JPH0269184A - ｔＰＡの精製方法 - Google Patents
ｔＰＡの精製方法Info
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- JPH0269184A JPH0269184A JP63221843A JP22184388A JPH0269184A JP H0269184 A JPH0269184 A JP H0269184A JP 63221843 A JP63221843 A JP 63221843A JP 22184388 A JP22184388 A JP 22184388A JP H0269184 A JPH0269184 A JP H0269184A
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- Japan
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- tpa
- proteins
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- aprotinin
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12N9/6456—Plasminogen activators
- C12N9/6459—Plasminogen activators t-plasminogen activator (3.4.21.68), i.e. tPA
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12Y304/21069—Protein C activated (3.4.21.69)
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- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は、組織プラスミノーゲンアクチベータ−（ｔＰ
Ａ）の精製方法に関する。さらに詳しくは、ｔｐ＾と他
の不純タンパクを含む粗製のＬＰＡを陽イオン交換樹脂
と接触させることにより分子量７万ダルトンのｔＰＡを
分離、精製する方法に関す。
Ａ）の精製方法に関する。さらに詳しくは、ｔｐ＾と他
の不純タンパクを含む粗製のＬＰＡを陽イオン交換樹脂
と接触させることにより分子量７万ダルトンのｔＰＡを
分離、精製する方法に関す。
〔従来技術と発明が解決しようする課題〕ｔＰＡは、高
等動物の組織で産生されるものであって、フィブリンに
特有な分解酵素であるプラスミンの前駆物質であるプラ
スミノーゲンを賦活化させる蛋白質である。
等動物の組織で産生されるものであって、フィブリンに
特有な分解酵素であるプラスミンの前駆物質であるプラ
スミノーゲンを賦活化させる蛋白質である。
ｔＰＡを医薬品として製造するためには、異種タンパク
質を完全に除去する必要がある。ｔＰＡにこのような異
種タンパク質が混入すると、これらの異種タンパク質は
人体投与において抗原性があられれ、副作用の原因とな
る。
質を完全に除去する必要がある。ｔＰＡにこのような異
種タンパク質が混入すると、これらの異種タンパク質は
人体投与において抗原性があられれ、副作用の原因とな
る。
ｔＰＡの製造工程で混入する異種タンパク質の種類は細
胞培養法及び精製法により異なる。培養工程においては
、培養液の成分及び細胞の分泌物中に異種タンパク質が
大量に含まれる。
胞培養法及び精製法により異なる。培養工程においては
、培養液の成分及び細胞の分泌物中に異種タンパク質が
大量に含まれる。
培養方法には胎児牛血清を用いて培養する方法及び無血
清培地で培養する方法がある。
清培地で培養する方法がある。
胎児牛血清を用いて培養する場合、胎児牛血清が人に対
して抗原性を有する異種タンパク質群である。胎児牛血
清由来タンパク質は、多種類存在するがそれらタンパク
質の等電点はほとんどが４〜６の範囲にある。
して抗原性を有する異種タンパク質群である。胎児牛血
清由来タンパク質は、多種類存在するがそれらタンパク
質の等電点はほとんどが４〜６の範囲にある。
また、無血清培地を用いて培養する場合、使用する細胞
に合わせて必要な物質を転化して培養を行う。
に合わせて必要な物質を転化して培養を行う。
必要な物質のうち、タンパク質としてはインツユリンな
どのホルモン類及びｌ・ランスフェリンなどがよく利用
される。インツユリン及びトランスフェリンの等電点は
約５〜６である。
どのホルモン類及びｌ・ランスフェリンなどがよく利用
される。インツユリン及びトランスフェリンの等電点は
約５〜６である。
ＬＰＡには一本鎖ＬＰ、１１および二本鎖ｔＰＡが知ら
れているが、特に−末鎖ｔＰＡを取１７する際、細胞培
養時に培養液にアプロチニン等のプロテアーゼインヒビ
ターを添加しｔＰＡを生産することが知られている。
れているが、特に−末鎖ｔＰＡを取１７する際、細胞培
養時に培養液にアプロチニン等のプロテアーゼインヒビ
ターを添加しｔＰＡを生産することが知られている。
使用するプロテアーゼイノヒビターも異種タンパク質で
ある。アプロチニンは等電点が１０〜ｌ０１５である。
ある。アプロチニンは等電点が１０〜ｌ０１５である。
また、ｔＰＡを含む液として上記培ａ液を部分精製され
た７夜も含む。
た７夜も含む。
ｔＰＡを精製する方法として、アフィニティクロマトグ
ラフィーが使用されている。例えば、コンカナバリンＡ
−セファロース（Ｒｉｊｋｅｎ、Ｄ、Ｃ，＆Ｃｏ１１ｅ
ｎ、Ｄ、、（１９８１） Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２
５６．７０３５−７０４１） 、エリスリナトリプソン
インヒビター（ＥＴＩ） −セファロース（ｌＩｅｕ
ｓｓｅｎ、ｃ、、ｅｔ、ａｌ（１９Ｆ＋４） Ｊ、Ｂｉ
ｏｌ、 ＣｈｅｍＪ皿、１ｌＧ３５−１１６３８）
、抗ｔ−ＰＡ抗体−セファロース（Ｒａｎｂｙ、Ｍ、、
ｅｔ、ａｌ、（１９８２） Ｆ［ＪＳ Ｌｅｔｔ、１
４６２８９−２９２）、フィブリン−セファロース（特
開昭５９−５１２２０）などが挙げられる。これら固定
化されたタンパク質は、使用時に少量ではあるが７容離
してくるのが観察される。これらのタンパク質も異種タ
ンパク質である。これらタンパク質の等重点はコンカナ
バリンＡ４．４〜５．５、ＥＴＩ ４．５〜５．５、免
疫グロブリン６５．８〜７．３、フィブリノーゲン５．
５〜５．８である。
ラフィーが使用されている。例えば、コンカナバリンＡ
−セファロース（Ｒｉｊｋｅｎ、Ｄ、Ｃ，＆Ｃｏ１１ｅ
ｎ、Ｄ、、（１９８１） Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２
５６．７０３５−７０４１） 、エリスリナトリプソン
インヒビター（ＥＴＩ） −セファロース（ｌＩｅｕ
ｓｓｅｎ、ｃ、、ｅｔ、ａｌ（１９Ｆ＋４） Ｊ、Ｂｉ
ｏｌ、 ＣｈｅｍＪ皿、１ｌＧ３５−１１６３８）
、抗ｔ−ＰＡ抗体−セファロース（Ｒａｎｂｙ、Ｍ、、
ｅｔ、ａｌ、（１９８２） Ｆ［ＪＳ Ｌｅｔｔ、１
４６２８９−２９２）、フィブリン−セファロース（特
開昭５９−５１２２０）などが挙げられる。これら固定
化されたタンパク質は、使用時に少量ではあるが７容離
してくるのが観察される。これらのタンパク質も異種タ
ンパク質である。これらタンパク質の等重点はコンカナ
バリンＡ４．４〜５．５、ＥＴＩ ４．５〜５．５、免
疫グロブリン６５．８〜７．３、フィブリノーゲン５．
５〜５．８である。
本発明者らはｔＰＡを製造するにあたり、考えられるこ
れら異種タンパク質を除去する方法について検討を１■
ねた結果、陽イオン交換樹脂を用いる方法が特に優れて
いることを見出し、本発明を完成した。
れら異種タンパク質を除去する方法について検討を１■
ねた結果、陽イオン交換樹脂を用いる方法が特に優れて
いることを見出し、本発明を完成した。
ｔＰＡ精製に陽イオン交換体を使用した例は知られてい
る（特開昭６Ｏ−１７４７２７）が、本発明における方
法と異なりｔＰＡ画分を回収するという部分精製の目的
で（吏用されている。
る（特開昭６Ｏ−１７４７２７）が、本発明における方
法と異なりｔＰＡ画分を回収するという部分精製の目的
で（吏用されている。
［課題を解決するための手段］
本発明者らは、陽イオン交換体によるＬＰＡの精製法に
ついて鋭意検討した結果、次のことを見出した。ｔＰＡ
はその荷電以外の要因がカ■わり、陽イオン交換体によ
り強い相斤作用を示し、その作用は不溶性担体の種類に
より異なる。これらのことを利用してＬＰＡを他の混入
異種タンパク質と分離する方法を考案した。
ついて鋭意検討した結果、次のことを見出した。ｔＰＡ
はその荷電以外の要因がカ■わり、陽イオン交換体によ
り強い相斤作用を示し、その作用は不溶性担体の種類に
より異なる。これらのことを利用してＬＰＡを他の混入
異種タンパク質と分離する方法を考案した。
つまりｔＰＡ と他の不純タンパク質を含む液をｔＰＡ
が吸着するｐｉ域で陽イオン交換体に接触させてｔＰＡ
を吸着させる。中性から弱酸性のｐ＋＋範囲が使用され
うる。例えばｐＨ３〜７の範囲、好ましくはｐ）ｌ ３
．５〜６．０の範囲である。
が吸着するｐｉ域で陽イオン交換体に接触させてｔＰＡ
を吸着させる。中性から弱酸性のｐ＋＋範囲が使用され
うる。例えばｐＨ３〜７の範囲、好ましくはｐ）ｌ ３
．５〜６．０の範囲である。
次いでｔＰＡの等電点と同等乃至低い等電点を有する不
純タンパク質を除去できるｐＨ領域で洗浄することによ
りこれら不純タンパク質を除去する。
純タンパク質を除去できるｐＨ領域で洗浄することによ
りこれら不純タンパク質を除去する。
例えば、ｐＨ４，５〜７の範囲、好ましくはｐＨ５，５
〜７の範囲が使用できる。
〜７の範囲が使用できる。
次いでｔＰＡの等電点間等乃至高い等電点を有する不純
タンパク質を陽イオン交換基のｐＫａ付近のｐ＋＋で洗
浄することによりこれら不純タンパク質を除去する。
タンパク質を陽イオン交換基のｐＫａ付近のｐ＋＋で洗
浄することによりこれら不純タンパク質を除去する。
この後、ＬＰＡが安定であるｐ１１領域でｔＰＡを）８
離する。例えば、ｐ１１２〜ＩＯの範囲が使用できる。
離する。例えば、ｐ１１２〜ＩＯの範囲が使用できる。
上記各工程において食品等の塩類が目的に応じて使用で
きる。
きる。
本発明において使用できる陽イオン交換基としてカルボ
キシメチル基、リン酸基及びスルホプロピル基がある。
キシメチル基、リン酸基及びスルホプロピル基がある。
水不溶性担体質としては多糖類、アクリルアミドなどが
挙げられる。
挙げられる。
本発明の方法は、ハツチ法及びカラム法のどちらでも使
用できる。
用できる。
本発明の方法によると異種タンパク質のみならず発熱性
物質パイロジエンを除去できる。また濃縮されたｔ−Ｐ
Ａを）８離できるため、濃縮操作、脱塩操作を用いるこ
となくそのまま医薬品として使用可能である。
物質パイロジエンを除去できる。また濃縮されたｔ−Ｐ
Ａを）８離できるため、濃縮操作、脱塩操作を用いるこ
となくそのまま医薬品として使用可能である。
〔実施例］
以下本発明を実施例により具体的に説明する。
実施例１
ボウズ（Ｂｏｗｅｓ）メラノーマ細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ
１４２４Ｇ３６１）を１０％熱不活性（５６°Ｃ１３０
分間）胎児牛血清を補充したＲＰＭ ｌ−１６４（Ｊｕ
ｌ織培養媒体中で培養後、培件物を一度洗い、４０ＫＩ
Ｖ／ｍｌのアプロチニンを含む血清を含まない培体中で
２４時間培養後、培体を集め収穫液とした。収穫液２１
にリン酸を加えｐＨ４，０に調整し、Ｏ，１５Ｍ食塩を
含む０．０５Ｍリン酸２水素ｌナトリウム溶液ｐＨ４，
０で平衡化したＣ門−セファロースカラム（Ｐｈａｒｍ
ａｃｉａ） １０ｍ１に通した。
１４２４Ｇ３６１）を１０％熱不活性（５６°Ｃ１３０
分間）胎児牛血清を補充したＲＰＭ ｌ−１６４（Ｊｕ
ｌ織培養媒体中で培養後、培件物を一度洗い、４０ＫＩ
Ｖ／ｍｌのアプロチニンを含む血清を含まない培体中で
２４時間培養後、培体を集め収穫液とした。収穫液２１
にリン酸を加えｐＨ４，０に調整し、Ｏ，１５Ｍ食塩を
含む０．０５Ｍリン酸２水素ｌナトリウム溶液ｐＨ４，
０で平衡化したＣ門−セファロースカラム（Ｐｈａｒｍ
ａｃｉａ） １０ｍ１に通した。
通過液を集めプラスミノーゲン依存フィブリン溶液活性
を測定したが、活性は検出されなかった。
を測定したが、活性は検出されなかった。
この後吸着したたんばく質は０．０３Ｍ食塩を含も０、
門リン酸２水素１ナトリウムーリン酸緩衝液ｐＨ２，５
，２０（１＋ｙｊ！で洗った。この後、０．０５Ｍ リ
ン酸１水素２す１−リウムー水酸化ナトリウム援衝液ｐ
１１１０．０で１００ｍ１でｔＰＡを（８出した。
門リン酸２水素１ナトリウムーリン酸緩衝液ｐＨ２，５
，２０（１＋ｙｊ！で洗った。この後、０．０５Ｍ リ
ン酸１水素２す１−リウムー水酸化ナトリウム援衝液ｐ
１１１０．０で１００ｍ１でｔＰＡを（８出した。
溶出されたｔＰＡ活１生の回収は約８５χであった。
このｔｐＡｉ９出画分を集めリン酸でｐｌ＋ ４．５に
３周整後、０．０５Ｍリン酸２水素［ナトリウム溶液ｐ
Ｈ４，５で平衡化したＣＭ−トリスアクリルＭ（ＬＫＢ
） ５ ｍｌに通した。通過液を集めプラスミノーゲン
依存フィブリン溶液活性を測定したが、活性は検出され
なかった。
３周整後、０．０５Ｍリン酸２水素［ナトリウム溶液ｐ
Ｈ４，５で平衡化したＣＭ−トリスアクリルＭ（ＬＫＢ
） ５ ｍｌに通した。通過液を集めプラスミノーゲン
依存フィブリン溶液活性を測定したが、活性は検出され
なかった。
この後、０．０５Ｍリン酸１１ｉｊｉ液ｐｆ＋ ５．８
１００ｍ１、続いて０．０５Ｍグリンンー塩酸緩酸液ｐ
Ｈ３，２ｆｏｏｄでカラムを洗った。これら洗浄液中の
ｔＰＡ活性はカラムにかけた活性の約５％であった。最
後にｔＰＡを０．１Ｍリン酸２水素１ナトリウム−リン
酸緩衝、・夜ｐＨ２，５，５０ｍ１で溶出した。溶出さ
れたｔＰＡ ：活１生の回収はカラムにかけた活性の約
９０％であった。
１００ｍ１、続いて０．０５Ｍグリンンー塩酸緩酸液ｐ
Ｈ３，２ｆｏｏｄでカラムを洗った。これら洗浄液中の
ｔＰＡ活性はカラムにかけた活性の約５％であった。最
後にｔＰＡを０．１Ｍリン酸２水素１ナトリウム−リン
酸緩衝、・夜ｐＨ２，５，５０ｍ１で溶出した。溶出さ
れたｔＰＡ ：活１生の回収はカラムにかけた活性の約
９０％であった。
この溶出画分をＳＯＳポリアクリルアミドゲル電気電気
移動後色で調べたところ、分子噴約７（１，０００ダル
トンのバンドのみが確認された。また抗胎児中血清）ノ
′ｃ体及び抗アプロチニン抗体を用いた酵素免疫測定（
ＥＩＡ）の結果、ｔＰＡ ｍｇ当たり胎児牛血清は約４
０ｎｇ、アプロチニンは約５ｎｇであった。
移動後色で調べたところ、分子噴約７（１，０００ダル
トンのバンドのみが確認された。また抗胎児中血清）ノ
′ｃ体及び抗アプロチニン抗体を用いた酵素免疫測定（
ＥＩＡ）の結果、ｔＰＡ ｍｇ当たり胎児牛血清は約４
０ｎｇ、アプロチニンは約５ｎｇであった。
実施例２
ヒトｔＰＡ遺伝子を組み込んだチャイニーズハムスター
卯母（ＣＨＯ）細胞培養液〔１０％熱不活性（５６°Ｃ
８３０分間）胎児牛血清及び４０ＫＩＬｌ／ｍｆｆ１ア
プロチニンを含む）ｌｆｆｉを抗ヒトｔＰＡ抗体−セフ
ァロース（１０ｍｇｂ’Ｃ体／ ｍｌ樹脂）カラム２０
０ｍＭに通した。
卯母（ＣＨＯ）細胞培養液〔１０％熱不活性（５６°Ｃ
８３０分間）胎児牛血清及び４０ＫＩＬｌ／ｍｆｆ１ア
プロチニンを含む）ｌｆｆｉを抗ヒトｔＰＡ抗体−セフ
ァロース（１０ｍｇｂ’Ｃ体／ ｍｌ樹脂）カラム２０
０ｍＭに通した。
１、叶食塩を含む０．０５Ｍリン酸緩徨ｉ？夜ｐ１１７
．５で洗浄後、２．０１チオシアン酸アンモニウムを含
むグリノン塩酸緩衡液ｐＨ３，５で吸着した蛋白を溶離
した。
．５で洗浄後、２．０１チオシアン酸アンモニウムを含
むグリノン塩酸緩衡液ｐＨ３，５で吸着した蛋白を溶離
した。
）８出）夜を集めフ゛ラスミノーゲン（衣存フィフ′リ
ンン容液活性を測定したところ、カラムに通した活性の
約９０％が確認された。この液に硫酸アンモニウムを３
００ｇ／ Ｑの割合で加えた後、ｐｎ ７．０に調整し
４°Ｃで一晩放置する。生した沈澱を遠心して集め、０
．０５Ｍ食塩を含む０．０５１’ｌ酢酸緩衡液ｐＨ４，
０に対して透析する。この液を０．０５Ｍ食塩を含む０
．０５Ｍ酢酸緩衝液ｐＨ４，０で平衡化したＳＰ（スル
ホプロピル）セファロース１０ｍ２に通した。カラムを
平衡化した９１ 復ｉ ／＆、で洗浄し、その？容土イ
′夜のフ゛ラスミノーゲン依存フィブリン溶液活性を測
定した。
ンン容液活性を測定したところ、カラムに通した活性の
約９０％が確認された。この液に硫酸アンモニウムを３
００ｇ／ Ｑの割合で加えた後、ｐｎ ７．０に調整し
４°Ｃで一晩放置する。生した沈澱を遠心して集め、０
．０５Ｍ食塩を含む０．０５１’ｌ酢酸緩衡液ｐＨ４，
０に対して透析する。この液を０．０５Ｍ食塩を含む０
．０５Ｍ酢酸緩衝液ｐＨ４，０で平衡化したＳＰ（スル
ホプロピル）セファロース１０ｍ２に通した。カラムを
平衡化した９１ 復ｉ ／＆、で洗浄し、その？容土イ
′夜のフ゛ラスミノーゲン依存フィブリン溶液活性を測
定した。
これにおいてカラムにかけた活性の約５％が回収された
。樹脂の吸着されているタンパク質は、０．０５Ｍリン
酸緩衝？Ｖｊ、ｐＨ６，２２００ｍＮで洗浄後、０．１
門食塩を含むＯ，１Ｍリン酸２水素１ナトリウム−リン
酸液ｉ％ｉ ？夜ｐ）１２．５５０蔵で溶出した。溶出
画分のｔＰＡ活性の回収はカラムにかけた活性の約９０
％であり、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動後の
染色で調べたところ、分子量約７０，０００ダルトンの
バンドのみが確認された。また抗胎児中血清抗体、抗ア
プロチニン抗体及び抗ヤギ免疫グロブリンＧ抗体を用い
たＥＩＡの結果、ｔＰＡ ｍｙ、当たり胎児牛血清は約
５０ｎｇ、アプロチニンは約３ｎｇ、ヤギ抗体は約ｌｏ
ｎｇであった。
。樹脂の吸着されているタンパク質は、０．０５Ｍリン
酸緩衝？Ｖｊ、ｐＨ６，２２００ｍＮで洗浄後、０．１
門食塩を含むＯ，１Ｍリン酸２水素１ナトリウム−リン
酸液ｉ％ｉ ？夜ｐ）１２．５５０蔵で溶出した。溶出
画分のｔＰＡ活性の回収はカラムにかけた活性の約９０
％であり、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動後の
染色で調べたところ、分子量約７０，０００ダルトンの
バンドのみが確認された。また抗胎児中血清抗体、抗ア
プロチニン抗体及び抗ヤギ免疫グロブリンＧ抗体を用い
たＥＩＡの結果、ｔＰＡ ｍｙ、当たり胎児牛血清は約
５０ｎｇ、アプロチニンは約３ｎｇ、ヤギ抗体は約ｌｏ
ｎｇであった。
実施例３
ヒ） ｔＰＡ遺伝子を組み込んだマウス綿維芽細胞（Ｍ
ｏｕｓｅ ｃ１２７１ ＡＴＣＣＣＲＬ１６１６）培養
液（インシュリン、トランスフェリン及び４０ＫＩＥ／
ｍｌアプロチニンを含む）２２を０．１５Ｍ食塩を含む
０．０５Ｍリン酸緩ｉ１？＆ｐＨ７，５で平衡化したフ
ィブリン−セファロース（２０ｍｇフィブリン／ ｍｌ
樹脂）２０ｍｉに通した。吸着したタンパク質を含む樹
脂は、１−食塩を含む０．０５Ｐ リン酸緩衝液ｐｕ
７．５４００雁で洗浄した。
ｏｕｓｅ ｃ１２７１ ＡＴＣＣＣＲＬ１６１６）培養
液（インシュリン、トランスフェリン及び４０ＫＩＥ／
ｍｌアプロチニンを含む）２２を０．１５Ｍ食塩を含む
０．０５Ｍリン酸緩ｉ１？＆ｐＨ７，５で平衡化したフ
ィブリン−セファロース（２０ｍｇフィブリン／ ｍｌ
樹脂）２０ｍｉに通した。吸着したタンパク質を含む樹
脂は、１−食塩を含む０．０５Ｐ リン酸緩衝液ｐｕ
７．５４００雁で洗浄した。
この後、０．５Ｍリジンを含む０．０５Ｍリン酸１水素
２ナトリウム−水酸化ナトリウムｐＨｌｏ、０ ２００
ｍＮでタンパク質をｌ８出した。溶出画分のプラスミノ
ーゲン依存フィブリンｉ８ ？（ｌ活性を測定するとカ
ラムにか５）だ活性の約９０％が回収された。）霧出画
分を５０ｍ門リンす２水素ｌナトリウムｐＨ４，５に対
し透を圧接、５０ｍＭリン酸２水素Ｉす１−リウ１．ρ
１１４．５で千１１１化したＣＭ−トリスアクリル？１
２０ｍ１に通した。吸着したタンパク質を含む樹脂は、
２５ｍ１リン酸緩衝ｉ（＋、ｐＨ６，０４００ｍＲ５続
いて０．０５Ｍグリソンー塩酸緩酸液ｉ？＆ｐＨ３，２
４００ｍ１で洗浄後、５０ｍＭ食塩を含む５０ｎ＋Ｍリ
ン酸２水１ナトリウム−リン酸緩衝液ｐＨ２，５１００
ｄ ’Ｔ： ｔ−ＰＡを）容土した。
２ナトリウム−水酸化ナトリウムｐＨｌｏ、０ ２００
ｍＮでタンパク質をｌ８出した。溶出画分のプラスミノ
ーゲン依存フィブリンｉ８ ？（ｌ活性を測定するとカ
ラムにか５）だ活性の約９０％が回収された。）霧出画
分を５０ｍ門リンす２水素ｌナトリウムｐＨ４，５に対
し透を圧接、５０ｍＭリン酸２水素Ｉす１−リウ１．ρ
１１４．５で千１１１化したＣＭ−トリスアクリル？１
２０ｍ１に通した。吸着したタンパク質を含む樹脂は、
２５ｍ１リン酸緩衝ｉ（＋、ｐＨ６，０４００ｍＲ５続
いて０．０５Ｍグリソンー塩酸緩酸液ｉ？＆ｐＨ３，２
４００ｍ１で洗浄後、５０ｍＭ食塩を含む５０ｎ＋Ｍリ
ン酸２水１ナトリウム−リン酸緩衝液ｐＨ２，５１００
ｄ ’Ｔ： ｔ−ＰＡを）容土した。
ＬＰＡの回収は約９０％であり、ＳＯＳポリアクリルア
ミドゲル電気泳動後の染色で調べたところ、分子猾杓７
０，０００ダルトンのハンドのみが確認された。また抗
インツユリン抗体、抗トランスフェリン抗体、抗フィブ
リノーゲン抗体及び抗アプロチニン抗体を用い、ｔ−Ｐ
Ａ中のこれら抗原物質の残存量を酵素免疫法で調べたと
ころ、ｔ−ＰＡｍｇ当たりインシュリンは５ｎｇ以下、
トランスフェリンは１０ｎｇ以下、フィブリノーゲンは
約３０ｎｇ、アプロチニンは約２ｎｇであった。
ミドゲル電気泳動後の染色で調べたところ、分子猾杓７
０，０００ダルトンのハンドのみが確認された。また抗
インツユリン抗体、抗トランスフェリン抗体、抗フィブ
リノーゲン抗体及び抗アプロチニン抗体を用い、ｔ−Ｐ
Ａ中のこれら抗原物質の残存量を酵素免疫法で調べたと
ころ、ｔ−ＰＡｍｇ当たりインシュリンは５ｎｇ以下、
トランスフェリンは１０ｎｇ以下、フィブリノーゲンは
約３０ｎｇ、アプロチニンは約２ｎｇであった。
実施例４
ヒト胎児肺細胞（ＡＴＣＣＭＲＣ５ＣＣＬ１７１）
［１０％熱不活性（５６°Ｃ１３０分間）胎児牛血清及
び２０ＫＩＥ／ｍｉアプロチニンを含む］１０１をエリ
スリナトリプシンインヒビター（ＥＴＩ）を固定化した
ＥＴＩ−セファロース（５ｍｇ ＥＴＩ／ｍｌ樹脂）ｌ
Ｏｍｌニ通シタ。
［１０％熱不活性（５６°Ｃ１３０分間）胎児牛血清及
び２０ＫＩＥ／ｍｉアプロチニンを含む］１０１をエリ
スリナトリプシンインヒビター（ＥＴＩ）を固定化した
ＥＴＩ−セファロース（５ｍｇ ＥＴＩ／ｍｌ樹脂）ｌ
Ｏｍｌニ通シタ。
２Ｍ食塩を含む０．０５Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７，５２０
０ｍｆで洗浄後、０．０５Ｍ食塩を含む０．０５Ｍクエ
ン酸緩衝液ｐＨ４，７５０ｍ１でタンパク質を溶出した
。溶出画分の活性の回収は約４０％であった。
０ｍｆで洗浄後、０．０５Ｍ食塩を含む０．０５Ｍクエ
ン酸緩衝液ｐＨ４，７５０ｍ１でタンパク質を溶出した
。溶出画分の活性の回収は約４０％であった。
溶出画分を５０ｍＭ食塩を含む０．０５Ｍクエン酸２１
ｆｊｉ／ｉ ｐ Ｈ４、７で平衡化したけ一セファロ
ース１０蛯に通した。吸着したタンパク質を含む樹脂は
、５０ｍＭ食塩を含む０．０５Ｍクエン酸緩酸液ｐＨ２
，８２００ｍｆｆ１．続いて５０ｍ門食塩を含む０．０
５？ｌリン酸緩衝液ｐＨ６，０，２００ｄで洗浄後、５
抛−食塩を含む０．０５１’ｌｌＪン酸１水素２ナトリ
ウム−水酸化ナトリウム覆面Ｊ ｐ８１０．０５０ｍｍ
”ｉ？ｔ−ＰＡをｒ容土した。
ｆｊｉ／ｉ ｐ Ｈ４、７で平衡化したけ一セファロ
ース１０蛯に通した。吸着したタンパク質を含む樹脂は
、５０ｍＭ食塩を含む０．０５Ｍクエン酸緩酸液ｐＨ２
，８２００ｍｆｆ１．続いて５０ｍ門食塩を含む０．０
５？ｌリン酸緩衝液ｐＨ６，０，２００ｄで洗浄後、５
抛−食塩を含む０．０５１’ｌｌＪン酸１水素２ナトリ
ウム−水酸化ナトリウム覆面Ｊ ｐ８１０．０５０ｍｍ
”ｉ？ｔ−ＰＡをｒ容土した。
カラムにかけた活性の約９０％が回収され、ＳＤＳポリ
アクリルアミドゲル電気電気移動後色により分子量約７
０．０００ダルトンの単一バンドが確認された。
アクリルアミドゲル電気電気移動後色により分子量約７
０．０００ダルトンの単一バンドが確認された。
抗胎児中血清抗体、抗ＥＴＩ抗体及び抗アプロチニン抗
体を用い、ｔ−ＰＡ中のこれら抗原物質の残存量を酵素
免疫測定法で調べたところ、ｔＰＡ ｍｇ当たり胎児牛
血清は約３０ｎｇ、 １ｉＴＩは約５ｎｇ、アプロチニ
ンはｌｏｇ以下であった。
体を用い、ｔ−ＰＡ中のこれら抗原物質の残存量を酵素
免疫測定法で調べたところ、ｔＰＡ ｍｇ当たり胎児牛
血清は約３０ｎｇ、 １ｉＴＩは約５ｎｇ、アプロチニ
ンはｌｏｇ以下であった。
特許出願人 三井東圧化学株式会社
手続ネ市正書 （方式）
％式％
１、事件の表示
昭和６３年特許願第２２１８４３号
２、発明の名称
ｔＰＡの精製方法
３、補正をする者
事件との関係 特許出願人
住所 東京都千代田区霞が関三丁目２番５号名称（３１
２） 三井東圧化学株式会社４、補正命令の日付
２） 三井東圧化学株式会社４、補正命令の日付
Claims (1)
- １）ｔＰＡと他のタンパク質を不純物として含む粗ｔＰ
Ａを陽イオン交換体と密接に接触させ、不純タンパク質
を除去できるｐＨ領域で不純タンパクを分離除去後、選
択的に分子量約７万ダルトンのｔＰＡを取得することを
特徴とするｔＰＡの精製方法。
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63221843A JPH0824578B2 (ja) | 1988-09-05 | 1988-09-05 | ｔＰＡの精製方法 |
| CA000609971A CA1335186C (en) | 1988-09-05 | 1989-08-31 | Method for purifying tissue plasminogen activator |
| KR1019890012820A KR910006600B1 (ko) | 1988-09-05 | 1989-09-05 | 조직 플라스미노겐 액티베이터의 정제방법 |
| DE68915230T DE68915230T2 (de) | 1988-09-05 | 1989-09-05 | Verfahren zum Reinigen von Gewebe-Plasminogenaktivator. |
| EP89202239A EP0358274B1 (en) | 1988-09-05 | 1989-09-05 | Method for purifying tissue plasminogen activator |
| US07/842,759 US5158882A (en) | 1988-09-05 | 1992-02-28 | Method for purifying a crude tissue plasminogen activator preparation |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63221843A JPH0824578B2 (ja) | 1988-09-05 | 1988-09-05 | ｔＰＡの精製方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0269184A true JPH0269184A (ja) | 1990-03-08 |
| JPH0824578B2 JPH0824578B2 (ja) | 1996-03-13 |
Family
ID=16773062
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63221843A Expired - Lifetime JPH0824578B2 (ja) | 1988-09-05 | 1988-09-05 | ｔＰＡの精製方法 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5158882A (ja) |
| EP (1) | EP0358274B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0824578B2 (ja) |
| KR (1) | KR910006600B1 (ja) |
| CA (1) | CA1335186C (ja) |
| DE (1) | DE68915230T2 (ja) |
Families Citing this family (1)
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|---|---|---|---|---|
| US20090130714A1 (en) * | 2007-09-24 | 2009-05-21 | Reliance Life Sciences Pvt.Ltd. | Process for purifying recombinanat tissue plasminogen activator (TPA) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS60174729A (ja) * | 1984-02-21 | 1985-09-09 | Nippon Shinyaku Co Ltd | 抗癌医薬組成物 |
| JPS61109727A (ja) * | 1984-11-02 | 1986-05-28 | ベーリングヴエルケ・アクチエンゲゼルシヤフト | ウロキナーゼの殺菌方法 |
| JPS61246131A (ja) * | 1985-04-22 | 1986-11-01 | 雪印乳業株式会社 | 新しいタイプのプラスミノ−ゲン活性化因子及びその調製方法 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS53107479A (en) * | 1977-02-28 | 1978-09-19 | Green Cross Corp:The | Preparation of human lysozyme |
| US4264738A (en) * | 1979-08-01 | 1981-04-28 | Stepanov Valentin M | Process for purification of proteolytic enzymes |
| US4374926A (en) * | 1981-05-13 | 1983-02-22 | Smith Laboratories, Inc. | Method for the production of improved chymopapain |
| JPS6379591A (ja) * | 1986-09-22 | 1988-04-09 | Mitsui Toatsu Chem Inc | ｔＰＡの精製方法 |
-
1988
- 1988-09-05 JP JP63221843A patent/JPH0824578B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1989
- 1989-08-31 CA CA000609971A patent/CA1335186C/en not_active Expired - Fee Related
- 1989-09-05 EP EP89202239A patent/EP0358274B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-09-05 DE DE68915230T patent/DE68915230T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1989-09-05 KR KR1019890012820A patent/KR910006600B1/ko not_active Expired
-
1992
- 1992-02-28 US US07/842,759 patent/US5158882A/en not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS60174729A (ja) * | 1984-02-21 | 1985-09-09 | Nippon Shinyaku Co Ltd | 抗癌医薬組成物 |
| JPS61109727A (ja) * | 1984-11-02 | 1986-05-28 | ベーリングヴエルケ・アクチエンゲゼルシヤフト | ウロキナーゼの殺菌方法 |
| JPS61246131A (ja) * | 1985-04-22 | 1986-11-01 | 雪印乳業株式会社 | 新しいタイプのプラスミノ−ゲン活性化因子及びその調製方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA1335186C (en) | 1995-04-11 |
| EP0358274B1 (en) | 1994-05-11 |
| JPH0824578B2 (ja) | 1996-03-13 |
| EP0358274A3 (en) | 1990-09-26 |
| DE68915230T2 (de) | 1994-08-18 |
| DE68915230D1 (de) | 1994-06-16 |
| KR900004933A (ko) | 1990-04-13 |
| EP0358274A2 (en) | 1990-03-14 |
| KR910006600B1 (ko) | 1991-08-29 |
| US5158882A (en) | 1992-10-27 |
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