JPH03133378A - 被験体を安定化させて液体中でのその生物学的活性を保存する方法 - Google Patents

被験体を安定化させて液体中でのその生物学的活性を保存する方法

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JPH03133378A
JPH03133378A JP2150093A JP15009390A JPH03133378A JP H03133378 A JPH03133378 A JP H03133378A JP 2150093 A JP2150093 A JP 2150093A JP 15009390 A JP15009390 A JP 15009390A JP H03133378 A JPH03133378 A JP H03133378A
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Rebecca J Hunt
レベッカ・ジョレン・ハント
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、抗体あるいは抗体フラグメントを用いて被験
体を安定化させて、液体中でのその生物学的活性を保存
する方法に関する。
［従来の技術］ 高分子量の生体分子の生理的活性は、その−次構造はも
とより、二次および三次構造に依存することが多い。繊
維状、球状、その曲の構造の分子が公知である。ある高
分子（例えば酵素）の特徴的な立体構造の解体によって
、その分子の活性は著しく減少し、破壊すらされること
がある。分子の三次構造の変化は、熱、強い酸または塩
基、およびその曲の条件を用いてこれをひき起こすこと
ができる。
臨床および研究の両方面で性能を発揮する酵素、ホルモ
ン、およびその池の生体分子の使用は、充分に確立され
ている。そのような化合物は、しばしば単離が困難であ
り、かつその製造が高価である。これらの、およびその
曲の被験体をその生理的活性を破壊する変性、分解、お
よびその他の過程から保護することが所望される。
医療および研究業界においては、抗体と抗原との間の相
互作用が３０年以上も各種の検出方法に利用されている
。広く慣用の手法としては、組織の染色、放射線免疫検
定法、酵素免疫検定法、蛍光免疫検定法、および免疫電
気泳動がある。それぞれの場合に、抗体が特定の抗原と
特異的に結合するという独特の能力が利用されている。
抗体は、体内への抗原の導入に応して形成されるある種
の球状蛋白質として一般的に定義づけることができる。
抗体は分子量が約１６０．０００であって、モノクロー
ナルおよびポリクローナル抗体産生の手法を用いてこれ
を製造することができる。
抗原は、特異的な体液性または細胞性免疫の産物と反応
する物質として定義づけることができる。換言すれば、
抗原とは、抗体と特異的な様式で反応する物質のことで
ある。天然および合成抗原としては、蛋白質、炭水化物
、核酸、脂質など、多種類の形態が公知である。抗体自
体も抗原として作用することができる。ハプテンは、特
定の抗体と反応することができる小型の分子であるが、
複合形態で注射されない限り特異的な抗体産生を誘発す
ることができない。
換言すれば、ハプテンは、高分子の担体、例えばウシ血
清アルブミンと複合されなければならない。
抗体には、それぞれ「可変」領域および「不変部」領域
と称される、機能的に明確に区別される２カ所の領域が
ある。可変領域は、化学的な共有結合を形成することな
く抗原と結合することができる。不変部領域は、細胞の
受容体との会合が可能である。不変部領域の分子的構造
の差異が免疫グロブリンの分類群およびその下位群を特
定する。群は主として５種類存在し、当業界テハそれぞ
れ、■ｇＧ、　ＩｇＡＳｒｇＭ、　ＩｇＤ、　オよびＩ
ｇＥと称されるが、ＩｇＧが最も一般的である。
ある与えられた抗体は、その対応抗原、またはそれと類
似の分子構造の抗原とのみ反応する。
対照的に、ある与えられた抗原は、１種類以上の形態の
抗体と反応することができる。この相互作用を説明する
のに「鍵と錠前」の類比がしばしば用いられる。すなわ
ち、抗原は、ある抗体の対応する構造的形状、すなわち
「錠前」に正確に嵌合する「鍵」のようなものである。
非共イ１結合によって、この複合体は安定化され、相互
に固定される。
抗原と抗体の相互作用は、もっばら３種類の力、すなわ
ち、ファンデルワールスおよびロンドンの力（双極子同
士の相互作用）、疎水性相互作用、およびイオン（クー
ロン力による）結合からもたらされる。
［発明が解決しようとする課題］ 本発明の目的は、抗体に固η丁の特性を利用して、液体
の媒体中での抗原（この場合の「被験体」）の安定化を
図る方法を提供することにある。したがって、本発明は
、処理上望ましい特性（例えば無菌的な濾過の可能性）
を有する安定化された被験体標本の提供を目的とする。
このような方法には、抗体、あるいは抗体フラグメント
を蛋白質、酵素、およびその他の被験体と結合させて、
例えば被験体分子内のペプチド鎖などの自発的なたたみ
込み、あるいはたたみ込みの解体を防ぐ段階が含まれる
。更に、結合する抗体または抗体フラグメントは、蛋白
質分解性の酵素、および各種の酸化性化合物から被験体
（酵素も含む）を遮蔽する。抗体を用いて安定化された
被験体は、その生物活性を保持している。
本発明の好適実施例においては、塩類溶液に被験体を加
え、次いで、この溶液に抗体、あるいは抗体フラグメン
トを加えることによって、安定化された被験体をＪ、ｍ
　装する。溶液を撹拌および加熱し、次いで、冷却およ
び濾過するのが好ましい。次いで、濾液を希釈して、所
望の濃度の規定の基質とする。安定化された複合体の調
製中および調製後における溶液の、抗体を用いて安定化
された被験体の活性を検定する。
［課題を解決するための手段］ 本明細書中で用いられる限りにおいて、「被験体」なる
用語は、抗原となり、あるいは抗原と協働することが可
能な高分子を指すものとする。ペプチド、蛋白質、糖蛋
白質、リポ蛋白質、酵素、炭水化物、核酸などがその例
である。より特定的には、下記の酵素、すなわち、前立
腺酸性ホスファターゼ、アスパラギン酸アミノ基転移酵
素、アラニンアミノ基転移酵素、アミラーゼ、リンゴ酸
脱水素酵素、ウレアーゼ、ヘキソキナーゼ、グルコース
−６−リン酸脱水素酵素、ペルオキシダーゼ、クレアチ
ンリン酸化酵素、。
グルタミン酸脱水素酵素、およびアルカリ性ホスファタ
ーゼが、本発明を用いて安定化させることができる被験
体の若干の代表例である。以下、「抗原」とは、抗原お
よび前記抗原の機能部分を意味するものとする。
本発明によれば、被験体の安定化は、適当な溶媒に被験
体を溶解させる段階から始まる。酵素、抗体、およびそ
の他の球状蛋白質は一般に、水、あるいは酸、塩基、ま
たは塩類の水溶液に可溶である。そうでない被験体は、
水性または非水性の溶液中でこれを溶媒和化させること
ができる。０．５〜３０％塩類溶液を用いるのが好適で
ある。
被験体溶液を調製したならば、これに所定量の抗体を加
える。１種類を越える抗体を加えることができる。本発
明に用いられる抗体の調製、単離、および精製は、当業
界の技術の習熟者が理解する各種の方法によることがで
きる。モノクローナル抗体、およびポリクローナル抗体
を用いて安定化された被験体溶液を調製することが可能
である。例えば、哺乳類を宿主として問題の被験体をこ
れに注射し、それによって、抗体の形成に至るような抗
原性の応答を誘発させることによって、ポリクローナル
抗体を産生させることができる。この哺乳類より採血し
た後、標準的分画手法を用いて、それぞれ特定の被験体
に特異的な各種の抗体を単離する。このようにして産生
された抗体を被験体と結合させると、安定化された被験
体・抗体複合体を形成することができる。これに用いる
哺乳類としては、ラット、マウス、霊長類、ヤギ、ヒツ
ジ、ウサギ、ウシ、ウマ、およびその池がある。
被験体・抗体複合体溶液の調製後、安定化された被験体
・抗体複合体の形成に充分な時間、溶液を撹拌および加
熱する。反応系に応じて、平衡に達する時間は、秒単位
、時間単位、あるいは日単位にわたることがある。典型
的には、被験体・抗体溶液を大気温度乃至約６５℃にて
数分乃至数時間加熱する。温度を上昇させると、安定化
された被験体・抗体複合体の形成が促進されるばかりか
、溶液中の安定化を損なうような酵素の活性が低下し、
あるいは完全に抑えられさえする。
安定化に充分な時間が経過した後は、被験体・抗体複合
体溶液を冷却し、濾過し、次いで、被験体含量の検定を
行う。平衡に達せしめた溶液を適当な粒子径制御装置、
例えば、濾過器、分子ふるい、樹脂、中空繊維、および
螺旋カートリッジ式排除器を通過させることによって、
濾過を実施することができる。０２μｍの孔眼寸法の無
菌濾過器を用いるのが好適である。所望の場合、試薬、
緩衝液、塩類溶液、蛋白質溶液、高分子溶液、およびそ
れらの混合液として調製され得る基質を濾液に加えて、
これを希釈することができる。本発明において好適とさ
れる蛋白質の基質液は、基本的には、哺乳類のぽ■清、
例えば、ヒト、ウシ、ウマ、ブタ、またはウサギの血清
および類似の成分、あるいはそれらの混合物を用いて構
成される。所望の通りの蛋白質基質で希釈することによ
って、抗体を用いて安定化被験体の活性を調整すること
かできる。
所望に従って、蛋白質溶液を加熱し、冷却し、更に旋過
することができる。
ある種の被験体は、これを完全な抗体分子と反応させる
と、はとんどの抗体の抗体結合価が一般に二価であるこ
とも手伝って、不溶性の免疫複合体を形成する傾向があ
ることが判明している。免疫複合体は、極めて高分子量
であり、不溶、かつ、無菌濾過などの処理手法に不適当
であることが多い。
したがって、本発明の好適実施例においては、抗体のＦ
ａｂフラグメント、あるいは完全な抗体とＦａｂフラグ
メントとの混合物が被験体溶液に加えられる。Ｆａｂフ
ラグメントの抗体結合価は、価であるから、不溶性免疫
複合体の形成は回避され、安定化および濾過可能性とい
う利点が得られる。
抗体のフラグメント化には、多数の方法を用いることが
できる［デイ−・グブリュー・ウェアーターナ−（ＤＪ
、　１Ｆｅｉｒ　Ｔｕｒｎｅｒ）およびスタンワース（
Ｓｔａｎｗｏｒｔｈ）　：　　ｒ実験免疫学ハンドブッ
ク（ｌｌａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ
ａｌ　ｒｍｍｕｎｏｌｏｇｙ月、第２版（１９７３年）
、英国オックスフォード所在、ブラックウェル・サイエ
ンティフィック・パブリケーンヨン社発行］（本書は参
照によって本発明に組み込まれる）。好適な方法は、酵
素、例えばパパインを用いたパパイン加水分解法である
。パパイン（パバヨチンとも称される）は、実質的に熱
に安定な酵素であって、蛋白質分子を「消化する」、す
なわち断片化する能力がある。水性媒体中で抗体をパパ
インで処理すると、３本の抗体フラグメント、すなわち
、ｒＦａｂＪなるフラグメント２本とｒＦｃＪなるフラ
グメント１本とが生じる。Ｆｃとは、抗体分子の［不変
の（ｃｏｎｓｔａｎｔ）Ｊ領域が含まれるフラグメント
であることを示す。
Ｆａｂフラグメントにはそれぞれ、１カ所の抗原結合部
位（「可変」領域）が存在し、完全な抗体分子と同様に
抗原と結合することができる。
対照的に、ＦＣフラグメントは、しばしば抗原結合能を
欠いているが、もとの抗体の抗原性および生物学的特性
の多くを保存している。
［実施例］ 安定化されたＡＣＰを下記の要領で調装する。
ＡＣＰを４℃にて０９％塩化ナトリウムｉｏ＋ｎ／に加
えて、濃度を８７７国際単位とする。この溶液にＦａｂ
　６　Ｑ１０を加える。ここで、ｒＦａｂＪは、各種ポ
リクローナル抗体のパパイン加水分解によって生しる抗
体フラグメントを意味するものとする。
抗体は、咄乳預を宿主としてＡＣＰで誘発した抗原応答
に対応して産生されたものである。
溶液を室温にて４時間震くミする。次いでＩｇＧ４、８
ｍｇをこれに加える。ここで、目ｇＧＪは、上記の要領
で調製されたポリクローナル抗体の完全な分子を意味す
るものとする。
溶液を室温にて１晩震盛し、次いで５６℃にて３６分間
加熱する。
溶液を４℃に冷ｔ（］　Ｌ、孔眼寸法が０２μｍの濾過
器を用いて濾過する。
慣用の手法を用いて、濾液のＡＣＰを検定する。
蛋白質の７．（質を加えて濾液を希釈し、５７℃にて３
０分間加熱し、次いで４℃に冷却する。
再び、濾液を０２μｍの濾過器を用いて濾過する。
」−記の要領で調製した安定化ＡＣＰの酵素活性を第１
表に示す。異なる温度における安定性を調べた。得られ
た結果は、高温における３日間の後でも酵素活性が高く
保たれることを示している。対照溶液は、４℃での経過
時間ゼロの時点におけるへＣＰ濃度が１００国際単位で
あった。
低温での長期間の安定性を調へ、結果を第２表に示す。
ＡＣ＋１活性は、７１［］後でさえ保たれている。ｒＲ
，Ｔ、Ｊは室温を意味する。
第２表 下記の要領で安定化ＡＬＰを調装する。
ＡＬＰを０．９％塩化ナトリウム溶液に加えて、濃度を
１．８．５００国際単位とする。
Ｆａｂ１２０ｍｑを上記の溶液１２ｍ１に加え、得られ
た溶液を室温にて２時間τ盛する。Ｆａｂは、ＡＩ、Ｐ
で誘導したポリクローナル抗体のパパイン加水分解によ
って調装したものである。
上記混合液にＩｇＧ２５ｍｑを加える。ここで、［ｇＧ
は、吐乳類を宿主としてＡＩ、Ｐで誘発された抗原応答
に応じて産生された、ポリクローナル抗体の完全な分子
である。
混合液を室温にて１晩震盪する。
混合液を５７℃にて３５分間加熱し、次いで、４℃に冷
却し、孔眼寸法が０．２μｍの濾過器を用いて濾過する
。
ＡＬＰの検定後、濾液に蛋白質の基質を加えて所望の濃
度に希釈し、５７℃にて３０分間加熱し、更に４℃に冷
却する。
次いで、安定化された溶液を孔眼寸法が０．２２℃１ｍ
の濾過器を用いて濾過する。
ＡＬＰの短期間（促進的条件）および長期間の安定性に
ついて調べた結果を、それぞれ第３表および第４表に示
す。
筆（３）表 した後のＡＬＰの活性（国際単位） １３ ７ １ ６ １ 上記の要領による被験体の安定化によって、変性および
分解に導くような条件に耐え、かつその生物活性がかな
りの期間保持される標本が形成される。
当業界の技術の習熟者には、本発明の基本的精神および
対象範囲から逸脱することなく、本発明に多数の追加的
変更および改良をなし得ることが理解されるものと思わ
れる。したがって、本発明は、上記の説明に限定される
のではなく、先に記載の請求節回にのみ限定されるもの
である。
ｒ＝’−一’を

Claims (24)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）被験体を液体に溶解させて溶液を形成する段階と
    、 活性剤、阻害剤、基質、およびその類似物を添加する段
    階と、 抗体、抗体フラグメント、およびそれらの混合物からな
    る一群から選択される安定化物質を温度に対して安定な
    被験体・抗体複合体を形成するのに充分な時間だけ被験
    体溶液に添加する段階と からなることを特徴とする被験体を安定化させて液体中
    のその生物学的活性を保存する方法。
  2. （２）抗体が、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗
    体、およびそれらの混合物からなる一群から選択される
    請求項（１）記載の被験体を安定化させる方法。
  3. （３）抗体が、被験体に対する哺乳類およびその他によ
    る抗原応答によって産生される請求項（１）記載の被験
    体を安定化させる方法。
  4. （４）抗体フラグメントが、Ｆａｂフラグメント、Ｆｃ
    フラグメント、およびそれらの混合物からなる一群から
    選択される請求項（１）記載の被験体を安定化させる方
    法。
  5. （５）抗体フラグメントが、酵素による抗体の加水分解
    によって得られる請求項（４）記載の被験体を安定化さ
    せる方法。
  6. （６）酵素がパパインである請求項（５）記載の被験体
    を安定化させる方法。
  7. （７）被験体が、ペプチド、蛋白質、糖蛋白質、リボ蛋
    白質、酵素、ハプテン、炭水化物、核酸、およびそれら
    の混合物からなる一群から選択される請求項（１）記載
    の被験体を安定化させる方法。
  8. （８）被験体が、前立腺酸性ホスファターゼ、アスパラ
    ギン酸アミノ基転移酵素、アラニンアミノ基転移酵素、
    アミラーゼ、リンゴ酸脱水素酵素、ウレアーゼ、ヘキソ
    キナーゼ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、ペルオ
    キシダーゼ、クレアチンリン酸化酵素、グルタミン酸脱
    水素酵素、およびアルカリ性ホスファターゼからなる一
    群から選択される酵素である請求項（１）記載の被験体
    を安定化させる方法。
  9. （９）被験体が、酸化還元酵素、転移酵素、加水分解酵
    素、脱離酵素、異性化酵素、および合成酵素からなる一
    群から選択される酵素である請求項（１）記載の被験体
    を安定化させる方法。
  10. （１０）被験体・抗体混合物を高温度に加熱して、被験
    体・抗体複合体の形成を促進する請求項（１）記載の被
    験体を安定化させる方法。
  11. （１１）高温度がほぼ大気温度乃至約６５℃である請求
    項（１０）記載の被験体を安定化させる方法。
  12. （１２）被験体・抗体複合体を形成する時間が１秒乃至
    数日の範囲である請求項（１）記載の被験体を安定化さ
    せる方法。
  13. （１３）安定化された複合体を、粒子径制御濾過器を用
    いて濾過する段階が更に含まれる請求項（１）記載の被
    験体を安定化させる方法。
  14. （１４）粒子径制御器具が、濾過器、分子ふるい、樹脂
    、中空繊維、および螺旋カートリッジ式排除器からなる
    一群から選択される請求項（１３）記載の被験体を安定
    化させる方法。
  15. （１５）濾過器が無菌濾過器である請求項（１４）記載
    の被験体を安定化させる方法。
  16. （１６）濾過器が約０．２μｍまたはそれ以下の孔眼寸
    法である請求項（１４）記載の被験体を安定化させる方
    法。
  17. （１７）安定化された複合体を基質中で希釈する段階が
    更に含まれる請求項（１）記載の被験体を安定化させる
    方法。
  18. （１８）基質が、試薬、緩衝液、塩類溶液、蛋白質溶液
    、および高分子溶液からなる一群から選択される請求項
    （１７）記載の被験体を安定化させる方法。
  19. （１９）蛋白質溶液が、ヒトの蛋白質、ヒト以外の蛋白
    質、およびそれらの混合物からなる一群から選択される
    蛋白質の溶液である請求項（１８）記載の被験体を安定
    化させる方法。
  20. （２０）基質がヒトまたは動物の血清、あるいはそれら
    の混合物である請求項（１８）記載の被験体を安定化さ
    せる方法。
  21. （２１）基質が、生物体液の化学的診断に用いられる試
    薬である請求項（１８）記載の被験体を安定化させる方
    法。
  22. （２２）被験体を前記被験体の抗体、あるいは抗体フラ
    グメントと反応させる段階が含まれることを特徴とする
    被験体を熱的または化学的分解から保護する方法。
  23. （２３）前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）を、ＰＡ
    Ｐを用いて誘導された全ポリクローナル抗体、およびパ
    パイン消化によって形成されたそのポリクローナル抗体
    フラグメントと反応させる段階が含まれることを特徴と
    する血清中のＰＡＰを安定化させる方法。
  24. （２４）アルカリ性ホスファターゼ（ＡＬＰ）を、ＡＬ
    Ｐを用いて誘導された全ポリクローナル抗体、およびパ
    パイン消化によって形成されたそのポリクローナル抗体
    フラグメントと反応させる段階が含まれることを特徴と
    する血清中のＡＬＰを安定化させる方法。
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