JPH026518B2 - - Google Patents
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- JPH026518B2 JPH026518B2 JP56174684A JP17468481A JPH026518B2 JP H026518 B2 JPH026518 B2 JP H026518B2 JP 56174684 A JP56174684 A JP 56174684A JP 17468481 A JP17468481 A JP 17468481A JP H026518 B2 JPH026518 B2 JP H026518B2
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、ATCC31724またはATCC31725とし
て同定される特性をもつミクロテトラスポラカエ
シアsp.nov.なる菌株を水性媒質中で浸漬好気性
条件下で培養媒質中に実質量のノカルジシンが生
成するまで培養すること、および任意に培養媒質
からノカルジシンを回収すること、によつて周知
の抗生物質たるノカルジシンを製造する方法に関
するものである。従来技術の操作と同様にして、
本発明の方法によりノカルジシンＡ（主成分）と
ノカルジシンＢ（少量成分）がえられ、これらは
所望ならば周知の操作によつて容易に分離するこ
とができる。 ノカルジシンに関連する従来技術として次のも
のがあげられる。 (A) ノカルジシンは1975年の第15回Inter−
science Conference on Antimicrobial
Agents＆Chemotherapy（Abstract97）におい
てH.アオキらによつて最初に報告された。こ
のものはコードNo.FR−1923と名付けられ、ノ
カルジアユニホルミスvar.ツヤマネンシス
ATCC21806の培養によつて生産される未知構
造の（β−ラクタム環を含むことは知られてい
たけれども）抗生物質であつた。 (B) 米国特許第3923977号には抗生物質FR−1923
（当時は未知構造のものであつたが今ではノカ
ルジシンとして知られている）およびノカルジ
アユニホルミスvar.ツヤマネンシス
ATCC21806の培養によるその製造法が開示さ
れ特許請求されている。 (C) H.アオキらは上述のフオローアツプ刊行物
としてのJ.Antibiotics29、492−500（1976）に
おいて、FR−1923をノカルジシンＡと名付け、
その構造を与え、そしてその分離と特性を記述
している。彼等はまたこの発酵液中に他の未同
定の少量成分があることを指摘している。 (D) M.ハシモトらはJ.Am.Chem.Soc.、98、3023
−５（1976）において、ノカルジアユニホルミ
スvar.ツヤマネンシスATCC21806によつて生
産されるノカルジシンＡおよびＢの構造を報告
している。これらの化合物はオキシム官能基に
おいて立体異性体である。ノカルジシンＡはシ
ン（syn）関係にあるオキシムとアシルアミノ
部分とをもつ化合物であり、ノカルジシンＢは
トランス関係でこれらの部分をもつ化合物であ
る。 (E) M.クリタらはJ.Antibiotics、29、1243−５
（1976）においてノカルジアユニホルミス
subsp.ツヤマネンシスATCC21806からのノカ
ルジシンＢの分離および特性を述べている。 (F) 特開昭54−151196号（ダーウエント02700C）
にはストレプトマイセスアルカロフイラス
ATCC31393と名付けられたストレプトマイセ
スの新規な好塩基性菌株の培養によるノカルジ
シンＡの製造が開示されている。 (G) 特開昭55−45327号（ダーウエント35223C）
にはノカルジアsp.No.Ｃ−14509（FERM−
P4642）の培養によるノカルジシンＡおよびＢ
の製造が開示されている。 (H) 米国特許第4212944号にはノカルジオプシス
アトラHuang sp.nov.ATCC31511の培養によ
るノカルジシンＡの製法が開示され特許請求さ
れている。 このように周知の抗生物質ノカルジシンは次の
構造式をもつ。 本発明によれば、この物質はミクロテトラスポ
ラ（Microtetraspora）属のある種の新種を同化
性の炭素源および窒素源を含む水性培養媒質中で
浸漬好気性条件下で発酵させることによつて製造
される。 微生物 β−ラクタム抗生物質を検査する過程におい
て、ノカルジシンを生産する２つの異常なアクチ
ノマイセテス菌株No.G432−４およびＧ−434−６
がインドで集めた土壌サンプルから分離された。
両菌株は20℃〜50℃の温度において天然媒質また
は化学的に作られた媒質上でよく生育する。 菌株No.432−４は密な気生菌糸をもつており、
その菌糸上に短い胞子鎖が生じる。この胞子鎖は
１つの鎖中に２〜６個の胞子を含み、集塊となつ
た担胞子体上の厚い塊りに発達する。この気生の
塊りの色相は淡青色または灰緑色である。２種類
の胞子を内蔵する小嚢と単一極鞭毛をもつ運動性
胞子とが基質菌糸中に生じる。寒天中にやや拡散
しうる暗灰緑色の色素がほとんどの寒天媒質中に
生じる。菌種No.G432−４とは異なり、菌株No.
G434−６は気生菌糸を全くまたは僅かしか生産
せず、緑色の色素も生産しない。この菌株は菌株
G434−４にみられるように厚い基質菌糸中に２
種類の胞子内蔵小嚢と鞭毛のついた胞子とを形成
する。 この２種類の菌株は特徴ある細胞壁成分として
メソ−ジアミノピメリン酸、グルコースおよび少
量のマンノースおよびラムノースをもつている。
ノカルドミコール酸はこの栄養菌糸中には存在し
ない。 アクチノマイセタルスのいくつかの属との比較
研究の結果として、菌株No.G432−４およびG434
−６はミクロテトラスポラ属の新種であると決定
された。この新種の名称ミクロテトラスポラカエ
シアは青灰色の気生菌糸にかんがみ菌株G432−
４およびG434−６に対して提案された。菌株
G432−４およびG434−６の培養菌は米国ワシン
トン特別地区のAmerican Type Culture
Collectionにブタペスト条約に基づく国際寄託さ
れ、それぞれATCC31724およびATCC31725とし
てその微生物永久コレクシヨンに加えられた。 材料および方法 比較研究に使用した微生物には次のものが含ま
れている：アクチノマジユラマジユラエ
（Vincent）Lechevalier＆Lechevalier1968；マ
イクロポリスポラアンジオスポラZhukova、
Tsyganov＆Morozov1967KCC Ａ−0109；ミク
ロポリスポラカエシアKalakoutskii1964KCCA
−0098；ミクロポリスポラフアエニイCross、
Maciever＆Lacey1968KAA Ａ−0099；ノカル
ジアコラリナ（Bergeyら）Waksman＆
Henrici1948；ノカルジアルテアCastellani＆
Charlmer1919；ノカルジアユニホルミスsubsp.
ツヤマネンシスAokiら1967ATCC21806；ノカル
ジオプシスダソンビレイ（Brocq−Rousseu）
Meyer1976ATCC23218；ミクロテトラスポラビ
リジスNonomura＆Ohara1971ACC Ａ−0112；
およびサツカロポリスポラヒルスタLacey＆
Goodfellow1975KCC Ａ−0170。 培養および生理学的研究のために使用した文献
は次のとおりである：(1)Shirline、E.B.＆D.
Gottlieb：Methods for Characterization of
Streptomyces species、Int.J.Syst.Bacteriol.、
16、313−340（1966）；(2)Waksman、S.A・：
The Actinomycetes、vol.2、（1961）；(3)
Luedemann、G.M.：Micromonorpora
Purpureochromogenes（Waksman＆Curtis1916）
Comb.Nov.（Snbjective Synonym：
Micromospora Fusca、Jensen1932）、Int.J.
Syst.Bacteriol.、21、240−247（1971）。 細胞壁の化学分析のために使用した文献は次の
とおりである：(1)Yamaguchi、T.：Comparison
of the cell−wall composition of
morphologically distinct actinomycetes、J.
Bacteriol.、89、444−453（1965）；(2)
Lechevalier、M.P.and H.Lechevalier：
Chemical methods as criteria for the
separation of nocardiae from other
actinomycetes、Biology of the
Actinomycetes and Related Organisms、11、
78−92（1976）。 分類学的記述のために使用した文献は次のとお
りである：(1)Bergey's Manual of
Determinative Bacteriology、8th ed.（edited
by R.E.Buchanan and N.E・Gibbsons）599−
861、1974；(2)Actinomycetales：
characteristics and practical importance
（edited by G.Sykes and F.A.Skinner）、
Society for Applied Bacteriology Symposium
SeriesNo.２、11−91、1973。 形態学 基質菌糸の菌糸体は0.4〜0.8μの直径をもち寒
天表面上で生育するか又は寒天中を浸透して叉状
に分枝する。短い繊毛を生成する基質菌糸の部分
的な分裂は固体媒質上に３〜４週間後に認められ
る。これは気生菌糸を欠く菌株G434−６につい
てより顕著に認められる。菌株G432−４の気生
菌糸体は長く、そして適度に分岐している。２〜
６個の、時には８個の胞子が鎖中に生まれ、そし
て分岐した胞子鎖がしばしば生成する。胞子鎖は
菌糸体の面に直接生まれるか又は単軸的に分岐し
た担胞子体上に直接生まれる。胞子形成は担胞子
体の単軸型分岐および菌糸体のさや中の向基的発
芽から生育する。胞子体の軸にそつて集塊する担
胞子は培養につれて胞子の厚い塊りに生育する。 胞子は球形もしくは楕円形の形状で、（0.7〜
1.0μ）×（0.7〜1.6μ）の大きさであり、平滑な表面
をもつている。時には気生胞子体チツプは胞子鎖
のように分裂し、無胞子生殖らせん状菌糸体が気
生菌糸中に単純に生成する。基質菌糸中に、球形
もしくは楕円形の半透明のカプセル（小胞）が見
出され、これは単一の胞子又は２〜６個の胞子の
直鎖を包んでいる。更に、不規則に又はしつかり
とコイル状になつた胞子鎖が時として認められ
る。上述の構造は栄養に富んだ媒質たとえばモル
ト−イースト又はベネツト寒天中での28℃におけ
る３〜４週間の培養後に認められる。楕円形の又
はバナナ形状の運動性胞子が菌糸塊の水性懸濁液
中に生成する。運動性胞子は単一の長い極鞭毛を
もち、培養後に出芽管を形成する。 培養特性 菌株G432−４およびG434−６は絶対好気性で
あり、20℃〜50℃の範囲で適度に生育する。菌株
G432−４は55℃においてさえ生育するが、菌株
G434−６は生育しない。イースト−モルト寒天
上の群体は円形で肉厚であり、放射状の又は不規
則なしわをもち、37℃での１週間の培養後に直径
３〜５mmになる。 菌株G432−４は豊富な気生菌糸を生成し、チ
ヤペツク寒天、イースト−モルト寒天、オートミ
ール寒天、グリセロール−アスパラギン寒天およ
びチロシン寒天に淡青色または灰緑青色の胞子鎖
塊を生み、そしてほとんどの媒質中で弱拡散性の
緑色色素を生産する。菌株G434−６はふつうの
寒天媒質（ISP媒質No.２、４、５および６ならび
にベネツト寒天）中で気生菌糸、胞子または色素
を生産しないが、チヤペツク寒天ならびにISP媒
質No.３および７中では僅か又は若干の気生菌糸を
生成する。菌株G432−４およびG434−６の培養
特性を第１表に要約して示す。 【表】 【表】 生理学的特性 菌株G432−４およびＧ−434−６はリゾチーム
の作用に対して抵抗性がある。その生育は３％
Naclの存在で制限され、５％では完全に抑制さ
れる。硝酸塩はペプトン液またはグルコースチヤ
ペツク液中で亜硝酸塩に還元されない。セラチン
はG432−４によつて溶かされるが、菌株Ｇ−434
−６によつては溶かされない。ミルクは菌株
G432−４によつて完全にペプトン化されるが、
菌株G434−６によつては部分的にペプトン化さ
れるにすぎない。硫化水素がシステインから生成
する。メラノイド色素はISP媒質No.１、６および
７中では生成されない。ルエデマンのポテトプラ
グ試験において生育はPH5.7において抑制される。
酸はグルコース、フラクトースまたはグリセロー
ルからは生成されない。菌株G432−４および
G434−６の生理学的特性を第２表に示す。 【表】 硝酸塩から亜硝酸塩へ 陰性
無機媒質〓チヤペツクのグルコース
硝酸塩液
【表】 育しない。
菌株G432−４およびG434−６の炭素源同化パ
ターンを第３表に示す。これら２種の菌株はグリ
セロール、Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース、
Ｌ−ラムノース、Ｄ−グルコース、Ｄ−ガラクト
ース、Ｄ−フラクトース、Ｄ−マンノース、ラク
トース、セロビオース、メリビオース、トレハロ
ース、でんぷんおよびＤ−マニトールを生育する
ために同化する。Ｌ−ソルボース、Ｄ−メレゾイ
トース、ダルシトール、イノシトールおよびＤ−
ソルビトールは上記のいづれの菌株によつても同
化されない。また、サクロースおよびラフイノー
スは菌株G432−４によつて同化されない。 【表】 グリセロール ＋ ＋
＋ ＋ ＋
D(−)アラビノース ＋ ＋
− − −
L(＋)アラビノース ＋ ＋
＋ ＋ ＋
【表】 細胞壁の組成 第４表に示すように、菌株G434−６の細胞壁
は特徴的なアミノ酸としてメソ−ジアミノピメリ
ン酸と痕跡量のグリシンとを含んでいる。細胞全
体の加水分解物は天然糖類としてグルコース、マ
ンノース、および痕跡量のリボースとラムノース
を含んでいる。かくて、メソ−ジアミノピメリン
酸（DAP）は菌株G434−６の細胞壁組成物中の
唯一の特徴的な成分であると考えられる。それ
故、菌株G434−６の細胞壁はTypeｃとして分
類しうる。菌株G434−６の細胞壁の脂質留分中
のノカルドミコール酸の不存在はMordarska、
Mordarski＆Goodfellow、J.Gen.Microbiol、
71、77−86（1972）の方法により示された。 【表】 分類学的検討 菌株G432−４およびG434−６を、気生菌糸上
に胞子鎖をもち細胞壁中にメソージアミノピメリ
ン酸をもつアクチノマイセタルス目の６個の属す
なわちノカルジア、ミクロポリスポラ、ミクロテ
トラスポラ、ノカルジオプシス、サツカロポリス
ポラおよびアクチノマジユラと比較した。菌株
G432−４およびG434−６は気生菌糸上の短い胞
子鎖の緑青色塊の形成において、および向基的発
芽胞子形成においてミクロポリスポラ属のいくつ
かの種に似ているが、基質菌糸中の胞子鎖集団の
欠如、リゾチームに対する抵抗性、塩化ナトリウ
ムに対する敏感性および細胞壁中のアラビノース
およびガラクトースの不存在においてこれらとは
異なる。ノカルジオプシス属およびサツカロポリ
スポラ属は気生菌糸の全部分中に胞子を生じる。
これらの属の気生胞子は菌糸体が長いセグメント
に分裂し次いでこれが２次分裂して不規則大きさ
のより小さなフラグメントになるようなふうにし
て形成される。これらの明らかに相違する胞子形
成機構を勘案して、菌株G432−４およびG434−
６はノカルジオプシス属およびサツカロポリスポ
ラ属から容易に区別される。更に、これら２つの
新規な菌株はリゾチームに対する抵抗性において
ノカルジオプシス属とは異なり、そしてその平滑
な胞子表面、細胞壁中のアラビノースの欠如、リ
ゾチームに対する抵抗性および塩化ナトリウムに
対する敏感性においてサツカロポリスポラ属とは
異なる。菌株G432−４およびG434−６は青緑色
気生菌糸および気生の短い胞子鎖を形成するアク
チノマジユラ属のいくつかの種に似ているが、向
基的発芽型の胞子形成、鎖中の少ない胞子の形
成、胞子鎖集団、および全細胞加水分解物のマジ
ユロースの欠如において後者とは異なる。 N.ユニホルミスsubsp.ツヤマネンシスは短い胞
子鎖の形成、グルコース、フラクトースおよびグ
リセロールからの酸生成の欠如、リゾチームに対
する抵抗性および塩化ナトリウムに対する敏感性
において、本発明の新菌株と若干の類似性をも
つ。然しながら、菌株G432−４およびG434−６
の向基的発芽、球形胞子、多くの分岐した担胞子
体を含む明白な胞子鎖集団、１〜数個の胞子の融
合した鎖および緑青色の厚い気生菌糸、菌糸体中
にセグメント化によつて起る桿状胞子を生産する
且つ単一胞子鎖および白色または淡色の未発達気
生菌糸を形成しうる能力をもつノカルジアのスポ
ロジエニツク種から容易に区別される。 Thiemann et al.、J.Gen.Microbiol.、50、295
−303（1968）によれば、ミクロテトラスポラ属
（M.フスカおよびM.グラウカ）は短い胞子鎖
（ほとんどの場合、１つの鎖中に４個の胞子）の
みを気生菌糸上に生産することによつて、ならび
に細胞壁中にメソ−DAP、グリシン、リジン、
痕跡量のLL−DAPをもち、特徴的な糖をもたな
いことによつて、特徴づけられる。Nonomura
and Ohara、J.Ferment.Technol.、49、１−７
（1971）および49、887−894（1971）はミクロテト
ラスポラ属中の２つの追加的な種、すなわち細胞
壁の特徴的成分としてメソ−DAPのみをもつM.
ビリデイスおよびM.ニベオアルビダを報告して
いる。第５表に示すように、菌株G432−４およ
びG434−６は、胞子鎖と胞子形態、胞子形成の
様式、リゾチームまたは塩化ナトリウムに対する
応答、および細胞壁の組成を含む主要特性におい
てミクロテトラスポラ属に密接に関連している。
かくて、菌株G432−４およびG434−６をミクロ
テトラスポラ属の４個の周知の種と比較した。こ
れら４個の種のうちのどれ１つとして45℃におい
て生育しないが、菌株G432−４およびG434−６
は50℃において生育する。気生塊の色系列はM.
フスカおよびM.グラウカについては灰色であり、
M.ビリジスについては緑色であり、そしてM.ニ
ベオアルバについては白色であるが、菌株G432
−４の気生塊の色は青色系列にある。 【表】 セルを形成
グザグ形の プソイドス
する。
菌糸 ポランジア
【表】 ロールか
らの酸
＊ 文献では(−)と報告されているが、我々の試験で
は(＋)を示した。
菌株G434−６は基質菌糸中に２種の小胞を生
成する。その１つは１〜数個の胞子を直線状に包
む半透明小胞であり、他の小胞は不規則に且つし
つかりとコイル状になつた胞子鎖塊である。単一
の極鞭毛をもつ運動性胞子も基質菌糸中に生成す
る。ミクロポリスポラ アンジオスポラは胞子を
包む半透明カプセルをもつと報告されている。然
し、運動性胞子の形成はミクロモノスポラセアエ
科およびノアルジアセアエ科のいかなる属につい
ても報告されなかつた（Bergey's Manual、8th
ed.、1974）。胞子形成小嚢、軟骨質小胞および運
動性鞭毛化要素（運動性同形配偶子）は
Nakazawa、Ann.Rep.Takeda Res.Lab.、25、
24（1966）によつてストレプトマイセス シンデ
ネンシスに対して報告された。運動性胞子は菌株
G434−６中にも気まぐれに認められるけれども、
S.シンデネンシスおよび菌株G434−６中の胞子
生産小胞または運動性要素の形態学的関係は明瞭
ではない。それ故、この２種の小胞および運動性
胞子は分類を決める顕著な形態学的構造とは考え
られない。上述の主要な特性をもとにして、菌株
G432−４およびG434−６はミクロテトラスポラ
属の新種であると決定された。これら２種の菌株
はミクロテトラスポラ カエシアsp.nov.と命名
された。このタイプの菌株はNo.G432−４である。 ミクロテトラスポラ カエシア菌株G432−４
およびＧ−434−６は天然または人工的に容易に
変異するので、本発明はこれらのオリジナル菌株
に限定されないことを理解すべきである。上述の
菌株からＸ線照射、紫外線照射、窒素マスタード
処理、フアージ処理などの手段によつて生成しう
るすべてのノカルジシン生産性の天然および人工
の変異体および変種を含むことを意図している。
他の微生物および抗生物質についてと同じよう
に、単一群体選択後の高生産性菌株の選択によつ
て、種々の変異体化剤による処理によつて、ある
いは組み換え、転換または導入の遺伝的手法によ
つて、より生産性の高いノカルジシンの製造が予
見される。 ノカルジシンの製造 ノカルジシンは菌株G432−４（ATCC31724）
またはG434−６（ATCC31725）の同定特性をも
つミクロテトラスポラ カエシアの菌株を水性栄
養媒質中で浸漬好気性条件下に培養することによ
つて製造される。他のアクチノマイセテスの培養
についての一般的方法がミクロテトラスポラ カ
エシアの培養に適用しうる。栄養媒質はグリセロ
ール、グルコース、フラクトース、マンノース、
でんぷん、デキストリン、マルトース、マニトー
ル、糖蜜、油、脂肪などの同化性炭素源の１種ま
たはそれ以上を純粋な又は粗の状態で含むべきで
ある。栄養媒質はまた、たとえば大豆ミール、フ
イツシユミール、モルトエキス、ペプトン、イー
ストエキス、蒸留可溶物、グルテンミール、コー
ンステープ液、硝酸塩、アンモニウム塩、尿素な
どの同化性窒素源の１種またはそれ以上を含むべ
きである。栄養無機塩たとえば塩化ナトリウム、
リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、炭酸カルシ
ウム、および痕跡量の重金属塩たとえば銅、亜
銅、マンガン、銅の塩などを栄養培質に加えるこ
ともできる。浸漬好気性培養において、発泡防止
剤たとえば液体パラフイン、大豆油、脂肪または
シリコーンを加えることもできる。 発酵温度は約20゜〜約50℃（菌株G432−４の場
合には55℃）の範囲、好ましくは約25゜〜約40℃
の範囲、そして最も好ましくは約25゜〜約35℃の
範囲、にあるべきである。発酵媒質のPHは約５〜
約10の範囲にあるべきであり、好ましい範囲は約
６〜約8.5である。ふつうには、温度に依存して
３〜７日間で最高のノカルジシンの生産量がえら
れる。タンク発酵を行なうときは、微生物の傾斜
もしくは土壌培養物または凍結乾燥培養物を発酵
物質に接種することによつて栄養液中に生育用種
菌を作るのが好ましい。このようにして活性接種
物をえた後に、これを発酵タンク媒質に無菌状態
で移す。発酵液中の抗生物質活性はプソイドモナ
スアエルジノサ菌株Pa−49（このものはβ−ラク
タム抗生物質に特定の感度をもつ）を試験微生物
として使用するペーパーデイスク寒天プレート分
析により、あるいはノカルジシン製造の従来技術
に記載されている周知の方法により、測定するこ
とができる。 培養物質からのノカルジシンの回収は文献〔た
とえばJ.Antibiotics、29、492−500〕に既に記載
されている方法により、または下記の実施例に記
載の如く行なうことができる。ノカルジシンの実
用性、投与の調剤単位および方法は文献に記載さ
れている。たとえば、公開英国出願第2035081A
号（マイコバクテリウム チユベルキユロシス、
マイコバクテリウム カンサシイ、マイコバクテ
リウム インターセルレエルなどのマイコバクテ
リウム属の種々の種に対するノカルジシンの使用
を述べている）を参照されたい。 実施例 １ 菌株G432−４の発酵 菌株G432−４のよく生育した寒天傾斜培養物
を使用して500mlのエルレンメイヤーフラスコ中
の液体生長用媒質100ml〔３％グリセロール、１
％フアーマメデイア、1.5％デイステイラーズ可
溶物（サントリイ）、１％フイツシユミールおよ
び0.65％CaCO3を含有〕に接種した。滅菌前にこ
の媒質のPHを7.0に調整した。種付け培養物を回
転シエーカー（250rpm）上で34℃において３日
間培養し、この培養物の２mlを同じ媒質100mlを
含む500mlのエルレンメイヤーフラスコに移した。
最大の抗生物質生産は回転シエーカー上で28℃に
おいて６日間培養した後にえられた。発酵の進行
に伴ない発酵液のPHは徐々に上昇し、150mcg／
mlの抗生物質活性に到達したとき約8.5になつた。 実施例 ２ ノカルジシンの分離と精製 実施例１と同じ条件を使用する菌株G432−４
の大規模培養からえられた発酵液（４、約
150mcg／ml）を過助剤により過した。集め
た菌糸体ケーキをメタノール（１×２）で抽出
し、抽出液（1.8）を水性溶液（300ml）に真空
濃縮した。この真空濃縮物を発酵液と一緒にし
てPH8.2において酢酸エチル（800ml×２）で洗浄
した。水性相を分離して真空濃縮し、次いでPH４
において活性炭と共にかきまぜた。活性炭を過
し、その活性主成分を80％水性アセトン（600ml
×２）と共にかきまぜることによつて活性炭から
溶出させた。活性溶出物を真空濃縮し、凍結乾燥
して約７ｇの粗物質をえた。この固体を少量の水
にとかし、酸処理ダイアイオンHP−20樹脂
（200ml）を含むカラムに通した。このカラムを水
（１）で洗い、次いで30％水性メタノール（1.6
）で展開した。活性留分を集め、真空濃縮し、
凍結乾燥して1.5ｇの部分的に純粋な物質をえた。
このようにしてえた固体をHP−20カラムクロマ
トグラフで更に精製した。活性な水性濃縮物をPH
2.0に調整し、冷蔵庫中に貯蔵して無色粉末とし
て抗生物質Bu−2445Aの純粋な生成物（35mg）
をえた。 抗生物質Bu−2445Aはアルカリ性溶液に易溶、
メタノール中に僅かに可溶、ふつうの有機溶媒に
不溶である。そのものはニンヒドリン試験で陽性
反応を示すがエールリツヒ反応およびトレンス反
応では陰性であつた。Bu−2445Aの元素分析は
C23H24N3O9・H2Oの式と一致した。計算値：
C53.28、H5.05、N10.79；実測値：C53.33、
H4.54、N10.83。 Bu−2445Aの紫外スペクトルは次の吸収最大
値を示した：溶 媒 λnax（単位ｎｍ）（E1%1cn） Ｍ／15りん酸塩緩衝液（PH８） 273（276） Ｎ／10NaOH溶液 245（376）283（232） KBr中のBu−2445Aの赤外スペクトルは1730、
1650、1605、および1520cm-1において特性吸収を
示した。Bu−2445AのNMRスペクトルは、芳香
族プロトンに帰せられる８個の低フイールドのプ
ロトン信号および2.0〜5.2ppm領域中のメチレン
基とメチン基とに対応する９個のプロトン信号を
示した。 抗生物質Bu−2445Aの赤外スペクトル、紫外
スペクトルおよびNMRスペクトルならびに元素
分析値はノルカジシンＡおよびＢのそれらの典型
的なものである。これは抗生物質Bu−2445Aの
薄層クロマトグラフによつて確認された。これは
下記に示す如く、ノカルジシンＡおよびＢに等し
い２つの成分（A1およびA2）の存在を示した。 【表】 パノール
実施例 ３ 菌株G434−６の発酵 実施例１と同じ発酵条件（媒質、接種物サイ
ズ、温度）のもとで、菌株G434−６を生産菌と
して使用した。回転シエーカー上での28℃におけ
る５日間の発酵後に、200mcg／mlの最大抗生物
質生産がえられた。 実施例 ４ ノカルジシンの分離と精製 実施例３と同じ条件を使用する菌株G434−６
の大規模培養からえられた発酵液（10、約
200mcg／ml）を過助剤により過した。菌糸
体ケーキをメタノール（0.75×２）で抽出し、
抽出液（1.5）を水性溶液に真空濃縮した。こ
の溶液を発酵液と一緒にしてPH４において活性
炭と共にかきまぜた。過により活性炭を回収
し、この活性主成分を１％の濃NH4OHを含む60
％水性アセトン（600ml×３）と共にかきまぜる
ことによつて活性炭から溶出させた。活性溶出物
を500mlに真空濃縮した。この溶液を酸処理ダイ
アイオンHP−20樹脂（700ml）のカラムに通し
た。このカラムを水（２）で洗い、次いで活性
物を８％水性メタノール（1.2）で溶出させた。
活性留分を集め、真空濃縮し、凍結乾燥して2.3
ｇの部分的に純粋な物質をえた。このようにして
えた固体をHP−20カラムクロマトグラフで更に
精製した。活性水溶液を集め、PH２に調整し、冷
蔵庫に貯蔵して無色粉末として純粋な生成物（80
mg）をえた。赤外スペクトル、紫外スペクトルお
よびNMRによる分析はこの物質が実施例２で製
造したものと同じであることを示した。
て同定される特性をもつミクロテトラスポラカエ
シアsp.nov.なる菌株を水性媒質中で浸漬好気性
条件下で培養媒質中に実質量のノカルジシンが生
成するまで培養すること、および任意に培養媒質
からノカルジシンを回収すること、によつて周知
の抗生物質たるノカルジシンを製造する方法に関
するものである。従来技術の操作と同様にして、
本発明の方法によりノカルジシンＡ（主成分）と
ノカルジシンＢ（少量成分）がえられ、これらは
所望ならば周知の操作によつて容易に分離するこ
とができる。 ノカルジシンに関連する従来技術として次のも
のがあげられる。 (A) ノカルジシンは1975年の第15回Inter−
science Conference on Antimicrobial
Agents＆Chemotherapy（Abstract97）におい
てH.アオキらによつて最初に報告された。こ
のものはコードNo.FR−1923と名付けられ、ノ
カルジアユニホルミスvar.ツヤマネンシス
ATCC21806の培養によつて生産される未知構
造の（β−ラクタム環を含むことは知られてい
たけれども）抗生物質であつた。 (B) 米国特許第3923977号には抗生物質FR−1923
（当時は未知構造のものであつたが今ではノカ
ルジシンとして知られている）およびノカルジ
アユニホルミスvar.ツヤマネンシス
ATCC21806の培養によるその製造法が開示さ
れ特許請求されている。 (C) H.アオキらは上述のフオローアツプ刊行物
としてのJ.Antibiotics29、492−500（1976）に
おいて、FR−1923をノカルジシンＡと名付け、
その構造を与え、そしてその分離と特性を記述
している。彼等はまたこの発酵液中に他の未同
定の少量成分があることを指摘している。 (D) M.ハシモトらはJ.Am.Chem.Soc.、98、3023
−５（1976）において、ノカルジアユニホルミ
スvar.ツヤマネンシスATCC21806によつて生
産されるノカルジシンＡおよびＢの構造を報告
している。これらの化合物はオキシム官能基に
おいて立体異性体である。ノカルジシンＡはシ
ン（syn）関係にあるオキシムとアシルアミノ
部分とをもつ化合物であり、ノカルジシンＢは
トランス関係でこれらの部分をもつ化合物であ
る。 (E) M.クリタらはJ.Antibiotics、29、1243−５
（1976）においてノカルジアユニホルミス
subsp.ツヤマネンシスATCC21806からのノカ
ルジシンＢの分離および特性を述べている。 (F) 特開昭54−151196号（ダーウエント02700C）
にはストレプトマイセスアルカロフイラス
ATCC31393と名付けられたストレプトマイセ
スの新規な好塩基性菌株の培養によるノカルジ
シンＡの製造が開示されている。 (G) 特開昭55−45327号（ダーウエント35223C）
にはノカルジアsp.No.Ｃ−14509（FERM−
P4642）の培養によるノカルジシンＡおよびＢ
の製造が開示されている。 (H) 米国特許第4212944号にはノカルジオプシス
アトラHuang sp.nov.ATCC31511の培養によ
るノカルジシンＡの製法が開示され特許請求さ
れている。 このように周知の抗生物質ノカルジシンは次の
構造式をもつ。 本発明によれば、この物質はミクロテトラスポ
ラ（Microtetraspora）属のある種の新種を同化
性の炭素源および窒素源を含む水性培養媒質中で
浸漬好気性条件下で発酵させることによつて製造
される。 微生物 β−ラクタム抗生物質を検査する過程におい
て、ノカルジシンを生産する２つの異常なアクチ
ノマイセテス菌株No.G432−４およびＧ−434−６
がインドで集めた土壌サンプルから分離された。
両菌株は20℃〜50℃の温度において天然媒質また
は化学的に作られた媒質上でよく生育する。 菌株No.432−４は密な気生菌糸をもつており、
その菌糸上に短い胞子鎖が生じる。この胞子鎖は
１つの鎖中に２〜６個の胞子を含み、集塊となつ
た担胞子体上の厚い塊りに発達する。この気生の
塊りの色相は淡青色または灰緑色である。２種類
の胞子を内蔵する小嚢と単一極鞭毛をもつ運動性
胞子とが基質菌糸中に生じる。寒天中にやや拡散
しうる暗灰緑色の色素がほとんどの寒天媒質中に
生じる。菌種No.G432−４とは異なり、菌株No.
G434−６は気生菌糸を全くまたは僅かしか生産
せず、緑色の色素も生産しない。この菌株は菌株
G434−４にみられるように厚い基質菌糸中に２
種類の胞子内蔵小嚢と鞭毛のついた胞子とを形成
する。 この２種類の菌株は特徴ある細胞壁成分として
メソ−ジアミノピメリン酸、グルコースおよび少
量のマンノースおよびラムノースをもつている。
ノカルドミコール酸はこの栄養菌糸中には存在し
ない。 アクチノマイセタルスのいくつかの属との比較
研究の結果として、菌株No.G432−４およびG434
−６はミクロテトラスポラ属の新種であると決定
された。この新種の名称ミクロテトラスポラカエ
シアは青灰色の気生菌糸にかんがみ菌株G432−
４およびG434−６に対して提案された。菌株
G432−４およびG434−６の培養菌は米国ワシン
トン特別地区のAmerican Type Culture
Collectionにブタペスト条約に基づく国際寄託さ
れ、それぞれATCC31724およびATCC31725とし
てその微生物永久コレクシヨンに加えられた。 材料および方法 比較研究に使用した微生物には次のものが含ま
れている：アクチノマジユラマジユラエ
（Vincent）Lechevalier＆Lechevalier1968；マ
イクロポリスポラアンジオスポラZhukova、
Tsyganov＆Morozov1967KCC Ａ−0109；ミク
ロポリスポラカエシアKalakoutskii1964KCCA
−0098；ミクロポリスポラフアエニイCross、
Maciever＆Lacey1968KAA Ａ−0099；ノカル
ジアコラリナ（Bergeyら）Waksman＆
Henrici1948；ノカルジアルテアCastellani＆
Charlmer1919；ノカルジアユニホルミスsubsp.
ツヤマネンシスAokiら1967ATCC21806；ノカル
ジオプシスダソンビレイ（Brocq−Rousseu）
Meyer1976ATCC23218；ミクロテトラスポラビ
リジスNonomura＆Ohara1971ACC Ａ−0112；
およびサツカロポリスポラヒルスタLacey＆
Goodfellow1975KCC Ａ−0170。 培養および生理学的研究のために使用した文献
は次のとおりである：(1)Shirline、E.B.＆D.
Gottlieb：Methods for Characterization of
Streptomyces species、Int.J.Syst.Bacteriol.、
16、313−340（1966）；(2)Waksman、S.A・：
The Actinomycetes、vol.2、（1961）；(3)
Luedemann、G.M.：Micromonorpora
Purpureochromogenes（Waksman＆Curtis1916）
Comb.Nov.（Snbjective Synonym：
Micromospora Fusca、Jensen1932）、Int.J.
Syst.Bacteriol.、21、240−247（1971）。 細胞壁の化学分析のために使用した文献は次の
とおりである：(1)Yamaguchi、T.：Comparison
of the cell−wall composition of
morphologically distinct actinomycetes、J.
Bacteriol.、89、444−453（1965）；(2)
Lechevalier、M.P.and H.Lechevalier：
Chemical methods as criteria for the
separation of nocardiae from other
actinomycetes、Biology of the
Actinomycetes and Related Organisms、11、
78−92（1976）。 分類学的記述のために使用した文献は次のとお
りである：(1)Bergey's Manual of
Determinative Bacteriology、8th ed.（edited
by R.E.Buchanan and N.E・Gibbsons）599−
861、1974；(2)Actinomycetales：
characteristics and practical importance
（edited by G.Sykes and F.A.Skinner）、
Society for Applied Bacteriology Symposium
SeriesNo.２、11−91、1973。 形態学 基質菌糸の菌糸体は0.4〜0.8μの直径をもち寒
天表面上で生育するか又は寒天中を浸透して叉状
に分枝する。短い繊毛を生成する基質菌糸の部分
的な分裂は固体媒質上に３〜４週間後に認められ
る。これは気生菌糸を欠く菌株G434−６につい
てより顕著に認められる。菌株G432−４の気生
菌糸体は長く、そして適度に分岐している。２〜
６個の、時には８個の胞子が鎖中に生まれ、そし
て分岐した胞子鎖がしばしば生成する。胞子鎖は
菌糸体の面に直接生まれるか又は単軸的に分岐し
た担胞子体上に直接生まれる。胞子形成は担胞子
体の単軸型分岐および菌糸体のさや中の向基的発
芽から生育する。胞子体の軸にそつて集塊する担
胞子は培養につれて胞子の厚い塊りに生育する。 胞子は球形もしくは楕円形の形状で、（0.7〜
1.0μ）×（0.7〜1.6μ）の大きさであり、平滑な表面
をもつている。時には気生胞子体チツプは胞子鎖
のように分裂し、無胞子生殖らせん状菌糸体が気
生菌糸中に単純に生成する。基質菌糸中に、球形
もしくは楕円形の半透明のカプセル（小胞）が見
出され、これは単一の胞子又は２〜６個の胞子の
直鎖を包んでいる。更に、不規則に又はしつかり
とコイル状になつた胞子鎖が時として認められ
る。上述の構造は栄養に富んだ媒質たとえばモル
ト−イースト又はベネツト寒天中での28℃におけ
る３〜４週間の培養後に認められる。楕円形の又
はバナナ形状の運動性胞子が菌糸塊の水性懸濁液
中に生成する。運動性胞子は単一の長い極鞭毛を
もち、培養後に出芽管を形成する。 培養特性 菌株G432−４およびG434−６は絶対好気性で
あり、20℃〜50℃の範囲で適度に生育する。菌株
G432−４は55℃においてさえ生育するが、菌株
G434−６は生育しない。イースト−モルト寒天
上の群体は円形で肉厚であり、放射状の又は不規
則なしわをもち、37℃での１週間の培養後に直径
３〜５mmになる。 菌株G432−４は豊富な気生菌糸を生成し、チ
ヤペツク寒天、イースト−モルト寒天、オートミ
ール寒天、グリセロール−アスパラギン寒天およ
びチロシン寒天に淡青色または灰緑青色の胞子鎖
塊を生み、そしてほとんどの媒質中で弱拡散性の
緑色色素を生産する。菌株G434−６はふつうの
寒天媒質（ISP媒質No.２、４、５および６ならび
にベネツト寒天）中で気生菌糸、胞子または色素
を生産しないが、チヤペツク寒天ならびにISP媒
質No.３および７中では僅か又は若干の気生菌糸を
生成する。菌株G432−４およびG434−６の培養
特性を第１表に要約して示す。 【表】 【表】 生理学的特性 菌株G432−４およびＧ−434−６はリゾチーム
の作用に対して抵抗性がある。その生育は３％
Naclの存在で制限され、５％では完全に抑制さ
れる。硝酸塩はペプトン液またはグルコースチヤ
ペツク液中で亜硝酸塩に還元されない。セラチン
はG432−４によつて溶かされるが、菌株Ｇ−434
−６によつては溶かされない。ミルクは菌株
G432−４によつて完全にペプトン化されるが、
菌株G434−６によつては部分的にペプトン化さ
れるにすぎない。硫化水素がシステインから生成
する。メラノイド色素はISP媒質No.１、６および
７中では生成されない。ルエデマンのポテトプラ
グ試験において生育はPH5.7において抑制される。
酸はグルコース、フラクトースまたはグリセロー
ルからは生成されない。菌株G432−４および
G434−６の生理学的特性を第２表に示す。 【表】 硝酸塩から亜硝酸塩へ 陰性
無機媒質〓チヤペツクのグルコース
硝酸塩液
【表】 育しない。
菌株G432−４およびG434−６の炭素源同化パ
ターンを第３表に示す。これら２種の菌株はグリ
セロール、Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース、
Ｌ−ラムノース、Ｄ−グルコース、Ｄ−ガラクト
ース、Ｄ−フラクトース、Ｄ−マンノース、ラク
トース、セロビオース、メリビオース、トレハロ
ース、でんぷんおよびＤ−マニトールを生育する
ために同化する。Ｌ−ソルボース、Ｄ−メレゾイ
トース、ダルシトール、イノシトールおよびＤ−
ソルビトールは上記のいづれの菌株によつても同
化されない。また、サクロースおよびラフイノー
スは菌株G432−４によつて同化されない。 【表】 グリセロール ＋ ＋
＋ ＋ ＋
D(−)アラビノース ＋ ＋
− − −
L(＋)アラビノース ＋ ＋
＋ ＋ ＋
【表】 細胞壁の組成 第４表に示すように、菌株G434−６の細胞壁
は特徴的なアミノ酸としてメソ−ジアミノピメリ
ン酸と痕跡量のグリシンとを含んでいる。細胞全
体の加水分解物は天然糖類としてグルコース、マ
ンノース、および痕跡量のリボースとラムノース
を含んでいる。かくて、メソ−ジアミノピメリン
酸（DAP）は菌株G434−６の細胞壁組成物中の
唯一の特徴的な成分であると考えられる。それ
故、菌株G434−６の細胞壁はTypeｃとして分
類しうる。菌株G434−６の細胞壁の脂質留分中
のノカルドミコール酸の不存在はMordarska、
Mordarski＆Goodfellow、J.Gen.Microbiol、
71、77−86（1972）の方法により示された。 【表】 分類学的検討 菌株G432−４およびG434−６を、気生菌糸上
に胞子鎖をもち細胞壁中にメソージアミノピメリ
ン酸をもつアクチノマイセタルス目の６個の属す
なわちノカルジア、ミクロポリスポラ、ミクロテ
トラスポラ、ノカルジオプシス、サツカロポリス
ポラおよびアクチノマジユラと比較した。菌株
G432−４およびG434−６は気生菌糸上の短い胞
子鎖の緑青色塊の形成において、および向基的発
芽胞子形成においてミクロポリスポラ属のいくつ
かの種に似ているが、基質菌糸中の胞子鎖集団の
欠如、リゾチームに対する抵抗性、塩化ナトリウ
ムに対する敏感性および細胞壁中のアラビノース
およびガラクトースの不存在においてこれらとは
異なる。ノカルジオプシス属およびサツカロポリ
スポラ属は気生菌糸の全部分中に胞子を生じる。
これらの属の気生胞子は菌糸体が長いセグメント
に分裂し次いでこれが２次分裂して不規則大きさ
のより小さなフラグメントになるようなふうにし
て形成される。これらの明らかに相違する胞子形
成機構を勘案して、菌株G432−４およびG434−
６はノカルジオプシス属およびサツカロポリスポ
ラ属から容易に区別される。更に、これら２つの
新規な菌株はリゾチームに対する抵抗性において
ノカルジオプシス属とは異なり、そしてその平滑
な胞子表面、細胞壁中のアラビノースの欠如、リ
ゾチームに対する抵抗性および塩化ナトリウムに
対する敏感性においてサツカロポリスポラ属とは
異なる。菌株G432−４およびG434−６は青緑色
気生菌糸および気生の短い胞子鎖を形成するアク
チノマジユラ属のいくつかの種に似ているが、向
基的発芽型の胞子形成、鎖中の少ない胞子の形
成、胞子鎖集団、および全細胞加水分解物のマジ
ユロースの欠如において後者とは異なる。 N.ユニホルミスsubsp.ツヤマネンシスは短い胞
子鎖の形成、グルコース、フラクトースおよびグ
リセロールからの酸生成の欠如、リゾチームに対
する抵抗性および塩化ナトリウムに対する敏感性
において、本発明の新菌株と若干の類似性をも
つ。然しながら、菌株G432−４およびG434−６
の向基的発芽、球形胞子、多くの分岐した担胞子
体を含む明白な胞子鎖集団、１〜数個の胞子の融
合した鎖および緑青色の厚い気生菌糸、菌糸体中
にセグメント化によつて起る桿状胞子を生産する
且つ単一胞子鎖および白色または淡色の未発達気
生菌糸を形成しうる能力をもつノカルジアのスポ
ロジエニツク種から容易に区別される。 Thiemann et al.、J.Gen.Microbiol.、50、295
−303（1968）によれば、ミクロテトラスポラ属
（M.フスカおよびM.グラウカ）は短い胞子鎖
（ほとんどの場合、１つの鎖中に４個の胞子）の
みを気生菌糸上に生産することによつて、ならび
に細胞壁中にメソ−DAP、グリシン、リジン、
痕跡量のLL−DAPをもち、特徴的な糖をもたな
いことによつて、特徴づけられる。Nonomura
and Ohara、J.Ferment.Technol.、49、１−７
（1971）および49、887−894（1971）はミクロテト
ラスポラ属中の２つの追加的な種、すなわち細胞
壁の特徴的成分としてメソ−DAPのみをもつM.
ビリデイスおよびM.ニベオアルビダを報告して
いる。第５表に示すように、菌株G432−４およ
びG434−６は、胞子鎖と胞子形態、胞子形成の
様式、リゾチームまたは塩化ナトリウムに対する
応答、および細胞壁の組成を含む主要特性におい
てミクロテトラスポラ属に密接に関連している。
かくて、菌株G432−４およびG434−６をミクロ
テトラスポラ属の４個の周知の種と比較した。こ
れら４個の種のうちのどれ１つとして45℃におい
て生育しないが、菌株G432−４およびG434−６
は50℃において生育する。気生塊の色系列はM.
フスカおよびM.グラウカについては灰色であり、
M.ビリジスについては緑色であり、そしてM.ニ
ベオアルバについては白色であるが、菌株G432
−４の気生塊の色は青色系列にある。 【表】 セルを形成
グザグ形の プソイドス
する。
菌糸 ポランジア
【表】 ロールか
らの酸
＊ 文献では(−)と報告されているが、我々の試験で
は(＋)を示した。
菌株G434−６は基質菌糸中に２種の小胞を生
成する。その１つは１〜数個の胞子を直線状に包
む半透明小胞であり、他の小胞は不規則に且つし
つかりとコイル状になつた胞子鎖塊である。単一
の極鞭毛をもつ運動性胞子も基質菌糸中に生成す
る。ミクロポリスポラ アンジオスポラは胞子を
包む半透明カプセルをもつと報告されている。然
し、運動性胞子の形成はミクロモノスポラセアエ
科およびノアルジアセアエ科のいかなる属につい
ても報告されなかつた（Bergey's Manual、8th
ed.、1974）。胞子形成小嚢、軟骨質小胞および運
動性鞭毛化要素（運動性同形配偶子）は
Nakazawa、Ann.Rep.Takeda Res.Lab.、25、
24（1966）によつてストレプトマイセス シンデ
ネンシスに対して報告された。運動性胞子は菌株
G434−６中にも気まぐれに認められるけれども、
S.シンデネンシスおよび菌株G434−６中の胞子
生産小胞または運動性要素の形態学的関係は明瞭
ではない。それ故、この２種の小胞および運動性
胞子は分類を決める顕著な形態学的構造とは考え
られない。上述の主要な特性をもとにして、菌株
G432−４およびG434−６はミクロテトラスポラ
属の新種であると決定された。これら２種の菌株
はミクロテトラスポラ カエシアsp.nov.と命名
された。このタイプの菌株はNo.G432−４である。 ミクロテトラスポラ カエシア菌株G432−４
およびＧ−434−６は天然または人工的に容易に
変異するので、本発明はこれらのオリジナル菌株
に限定されないことを理解すべきである。上述の
菌株からＸ線照射、紫外線照射、窒素マスタード
処理、フアージ処理などの手段によつて生成しう
るすべてのノカルジシン生産性の天然および人工
の変異体および変種を含むことを意図している。
他の微生物および抗生物質についてと同じよう
に、単一群体選択後の高生産性菌株の選択によつ
て、種々の変異体化剤による処理によつて、ある
いは組み換え、転換または導入の遺伝的手法によ
つて、より生産性の高いノカルジシンの製造が予
見される。 ノカルジシンの製造 ノカルジシンは菌株G432−４（ATCC31724）
またはG434−６（ATCC31725）の同定特性をも
つミクロテトラスポラ カエシアの菌株を水性栄
養媒質中で浸漬好気性条件下に培養することによ
つて製造される。他のアクチノマイセテスの培養
についての一般的方法がミクロテトラスポラ カ
エシアの培養に適用しうる。栄養媒質はグリセロ
ール、グルコース、フラクトース、マンノース、
でんぷん、デキストリン、マルトース、マニトー
ル、糖蜜、油、脂肪などの同化性炭素源の１種ま
たはそれ以上を純粋な又は粗の状態で含むべきで
ある。栄養媒質はまた、たとえば大豆ミール、フ
イツシユミール、モルトエキス、ペプトン、イー
ストエキス、蒸留可溶物、グルテンミール、コー
ンステープ液、硝酸塩、アンモニウム塩、尿素な
どの同化性窒素源の１種またはそれ以上を含むべ
きである。栄養無機塩たとえば塩化ナトリウム、
リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、炭酸カルシ
ウム、および痕跡量の重金属塩たとえば銅、亜
銅、マンガン、銅の塩などを栄養培質に加えるこ
ともできる。浸漬好気性培養において、発泡防止
剤たとえば液体パラフイン、大豆油、脂肪または
シリコーンを加えることもできる。 発酵温度は約20゜〜約50℃（菌株G432−４の場
合には55℃）の範囲、好ましくは約25゜〜約40℃
の範囲、そして最も好ましくは約25゜〜約35℃の
範囲、にあるべきである。発酵媒質のPHは約５〜
約10の範囲にあるべきであり、好ましい範囲は約
６〜約8.5である。ふつうには、温度に依存して
３〜７日間で最高のノカルジシンの生産量がえら
れる。タンク発酵を行なうときは、微生物の傾斜
もしくは土壌培養物または凍結乾燥培養物を発酵
物質に接種することによつて栄養液中に生育用種
菌を作るのが好ましい。このようにして活性接種
物をえた後に、これを発酵タンク媒質に無菌状態
で移す。発酵液中の抗生物質活性はプソイドモナ
スアエルジノサ菌株Pa−49（このものはβ−ラク
タム抗生物質に特定の感度をもつ）を試験微生物
として使用するペーパーデイスク寒天プレート分
析により、あるいはノカルジシン製造の従来技術
に記載されている周知の方法により、測定するこ
とができる。 培養物質からのノカルジシンの回収は文献〔た
とえばJ.Antibiotics、29、492−500〕に既に記載
されている方法により、または下記の実施例に記
載の如く行なうことができる。ノカルジシンの実
用性、投与の調剤単位および方法は文献に記載さ
れている。たとえば、公開英国出願第2035081A
号（マイコバクテリウム チユベルキユロシス、
マイコバクテリウム カンサシイ、マイコバクテ
リウム インターセルレエルなどのマイコバクテ
リウム属の種々の種に対するノカルジシンの使用
を述べている）を参照されたい。 実施例 １ 菌株G432−４の発酵 菌株G432−４のよく生育した寒天傾斜培養物
を使用して500mlのエルレンメイヤーフラスコ中
の液体生長用媒質100ml〔３％グリセロール、１
％フアーマメデイア、1.5％デイステイラーズ可
溶物（サントリイ）、１％フイツシユミールおよ
び0.65％CaCO3を含有〕に接種した。滅菌前にこ
の媒質のPHを7.0に調整した。種付け培養物を回
転シエーカー（250rpm）上で34℃において３日
間培養し、この培養物の２mlを同じ媒質100mlを
含む500mlのエルレンメイヤーフラスコに移した。
最大の抗生物質生産は回転シエーカー上で28℃に
おいて６日間培養した後にえられた。発酵の進行
に伴ない発酵液のPHは徐々に上昇し、150mcg／
mlの抗生物質活性に到達したとき約8.5になつた。 実施例 ２ ノカルジシンの分離と精製 実施例１と同じ条件を使用する菌株G432−４
の大規模培養からえられた発酵液（４、約
150mcg／ml）を過助剤により過した。集め
た菌糸体ケーキをメタノール（１×２）で抽出
し、抽出液（1.8）を水性溶液（300ml）に真空
濃縮した。この真空濃縮物を発酵液と一緒にし
てPH8.2において酢酸エチル（800ml×２）で洗浄
した。水性相を分離して真空濃縮し、次いでPH４
において活性炭と共にかきまぜた。活性炭を過
し、その活性主成分を80％水性アセトン（600ml
×２）と共にかきまぜることによつて活性炭から
溶出させた。活性溶出物を真空濃縮し、凍結乾燥
して約７ｇの粗物質をえた。この固体を少量の水
にとかし、酸処理ダイアイオンHP−20樹脂
（200ml）を含むカラムに通した。このカラムを水
（１）で洗い、次いで30％水性メタノール（1.6
）で展開した。活性留分を集め、真空濃縮し、
凍結乾燥して1.5ｇの部分的に純粋な物質をえた。
このようにしてえた固体をHP−20カラムクロマ
トグラフで更に精製した。活性な水性濃縮物をPH
2.0に調整し、冷蔵庫中に貯蔵して無色粉末とし
て抗生物質Bu−2445Aの純粋な生成物（35mg）
をえた。 抗生物質Bu−2445Aはアルカリ性溶液に易溶、
メタノール中に僅かに可溶、ふつうの有機溶媒に
不溶である。そのものはニンヒドリン試験で陽性
反応を示すがエールリツヒ反応およびトレンス反
応では陰性であつた。Bu−2445Aの元素分析は
C23H24N3O9・H2Oの式と一致した。計算値：
C53.28、H5.05、N10.79；実測値：C53.33、
H4.54、N10.83。 Bu−2445Aの紫外スペクトルは次の吸収最大
値を示した：溶 媒 λnax（単位ｎｍ）（E1%1cn） Ｍ／15りん酸塩緩衝液（PH８） 273（276） Ｎ／10NaOH溶液 245（376）283（232） KBr中のBu−2445Aの赤外スペクトルは1730、
1650、1605、および1520cm-1において特性吸収を
示した。Bu−2445AのNMRスペクトルは、芳香
族プロトンに帰せられる８個の低フイールドのプ
ロトン信号および2.0〜5.2ppm領域中のメチレン
基とメチン基とに対応する９個のプロトン信号を
示した。 抗生物質Bu−2445Aの赤外スペクトル、紫外
スペクトルおよびNMRスペクトルならびに元素
分析値はノルカジシンＡおよびＢのそれらの典型
的なものである。これは抗生物質Bu−2445Aの
薄層クロマトグラフによつて確認された。これは
下記に示す如く、ノカルジシンＡおよびＢに等し
い２つの成分（A1およびA2）の存在を示した。 【表】 パノール
実施例 ３ 菌株G434−６の発酵 実施例１と同じ発酵条件（媒質、接種物サイ
ズ、温度）のもとで、菌株G434−６を生産菌と
して使用した。回転シエーカー上での28℃におけ
る５日間の発酵後に、200mcg／mlの最大抗生物
質生産がえられた。 実施例 ４ ノカルジシンの分離と精製 実施例３と同じ条件を使用する菌株G434−６
の大規模培養からえられた発酵液（10、約
200mcg／ml）を過助剤により過した。菌糸
体ケーキをメタノール（0.75×２）で抽出し、
抽出液（1.5）を水性溶液に真空濃縮した。こ
の溶液を発酵液と一緒にしてPH４において活性
炭と共にかきまぜた。過により活性炭を回収
し、この活性主成分を１％の濃NH4OHを含む60
％水性アセトン（600ml×３）と共にかきまぜる
ことによつて活性炭から溶出させた。活性溶出物
を500mlに真空濃縮した。この溶液を酸処理ダイ
アイオンHP−20樹脂（700ml）のカラムに通し
た。このカラムを水（２）で洗い、次いで活性
物を８％水性メタノール（1.2）で溶出させた。
活性留分を集め、真空濃縮し、凍結乾燥して2.3
ｇの部分的に純粋な物質をえた。このようにして
えた固体をHP−20カラムクロマトグラフで更に
精製した。活性水溶液を集め、PH２に調整し、冷
蔵庫に貯蔵して無色粉末として純粋な生成物（80
mg）をえた。赤外スペクトル、紫外スペクトルお
よびNMRによる分析はこの物質が実施例２で製
造したものと同じであることを示した。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ ミクロテトラスポラ属に属するノカルジシン
生産菌を培養し培養媒質中にノカルジシン混合物
を生成、蓄積させることを特徴とするノカルジシ
ンＡとノカルジシンＢとの混合物の製造法。 ２ ノカルジシン生産菌がATCC31724または
ATCC31725として同定される特性をもつミクロ
テトラスポラカエシアsp.nov.なる菌株であり、
同化性の炭素源および窒素源を含む水性媒質中で
浸漬好気性条件下で約20℃〜約50℃の温度におい
て培養媒質中に実質量のノカルジシン混合物が生
成し蓄積されるまで培養することを特徴とする特
許請求の範囲第１項記載の方法。 ３ 培養媒質からノカルジシン混合物を回収する
付加工程を含む特許請求の範囲第１項または第２
項に記載の方法。 ４ 約25℃〜約35℃の温度において培養を行う特
許請求の範囲第２項記載の方法。
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US06/203,778 US4320199A (en) | 1980-11-03 | 1980-11-03 | Fermentation process for producing nocardicins A and B |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS57141296A JPS57141296A (en) | 1982-09-01 |
| JPH026518B2 true JPH026518B2 (ja) | 1990-02-09 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP56174684A Granted JPS57141296A (en) | 1980-11-03 | 1981-11-02 | Fermentation method |
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- 1981-11-02 DE DE8181109481T patent/DE3163322D1/de not_active Expired
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