleter, perler, en film eller en fiber. Generelt er det fordelaktig å bruke plater med mange uttrykninger (brønner) brukt for forsøk eller separasjon av plasma eller dets fraksjonerte komponenter.

Når det fikserte monoklonale antistoff bringes i kontakt med en blanding inneholdende humant protein C i nærvær av kalsiumion (Ca<++>), bindes humant protein C til det fikserte monoklonale antistoff og fanges således opp.

Etter ønske separeres det humane protein C som er fanget av det fikserte monoklonale antistoff, ved vask med en vandig oppløsning inneholdende et kalsiumion sammen med bæremidlet til hvilket det er bundet, for derved å fjerne det gjenværende av blandingen og så behandle det fikserte monoklonale antistoff med et vandig medium i hovedsak fritt for kalsiumion.

Således tillater anvendelsen av det monoklonale antistoff, i henhold til denne oppfinnelsen, fjerning av humant protein C fra en blanding inneholdende humant protein C, separasjon av humant protein fra blandingen og dets opprensing og måling av innholdet av humant protein C i blandingen ved meget enkle operasjoner. F.eks. kan innholdet av humant protein C med et Gla-doméne i en blanding inneholdende dette, bestemmes ved å bruke det monoklonale antistoff mot humant protein C i henhold til foreliggende oppfinnelse og indusere en antigen-antistoffreaksjon mellom disse, fortrinnsvis i nærvær av kalsiumion. Videre kan mengden av Gla-fattig protein C (PIVKA-PC) bestemmes ved å kombinere innholdet av humant protein C, bestemt ved ovenfor angitte metode med resultatene av målingene av den fullstendige mengde protein C ved en immunologisk teknikk (så som EIA, RIA eller Laurell metoden) ved å bruke et monoklonalt antistoff som gjenkjenner et sete uten tilknytning til den Gla-avhengige steriske strukturelle forandring, et polyklonalt antistoff eller et antiserum.

De følgende eksempler illustrerer foreliggende oppfinnelse mer spesifikt. I disse eksempler vil protein C enkelte ganger forkortes som PC.

Eksempel 1

To Balb/C hunnmus (4 uker gamle) ble immunisert med renset humant PC fire ganger ved 14-dagers intervaller. Første immunisering ble fremskaffet ved intraperitoneal tilførsel til musene av en blanding (emulsjon) på 50 pg av humant PC oppløst i fosfatbufret saltvann (PBS) og en lik mengde fullstendig Freund tilsetning i en mengde på 0,5 ml/hode. Andre og tredje immunisering ble fremskaffet ved intraperitoneal tilførsel til musene av en blanding på 50 pg av humant PC og Freund ufullstendig tilsetning. Den endelige immunisering ble utført ved tilføring en PBS-oppløsning på 30 pg av humant PC fra halevenen hos musene. Tre dager etter den endelige immunisering ble miltcellene til de immuniserte mus brukt for cellefusjon.

Miltcellene til de immuniserte mus og myelomceller (P3U1) av en mus av samme stamme ble blandet i et forhold fra 2:1 til 15:1, og fusert i nærvær av 50% polyetylenglykol 1540 (et produkt fra Wako Pure Chemicals, Co. Ltd.) i samsvar med metoden til Kohler og Milstein. De fuserte celler ble suspendert i RPMI-1640 medium (inneholdende 10% FCS) slik at konsentrasjonen til cellene ble 1 x IO<6> celler/ml. Suspen-sjonen ble fordelt til brønner av en 96 brønners mikroplate (Coster) i en mengde på 100 pl per brønn.

De fuserte celler ble inkubert i en C02 inkubator (5% C02, 37°C). Etter en dag ble et medium inneholdende hypoxantin, aminopterin og thymidin (HAT medium) tilsatt hver brønn, og et halvt volum av mediet i hver brønn ble fjernet og HAT-mediet ble tilsatt hver brønn hver andre eller tredje dag. Således ble hybridomceller bestående av miltceller og myelomceller valgt ut. Antistoffet i supernatanten av kulturen av hybridomcellene ble påvist ved ELISA metode ved å bruke en mikrotiterplate dekket med humant PC som et antigen. Som et andre antistoff ble et alkalisk fosfatasemerket kanin anti-muse IgG antistoff brukt, og for å bestemme forskjellen i binding av humant PC til antistoffet ved nærvær av kalsiumion fra det ved fravær av kalsiumion, ble TBS (0,02 M Tris/HCl, 0,14M NaCl, pH 7,4) inneholdende 5 mM CaCl2 tilsatt til en supernatant fra en brønn, og PBS ble tilsatt en annen supernatant fra samme brønn. Videre ble PBS inneholdende 5 mM CaCl2, 0,05% Tween 20/0,02% NaN3 eller TBS/0,05% Tween 20/0,02% NaN3 brukt som fortynningsmiddel for det andre antistoff og en vaskebuffer.

I 541 brønner totalt, hvori de fuserte celler ble plassert, ble dannelsen av kolonier observert i 523 brønner. Av disse ble 44 brønner funnet å være positive for antistoffproduk-sjon som vist i tabell 1 nedenfor. 44 brønner viste binding til humant PC i nærvær av kalsiumion, og 32 brønner viste binding til humant PC ved fravær av kalsiumion.

Disse positive brønner ble klonet to ganger ved den begrensende fortynningsmetode. De resulterende kloner ble suspendert i 90% FCS-10%DMSO og lagret i flytende nitrogen.

De monoklonale antistoff, dannet av de individuelle kloner, ble dyrket i bukhulen til Balb/C mus. Humant PC ble isolert fra bukvæsken til musene og opprenset ved å bruke en protein A-sepharose 4B kolonne.

Eksempel 2

IgG av de individuelle kloner opprenset fra musebukvæsken, ble undersøkt for subklasser, effekt på human PC-aktivitet, bindingsaktivitet til L-kjeden eller H-kjeden og bindingsaktivitet til humant PC hvis Gla-doméne var fjernet ved enzymatisk behandling ved å bruke alfa-chymotrypsin.

Subklassene ble bestemt ved Ouchterlony-metoden ved å bruke anti-mus antisera spesifikt for de individuelle klasser.

Effekten på human PC-aktivitet ble bestemt ved å blande IgG og humant PC i et molforhold på 5:1, inkubering av blandingen over natten ved 4"C under aktivering av humant PC ved et thrombin-thrombomodulingkompleks, og å måle den humane PC-aktivitet ved å måle dekomponeringsaktiviteten til et syntesesubstrat. Som syntesesubstrat ble det brukt H-Val-

2HC1 (hvor Val representerer optisk

aktivt D-valin, Leu representerer optisk aktivt Lleusin og Arg representerer opptisk aktivt L-arginin; et produkt av Kabi Vitrum AB av Sverige betegnet S-2266).

Bindingsaktiviteten til L-kjeden eller H-kjeden ble bestemt ved å underkaste humant PC elektroforese under reduserende betingelser, fulgt av immunoblotting ved å bruke en nitro-cellulosemembran og HRP-merket geit anti-muse IgG.

Det Gla-doméne-fjernede humane PC ble fremstilt ved begren-set hydrolyse under bruk av alfa-chymotrypsin i henhold til metoden til Esmon et al. [N. L. Esmon et al., J. Bio. Chem., 258, 5548-5553 (1983)], og ved immunoblotting hvor dets bindingsegenskaper til antistoffet ble bestemt.

Egenskapene til antistoffene dannet av de seks kloner er oppsummert i tabell 2. Kalsiumavhengige antistoff bandt alle til L-kjeden, og selv ved nærvær av kalsiumion bandt de ikke til humant PC fra hvilket Gla-doménet var fjernet. Disse antistoff ble vist å binde til kalsiumionet og gjenkjenne kun det humane PC som undergitt konformasjonsforandring avhengig av Gla-doménet.

Eksempel 3

Måling av humant PC i plasma

PC ble undersøkt ved de følgende to metoder av IRMA (immuno-radiometrisk assasy) ved å bruke plasmaprøver tatt fra

normale friske personer, plasmaprøver tatt fra pasienter med protein C-mangel, plasmaprøver tatt fra pasienter med leversykdom og plasmaprøver tatt fra pasienter tilført warfarfin.

Metode A

Plasmaprøvene og en standard plasmaprøve ble hver fortynnet med 0,05M Tris-HCl (pH 7,4)/0,15 M NaCl (TBS) inneholdende 1% BSA, og fordelt til brønnene av en mikrotiterplate belagt med antistoffet (6C3) i stand til å binde H-kjeden til PC og blokkert med 1% BSA. Platen ble inkubert ved 37°C i 3 timer, og brønnene ble vasket med 1% BSA/TBS/O,05% Tween 20. <125>i-merket kalsiumavhengig PC antistoff (7B12) fortynnet med 1% BSA/TBS inneholdende 5 mM CaCl2 ble tilsatt. Platen ble inkubert ved 37°C i tre timer, og brønnene ble vasket med 1% BSA/TBS/O,05% Tween 20 tilsatt 5 mM CaCl2- Brønnene ble så telt med en gamma-teller.

Metode B

Fremgangsmåten til metode A ble gjentatt bortsett fra at 1-251-raerket kanin antiserum PC antistoff ble brukt som det ^-251-merkede andre antistoff.

Resultatene av målingene er vist i medfølgende tegning. I plasmaprøvene tatt fra normale friske personer, pasienter med protein C-mangel og pasienter med leversykdom var målingsverdiene erholdt ved metode A og B godt i overenstemmelse med hverandre og korrelasjonskoeffisienten var t=0,99. I tilfelle med plasmaprøvene fra pasientene tilført warfarin var målingsverdiene erholdt ved metode A lavere enn de erholdt ved metode B. Dette viser at Gla-manglende PC (PIVKA-PC) som ikke undergikk konformasjonsforandring, avhengig av Gla selv i nærvær av kalsiumion, ble utskilt i blodet. Mengden av Gla-manglende PC (PIVKA-P) kan bli tatt som forskjellen mellom to målte verdier erholdt ved metodene A og B.

I tegningen viser sirkulære merkinger de målte verdier til

prøvene fra normalt friske personer; de firkantede merkinger målte verdier for prøver fra pasienter med leversykdom; tre-kanter målte verdier for prøver fra pasienter med protein C-mangel og sorte sirkulære merker de målte verdier for prøver fra pasienter tilført warfarin.

Eksempel 4

Måling av mengden av PC antigen før og etter tilføring av warfarin: Protein C i plasmaprøvene tatt før og etter tilføring av warfarin, ble målt ved de samme to metodene A og B som i eksempel 3.

Tabell 3 viser resultatene av målingene i to tilfeller. I de to tilfellene var mengden av protein C før tilførsel av warfarin i det normale område og de målte verdier ved de to metodene A og B var i god overenstemmelse med hverandre. Imidlertid etter tilføring av warfarin sank tydeligvis protein C-nivået. Mengden av PC målt ved metode A etter til-førsel var en halv gang av den ved metode B eller mindre. Dette viser at tilførsel av warfarin minket mengden av protein C utskilt i blodet og det Gla-manglende protein C (PIVKA-PC) ble utskilt.

Eksempel 5

(1) Fiksering av antistoff til et uløselig bærestoff

0,5 g tørr gel av sepharose 4B (laget av Pharmacia Fine Chemicals) aktivert med cyanogenbromid ble svellet og vasket med 100 ml ImM HC1 på et G3 glassfilter, og ytterligere vasket med en koblingsbuffer (0,1M NaHC03 inneholdende 0,5M NaCl, pH 8,3). Etter at koblingsbufferen var fjernet ved sug, ble gelen umiddelbart tilført 2 ml av en oppløsning av antistoff (6H2) i en koblingsbuffer (3 mg/ml) og suspendert. Suspensjonen ble rystet lett over natten ved 4°C. Gelen ble så overført til IM etanolamin-HCl (pH 8,0, 2 ml), og rystet ved romtemperatur i to timer for å blokkere de gjenværende aktive seter. Etter blokkering ble den antistoffkoblede sepharosegel vasket alternerende med 0,1M acetatbuffer (pH 4,0) inneholdende 0,5M NaCl og 0,1M boratbuffer (pH 8,0) inneholdende 0,5M NaCl på et glassfilter. Når absorbansen til filtratet ved 280 nm var mindre enn 0,01, ble det ekvilibrert med 5 mM CaCl2 og 0,05M Tris HC1 (pH 7,4) og pakket i en kolonne. Affinitetskromatografien ble utført ved å bruke den antihumane PC monoklonale antistoff (6H2)-koblede sepharose 4B kolonne således fremstilt.

(2) Adsorbsjon av protein C på det antistoffkoblede sepharose 4B og dets eluering. 8 ml av en IM BaCl2 oppløsning ble satt til 100 ml humant plasma og blandingen ble omrørt ved 4°C i 1 time. Presipita-tet ble samlet opp ved sentrifugal separering og vasket med 0,1M NaCl inneholdende 5 mM BaCl2 og 5mM benzamidin, og så oppløst i 0,2 M EDTA (pH 7,4) inneholdende 15 ml 5 mM benz-amidineto for å erholde en bariumadsorbert fraksjon. Den bariumadsorberte fraksjon ble dialysert mot 0,05M Tris-HCl (pH 7,4) inneholdende 1 mM benzamidin, og en CaCl2 oppløs-ning ble tilsatt slik at den endelige konsentrasjon nådde 5 mM. Blandingen ble satt på den antistoff-(6H2)-koblede kolonne ekvilibrert med 0,05 M Tris HC1 inneholdende 5 mM CaCl2 og 1 mM benzamidin. Kolonnen ble vasket med 0,05 M Tris-HCl inneholdende 5mM CaCl2, lmM benzamidin og en IM NaCl, og eluert med 0,05 M Tris HCl inneholdende 50mM EDTA og lmM benzamidin. En enkel topp inneholdende PC ble erholdt. PC i fraksjonen eluert fra antistoff sepharose 4B ble renset til en grad så høy som ca. 52 ganger den i den bariumadsorberte fraksjon og gjenvinningsgraden til PC var ca. 48,2%.

Claims (3)

1. Monoklonalt antistoff som binder selektivt til humant protein C til anvendelse in vitro, karakterisert ved at det ikke gjenkjenner humant protein C som ikke har bundet et kalsiumion ved Gla-doménet, men som gjenkjenner humant protein C som har bundet et kalsiumion ved Gla-doménet, hvilket monoklonalt antistoff er produsert av et hybridom dannet cellefusjon mellom humant protein-C-anti-stoff-dannende celler fra ikke-humane dyr andre enn mus og vanlige tilgjengelige myelomceller.

2. Anvendelse av monoklonalt antistoff ifølge krav 1, ved in vitro bestemmelse av tilstedeværelse av humant protein C inneholdende et Gla-doméne i et medium, hvor det med eller uten nærvær av kalsiumion induseres en antigen-antistoffreaksjon mellom dette monoklonale antistoff og det humane protein C.

3. Anvendelse av monoklonalt antistoff ifølge krav 1, ved in vitro separasjon av humant protein C inneholdende et Gla-doméne i et medium inneholdende et humant protein C samt kalsiumioner, hvor det monoklonale antistoff eventuelt er bundet til en uløselig bærer, og hvor det separerte humane protein C eventuelt påfølgende kan fjernes fra det monoklonale antistoff ved senking av kalsiumionkonsentrasjonen i det anvendte medium.