JPS61109727A - ウロキナーゼの殺菌方法 - Google Patents

ウロキナーゼの殺菌方法

Info

Publication number
JPS61109727A
JPS61109727A JP60244241A JP24424185A JPS61109727A JP S61109727 A JPS61109727 A JP S61109727A JP 60244241 A JP60244241 A JP 60244241A JP 24424185 A JP24424185 A JP 24424185A JP S61109727 A JPS61109727 A JP S61109727A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
urokinase
solution
optionally
exchanger
glycine
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
JP60244241A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2594256B2 (ja
Inventor
エリク・パクヴエース
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Siemens Healthcare Diagnostics GmbH Germany
Original Assignee
Behringwerke AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Behringwerke AG filed Critical Behringwerke AG
Publication of JPS61109727A publication Critical patent/JPS61109727A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP2594256B2 publication Critical patent/JP2594256B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/6456—Plasminogen activators
    • C12N9/6462—Plasminogen activators u-Plasminogen activator (3.4.21.73), i.e. urokinase
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21073—Serine endopeptidases (3.4.21) u-Plasminogen activator (3.4.21.73), i.e. urokinase

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ウロキナーゼの精製およびパスツール殺菌方
法に関する。この方法により得られるウロキナーゼは血
栓溶解剤として用いることができる。
プラスミノーゲンは触媒の作用の下にプラスミンに転化
される。ウロキナーゼはこの反応の触媒の１つである。
ウロキナーゼは例えば人尿中に微量存在する。ウロキナ
ーゼを立役溶解に用いることは知られている。商業的に
入手しうるウロキナーゼ製品がしばしば高分子ｉ（分子
Ｊ１５４，０００）および低分子ｋ（分子量３３．００
０）型のウロキナーゼから成ることも既に知られている
。高分子量ウロキナーゼ（ＨＭＷ−ＵＫ）は天然型の分
子に相当するのに対し、低分子１型（ＬＭＷ−ＵＫ）は
ＨＭＷ　−ＵＫのタンパク分解生成物である。
天然型に対応しているのでＨＭＷ−ＵＫの方が治療目的
で投与するのに好ましい。低分子′に型への転化が自触
媒作用により、あるいは汚染プロテアーゼにより引き起
こされるかどうかは明らかでない（Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ、　９０　（２２５−２３２）　１９８１　＋Ｔｈｒ
ｏｍｂ、　Ｒａｇ、　２３（５４１−５４７）　１９８
１参照）。
ウロキナーゼの単離および精製には各種の方法が既に報
告されている。これらの方法は主として、好ましくない
ＨＭＷ−ＵＫ　：　ＬＭＷ−ＵＫ比を有するウロキナー
ゼ生成物の製造に係るものである。
ＨＭＷ−ウロキナーゼの取得方法が西独特許仕願公開第
２，８１５．８５３号明細書く記載されていふ。
この方法を用いた場合の収量は、ＬＭＷ画分の次表のた
めに１そしてまたＨＭＷ−ウロキナーゼの分解を防けな
いために極めて低い。
本発明の目的は、高割合の尿中にみられるようなＨＭＷ
−ウロキナーゼおよび高い安定性を有するウロキナーゼ
調製物を製造することにある。
驚くべきことに、ウロキナーゼを溶液から陽イオン交換
体上に結合させそして段階的濃度勾配溶出を行うことに
よりウロキナーゼを随伴タンパクから好収率で分離でき
、そしてこの精製方法によｊ５　ＨＭＷ−ウロキナーゼ
の安定性が相当に高められることを見出した。更にまた
、飛〈べきことに、ウィルスを不活性化させるために熱
処理する際のＨＭＷ−ウロキナーゼの分解を、ウロキナ
ーゼ溶液を１０，０００〜１００，０００　ＩＵ／＋ｄ
の濃度に希釈するか、または６以下、好ましくは４〜５
．９５のｐＨＫ調節することＫよシ防止できることを見
出した。
これら３つの手順を組合せることができ°る。
すなわち、本発明は、タンパク分解活性を有する異物質
が除去され、そして高い安定性を有する生成物を好収率
で製造できるウロキナーゼの精製方法に関する。
本発明はまた。　ＢＭＷ−υにの割合およびウロキナー
ゼ活性を大して低下させることのないウロキナーゼの溶
液のパスツール殺菌方法にも関する。
本発明は特に、ウロキナーゼの溶液を陽イオン交換体と
接触させ、タン・ぞり分解活性を有する不純物を段階的
溶出により負荷された交換体から除去しそしてウロキナ
ーゼを溶出することよシなるウロキナーゼの精製方法に
関する。
例えば尿を出発溶液として用いることができる。
本発明はまた、ウロキナーゼの溶液を６以下、の−、好
ましくは４〜５．９５、そして１０，０００〜１００．
０００　ＩＵ／−のウロキナーゼ濃度に調節し、次いで
単糖類または二糖類または糖アルコール、および場合に
よりアミノ酸の存在下に４０〜９０℃、好ましくは５５
〜６５℃の温度で、少くとも１時間、好ましくは８〜２
０時間加熱することよりなる、熱処理によるウロキナー
ゼの前液中の病原性ウィルスの失活化方法にも関する。
次にそのウロキナーゼの溶液は濃縮しそしてν過により
滅菌することができる。糖類の濃度は好ましくは４００
〜６００１１／ｌであシ、またアミノ酸のそれは好まし
くは１〜３モル／ｌである。
本発明はまた、特に注射、潅流または類似の方法によ）
投与されうる、この方法によ）製造された生成物を治療
目的に使用することに関する。
ウロキナーゼ含有水性溶液が干渉量の塩類を含有する場
合には、これらをそれから実質的な程度除去するのが有
利である。
他の望ましくない随伴タンパクは、場合により、例えば
陰イオン交換体を用いて除くことができる。
好ましい方法は、場合によりクロキナーゼ含有溶液から
塩類を除去し、場合によりその低塩類濃度の溶液を陰イ
オン交換体と接触させ、そしてその交換体を除去し、場
合により上清あるいはまた脱塩された溶液をｐＨ５〜６
、好ましくは５．４〜５．６に＋Ｍ節しそしてそれを陽
イオン交換体、好ましくはＣＭ−セルロースと接触させ
ることよりなる。その陽イオン交換体を好ましくはｐＨ
ａ５で、そして好ましくは５〜１０ｍ８１（２０℃）の
伝導度を有する緩衝液で洗浄し、そしてそのウロキナー
ゼを−５，５〜９５、好ましくは６．５〜９で、そして
好ましくは２０〜３０ｍ８１（２０℃）の伝導度を有す
る緩衝液で溶出する。
特に好ましい態様においでは、ウロキナーゼ含有溶液例
えば尿を場合によ）脱塩し、不純物を場合により陰イオ
ン交換体で処理することＫより除去し、その溶液をｐＨ
５，５に調節し、そしてＣＭ−セルロースを添加しセし
て次に除去しそして、０．０７モル／ｌの酢酸ナトリウ
ムと０．５モル／ｌのグリシンを含有するｐＨ５，ｓの
緩衝液（伝導度：　Ｏ〜５　ｍ１３ｉ　＋２０℃）で洗
浄し次いで０．１５モル／ｌの酢酸ナトリウムと０．５
モル／ｌのグリシンを含有する−５．５の緩衝液（伝導
度：５〜１０ｍ８１ｉ２０℃）で洗浄し、そして次にそ
のウロキナーゼをｐＨ９の緩衝液（伝導度：２０〜３０
ｍ８ｉ　：　２０℃）で溶出するというような方法とす
ることができる。
更にまた、溶出液を５．５の陣に調節し、そして単糖類
ま九はオリゴ糖類または糖アルコール、好ましくは１　
ｋｌｉ／ｌのシェークロースおよび場合によっては水溶
性アミノ酸、好ましくは１１２１／ｌのグリシンの添加
後、１０，０００〜１００，０００ＩｔＴ／ｄ、好まし
くは５０．ＯＱ　ＯＩｔｉ／−のウロキナーゼ最終濃度
で６０℃で１０時間加熱しそして濃縮しそして濾過によ
り滅菌するようにして本発明方法を行うこともできる。
前述の方法により製造された生成物は当初の溶液に相当
するＨＭＷ／　ＬＭＷ−ウロキナーゼ比および高純度を
有すると同時に良安定性を有している点で区別される。
例えば、高分子量つμキナーゼ／低分子量ウロキナーゼ
比が７０／３ｏの出発材料を用いた場合には、８５チの
収率および９０チを超える純度で得られた生成物は同じ
ＨＭＷ　−ＵＫ／ＬＭＷ−ＵＫ比を有した。陽イオン交
換体の洗浄を省略すると、生成物中のＨＭＷ／Ｉ、ＭＹ
比は５５／４５であシ、収車Ｆｉ９０チであシ、そして
純度は６０チを下回った。この場合には、最終生成物の
安定性もよシ低かった。溶液を室温で放置すると、その
ポリマー比は低分子ｆ画分優勢にシフトした。ＨＭＷ−
ＵＫ／ＬＭＷ　−ＵＫ比はモノ−８−カラム（ＦＰＬＣ
−Ｐｈａｒｍａｃｉａ　）で２つの型を分離後、アミド
分解活性の測定によって測定した。
最終生成物の収車およびポリマー比はまた加熱段階での
−１にも依存する。その−は、約５．５とするのが有利
であシ、そのｐＨでは、好ましい高分子量ウロキナーゼ
／低分子量ウロキナーゼ比が得られしかも収率は極めて
良好である。
本発明を次の実施例により詳細に説明する。
実施例 １、精製 ウロキナーゼ含有出発溶液から４℃でのゲル濾過により
塩を除去し、そしてその溶出液を集め、そしてｐＨ８で
ＤＥＡＥ−セルロースを用いてそれから不純物を除去し
た。５ｏａｙｉｔのシュークロースおよび５７．５１１
／ｌのグリシンをその溶出液に添加し、その声を壌酸で
５，５に調節し、そして４℃で、Ｑ、０７モル／ｌの酢
酸ナトリウムとα５モル／ｌのグリシ／を含有しそして
５．５の声を有する溶液で平衡させたＣＭ−セルロース
を添加し、そしてその混合物を１時間攪拌した。
そのゲルを吸引乾燥し、平衡緩衝液で洗い、カラムに充
填しそしてａ１５モル／ｌの酢酸ナトリウムと（１５モ
ル／ｌのグリシンを含有するｐＨｓ、ｓの緩衝液（伝導
度：　７．８〜ａ１　ｍ８ｉ、２０℃）で洗浄し次いで
ウロキナーゼを０．２モル／ｌの酢酸ナトリウムと１５
モル／ｌのグリシンを含有するｐＨ９，０の溶液（伝導
度：　２６〜３０　ｍ８ｉ、２０℃）を用いて溶出した
。
２　ウィルス不活性化 前記溶出液１ｔあたシに１ゆのシュークロースおよび１
１２１のグリシンを添加し、そのｐＨを塩酸で５．５に
調節し、ウロキナーゼ濃度をｓｏ、ｏｏ。
Ｉｔ７／ｐＨに希釈し、次いでその溶液を６０℃で１０
時間加熱した。ウロキナーゼの加熱した溶液を濃縮し、
次いで濾過により滅菌した。
峙許出願人　　ベーリングヴエルケ・アクチェンゲゼル
シャフト 外２名

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １）ウロキナーゼの溶液をウロキナーゼを結合しうる陽
    イオン交換体と接触させ、タンパク分解活性を有する不
    純物をその負荷した交換体から段階的溶出により除去し
    、そしてウロキナーゼを溶出し、そして場合によりその
    ウロキナーゼをパスツール殺菌することよりなる、ウロ
    キナーゼの精製方法。 ２）塩を除去してあるウロキナーゼの溶液を用いる特許
    請求の範囲第１項記載の方法。 ３）陰イオン交換体で処理してあるウロキナーゼの溶液
    を用いる特許請求の範囲第１項記載の方法。 ４）ウロキナーゼ含有溶出液をシュークロースおよび場
    合によりグリシンの存在下に４０〜９０℃および６以下
    、好ましくは４〜５．９５のｐＨで１〜２０時間パスツ
    ール殺菌する特許請求の範囲第１項記載の方法。 ５）ウロキナーゼ含有溶液から塩を除去し、その低塩濃
    度溶液を場合により陰イオン交換体と接触させ、そして
    その交換体を除去し、場合により上清あるいはまた前記
    溶液を５．４〜５．６のｐＨに調節しそしてＣＭ−セル
    ロースと接触させ、そしてその交換体を除去しそして５
    ．４〜５．６のｐＨおよび５〜１０ｍＳｉの伝導度を有
    する緩衝液で洗浄し、そしてそのウロキナーゼを５．５
    〜９．５のｐＨを有する緩衝液で溶出し、そして場合に
    より、得られたウロキナーゼの溶液に４００〜６００ｇ
    ／ｌのシュークロースと１〜３モル／ｌのグリシンとを
    添加し、それを次に４０〜９０℃、好ましくは５５〜６
    ５℃の温度、６以下、好ましくは４〜５．９５のｐＨで
    １〜２０時間加熱する、特許請求の範囲第１項記載の方
    法。 ６）特許請求の範囲第１項に記載のウロキナーゼ調製物
    の治療目的の使用。
JP60244241A 1984-11-02 1985-11-01 ウロキナーゼの殺菌方法 Expired - Lifetime JP2594256B2 (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE3439980.1 1984-11-02
DE19843439980 DE3439980A1 (de) 1984-11-02 1984-11-02 Verfahren zur reinigung sowie pasteurisierung von urokinase

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPS61109727A true JPS61109727A (ja) 1986-05-28
JP2594256B2 JP2594256B2 (ja) 1997-03-26

Family

ID=6249261

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP60244241A Expired - Lifetime JP2594256B2 (ja) 1984-11-02 1985-11-01 ウロキナーゼの殺菌方法

Country Status (7)

Country Link
US (1) US5156967A (ja)
EP (1) EP0180859B1 (ja)
JP (1) JP2594256B2 (ja)
AT (1) ATE77102T1 (ja)
AU (1) AU599309B2 (ja)
CA (1) CA1335369C (ja)
DE (2) DE3439980A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0269184A (ja) * 1988-09-05 1990-03-08 Mitsui Toatsu Chem Inc ｔＰＡの精製方法

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU569429B2 (en) * 1985-05-28 1988-01-28 Wellcome Foundation Limited, The Aqueous acidic tissue plasminogen activator parenternal formulation
US4929444A (en) * 1985-05-28 1990-05-29 Burroughs Wellcome Co. Low pH pharmaceutical formulation containing t-PA
US20030040095A1 (en) * 2001-03-16 2003-02-27 Achille Arini Method for the production of pharmaceutically active recombinant proteins
CN110894495B (zh) * 2019-12-24 2020-07-31 江苏尤里卡生物科技有限公司 一种尿激酶的制备方法及其冻干粉

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS53130485A (en) * 1977-04-12 1978-11-14 Choay Sa Separating method of urokinase and medicin containg urokinase as useful component

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BE549167A (ja) * 1955-07-01
SE303567B (ja) * 1959-02-17 1968-09-02 Behringwerke Ag
US3355361A (en) * 1964-10-15 1967-11-28 Sterling Drug Inc Recovery and purification of urokinase
US4169764A (en) * 1975-08-13 1979-10-02 Ajinomoto Co., Inc. Process for production of urokinase
US4066506A (en) * 1976-10-08 1978-01-03 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Health, Education And Welfare Method of separating and purifying two active forms of urokinase using affinity chromatography
JPS5935B2 (ja) * 1977-06-03 1984-01-05 住友化学工業株式会社 ウロキナ−ゼの精製法
GB2038337B (en) * 1978-12-21 1983-01-19 Green Cross Corp Process which comprises separation of urokinases having different molecular weights
AT367635B (de) * 1978-12-22 1982-07-26 Green Cross Corp Verfahren zum herstellen eines neuen thrombolytisch wirkenden praeparats

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS53130485A (en) * 1977-04-12 1978-11-14 Choay Sa Separating method of urokinase and medicin containg urokinase as useful component

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0269184A (ja) * 1988-09-05 1990-03-08 Mitsui Toatsu Chem Inc ｔＰＡの精製方法

Also Published As

Publication number Publication date
JP2594256B2 (ja) 1997-03-26
ATE77102T1 (de) 1992-06-15
DE3586197D1 (de) 1992-07-16
EP0180859A3 (en) 1989-03-15
AU599309B2 (en) 1990-07-19
AU4930885A (en) 1986-05-08
EP0180859A2 (de) 1986-05-14
DE3439980A1 (de) 1986-05-07
EP0180859B1 (de) 1992-06-10
CA1335369C (en) 1995-04-25
US5156967A (en) 1992-10-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US4877866A (en) Method of producing a virus safe, storage-stable, and intravenously tolerable immunoglobulin-G preparation
RU2000113224A (ru) Способ продуцирования в высокой степени вирусобезопасных компонентов для получения фибринового клея из пула плазмы человека
EP0782616B1 (en) Therapeutic grade thrombin production and products
JPH0480886B2 (ja)
JP3438735B2 (ja) 上清ｉｖ、特にｉｖ−４またはコーンフラクションｖまたはそれと類似の上清または画分からヒトアルブミンを単離する方法
JPS63243032A (ja) トロンビンの加熱処理方法
RU97106349A (ru) Производство и продукты тромбина терапевтической степени чистоты
JPH06321994A (ja) アンチトロンビン調製物およびその調製方法
US4510084A (en) Method of producing an antithrombin III-heparin concentrate or antithrombin III-heparinoid concentrate
HU210026B (en) Heparin-free composition for stabilizing blood plasma during pasteurization, and process for pasteurizing blood plasma
JPH0366292B2 (ja)
JPS61109727A (ja) ウロキナーゼの殺菌方法
JPH02113893A (ja) 凝固因子２、７、９およびｘの１または２以上を濃縮する方法
US5945103A (en) Process for producing thrombin
JP2681650B2 (ja) カゼインペプチドの製造方法
JP2001000179A (ja) ウィルスの不活化方法
EP0230956B1 (de) Verfahren zur Gewinnung und Herstellung eines pasteurisierten Präparates von alpha2-Antiplasmin
CN103102409B (zh) 灭活人尿中提取的胰蛋白酶抑制剂所含病毒的方法
JPS60155120A (ja) 血漿製剤の製法
CA1340217C (en) Process for the isolation and preparation of pasteurized alpha2-antiplasmin product
JPS5889196A (ja) インタ−フエロンの精製法
JPS6030294B2 (ja) 人顆粒球の分化増殖を促進する糖蛋白質を含有する分画の加熱処理方法
JPS608226A (ja) 低分子蛋白質を有効成分とする制ガン剤
JPS62258324A (ja) 制ガン作用を有する糖蛋白質
JPS63215700A (ja) 低分子量蛋白質

Legal Events

Date Code Title Description
R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

EXPY Cancellation because of completion of term