JPH0269590A - 化学発光法と発光用組成物 - Google Patents

化学発光法と発光用組成物

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JPH0269590A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 この発明は蛍光性化合物と安定な１，２−ジオキセタン
を含み、酵素を含む化学試薬により誘発され高度の化学
発光を行なう組成物に関するものである。特にこの発明
は１，２−ジオキセタン類からの化学発光を著増させる
ための化学発光法であって、ジオキセタンと蛍光性化合
物とを密な近接位置関係に保持するミセル等の組織化さ
れた集合物中での蛍光性化合物への分子間エネルギー移
動を包含する発光法に係る。
〔従来の技術〕
１、発光の機序・・・発熱化学反応は、反応過程におい
てエネルギーを放出する。実質上全ての場合において本
エネルギーは、振動励起または熱の形で放出される。し
かしながら若干の化学反応過程では熱の代わりに光、つ
まり化学発光が生ぜしめられる。光発生の機序には、高
エネルギー物質（１，２−ジオキセタンのような有機過
酸化物である場合が多い。）の熱分解或は接触分解によ
り三重項または一重項電子励起状態の反応生成物が生ぜ
しめられる過程が含まれる。−重項励起状態の反応生成
物からの蛍光は、いわゆる直接発光である。この化学発
光の量子収率は、−重項化学励起の量子収率と発光の量
子収率との積である。これらの量は効率でもって表現さ
れる場合が多く、ここに効率Ｃ９６）　＝Φ×１００で
ある。三重項または一重項励起状態の生成物から蛍光受
容体へのエネルギー移動は、間接化学発光を生じさせる
ために利用できる。間接化学発光の量子収率は、三重項
または一重項化学励起の量子収率とエネルギー移動の量
子収率とエネルギー受容体の発光の量子収率との積であ
る。
ｈν ｈν 層Ｆ′ ２、生物発光におけるジオキセタン中間体・・・・・・
１９６８年にマツクカプラ（ＭｃＣａｐｒａ　）は、１
．２−ジオキセタン類が蛍の系統を含む種々の生物発光
反応において重要な高エネルギー中間体であろうと提唱
した。（ＦｏＭｃＣａｐｒａ　：　（ｈｅｍ、　Ｃｏｍ
ｍｕｒＬ、、　１５５（１９６８））。この中間体は全
く不安定であって単離もされておらず分光学的に観測さ
れてもいないが、生物発光反応における本中間体の明白
な証拠が酸素１８標識実験によって与えられている（０
゜Ｓｈｉｍｏｍｕｒａ　　ａｎｄ　　ｆ；、　Ｈ，Ｊｏ
ｈｎｓｏｎ　：　ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ、ｐ）ｎｔｏｂｉ
ｏｌ。
３０、　８９　　（１９７９））　　。
ルンフエリン Ｘ＝Ｏ−（生物発光） 高エネルギーの ジオキセタン中間体 ３、信頼できる１、２−ジオキセタン類の最初の合成・
・・１９６９年にコペッキイ（Ｋｏｐｅｃｋｙ）　（！
：マン７　ｔ　−ｔ’　（Ｍｕｍｆｏｒｄ）（１、β−
ブロムヒドロペルオキシドの塩基触媒環化によるジオキ
セタン（３゜３．４−）ジメチル−１，２−ジオキセタ
ン）の最初の合成について報告したＣＫ−ＲｌＫｏｐｅ
ｃｋｙ　ａｎｄＣ−Ｍｕｍｆｏｒｄ　：　Ｃａｎ、　Ｊ
、　Ｃｈｅｒｒｈ　４７　、　７０９’（１９６９））
。
マツクカプラ（ＭｃＣａｐｒａ）によって予測されたよ
うにこのジオキセタンは実際に、５０℃に加熱するとア
セントン及びアセトアルデヒドに分解しつつ化学発光を
生じた。しかしこの過酸化物は比較的不安定であり、常
温（２５℃）で保存すると急速に分解してしまう。また
化学発光の効率が非常に低い（０，１９６以下）。
バートレット（Ｂａｒｔｌｅｔｔ）及びシャープ（Ｓｃ
ｈａａｐ）とマツアー（Ｍａｚｕｒ）及びフツテ（ｐｏ
ｏｔｅ）は各独自に、１，２−ジオキセタン類のより容
易な別の合成法を開発した。分子酸素を感光色素との存
在下で正当に置換されたアルケン類を光酸化することに
よって、ジオキセタン類が高収率で生成される（Ｐ、　
Ｄ、　Ｂａｒｔｌｅｔｔ　ａｎｄ　Ａ、　Ｐ−５ｃｈａ
ａｐ　：　Ｊ、　Ａｍｅｒ。
（：ｈｅｍ、　Ｓｏｃ、　９２．　３２２３　（１９７
０）及び３．Ｍａｚｕｒａｎｄ　Ｃ，Ｓ、　Ｆｏｏｔｅ
：　Ｊ、Ａｍｅｒ、　Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、　９２　、
３２５５（１９７０）　）。この反応の機序には、アル
ケンと２＋２環化付加を行なってジオキセタンを生成す
る一重項酸素として知られている準安定化合物の光化学
的発生が含まれる。研究の結果、この反応を用いて各種
のジオキセタン類を製造できることが示されている仏、
Ｐ、５ｃｈａａｐ、　ｐ、　Ａ、　Ｂｕｒｎｓ、　　ａ
ｎｄＫ、　Ａ、　Ｚａｋｌｉｋａ　：　　Ｊ、　Ａｍｅ
ｒ、　　Ｃｈｅｍ、　　Ｓｏｃ、　　９９　、１２７０
（１９７７）、Ｋ、　Ａ、　Ｚａｋｌｉｋａ、　Ａ、Ｌ
、　Ｔｈａｙｅｒ、　ａｎｄ　　ＡＰ、　５ｃｈａａｐ
：　Ｊ、　Ａｍｅｒ、　Ｃｈｅｍ　　Ｓｏｃ、　　１０
０．３１８（１９７８）、Ｋ、　Ａ、　Ｚａｋｌｉｋａ
、　Ｔ、　Ｋ１５ｓｅ１．　Ａ、　Ｌ、−Ｔｈａｙｅｒ
、　　Ｐ　、　　Ａ　−Ｂｕｒｎｓ　＋　ａｎｄ　Ａ、
ｐ、　５ｃｈａａｐ：　Ｊ、　Ａｍｅｒ、　（：ｈｅｍ
、　ＳＯＣ。
１００、　４９１６　　（１９７Ｂ）、Ｋ、Ａ、Ｚａｋ
ｌｉｋａ＋　　Ｔ　。
Ｋ１５ｓｅｌ、＝Ａ、　Ｌ、　Ｔｈａｙｅｒ、　Ｐ、　
Ａ、　Ｂｕｒｎｓ、　ａｎｄ　Ａ　、　　ＰＳｃｈａａ
ｐ　：　Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ、　　ｐｈｏｔｏｂｉｌｏ
、　３０　、　３５（１９７９）、及びＡ、　Ｐ、　５
ｃｈａａｐ、　Ａ、　Ｌ、　Ｔｈａｙｅｒ、　ａｎｄ　
Ｋ、　Ｋｅｅｓ　：Ｑｒｇａｎｉｃ　　Ｐｈｏｔｏｃｈ
ｅｍｉｃａｌ　　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　ＩＩ　、　４９
　（１９７６））。
この研究の過程で、光酸化用のポリマー結合増感剤が開
発された（Ａ、　Ｐ、　５ｃｈａａｐ、　Ａ、　Ｌ、　
Ｔｈａｙｅｒ、　Ｅ。
Ｃ，Ｂｌｏｓｓｅｙ、　ａｎｄ　Ｄ、　Ｃ，Ｎｅｃｋｅ
ｒｓ：　Ｊ、　Ａｍｅｒ、　Ｃｈｅｍ　。
Ｓｏｃ、９７．　３７４１　（１９７５）　、及びＡ、
　Ｐ、　５ｃｈａａｐ。
Ａ、　Ｌ、　Ｔｈａｙｅｒ、　Ｋ、　Ａ、　Ｚａｌｉｋ
ａ、　ａｎｄ　Ｐ、　Ｃ，ＶａｌｅｎｔｉＪ、　Ａｍｅ
ｒ、　Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、　１０１．４０１６　（１
９７９）　）。
この新しいタイプの増感剤は特許され、商標名ｒ　５Ｅ
ＮＳ　ＩＴＯＸ　Ｊで販売されている（１９８２年２月
１６日発行の米国特許Ｎα４．３１５，９９８、及び１
９７９年１２月１９日発行のカナダ特許Ｎα１．０４４
６３９　）。
この製品の使用についての報告が、５０を越える文献で
なされている・。
性化エネルギーが３７　ｋｃａ１１モルであり常温（２
５℃）での半減期が２０年を越えることが示された（Ｎ
、　Ｊ、　Ｔｕｒｒｏ、　Ｇ、　５ｃｈｕｓｔｅｒ、　
Ｈ，Ｃ，Ｓｔｅｉｎｍｅｔｚｅｒ、Ｇ。
Ｒ，Ｆａｔｅｒ、　ａｎｄ　Ａ、　Ｐ、５ｃｈａａｐ　
：　Ｊ、　Ａｍｅｒ、　（、ｈｅｒｒｘ　ＳＯＣ。
９７．７１１０　（１９７５））。実際上、これが今ま
で文献で報告された最も安定なジオキセタンである。ア
ダム（Ａｄａｍ　）とウィンバーブ（Ｗｉｎｂｅｒｇ　
）は最近、官能化されたアダマンチリデンアダマンタン
１．２−ジオキセタン類が生物医学上の用途に対し有用
であろうことを示唆している（Ｗ、　Ａｄａｍ。
Ｃ，Ｂａｂａｔｓｉｋｏｓ、　　ａｎｄ　　Ｇ、　Ｃ１
１ｅｎｔｏ　：　Ｚ、Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃｈ。
は、アダマンチリデンアダマンタンのような立体障害の
アルケン類の光酸化によって極めて安定なジオキセタン
類が提供されることを発見した（Ｊ。
Ｈ，Ｗｉｅｒｉｎｇａ、　Ｊ、　３ｔｒａｔｉｎｇ、　
Ｈ−Ｗｙｎｂｅｒｇ、　、ａｒｉｄ　　Ｗ　。
Ａｄａｍ、　Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅ旦、１６９
（１９７２））、ター口（Ｔｕｒｒｏ　）及びシャープ
（５ｃｈａａｐ）による共同研究によりこのジオキセタ
ンについて、分解のための活ＭｃＥｌｒｏｙ編、　Ａｃ
ａｄｅｍｉｃ　　Ｐｒｅｓｓ、　　Ｎｅｗ　Ｙａｒｋ　
、　１９８１年発行、第６８７頁、及びＪ、　Ｃ−Ｈｕ
ｍｍｅｌｅｎ、　Ｔ、　Ｍ。
Ｌｕ１ｄｅｒ、　ａｎｄ　　Ｈ，Ｗｙｎｂｅｒｇ　　：
　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ１３３
Ｂ、　５３１　（１９８６）　’）。しかしこの異常に
安定な過酸化物を化学発光性標識として使用したとする
と、１５０−２５０℃の検出温度が必要となる。これら
の条件は明らかに、水性媒体中での生物学的被分析物の
検出に対し不適当である。マツクカプラ（ＭｃＣａｐｒ
ａ　）　、７ダム（Ａｄａｍ　）、及びフーテ（Ｆｏｏ
ｔｅ）は、スピロ結合の環式或は多環式のアルキル基を
ジオキセタンと組合せると、この立体的にかさばった基
が存在しないとすれば比較的不安定であるジオキセタン
を安定化するのに役立つこトラ、見出した（　Ｆ、　Ｍ
ｃＣａｐｒａ、　１．　Ｂｅｈｅｓｈｔｉ、　　Ａ　。
Ｂｕｒｆｏｒｄ　、　Ｒ，Ａ、　Ｈａｎｎ＋　　ａｎｄ
　Ｋ、　Ａ、　Ｚａｋｌｉｋａ：Ｊ、Ｃｈｅｍ。
Ｓｏｃ、、　Ｃｈｅｍ、　Ｃｏｍｍｕｎ、、　　９４４
　（１９７７）、Ｗ、Ａｄａｍ。
Ｌ、　Ａ、　Ａ、　Ｅｎｃａｒｎａｃｉｏｎ、　ａｎｄ
　Ｋ、　Ｚｉｎｎｅｒ：　Ｃｈｅｍ　Ｂｅｒ。
１１６、８３９　　（１９８３）、Ｇ、　Ｇ、　Ｇｅ１
ｌｅｒ、　Ｃ，Ｓ、　Ｆｏｏｔｅ。
ａｎｄ　Ｄ、　Ｂ、　Ｐｅｃｈｍａｎ：　Ｔｅｔｒａｈ
ｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ、　、　６７３（１９８３）、Ｐ
、Ｌｅｃｈｔｋｅｎ　：　Ｃｈｅｍ、　Ｂｅｒ、　１０
９．　２８６２　　（１９７６）、及びＰ、　Ｄ、　Ｂ
ａｒｔｅｔｔ　ａｎｄ　Ｍ、　Ｓ、　Ｈｏ　：　Ｊ−Ａ
ｍｅｒ、Ｃｈｅｍ。
Ｓｏｃ、　９６　、　６２７　（１９７４））。
５、　ジオキセタン化学発光に対する置換基の効果・・
・ジオキセタン類の安定性と化学発光効率は、特定の置
換基をペルオキシド環に付加することによって変更する
ことができる（Ｋ、　Ａ、　Ｚａｋｌｉｋａ、　ＴＫｉ
ｓｓｅｌ、　Ａ、　Ｌ、　Ｔｈａｙｅｒ、　Ｐ、　Ａ、
　Ｂｕｒｎｓ、　　ａｎｄ　　Ａ、　Ｐ。
３ｃｈａａｐ　：　ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ、　ｐｈｏｔｏ
ｂｉｏｌ、　３０　、　３５　（１９７９）、Ａ、　Ｐ
、　５ｃｈａａｐ　ａｎｄ　Ｓ、　Ｇａｇｎｏｎ　：　
Ｊ、　Ａｍｅｒ、　Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ。
１０４、３５０４（１９８２）、Ａ、　Ｐ、　３ｃｈａ
ａｐ、　Ｓ、　Ｇａｇｎｏｎ　。
ａｎｄ　Ｋ、　Ａ、　Ｚａｋｌｉｋａ　：　Ｔｅｔｒａ
ｈｅｄｒｏｎ　１ｅｔｔ、　、　２９４３　（１９８２
）、及びＲ，Ｓ、　Ｈａｎｄｌｅｙ、　Ａ、　Ｊ、　５
ｔｅｒｎ、　ａｎｄ　Ａ、　Ｐ、　５ｃｈａａｐ：　’
ｌ’ｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ、、　３１８３　
　（１９８５））　ｏ次に示す二環式系についての結果
は、ジオキセタン類の特性に対する種々の官能基の有意
義な効果を例証している。すなわち２．３−ジアリール
−１，４−ジオキセタンから誘導されたヒドロキシ置換
ジオキセタン（Ｘ＝ＯＨ）は、常温（２５℃）での分解
による半減期が５７時間であり、加熱による昇温下で非
常に低いレベルの蛍光を発生する。しかし対照的に、こ
のジオキセタンを一３０℃で塩基と反応させると青い光
の閃光を発生する。動力学的な研究によって脱プロトン
化したジオキセタン（Ｘ＝Ｏ−）が２５℃におき、プロ
トン付加型（Ｘ＝ＯＨ）よりも５．７Ｘ１０”倍も速く
分解することが示されている。
Ｘ＝Ｏ−（化学発光性） Ｘ＝ＯＨ（非化学発光性） これらの２つのジオキセタンの特性の差異は、分解につ
いての２つの拮抗する機序に由来する（　Ｋ、　Ａ、　
Ｚａｋｌｉｋａ　、　Ｔ、　Ｋ１５ｓｅｌ、　Ａ、　Ｌ
−Ｔｈａｙｅｒ、　Ｐ、　Ａ。
Ｂｕｒｎｓ、　ａｎｄ　Ａ、　Ｐ、　５ｃｈａａｐ：　
Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ、　Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ　。
３０、　３５　（１９７９）、Ａ、Ｐ、　３ｃｈａａｐ
、　ｓ、　Ｇａｇｎｏｎ。
ａｎｄ　　Ｋ、Ａ、　Ｚａｋｌｉｋａ　：　Ｔｅｔｒａ
ｈｅｄｒｏｎ　　Ｌｅｔｔ、　、　２’９４３（１９８
２）、及びＲ，Ｓ、　Ｈａｎｄｌｅｙ、　Ａ、　Ｊ、　
５ｔｅｒｎ　、　ａｎｄ　Ａ、　Ｐ、　５ｃｈａａｐ。
Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ、、　　３１８３（
１９８５））　ｏたいていのジオキセタンは、Ｏ−Ｏ結
合のホモリシス及びビラジカルの形成を含む過程によっ
て開裂する。開裂に関する別の機序は、０−のように低
い酸化電位を有する置換基を持つジオキセタンについて
のものである。すなわち開裂は、置換基からペルオキシ
ド結合の反結合軌道への分子内電子移動によって開始せ
しめられる。
６、　ジオキセタン類の化学的な誘発・・・文献中での
最初の例は、上述した報文（Ａ、　Ｐ、　５ｃｈａａｐ
　ａｎｄＳ、Ｇａｇｎｏｎ　：　Ｊ　、　Ａｍｅｒ、　
Ｃｈｅｒｒｈ　Ｓｏｃ、　１０４．３５０４　（１９８
２）　）に記載されている。しかしヒドロキシ置換ジオ
キセタン及びジアリール−１，４−ジオキセタンから誘
導された他のどのようなジオキセタンも、あまりに不安
定すぎて如何なる用途にも使用できない。これらのジオ
キセタンは２５℃で只の数時間の半減期をもつに過ぎな
い。ジオキセタンだけでなくその前駆体アルケーンも、
誘導体を生成するのに必要な条件をのり切れない。さら
にこれらの非安定化ジオキセタン類は少量のアミンＣＴ
−Ｗｉ　ｌ５ｏｎ。
Ｉｎｔ、　Ｒｅｖ、　Ｓｃｉ、　：　Ｃｈｅｍｌ、　Ｓ
ｅｒ、　Ｔｗｏ、　９．２６５　（１９７６））及び金
属イオ７　（Ｔ、　Ｗｉｌｓｏｎ、Ｍ、　Ｅ、　Ｉ、ａ
ｎｄｉｓ、　Ａ、Ｌ。
Ｂａｕｍｓｔａｒｋ、　ａｎｄ　Ｐ−Ｄ、　Ｂａｒｔｌ
ｅｔｔ　：　Ｊ、　Ａｍｅｒ、　Ｃｈｅｍ。
Ｓｏｃ、　９５　、　４７６５　（１９７３）、及びＰ
、　Ｄ、　Ｂａｒｔｌｅｔｔ。
Ａ、　Ｌ、　Ｂａｕｍｓｔａｒｋ、　ａｎｄ　Ｍ、　Ｅ
、　Ｌａｎｄｉｓ　：　Ｊ、　Ａｍｅｒ　。
Ｃｈｅｍ、　３ｏｃ、　９６　、　５５５７　（１９７
４））により破壊され、酵素による誘発のために必要な
水性緩衝液中で用いえなかった。
するエネルギー移動化学発光に関する最初の例は、ウィ
ルソン（Ｗｉｌｓｏｎ）及びシャープ（５ｃｈａａｐ）
によって報告された（Ｔ、　Ｗｉｌｓｏｎ　ａｎｄ　Ａ
、　Ｐ、　５ｃｈａａｐ：　Ｊ。
Ａｍｅｒ、　ＣＣ１１ｅ、　Ｓｏｃ’、　９３．、４１
２６　（１９’７１）　）　。極めて不安定なジオキセ
タン（シス−ジェトキシジオキセタン）を熱分解するこ
とにより、−重積励起及び三重項励起の両者のギ酸エチ
ルが生じた。９，１〇−ジフェニルアントラセンと９．
１０−ジブロモアントラセンを付加することによって、
−重項一一重項エネルギー移動及び−重項一三重項エネ
ルギー移動番こよりそれぞれ増強された化学発光が生じ
た。本技術は次いで数多くの他の研究者らにより、各種
のジオキセタン類の熱分解によって生ぜしめられる化学
励起生成物の収率を測定するのにＷ、　Ａｄａｍ　ａｎ
ｄ　□、、　Ｃ１１ｅｎｔｏ、編、　Ａｃａｄｅｍｉｃ
　Ｐｒｅｓｓ　。
Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　、　　１９８２年発行、第４章参照
）。しがも均質溶液中でのエネルギー移動は、電子的な
励起状態にあるジオキセタンの半減期が短いことがらし
て高濃度のエネルギー受容体を必要とする。
かかる高濃度は七ルフクエンチング（自己消光）と再吸
収といった問題を生じさせる。この発明はこの問題点を
１，２−ジオキセタンと発光エネルギー受容体とを用い
ることによって解決するものであり、この両者は基体溶
液中に高濃度の蛍光体を必要とすることなしに十分なエ
ネルギー移動を可能ならしめるミセル中に混合するのが
適当している。
々の化学反応の速度を、水溶液中においてミセルにより
促進することができる（例えばＥ、　Ｈ，ＣＤｒｄｅｓ
ａｎｄ　Ｒ，Ｂ、　Ｄｕｎｌａｐ　：　ＡＣＣ，Ｃｈｅ
ｍ、　Ｒｅｓ、　２．３２９（１９６９）参照）。ミセ
ルのプソイド相（ｐｓｅｕｄｏｐｈａｓｅ）中での基質
の可溶化及び静電的、疎水性或は極性の因子に基いて触
媒作用が生じる。ミセル水溶液は、化学的に誘発される
ジオキセタンの割合を高めるのに利用されて来ている（
　Ａ、　Ｐ、　５ｃｈａａｐ、　Ｆｉｎａｌ　Ｔｅｃｈ
−ｎｉｃａｌ　　Ｒｅｐｏｒｔ　　ｔｏ　ｔｈｅ　Ｑｆ
ｆｉｃｅ　　ｏｆ　Ｎａｖａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ。
１９８７年、第１６頁）。化学発光の効率を高めるため
に蛍光性の共存性界面活性剤のような蛍光性化合物を用
いる実験は、何ら報告されていない。
いくつかの報文が、ミセルを用いた環境中での化学反応
に基づく増強された化学発光について記載している。し
かしこれらは何れも、共存性の蛍光界面活性剤へのエネ
ルギー移動を利用していない。ミセル中で安定化された
ジオキセタンについては、全く研究されていない。ゴト
ウ（Ｇｏｔｏ）は中性、アニオン性、及びカチオン性界
面活性剤の存在下でのルシフェリンの化学酸化について
研究している（Ｔ、　Ｇｏｔｏ　　ａｎｄ　　Ｈ，Ｆｕ
ｋａｔｓｕ　、　ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔ、、
　４２９９　（１９６９））。水溶液におけるのと対比
して、ミセル中においては化学発光が増強されることか
らして反応生成物の発光効率の向上がみラレタ。アルカ
リ性水溶液中でのアクリドンエステルの化学発光反応に
対する臭化セチル）　ＩＪメチルアンモニウムのミセル
の効果が、報告されている（　Ｆ、　ＭｃＣａｐｒａ　
：　Ａｃｃ、　Ｃｈｅｍ、　Ｒｅｓ、　９．２０１　（
１９７６）　）。
しかし本報文は、ミセルを用いた環境が「励起反応を助
けることはしない」ことを示している。むしろミセルは
、競合する非発光性の加水分解反応の速度を減少させる
ことによって発光収率を高めると、考えられている。類
似してニコカボウラス（Ｎ　１ｋｏｋａｖｏｕｒａｓ　
）及びガング？　７　（Ｑｕｎｄｅｒｍａｎｎ　）は、
ルシゲニン及びルミノールの各誘導体の化学発光反応に
対するミセルの効界について研究しているＣＣ−Ｍ、　
Ｐａ１ｅｏｓ、　Ｇ、　Ｖａｓｓｉｌｏｐｏｕｌｏｓ、
　ａｎｄ　Ｊ、　Ｎｉｋｏｋａｖｏｕｒａｓ　＋　Ｂｉ
ｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ　　ａｎｄ　　Ｃｈｅｍｉ
ｌｕｍ、１ｎｅｓｃｅｎｃｅ　。
Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　ＹＯｒｋ、
　１９８１年発行、第７２９頁１及びに、　Ｄ、　Ｇｕ
ｎｄｅｒｍａｎｎ、同書、第１７頁）。ジンカイ（５ｈ
ｉｎｋａｉ　）は、不安定な非単離性のジオキセタンの
化学発光収率を水と対比してのミセル中で高めうろこと
を、観察したズＳ−５ｈｉｎｋａｉ　＋　Ｙ。
Ｉｓｈｉｋａｗａ、　Ｏ，Ｍａｎａｂｅ　、　ａｎｄ　
Ｔ、　Ｋｕｎｉｔａｋｅ、　Ｃｈｅｍ、　Ｌｅｔｔ、　
。
１５２３　（１９８１）　）。これらの研究者は、励起
状態の収率は水中でよりもミセルの疎水性核中での方が
より高いであろうことを、示唆した。
酵素によって誘発される化学発光を界面活性剤によって
増強することについての唯一の文献として、発光性飛翔
昆虫のルシフェラーゼ系に関するクリフカ（Ｋｒ１ｃｋ
ａ　）及びデル力（ＤｅＬｕｃａ）　（７）報文がある
（　Ｌ、　Ｊ、　Ｋｒ１ｃｋａ　ａｎｄ　Ｍ、　ＤｅＬ
ｕｃａ　：　Ａｒｃｈ　。
Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　２１７．６７４
　（１９８３）　）　。非イオン性の洗剤とポリマーが
、酵素の転換を増すことにより全体としての発光収率を
高めた。臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ
）のようなカチオン性の界面活性剤は実際上、ルシフェ
ラーゼの触媒活性を完全に阻止した。
ルミノール／ペルオキシダーゼ反応の化学発光収率ヲ、
６−ヒドロキシベンゾチアゾール誘導体またはパラ置換
フェノールの添加によって高める方法がある（Ｇ、Ｈ，
Ｇ、　Ｔｈｏｒｐｅ、　Ｌ、　Ｊ、　Ｋｒ１ｃｋａ、　
３゜Ｂ、　Ｍｏ５ｅｌｅｙ、　Ｔ、　Ｐ、　Ｗｈｉｔｅ
ｈｅａｄ：　Ｃ１１ｎ、　Ｃｈａｎ、　３１．１３５５
（１９８５）、Ｇ、　Ｈ，（：、、　’ｌ’ｈｏｒｐｅ
　ａｎｄ　Ｌ、Ｊ、　Ｋｒ１ｃｋａ　：Ｍｅｔｈｏｄｓ
　　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　１３３＋　３３１　
（１９８６）、及びり、　Ｊ、　Ｋｒ１ｃｋａ、　Ｇ−
Ｈ，Ｇ−Ｔｈｏｒｐｅ、　ａｎｄ　Ｒ，Ａ、　Ｗ、５ｔ
ｏｔｔＰｕｒｅ　＆　Ａｐｐｌ、　Ｃｈｅｍ、　５９．
６５１　（１９８７））　、収率向上の機序は知られて
いないが、分子内エネルギー移動或は共存ミセル性の蛍
光界面活性剤への分子間エネルギー移動は包含しない。
共゛存ミセル性の蛍光プローブが、ミセルの動的特性を
研究するために利用されて来ている（Ｙ。
Ｋｕｂｏｔａ、　Ｍ、　Ｋｏｄａｍａ、　ａｎｄ　Ｍ、
　Ｍｉｕｒａ　：　Ｂｕｌｌ、Ｃｈｅｍ、３ｏｃ　。
Ｊｐｎ、　４６．１００　（１９７３）、Ｎ、　Ｅ、　
５ｃｈｏｒｅ　ａｎｄ　　Ｎ、　１Ｔｕｒｒｏ　：　Ｊ
、　Ａｍｅｒ、　Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、　９ａ　３０６
　（１９７４）、及びＧ、　Ｗ、　Ｐｏｈｌ　：　Ｚ、
　Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃｈ、　３１ｃ　、　５７５　（
１９７６１）。
しかしこれらの発光物質を、ミセル中でエネルギー移動
過程により化学発光反応を促進するように用いた例を開
示する文献は、見当らない。
９、化学発光免疫測定・・・酵素基質としてのジオキセ
タン或は酵素結合アッセイにおけるジオキセタンの利用
に関する報告は、１９８６年７月１７日付の米国特許出
願Ｎα８８７．１３９の出願日前には存在しない。ウィ
ンバーブ（ｗｙｎｂｅｒｇ）は、免疫測定用の「熱化学
発光性」標識として安定なジオキセタン類を用いた（　
Ｊ、　Ｃ，Ｈｕｍｍｅｌｅｎ　、　Ｔ、　Ｍ−Ｌｕ１ｄ
ｅｒ　。
ａｎｄ　Ｈ，Ｗｙｎｂｅｒｇ　：　Ｍｅｔｈｏｄｓ　　
ｉｎ　　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　１３３Ｂ。
５３１　（１９８６））。これらのジオキセタンは、タ
ンパク質のような生物学的物質を標識するのに用いられ
ている。測定は試料を１００−２５０℃に加熱し、熱的
に発生する化学発光を検出することによって行なわれる
。この技術と、誘発可能なジオキセタン類を酵素基質と
して用いることとは明白に異質である。
ルミノール誘導体、アクリジニュウムエステル及びルシ
ゲニンが抗原、抗体及びハプテン用の化学発光性標識と
して、用いられている（Ｈ，Ｒ。
５ｃｈｒｏｅｄｅｒ　　ａｎｄ　　Ｆ、　Ｍ、　Ｙ６ａ
ｇｅｒ　：Ａｎａｌ、　Ｃｈｅｍ、　５０　。
１１１４　（１９７８）、Ｈ，Ａｒａｋａｗａ、　Ｍ、
　Ｍａｅｄａ　、　ａｎｄ　　Ａ　。
Ｔｓｕｊｉ　　：　Ａｎａｌ、　］３ｉｏｃｈｅｍ、　
７９．２４８　（１９７９）、及びＨｌＡｒａｋａｗａ
、　Ｍ、　　Ｍａｅｄａ、　ａｎｄ　Ａ、　Ｔｓｕｊｉ
　：　Ｃ１１ｎ、　Ｃｈｅｍ、　３１゜４３０　（１９
８５）　）。また次の刊行物も参照されたい＝Ｌ、Ｊ−
Ｋｒ１ｃｋａ　ａｎｄ　Ｔ、　Ｊ、　Ｎ、　Ｃａｒｔｅ
ｒ、　Ｉｎ　Ｃ１１ｎｉｃａｌａｎｄ　　Ｂｉｏｃｈｅ
ｍｉｃａｌ　　Ｌｕｍ１ｎｅｓｃｅｎｃｅ、　　Ｌ、　
Ｊ、　Ｋｒ１ｃｋａ及びＴ、Ｊ、Ｎ、Ｃａｒｔｅｒ編、
　Ｍａｒｃｅｌ　　Ｄｅｋｋｅｒ、　Ｉｎｃ、　、　Ｎ
ｅｗ　Ｙｏｒｋ　。
１９８２年発行、第８章、Ｌ、　Ｊ、　Ｋｒ１ｃｋａ、
　Ｌｉｇａｎｄ　−Ｂｉｎｄｅｒ　Ａｓ５ａｙｓ、　Ｍ
ａｒｃｅｌ　　Ｄｅｋｋｅｒ　、　Ｉｎｃ、　、　Ｎｅ
ｗ　Ｙｏｒｋ。
１９８５年発行、第７章、Ｆ、　ＭｃＣａｐｒａ　ａｎ
ｄ　　■。
Ｄｙｋｅ編、ＣＲＣＰｒｅｓｓ、　Ｉｎｃ、　、　　Ｅ
３ｏｃａ　　Ｒａｔｏｎ、　Ｆｌｏｒｉｄａ　。
１９８５年発行、第７章、特に第１３頁のジオキモタフ
０項・及びＧ−Ｊ、　ＲｏＢａｒｎａｒｄ、　Ｊ、　Ｂ
、Ｋｉｍ、　ＪＬ、　Ｗｉｌｌｉａｍｓ、　ａｎｄ　Ｗ
、　Ｐ、　Ｃｏ１１ｉｎｓ、同書、第７章。
酵素で標識された抗原、抗体及びハプテンを用いるアッ
セイは、酵素免疫測定（ｅｎｚｙｍｅ　ｉｍｍｕｎｏ−
ａｓｓａｙ　）と名付けられている。酵素標識は、色或
は発光展開法で検出されて来ていた。より最近では酵素
免疫測定は、アルカリ性条件の下でルミノール／過酸化
水素、ピロガロール／過酸化水素、フオラス・ダクチラ
ス（Ｐｈｏｌａｓ　　ｄａｃｔｙｌｕｓ）ルシフェリン
、或はルミノールを用いて測定されるペルオキシダーゼ
共役体に基いている（　Ｌ、　Ｊ、　Ｋｒｌｃｋａ編、
　Ｍａｒｃｅｌ　　］）ｅｋｋｅｒ、　Ｉｎｃ、　、　
Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１９８２年発行、第８章）。酵素
結合アッセイに関する文献においてジオキセタン類を、
光を発生する酵素基質として測定のために使用するよう
なことは、何ら記載されていない。
１０、発光反応の写真検出・・・いくつかの化学発光及
び生物発光反応による光放出を記録するのに、インスタ
ント写真フィルム及びＸ線フィルムが用イラレテ来ティ
る（Ｌ’　Ｊ、　Ｋｒ１ｃｋａ　ａｎｄ　Ｇ、　Ｈ，Ｇ
。
Ｔｈｏｒｐｅ　：　Ｍｅｔｈｏｄｓ　　ｉｎ　Ｅｎｚｙ
ｍｏｌｏｇｙ　１３３．４０４　（１９８６）及び同報
文での引用文献参照）。また以下の文献も参照されたＬ
’　：　Ｍ−Ｍ、　Ｌ−Ｌｅｏｎｇ、　ｃ、　Ｍｉｌｓ
ｔｅｉｎ　。
ａｎｄ　　Ｒ，Ｐａｎｎｅｌ　：　Ｊ、　Ｈｉｓｔｏｃ
ｈｅｍ、　（：：ｙｔｏｃｈｅｍ、　３４　、１６４５
（１９８６）．Ｒ２Ａ、　１３ｒｕｃｅ、　Ｇ、　Ｈ，
Ｇ、Ｔｈｏｒｐｅ、　Ｊ　、Ｅ−Ｃ−Ｇｉｂｂｏｎｓ、
　Ｐ、　Ｒ９Ｋ１１ｌｅｅｎ、　Ｇ、　Ｑｇｄｅｎ、　
Ｌ、Ｊ、　Ｋｒ１ｃｋａ。
ａｎｄ　　Ｔ、　Ｐ、　Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ　：Ａｎａ
ｌｙｓｔ、　　１１０．　６５７　（１９８５）、Ｊ、
　Ａ、　Ｍａｔｔｈｅｗｓ　、　Ａ、　Ｂａｔｋｉ、　
Ｃ，Ｈｙｎｄｓ、　ａｎｄ　　Ｌ、Ｊ−）（ｒｉｃｋａ
　：Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１５１．２０５　
（１９８５）　、及びＧ、　Ｈ−Ｇ、　Ｔｈｏｒｐｅ　
、　Ｔ、　Ｐ、　Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ、　Ｒ，Ｐｅｎｎ
、　　ａｎｄＬ、　Ｊ、Ｋｒ１ｃｋａ　：　Ｃ１１ｎ、
　（、ｈｅｍ、　３０．８０６　（１９８４）、何れの
文献中にも、安定化されたジオキセタン類の化学的或は
酵素的な誘発によって発生する化学発光の写真検出につ
いて、言及するところがない。
〔発明課題〕
したがってこの発明の目的とするところは、誘発可能で
ある１、２−ジオキセタンの化学発光を増強させる方法
と組成物を提供するにある。またこの発明は、免疫測定
及び酵素結合ＤＮＡ探査に使用できる方法と組成物を提
供することも、目的とする。この発明の他の目的と効果
は、以下に述べる説明と図面を参照することによって極
（明白となる。
〔−船釣な説明〕
この発明は化学発光を発生させる方法に関し、この発明
に係る発光法は、 （ａ）、蛍光性化合物を、一般式 〔式中、Ａｒ０ＸはＸ−オキシ基で置換されたアリール
環をもつアリール基であって、活性化剤でＸを除去して
反応を誘発すると不安定なオキシド中間体の１．２−ジ
オキセタン化合物を形成しその不安定な１．２−ジオキ
セタン化合物が電子エネルギーを放出して分解し光と一
般式 の２個のカルボニル含有化合物とを生成し、またＸは活
性化剤により除去されて不安定なオキシド中間体の１，
２−ジオキセタンを形成させる化学的に易反応性の基で
あり、Ａはそれぞれ光の生成を許容する受動性の有機性
基である。〕で表される安定な１．２−ジオキセタン化
合物と近接した位置に保持されるように設け、（ｂ）、
安定な１．２−ジオキセタンを活性化剤により分解させ
不安定な１．２−ジオキセタン化合物の分解によって放
出される電子エネルギーを蛍光性化合物に受けとらせて
、ジオキセタン単独の誘発によって生成される光よりも
強い光を生成させる、 ものに構成される。
特にこの発明は化学発光を発生させる方法であって、 （ａ）、蛍光性化合物を、一般式 〔式中．Ｒ２とＲ２及びＲ５とＲ３はそれぞれ、炭素及
びアリール環の他に異種原子（Ｎ、Ｓ、ＯまたはＰ）を
含みうるスピロ結合アルキレンとして結合させてもよく
、Ｒ３とＲ２またはＲ３とＲ４のうちの少なくとも１個
はＸ−オキシ基で置換されたアリール環をもつアリール
基であって酸、塩基、塩、酵素、有機触媒、無機触媒及
び電子供与体から選択された活性化剤でＸを除去して反
応を誘発すると不安定なオキシド中間体の１，２−ジオ
キセタン化合物を形成しその不安定な１．２−ジオキセ
タン化合物が電子エネルギーを放出して分解し光と一般
式間体を形成させる化学的に易反応性の基である。〕で
表される安定な１．２−ジオキセタン化合物と近接した
位置に保持されるように設け、（ｂ）、安定な１．２−
ジオキセタンを活性化剤により分解させ不安定なオキシ
ド中間体の分解によって放出される電子エネルギーを蛍
光性化合物に受けとらせて、ジオキセタン単独の誘発に
よって生成される光よりも強い光を生成させる、発光法
に係る。
またこの発明は誘発されると光を発生する組成物に係り
、同発光用組成物は、 （ａ）、蛍光・性化合物、及び （ｂ）、一般式 の２個のカルボニル含有化合物とを生成し、またＸ−オ
キシ基で置換されていないＲ１，Ｒ２，ＲｓまたはＲ４
は１，２−ジオキセタン化合物に安定性を与える炭素及
び異種原子含有の有機性基であり、Ｘは活性化剤により
除去されて不安定なオキシド中〔式中、Ａｒ０ＸはＸ−
オキシ基で置換されたアリール基であって、活性化剤で
Ｘを除去して反応を誘発すると不安定なオキシド中間体
の１．２−ジオキセタン化合物を形成しその不安定な１
，２−ジオキセタン化合物が電子エネルギーを放出して
分解し光と一般式 つて生成される光よりも強い光を生成する。
本組成物は、発光法に用いられるのと同様の好適したジ
オキセタンを含む。
さらにこの発明は化学発光を発生させる方法であって、 （ａ）、蛍光性化合物を、一般式 の２個のカルボニル含有化合物とを生成し、またＸは活
性化剤１こより除去されて不安定なオキシド中間体の１
．２−ジオキセタンを形成させる化学的に易反応性の基
であり、Ａはそれぞれ光の生成を許容する受動性の有機
性基である。〕で表される安定な１．２−ジオキセタン
、ヲ含み、安定な１．２−ジオキセタンが活性化剤によ
り分解されると、不安定なオキシド中間体の分解によっ
て生成される電子エネルギーを蛍光性化合物が受けとっ
てジオキセタン単独の誘発によ〔式中、Ｒ１はＲｔとス
ピロ結合したアリール基を含むアルキル基、アルコキシ
基、アリールオキシ基。
ジアルキルアミノ基、トリアルキルシリルオキシ基、ア
リールシリルオキシ基、及びアリール基から選択された
ものであり、またＲ２はＲ１を含んでもよく且つＸ−オ
キシ基で置換されたアリール基であって酸、塩基、塩、
酵素、無機触媒、有機触媒及び電子供与体から選択され
た活性化剤でＸを除去して反応を誘発すると不安定なオ
キシド中間体の１，２−ジオキセタン化合物を形成しそ
の不安定な１．２−ジオキセタン化合物が電子エネルギ
ーを放出して分解し光と一般式 の２個のカルボニル含有化合物を生成し、またＸは活性
化剤により除去されて不安定なオキシド中間体を形成さ
せる化学的に易反応性の基であり、さらにＲ５及び＆は
スピロ結合の多環式アルキル基及び多環式アリール基と
して互に結合させてもよいアリール基、ヘテロアルキル
基及びアルキル基から選択されたものである。〕 で表される安定な１，２−ジオキセタン化合物と近接し
た位置に保持されるように設け、（ｂ）、安定な１．２
−ジオキセタンを活性化剤により分解させ不安定なオキ
シド中間体の分解によって放出される電子エネルギーを
蛍光性化合物に受けとらせて、ジオキセタン単独の誘発
によって生成される光よりも強い光を生成させる、発光
法に係る。
ジオキサン生成物の励起状態と対比して一重項励起状態
でより低いエネルギーをもつ如何なる蛍光性化合物も、
化学発光効率を高めるために使用できる。長い炭化水素
鎖（望ましくは８−２０個の炭素原子をもつもの）を蛍
光性化合物に付加して、組織化された集合物中に導入す
るための共存性界面活性剤として作用するものとするの
が、望ましい。ここに界面活性剤（Ａ）に対し［共存性
の界面活性剤（ｃｏ　−５ｕｒｆａｃｔａｎｔ　）　Ｊ
　　（Ｂ　）とは、前者の界面活性剤（Ａ）と共に両界
面活性剤（Ａ）；。
（Ｂ）の両親媒性分子が共存するミセルを形成可能であ
る界面活性剤を意味する。蛍光体の例としては何らかの
蛍光染料（蛍光漂白剤）、ナフタレン類、アントラセン
類、ピレン類及びビフェニル類等の芳香族化合物、アク
リジン、クマリン類、キサンチン類、フタロシアニン類
、スチルベン類、フラン類、オキサゾール類、オキサジ
アゾール類及びベンゾチアゾール類がある。蛍光物質と
共ニミ七ルを形成する界面活性剤を使用することで１゜
２−ジオキセタンを蛍光物質に隣接位置させるのが、最
も好ましい方法である。使用可能な界面活性剤はアメリ
カ合衆国、ニューヨークのＡｃａｄｅｍｉ　ｃＰｒｅｓ
ｓ社１９７５年発行のｒ　Ｍｉｃｅｌｌａｒ　ａｎｄ　
　Ｍａｃｒｏ−ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　　Ｓｙｓｔｅｍｓ
　Ｊ中の第１章［Ｃａｔａ１ｙＳ！Ｓ」の第１−１８頁
に記載されている。それには双生イオン、カチオン性（
アンモニウム塩、ピリジニウム塩、ホスホニウム塩、ス
ルホニウム塩）、アニオン性（硫酸塩、スルホン酸塩、
カルボン酸塩）、中性（ポリオキシエチレン誘導体、シ
クロデキストリン類、長鎖エステル類、長鎖アミド類）
、及び天然の界面活性剤（脂質）がある。
特にこの発明は一般式 〔式中．Ｒ２は１から８個の炭素原子を含む低級アルキ
ル基、Ｒ２はアリール基、ビアリール基、置換または置
換されていない結合環の多環式アリール基から選択され
たもの．Ｒ２Ｃ−は６から３０個の炭素原子を含む多環
式アルキル基、ＯＸはアリール環上に置換されたオキシ
基であって酸、塩基、塩、酵素、無機触媒、有機触媒及
び電子供与体から選択した活性化剤でＸを除去して反応
を誘発すると不安定なオキシド中間体の１．２−ジオキ
セタン化合物を形成し、またＸは活性化剤により除去さ
れて不安定なオキシド中間体を形成させる化学的に易反
応性の基である。〕 で表される安定な１，２−ジオキセタンであって、活性
化剤の存在下で分解して光と一般式％式％） のカルボニル含有化合物とを生成する１、２−ジオキセ
タンを、用いる方法と組成物に関する。
またこの発明は一般式 であり、またＲ５Ｃ−は６から３０個の炭素原子を含む
多環式アルキル基である。〕 で表される安定な１，２−ジオキセタン化合物を、使用
する方法と組成物に関する。上記構造中でＲ。
とＲ２は、互に結合している。
構造式 〔式中、Ａｒ　ＯＸはＸ−オキシ基で置換した環を含む
スピロ結合のアリール基であって酸、塩基、塩、酵素、
無機触媒、有機触媒及び酸素供与体から選択した活性化
剤でＸを除去して反応を誘発すると不安定なオキシド中
間体の１，２−ジオキセタン化合物を形成し、またＸは
活性化剤により除去されて不安定なオキシド中間体の１
．２−ジオキセタン化合物を形成させる化学的に易反応
性の基であって、不安定な１，２−ジオキセタン化合物
は分解して光と一般式 ％式％ の２個のカルボニル含有誘導体とを生成するもので表わ
される化合物について説明する。
（ｉｔ、　　Ｒ，がＲ７と結合していないときは、この
基Ｒ。
はアルキル基、アルコキシ基、ジアルキルまたはアリー
ルアミノ基、トリアルキルまたはアリールシリルオキシ
基である。アルキル基は１から８個の炭素原子を含むも
のであるのが好ましい。Ｒ１はまた、結合環のアリール
化合物を含む炭素数６−１４の環式脂肪族基または了り
−ル基であってもよい。Ｒ１がＲ２と結合しているとき
は、これらの基は６から３０個の炭素原子を含むアリー
ル基となる。
（２＋、　Ｒ２は、Ｘ−オキシ基（ＯＸ基）で置換され
たアリール基である。アリールを含む基はフェニル基、
ビフェニル基、結合フェニル基及び他のアリール基であ
り、６−３０個の炭素原子を含み、且つ他の置換体を含
んでいてよい。Ｘは活性化剤によって除去される如何な
る易反応性の基であってもよい。ＯＸ基は例えばヒドロ
キシル基、アルキルまたはアリールカルボキシルエステ
ル、無機オキシ酸塩特にリン酸塩または硫酸塩、アルキ
ルまたはアリールシリルオキシ基、及びピラノシド酸素
基から選択できる。
（３）、　ＲｓとＲ４はＲ１と同じであってもよい。実
施例では特に合成および比較を容易とするためにゐとＲ
４を互に結合させて多環式アルキレン基を形成したが、
どのような有機性基を用いてもよい。多環式アルキレン
基は、６−３０個の炭素原子を含むものであるのが好ま
しい。
安定なジオキセタン化合物は活性化剤で反応を誘発でき
るけれども、常温（２０−３，５℃）で比較的長い半減
期をもつ。従来技術に係る化合物は全て、常温で不安定
であるか、或は熱分解するのにほとんどの用途で実用的
でない５０℃またはそれより高い温度を必要とする。
活性化剤は、化学性または酵素性の何れであってもよい
。成る場合（Ｆ−）には１当量が必要であり、他の場合
（酵素性）には極く少量のみ用いられる。かかる活性化
剤は当該分野のどのような標準的化学専門書にも記載さ
れており、それには酸、塩基、塩、酵素、及び他の無機
及び有機の触媒が含まれる。用いる活性化剤は安定な１
．２−ジオキセタンが活性化される条件、及び特定の１
．２−ジオキセタン上でＸ基がどの程度不安定ないし易
反応性であるかに依って決定される。電子供与体はＸを
除去するために使用でき、それには電子源はもちろん還
元剤も含まれる。
１．２−ジオキセタンは分解して、カルボニル含有化合
物と光とを生成する。不安定な１．２−ジオキセタンと
して、次の一般式のものが形成される。
一般に−ＡｒＯＸで置換された１、２−ジオキセタン類
は、適当したアルケンに酸素を付加することによって形
成される。これらのアルケン類は、一般式 のアルキル及び／またはアリール置換カルボニル含有化
合物を経て合成される。これらの物質は極性有機溶媒、
特にテトラヒドロフラン中において水素化アルミニウム
リチウム或は他の金属水素化物の存在下でハロゲン化遷
移金属塩、特に塩化チタン、及び第三アミン塩と反応す
る。この反応は通常、還流するテトラヒドロフラン中で
行なわれ、普通約４−２０時間で完了する。
安定化された１、２−ジオキセタンの製造と化学的誘発 熱的に安定なジオキセタンを必要に応じ化学的及び酵素
的な方法で誘発して化学発光を発生させうることが、見
出された（Ａ、　Ｐ、　５ｃｈａａｐによる１９８６年
７月１７日付けの米国特許出願Ｎα８８７，１３９、Ａ
、　Ｐ、　５ｃｈａａｐ　　Ｒ，Ｓ、　Ｈａｎｄｌｅｙ
、　ａｎｄ　Ｂ、　Ｐ、　Ｇｉｒｉ　：Ｔｅｔｒａｈｅ
ｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ、、　９３５　（１９８７）、Ａ−
Ｐ、５ｃｈａａｐ。
Ｔ、　Ｓ、、Ｃｈｅｎ、　Ｒ，Ｓ、　Ｈａｎｄｌｅｙ　
、　Ｒ，ＤｅＳｉｌｖａ、　ａｎｄ　Ｂ。
Ｐ、　Ｇｉｒｉ　：　Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔ
ｔ、　、　１１５５　（１９８７）、及びＡ、　Ｐ、　
５ｃｈａａｐ、　Ｍ、　Ｄ、　５ａｎｄｉｓｏｎ、　ａ
ｎｄ　　Ｒ，Ｓ、　Ｈａｒｘｉｌｅｙ：　Ｔｅｔｒａｈ
ｅｄｒｏｎ　１ｅｔｔ、　、　１１５９　（１９８７）
　）　、これを行なわせるため、次のような鍵となる特
徴をもつジオキセタン類を製造するために新たな合成法
が開発された。（１）、スピロ結合アダマンチル基の安
定化作用を、常温で数年間の「貯蔵寿命（５ｈｅｌｆｌ
ｉｆｅ　）　Ｊをもつジオキサン類を提供するのに利用
する。（２）、構造中に、カルボニル開裂生成物からの
直接化学発光を得させる部分を挿入する。（３）。
安定化されたジオキセタンの化学発光分解を誘発するた
めの新しい方法を提供する。
必要なアルケン類はＴＨＦ　（テトラヒドロフラン）中
で三塩化チタン／ＬＡＨ（水素化アルミニウムリチウム
）を用い、２−アダマンチル基を芳香族ニスチル類また
はケトン類と反ポさせることによって製造される（Ａ、
　Ｐ−５ｃｈａａｐによる１９８６年７月１７日付の米
国特許出願Ｎα８８７，１３９　）。これは、マクマリ
−（ＭｃＭｕｒｒｙ　）法を用いてジビニルエーテル類
を生成するためのケトン類とエステル類の分子間縮合に
ついての最初の報告である。
マクマリ−はかつてケトンとエステルの官能基の分子内
反応について研究したが、この方法によっては環式ケト
ン類が製造されジビニルエーテル類は製造されていない
（Ｊ、　ＥｏＭｃＭｕｒｒｙ　ａｎｄ　Ｄ−Ｄ。
Ｍｉｌｌｅｒ　：　Ｊ、　Ａｍｅｒ、　Ｃｈｅｍ、　３
ｏｃ、　１０５．１６６０（１９８３）　）。
これらのジビニルエーテル類を光酸化すると、所望の熱
安定性をもち取扱いが容易であるジオキセタン類が提供
される。例えば次に掲げるジオキセタンは、活性化エネ
ルギーが２８．４　ｋｃａ１１モルで２５℃での半減期
が３．８年である。Ｏ−キシレン中での本ジオキセタン
試料は研究室のベンチの上に放置しておいて数か月間、
検出可能な分解を示さないままに残された。
しかしながらこのジオキセタンの化学発光分解を都合良
く常温で、シリル基保護々スクをフッ化物イオンを用い
て除去し不安定なアリールオキシドを生成させることに
より誘発でき、生成されたアリールオキシドは開裂して
強い青色光を生じる。
アリールオキシド薗換゛ジオ°キセタンの半減期は、２
５℃で５秒である。ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）
中での化学発光からのスペクトルは４７０Ｈｍで極大を
示したが、これは本条件下でのエステル開裂生成物（３
−ヒドロキシル安息香酸メチル）の化学発光及び費消ジ
オキセタン溶液の発光と一致する。アダマンタノン発光
に由来する化学発光は、何ら生せしめられないようであ
る。フッ化物で誘発した分解の化学発光量子収率をルミ
ノール対照標準と対比して測定し１．０．２５を得た（
化学発光効率でいうと２５９６）。本条件下でのエステ
ルの発光量子収率（ｌｌ’Ｆ＝０．４４）を用い補正し
て、−重項励起のエステルの生成効率が５７９６と求め
られた。この値は、研究室で調製されたジオキセタンに
ついてこれ迄報告されたものの中で最も高い一重項化学
励起効率である。
安定 不安定 一重項励起 １．２−ジオキセタンの酵素的誘発 酵素を包含する免疫測定及び核酸探査等の生物学的アツ
セーは、酵素と反応すると色を形成する（クロモゲン性
）か或は蛍光を発生する（蛍光性）様々な基質を利用す
る。シャープ（Ａ、　Ｅ、５ｃｈａａｐ）による１９８
６年７月１７日付の米国特許出願Ｎα８８７，１３９は
、化学発光性の酵素基質として機能しうる最初のジオキ
セタン類を開示している。次の文献も参照されたい：　
Ａ、　Ｐ、　５ｃｈａａｐ、　Ｒ，Ｓ、　Ｈａｎｄｌｅ
ｙ、　ａｎｄ　Ｂ。
Ｐ、　Ｇｉｒｉ　：　Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　　１ｅ
ｔｔ、、　９３５　（１９８７）、Ａ。
Ｐ、　５ｃｈａａｐ、　Ｔ、　Ｓ、Ｃｈｅｎ＋、　Ｒ，
Ｓ、　Ｈａｎｄｌｅｙ、　Ｒ，ＤｅＳｉｌｖａ　。
ａｎｄ　Ｂ、　Ｐ、　Ｇｉｒｉ　：Ｔｅｔｒａｈｅｄｒ
ｏｎ　　Ｌｅｔｔ、、　１１５５（１９８７）、及びＡ
、　Ｐ、　３ｃｈａａｐ、　Ｍ、　Ｄ、　５ａｎｄｉｓ
ｏｎ、　ａｎｄ　　Ｒ−Ｓ。
Ｈａｎｄｌｅｙ　：Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ
、　、　１１５９　（１９８７）　ｏ生物学的な組成中
でこれらの過酸化物を使用するためには、酵素反応の温
度で熱的に安定であり水性緩衝液中で迅速に自発分解し
ないジオキサン類が必要となる。先に述べたスピロ結合
アダマンチルジオキサン類は、かかる要求を満たす。酵
素的に修正されてアリールオキシド形を生成しつる官能
基をもつ１．２−ジオキセタン類を作製した。不安定な
アリールオキシド中間体の分解によって蛍光が発生する
。アリールニスラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ及
びアルカリホスファターゼを含む種々の酵素によって分
解反応を誘発できる１゜２−　シ、ｔ　＋セタン類を合
成した。ホスファターゼ試料は、この酵素が酵素結合免
疫測定及び核酸探査において広く用いられていることか
らして特に有意義である。
例えば、アルカリホスファターゼによる酵素的な分解誘
発が、３−ヒドロキシ−９Ｈ−キサンチン−９−オンと
２−アダマンタｉンとから誘導した１、２−ジオキセタ
ンについて認められた。このジオキセタンは熱的に安定
であり、３０．７　ｋｃａ１１モルの活性化エネルギー
と２５℃での１２年間の半減期を有する。本ジオキセタ
ンは有機溶媒中で安定であるだけではなく、水性緩衝液
中で極くゆつぐりとした自発分解しか行なわない。
ウシの腸粘膜［３，２Ｍの（ＮＨ，）２ＳＯｊ中に１−
あたり５．３ＩＩＩＩ＋のタンパク質（１１００単位／
岬タンパク質）の懸濁液〕とリン酸塩保護のジオキセタ
ンを用い、０．７５Ｍの２−アミノ−２−メチル−１−
プロパツール緩衝液中においてｐＨ１０，３で誘発実験
を実施した。リン酸塩−ジオキセタン貯蔵溶液の５０ｇ
１画分（０，０１３μｍｏｌ　）を３７℃で３−の緩衝
液に加えて、ジオキセタンの最終濃度を４．２ｘ　１０
”Ｍとした。この溶液にアルカリホスファターゼ３−（
タンパク質の最終濃度＝１．８・μｇ／−）を注入する
と、化学発光が突発し３分間で減衰した。この期間中、
緩衝液中のジオキセタンのゆっくりとした非酵素的加水
分解に基づく発光によるバックグランドは、酵素的過程
で生ぜしめられる発光の僅かに０．２　％量であった。
合計の光放出量は、ジオキセタンの濃度に直線的に依存
することが認められた。光放出の減衰速度は酵素濃度の
関数であり、他方、合計の光放出量は酵素の転換からし
て酵素濃度に無関係である。ホスファターゼによる触媒
分解についての化学発光スペクトルを、緩衝溶液中にお
いて常温で試験して測定した。この化学発光スペクトル
を費消反応混合物の蛍光スペクトル及び緩衝液中のヒド
ロキシキサンタノン開裂生成物の蛍光スペクトルと比較
して、光放出がジオキセタン中のリン酸基の酵素的開裂
によって誘発されて不安定なアリールオキシドジオキセ
タンが産成され、それがヒドロキシセタノンの一重項励
起アニオンを生じさせることが示された。
〔明細な説明〕
図面について 第１図は、キシレン中でのリン酸塩置換ジオキセタン２
Ｃの熱分解についてのアレニウスプロットを示している
。
第２図はジオキセタン２ｂの塩基誘発反応の化学発光量
子収率を、臭化セチル）　ＩＪメチルアンモニウム（Ｃ
ＴＡＢ’）の濃度の関数とみてプロットした平面座標を
示している。第２ａ図は、蛍光性の共存界面活性剤及び
ＣＴＡＢ界面活性剤でもって理想化されたジオキセタン
構造を示している。
第３図は、２−アミノ−２−メチル−１−プロパツール
（２２１）緩衝液（ｐＨ１０，３）中で３７℃において
アルカリホスファターゼを含むヒト血清１００μｊを加
えた１０　　Ｍのジオキセタン２Ｃの化学発光強度と時
間との関係と示すグラフである。
第４図はジオキセタン２Ｃについて、１０ｇ（プラトー
での光強度）と１０ｇ（血清の量μｌ、１−１００）と
の関係を示すグラフである。
第５図はジオキセタン２Ｃについて、ｌｏｇ（５０秒で
の光強度）とｌｏｇ　（血清の量μｌ）との関係を示す
グラフである。
第６図は化学発光スペクトルを示すもので、曲線ＡはＣ
ＴＡＢ及び蛍光性の共存性界面活性剤３の不存在下にお
いて２２１緩衝液中でジオキセタン２Ｃを酵素により誘
発した場合の化学発光を、また曲線ＢはＣＴＡＢ及び界
面活性剤３の存在下においてジオキセタン２Ｃを酵素に
より誘発した場合のエネルギー移動化学発光を、それぞ
れ表している。
第７図は、ＣＴＡＢ／蛍光体及び２．７ｘｌＯモルのア
ルカリホスファターゼを含む３−の２２１緩衝液中での
ジオキセタン２ｃについての光強度と時間との関係を示
すグラフである（実験Ｄ）。
酵素の不存在下での試薬のバックグランドは、時間零（
０）での強度に等しい。
第８図は、ｌｏｇ（０−３分の間の積分光強度）とＪｏ
ｇ（アルカリホスファターゼのモル数）との関係を示す
グラフである。
第９図は、ＣＴＡＢ／蛍光体及び２．３Ｘ１０　　モル
のアルカリホスファターゼを含む２００μｌの２２１緩
衝液中でのジオキセタン２ｃについての光強度と時間と
の関係を示すグラフである。酵素の不存在下での試薬の
バックグランドは、時間零（０）での強度に等しい。
第１０図は、ｌｏｇ（０−３０分の間の積分光強度）と
ｌｏｇ　　（アルカリホスファターゼのモル数）との関
係を示すグラフである。
第１１図は、ＡＳＡ　３０００　Ｐｏ１ａ：ｒｏｉｄ　
　Ｔｙｐｅ　５７フイルムを用いたジオキセタン２ｃか
らの化学発光測定の結果を、コンピューター処理により
線図化して示す図である。アルカリホスファターゼ、ジ
オキセタン、Ｍｇ　（ＯＡｃ）　２　、ＣＴＡＢ、及び
フルオレセイン界面活性剤３を含む２２１緩衝液（１０
０ｕｌ）の溶液を、］）ｙｎａｔｅｃｈ　　Ｉｍｍｕｌ
ｏｎ　（登録商標）ウェル中で３７℃で１時間養生し、
次にその温度で１５分間感光させた。アルカリホスファ
ターゼの量はＡ　：　２７００アトモル、Ｂ：２５０ア
トモル、Ｃ゛２３２３アトモル酵素なしの試薬対照標準
（視認できず）である。
第１２図は、ＡＳＡ　３０００　Ｆｂｌａｒｏｉｄ　Ｔ
ｙｐ＝　５７フイルムを用いたジオキセタン２ｃからの
化学発光測定の結果を、コンピューター処理により線図
化して示す図である。アルカリホスファターゼ、ジオキ
セタン、Ｍｇ　（ＯＡｃ）　２、ＣＴＡＢ、及びフルオ
レセイン界面活性剤３を含む２２１緩衝液（１００ｔＬ
ｌ）の溶液を、Ｄｙｎａｔｅｃｈ　　Ｉｍｍｕｌｏｎ　
（登録商標）ウェル中で３７℃で１時間養生し、次にそ
の温度で３０分間撮影した。アルカリホスファターゼの
量はＡ：２５０アトモル、Ｂ：２３アトモル、Ｃ；２ア
トモル、Ｄ：酵素なしの試薬対照標準（視認できず）で
ある。
第１３図は、ＣＴＡＢ／蛍光体と１．３ｇのＳ−抗原及
び抗体−アルカリホスファターゼ共役体を含ｔｌ’１０
０Ｊの２２１緩衝液中でのジオキセタン２Ｃについての
光強度と時間との関係を示すグラフである。酵素の不存
在下での試薬のバックグランドは、時間零（０）での強
度に等しい。
第１４図は、ｌｏｇ（０−１５分の間の積分光強度）　
（！：　ｌｏｇ　　（ミクロウェルにコーティングした
Ｓ−抗原の量ｎｇ）との関係を示すグラフである。
第１５図は、ジオキセタ７２　ｃ　、　Ｍｇ（ＯＡｃ）
　！、Ｃ’ｌ’ＡＢ、及びフルオレセイン界面活性剤３
を含む２２１緩衝液（ｌ　ＯＯｄ）を用いたＳ−抗原に
ついての化学発光写真測定の結果を、コンピューター処
理により線図化して示している。蛍光光度計を用いた実
験に引続いて７個のＩｍｍｕｌｏｎ　（登録商標）ウェ
ルにつき３７℃で３０分間養生し、次にその温度で１５
分間、ＡＳＡ　３０００　　Ｐｏ１ａｒｏｉｄ諏Ｘ５７
フイルムを用い感光させた。下左側から上布側２番目ま
でのＳ−抗原の量はそれぞれ１１２．５６．２８．１４
．７．３．５及び１．３　ｎｇであり、上布側１番目（
視認できず）は試薬だけを含むウェルについてのもので
ある。
第１６図は、Ｓ−抗原についての化学発光測定の結果を
示す写真を、コンピューター処理により線図化して示し
ている。４個のウェルに５０ｎｇのＳ−抗原をコーティ
ングし、ＭＡＩ）Ａ　９−Ｃ６単クロ一ン抗体と反応さ
せ、抗マウスＩｇＧ−アルカリホスファターゼ共役体と
反応させ、次に２２１緩衝液（１００ｔＬＩり中のジオ
キセタン２　ｃ　、　Ｍｇ（ＯＡｃ）２、ＣＴＡＢ及び
フルオレセイン界面活性剤・３を用いて測定した。ウェ
ルについて４５℃で１時間養生し、次にＡＳＡ　３００
０　　Ｐｏ１ａｒｏｉｄ　　Ｔｙｐｅ　５７　フィルム
を用い同温度で３０秒間、感光させた。中央の対照標準
のウェル（視認できない）は、ＣＴＡＢ／フルオレセイ
ン緩衝液中にジオキセタンのみを含むものとした。
１．２−ジオセタン化合物及び蛍光表面活性剤の合成 （ｂ）　Ｘ　−Ａｃ （ｃ）　Ｘ　−ＰＯ３Ｎａ２ 機器分析 核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペク）／しは特１こ断っていな
い限り、内標準としてのテトラメチルシランヲ有スルＣ
ＤＣｌ２中ノ溶液トシテＮｉＣ０１ｅｔＮＴ３００（商
標名）またはＱｅｎｅｒａｌ　　Ｅｌｅｃｔｒｉｃ　Ｑ
Ｅ　３００　（商標名）を用いて得た。赤外線（ＩＲ）
スペクトルはＮ１ｃｏｌｅｔ　（商標名）またはＢｅｃ
ｋｍａｎ　Ａｃｃｕｌａｂ　８（商標名）分光計を用い
て得た。質量スペクトルはＫｒａｔｏｓ　（商標名）ま
たはＡＥＩ　ＭＳ−９０（商標名）分光計を用いて得た
。紫外線及び可視光線の吸収スペクトルは、Ｖａｒｉａ
ｎ　Ｃａｒｙ　２１９　（商標名）分光光度計を用いて
得た。蛍光スペクトルはＳｐｅｘＦｌｕｏｒｏｌｏｇ　
（商標名）蛍光分光光度計マ記録した。
化学発光スペクトルは５ｐｅｘ　　Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔ
ｅｒ　（商標名）を用いて測定した。化学発光の動力学
的な測定及び量子収率の測定は、研究室で組立てた蛍光
光度計を用いて行なった。本装置は、−７８℃に冷却さ
れたＲＣＡ　Ａ−３１０３４Ａヒ化ガリウム増倍型光電
管とＱｒｔｅｃ光子計数用電子計数器を備え、Ａｐｐ１
ｅ工Ｉｅ（商標名）及びＭａｃｉｎｔｏｓｈ　（商標名
）コンピュータに結び付ける。元素分析はアメリカ合衆
国、インデイアナポリスのＭｉｄｗｅｓｔ　Ｍｉｃｒｏ
ｌａｂｓ　が行なった。融点はＴｈｏｍａｓ　Ｈｏｏｖ
ｅｒ　（商標名）毛管溶融装置で測定し、補正していな
い。精密質量は、Ｑｉｈｎ　　ｍｏｄｅｌ　４７００　
（商標名）電子天秤を用いて測定した。
材　　　料 ０−キシレンは＆１ｒｄｉｃｋ　ａｎｄ　　Ｊａｃｋｓ
ｏｎ　　Ｌａｂｏｒａｔｏ−ｒｉｅｓから入手し、入手
した状態のままで動力学的及び分光学的測定のために使
用した。無水のＤＭＦ及びＤＭＳＯは、水素化カルシウ
ムから真空蒸留により得た。酸化シュウチリウム、１．
４−ジｔ−＋サン−ｄ８、クロロホルム−ｄ１フルオレ
セインアミン（アイソマー１）、及び他の化学試薬は、
Ａｌｄｒｉｃｈ　　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　　Ｃｏ、から購
入した。シリカ、アルミナ及び他の固体担体は種々の市
販源から入手し、さらに精製することなく使用した。
５００−のフラスコに還流冷却器、１２５−の滴下漏斗
、及び窒素供給管を取付けた。装置を熱風吹付は及び窒
素による駆除で乾燥させた。乾燥ＴＨＦ　（４０，ｚ）
を加え、フラスコを水浴中で冷却した。ＴｉＣｌ５（１
，５ｇ　、　　１０ミリモル）を迅速に加え、次いでＬ
ＡＨ（０，１９ｇ、　　５ミリモル）を撹拌しながら滴
下した。冷却浴を取去り、黒色の混合物を室温にまで放
置して暖まらせた。次にトリエチルアミン（０，７Ｗ１
１，５ミリモル）を撹拌した懸濁液に加えて、１５分間
還流した。その後に乾燥ＴＨＦ２０−中のメチル−３−
ヒドロキシ安息香酸（１５２ｕ、　　１　ミ’Ｊモル）
及び２−アダマンタノン（３００−１１，２ミリモル）
の溶液を還流中の混合物に対し、１５分間をかけて１滴
ずつ加えた。還流をさらに１５分間継続し、その後で反
応物を室温にまで冷却して１００−の蒸留水で希釈した
。この水溶液を、３×５０一部の酢酸エチルで抽出処理
した。有機性層を水で洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥させ
、濃縮した。１５９６の酢酸エチル／ヘキサンを用いる
シリカ上でのクロマトグラフィーにより、２４０ｕ（８
９％）のヒドロキシアルケン１ａを白色の固体として得
た。融点１３３−４℃、　’ＨＮＭＲ（ＣＤＣＩ、　）
　　δ１．６４−１．９６　（ｍ。
１２Ｈ）　、２．６５　（ｓ、ＩＨ）　、３．２４（ｓ
、ＩＨ）、３．３２　（ｓ、　３Ｈ）　、５．２５　（
ｓ、　ＩＨ，Ｄ２０でＯＨ交換）　、６．７０−７．３
０　　（ｍ、４Ｈ）。Ｃ，ＮＭ　Ｒ（、ＣＤＣｌ、）δ
２８．４５．３０．３６．３２．３６．３７、３０．３
９．１８．３９．３３．５７．８２．１１４．６０１１
６．１６．１２２．１９．１２９．２４．１３７．２４
．１５５．６２゜Ｍ　Ｓ　ｍ／ｅ　（相対強度）　２７
１　（２０，Ｍ＋）、２７０　（１００，Ｍ）　、２５
３　（７，３）　、２１３（３５，１）　　、１２１　
　（４１，７）　　、９３　　（９，４）　。
精密質量−計算値２７０．１６１９、実測値２７０．１
６１６゜ヒドロキシアルケン１　ａ　（０，７５ｇ、　
　２．８ミリモル）を、Ｎ２雰囲気中で１０−のＣＨ２
Ｃｌ、及びピリジン（５，２ｇ、　　６５．８　ミリモ
ル）中に溶解した。
溶液を水浴中で冷却し、１−のＣＨｔＣ］　２中の塩化
アセチル（２，６ｇ、３３ミリモル）溶液を注射器で１
滴ずつ加えた。０℃で５分間たった後で、２０％の酢酸
エチル／ヘキサンを用いるシリカ上でのＴＬＣ（１層ク
ロマトグラフィー）により、１ａの完全な了セチル化が
示された。溶媒を除去した後、固体残分を３０４のエー
テルで洗浄した。エーテルを３×２５４の水で洗浄し、
Ｍｇ　ＳＯ４上で乾燥させ、蒸発乾固した。製品をシリ
カ上で２０％の酢酸エチル／ヘキサンを用いてクロマト
グラフィー処理し、０．４５　ｇの１ｂを油状物として
得た。
’ＨＮＭＲ（ＣＤＣＩ３）　　δ１，７９−１．９６　
（ｍ、　　１２Ｈ）、２．２７　（ｓ、　　３Ｈ）　、
２．２６　（ｓ、　　ＩＨ）　、３．２６（ｓ、　　Ｉ
Ｈ）　、３．２９　（ｓ、　　３Ｈ）　、６．６９−７
．３６（ｍ、　　４　Ｈ）　、”ＣＮＭＲ（ＣＤＣＩ、
）　ａ　２０．９０．２８．１３．３０．０７．３１．
９９．３６．９９．３８．８９．３９．０１．５７．５
９．１２０．３４．１２２．１４．１２６．５５．１２
８．６６．１３２．１９．１３６．９０．１４２．５９
．１５０．４２．１６９．０４゜ＭＳｍ／ｅ（相対強度
）３１２　（１００，Ｍ）、２７０（２５）、２５５　
（１９，３）　、２１３　（２０，７）、１６３（１２
，２）、１２１　（３０，７）、４３　（３０）。
ｌＲ３００６，２９２５，２８５６，１７２５，１６０
０，１４３８，１３６２，１２１８，１０００ｃｍ″。
Ｃ２０Ｈｔ４０ｓの分析；計算値Ｃ７６，９２、Ｎ７．
６９．実測値Ｃ７６，９６、Ｎ７．８５゜ ヒドロキシアルケンｌａ　（５００ｗ、１．５８ミリモ
ル）を、１−の乾燥ピリジン（塩基性アルミナ上で脱水
）中に溶解した。この溶液を１−ｄ（１０，７ミリモル
）の塩化ホスホリルと５−の乾燥ピリジンとの冷混合物
に対し、反応温度が５℃よりも低く維持されるような速
さでゆっくりと加えた。３０分後に反応を終了し、ホス
ホリルニ塩素化物製品を２０ｇの氷と１艷のＩＯＮ水酸
化ナトリウムとの混合物に注いだ。混合物を分液漏斗に
移し、３〇−宛のＣＨｔＣｌｔで５回洗浄した。１晩冷
蔵後に水溶液部分から製品が沈降した。固形分を１〇−
宛のＣＨｚＣ］ｖで３回洗浄し、次に１０−宛の冷水で
３回洗浄した。次いで白色の固体を減圧下で乾燥して、
４００哩（１，０２ミリモル、６４９６）のリン酸化ア
ルケンＩＣを得た。ＨＮＭＲ（ＤｔＯ／ｐ−ジオキサ：
ｙ−ｄ、）δ１．６７−１．８３　　（ｍ、１２Ｈ）、
２．５０　（ｓ、　、Ｉ　Ｈ）　、３．０４　　（ｓ、
　　Ｉ　Ｈ）、３．１９（ｓ、　　３Ｈ）　、　　６．
７−７．２　　（ｍ、　　４Ｈ）、　、”ＣＮＭＲ（Ｄ
、Ｏ）δ２８．２９．３０．４４．３２．４５．３６．
９９．３８．８９．５７．９８．１２０．１６．１２０
．８５．１２３゜７４．１２８．８９．１３３．１５．
１３６．１１．１４２．６８．１５４．４５゜”Ｐ　　
ＮＭＲ（Ｄ、Ｏ／ｐ−ジオキサン−ｄ、）８１．５８６
゜すＩ′ｖ３Ｎａ２ フルオレセイン界面活性剤：５−（Ｎ−テトラゾ塩化　
　ミ　リ　ス　ト　リ　ル　（２，１８ｇ、　　　８．
８　３　　ミ　リ　モル）のＴＨＦ溶液をＡｌｄｒｉｃ
ｈ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　　Ｃｏ、から入手したフルオレ
セインアミノ−アイソマー１（３，０７ｇ＋　　ｓ、ｓ
　５　ミＩＪモル）の乾燥ピリジン（塩基性アルミナ上
で脱水）溶液に、常温で１２時間をかけて撹拌しながら
１滴ずつ加えた。２０９６ＭｅＯＨ／ベンゼンを用いた
シリカ上でのＴＬＣ（薄層クロマトグラフィー）により
、極性がより小さい生成物への変換が示された。反応物
を氷水中に注ぎ、固体沈澱物を濾過により単離して４ｇ
の固体状の橙色物質を得た。１０　％　ＭｅＯＨ／ベン
ゼンを用いるからムクロマトグラフィーによって、５０
０萼の純粋製品が橙色の固体として得られた。融点１８
５−１９０℃。’ＨＮＭＲ（ＣＤＣＩり　　δ０．８８
（ｔ、　　３Ｈ）、１．２７　（ｍ、　　２０Ｈ）　、
　　１．７４（ｍ。
２Ｈ）　、２．４２　（ｔ、　　２Ｈ）　、６．５４−
８．３２（ｍ。
９Ｈ）。ＣＮＭＲ（ＣＤＣＩ、）δ１３．０５．２２．
２７．２５．３４．２８．９０．２９．０１．２９．１
７．２９．３１．３１．６１、３６．６５、１０１．０
０、１１０．２５．１１２．４３、１１４．９３、１　
２４．４　１．１２６，５８．１２７．８６、１２Ｂ、
７７、１４０．４１．１４７．００．１５２．８９、１
６０−２８、１６９．９６、１７３．６５゜ＭＳ　（Ｆ
ＡＢ）ｍ／ｅ　（相対強度）５５８　（１０，Ｍ＋１）
、　　４０２　　（１４，７）　　、　３８８　　（１
４，２）、３７４　　（１２，５）　　、　３４８　　
（２８，１）　　、３０２（３５，２）、　　２１　３
　　（３６，４）　　、　１６５　　（３６，４）、１
３３（５０）。本製品３の特性は、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ
ｐｒｏｂｅｓ　、　　Ｉｎｃ　、　　により市販されて
いるものについて記載されている特性と一致する。
６−ヒドロキシ−２−ベンゾチアゾアートメチル（６０
吋、０．３０ミリモル）　　（Ｆ、　ＭｃＣａｐｒａ　
ａｎｄＺ、　Ｒａｚａｎｉ：　Ｃｈｅｍ、　Ｃｏｍｍｕ
ｎ、、　１５３　（１９７６）参照〕と１−ヘキサデシ
ルアミン（４，３０−９，１，８ミリモル）を、メタノ
ールに溶解した。溶液を２日間還流した後、４０％Ｅｔ
ＯＡｃ／ヘキサンを用いる薄層クロマトグラフィーによ
りベンゾチアゾアートが極性のより小さい物質に変換さ
れたことが示された。メタノールを蒸発させ、次に残分
を２９６ＥｔＯＡｃ／ヘキサンを用いるクロマトグラフ
ィーにかけて過剰の１−ヘキサデシルアミンを除去した
。
引続いて５０　％　ＥｔＯＡｃ　／ヘキサンを用いてク
ロマトグラフィーを継続し、製品４を白色の固体として
得た。３３即（２７９６）。融点８２−４℃。′ＨＮＭ
Ｒ（７−ｔ＝トン−ｄ、）　　Ｉ　Ｏ，８３（ｔ　、　
　３　Ｈ）　　、１．３２（ｂｒ、２６Ｈ）、１．６６
　（ｍ、　　２Ｈ）　、３．４３　（ｔ。
２Ｈ）　、７．１０−７．８８　（ｍ、　　３Ｈ）　、
８．１５（ｂｒ、　ＩＨ，ＤｚＯでＯＨを置換）　、　
′３ＣＮＭＲ（ベンゼンｄａ）δ１４．２９．２３．０
５．２７．０８　、２９．５８．２９．６６．２９．７
５．２９．８６．３０．１３．３２．２８．３９．９８
．　（ｙセトン　ｄａ）’１０７．５１．１１７．６９
．１２５．６１．１３９．３３．１４７．８０．１５７
．６３．１６０．４８．１６２．１２゜ＭＳ　　ｍｅ（
相対強度）４１８　（Ｍ＋、　　３３．７）　、３６０
　（１４，１）　、２４０（６１，１）、１７８　（７
７，３）　、１５１　（３９，１）、９７　（２８，６
）　、８３　（３４，７）　、　Ｃ２４Ｈｊ８Ｎｔ０２
Ｓの精密質量：計算、値４１８．２６５３、実測値４１
８．２６５９゜１．２−ジオキセタン類の製造 光酸化法 典型的には５１０ｕのアルケン試料を、光酸化管中で５
−のＣＨ２Ｃｌ□に溶解した。約４０蹴９のローズベン
ガル（３ｅｎｓｉｔｏｘ　１−登録商標）（このタイプ
の増感剤についてはＡ、　Ｐ、　５ｃｈａａｐ、Ａ、　
Ｌ、Ｔｈａｙｅｒ　。
Ｅ、　Ｃ，Ｂｌｏｓｓｅｙ、　ａｎｄ　Ｄ、　Ｃ，Ｎｅ
ｃｋｅｒｓ　：　Ｊ、　Ａｍｅｒ、Ｃｈｅｍ。
３ｏｃ、工、３７４１　（１９７５）を参照）を加え、
酸素噴射器に接続した。溶液に酸素を５分間ゆっくりト
通し、装置をドライアイス／２−プロパツールを含む片
面銀メツキのジュワーびんに浸漬した。
連続して酸素を吹込みながら試料を、２５０Ｗまたは１
ＯＯＯＷのナトリウムランプ（Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｅｌｅ
ｃ−ｔｒｉｃ社のＩ、ｕｃａｌｏｘ　）及び紫外線除去
フィルタを用いて照射した。反応の進行を、薄層クロマ
トグラフィーにより鑑視した。普通、極めて安定なジオ
キセタン類を示すはん点が検出でき、そのＲｆはアルケ
ンについての値より僅かに小さかった。アダマンチル置
換ジオキセタン類を常温で濾過し、回転蒸発器で蒸発さ
せ、適当な溶媒を用いて再結晶させた。
ヒドロキシアルケン１ａ（１００即）を３ｅｎｓｉｔｏ
ｘ■の存在下で一７８℃において、８−のＣＨ２Ｃｌ２
中で１０００　ＷのＮａランプにより照射した。アルケ
ンとジオキセタンを２０％の酢酸エチル／ヘキサンを用
いる薄層クロマトグラフィーにかけると、同一のＲｆ値
を示す。そこで開裂生成物の痕跡が現れ始めたときに反
応を停止した。濾過して増感剤を除去し、溶媒を蒸発さ
せた。出発物質が全て酸化されたことをみるためには、
’ＨＮＭＲを利用した。
ジオキセタン２ａをペンタン／ベンゼンを用いて再結晶
処理し、白色の固体を得た。融点１３５℃。
’ＨＮＭＲ（ＣＤＣＩｓ）’　１．０４　２．１０　　
（ｍ、　　１２Ｈ）、２．２１　　（ｓ、　　Ｉ　Ｈ）
　、３．０４　（ｓ、　　ＩＨ）　、３．２４（ｓ、　
　３Ｈ）　、６．４８　（ｓ、　ＩＨ，Ｄ２０でＯＨを
置換）　、６．９３−７．３０　（ｍ、　　４Ｈ）　、
”ＣＮＭＲ（ＣＤＣ１３）　　δ２５．８１．２５．９
５．３１．４７．３１．５７．３２、２７、３２．８６
、３３．０７、３４．、５８．３６３０　。
４９、８３、９５．８８、１１２．０８、１１６．４６
．１２９．３４、１３６．１、１５６．２１゜１２２．
５８、１２９．１６、１３６．４２．１５０．７２．１
６９．１１゜ アルケン１　ｂ　（１４０−ｇ−，０，４５ミリモル）
を−７８℃で３０４のＣＨ２Ｃｌ２中において、４００
■の５ｅｎｓｉｔｏｘ　Ｉを用い１００ＯＷの高圧ナト
リウムランプにより照射した。２０９６の酢酸エチル／
ヘキサンを用いるシリカゲル上でのＴＬＣ分析によって
２．５時間でより極性な物質への完全な変換が示されさ
れた。濾過及び溶媒の除去によって製品２ｂが、油状物
として得られた。’ＨＮＭＲ（ＣＤＣＩ、）δ０，９０
−１．９０　（ｍ、　　１２Ｈ）　、２．１５　（ｓ。
ＬＨ）　、２．３１　（ｓ、　　３Ｈ）　、３．０３　
（ｓ、　ＩＨ）、３．２３　（ｓ、　　３Ｈ）　、６．
６１−７．４５　（ｍ、　４Ｈ）。
１３ＣＮＭＲ（ＣＤＣＩ、）　ａ　２　ｔ　Ｏｏ、２５
．８２．２５．９７．３１、５０、３１．６５、３２．
２１、３２．８０．３３．０９．３４．７１、３６．３
２、４９．９２、９５．３４．１１１，５０、アルケン
ＩＣ（５０即）を２艷のＤ２０／ｐ−ジオキサ７−（Ｌ
（１：　Ｉ　Ｖ／Ｖ）中で１０℃において、３ｅｎｓｉ
ｔｏｘ　Ｉを用い１００ＯＷの高圧ナトリウムランプに
より照射した。’ＨＮＭＲ分析によって、４５分間でジ
オキセタン２ｃへの完全な変換が示された。増感剤を濾
過により除去し、ｐ液を化学発光実験用の貯蔵溶液とし
て用いた。’ＨＮＭＲ（Ｄ２０／ｐ−ジオキサン−ｄ、
）δ０．９１−１．７０　（ｍ。
１２Ｈ）　、２．０８　（ｓ、　　Ｉ　Ｈ）　、３．０
７（ｓ、　３Ｈ）、７．００　７．２６　　（ｍ、　　
４　Ｈ）　。”ＣＮＭＲ（Ｄ２０／ｐ−ジオキサン−ｄ
、　）δ２８．９５．３０．９５．３２．９８．３７．
６５．３９，５３．５８．３１．１２０．６２．１２１
．６４．１２３．５５．１２９．３１．１３２．４５、
１３６．５７．１４３．９８、１５５．３０゜ 安定なジオキセタン類の熱分解速度を、曝気溶液からの
化学発光の減衰によって測定した。磁気撹拌棒を装備し
た円筒状のパイレックス製バイアルニ３−４ｒｄの反応
溶媒を充填し、テフロンライニングのねじキャップで密
封して化学発光測定用の蛍光光度計（ルミノメータ−）
の恒温試料室中に霞いた。外部の循環水浴によって温度
を制御した。計器利得及び光学スリット寸法について適
当な値を選定した。熱平衡に到達すると（約３分）、１
０’〜１よりも大ではない最終濃度を得させるのに十分
な量のジオキセタン貯蔵溶液を、蛍光光度計の頂部を開
放することによりピペットで、或はバイアル直上部のカ
バー中に位置させた光遮断性ゴム隔壁を通し注射器で、
加えた。高温を利用するときはバイアルを、蒸発を阻止
するようにテフロンライニングのねじキャップで密封し
た。信号の測定は、シャッターを開放することで開始し
た。
化学発光の減衰は一般に、少なくとも３回の半減期につ
いて記録した。Ｉｎ（強度）対時間データからの一次速
度定数（ｋ）の計算は、標準的な最小自乗法を用いるコ
ンピュータープログラムによって行なった。相関係数（
ｒ）は典型的には少なくとも０９９９であり、ｋは同一
試料についての繰返しの測定間で５％よりも小さな範囲
でのみ変動した。
ジオキセタン類の分解に対する活性化パラメーターを、
Ｉｎ　　ｋ対１／Ｔ（アレニウス式）またはＩｎｋ／を
対１／Ｔ（アイリング式）のプロットから標準的な最小
自乗−次回帰法によって算出した。８０−１２０℃の温
度範囲内の５から１０の温度での繰返し測定の結果、０
．９９またはそれより高い相関係数を有する直線が得ら
れることが判明した。例えば第１図はリン酸塩置換ジオ
キセタン２Ｃの０−キシレン中での熱分解についてのア
レニウスプロットを示しており、Ｅａ＝３２．５ｋｃａ
１１モルでｒ＝０．９９９である。２５℃での半減期は
アレニウス式から、１９年であると算出される。
キシレン中でのジオキセタン類の熱分解の活性化エネル
ギー ２ａ（Ｏル　　２８．３　　１２．５　５．３８ｘｌＯ
４，１年２ｂ　（ＯＡｃ）　　　３０，４　　１３．６
　　１．７３ｘｌＯ１３年２Ｃ（ＰＯ３Ｎａｔ）　３２
．５　　１４．９　　１．１９Ｘ１０　　１９年上の結
果は、これらのタイプのジオキセタン類が適当な化学剤
または酵素で誘発される前に極めて高い安定性（長い半
減期）をもつことを、示している。
化学発光量子収率の測定 ジオキセタン類の分解についての化学発光量子収率（ｌ
ＩｌｃＬ）は、分解されたジオキセタンのモル数に対す
る放出化学発光のアインスタイン値の割合と定義される
。反応中に反応エンタルピー（△ＨＲ）及びアレニウス
活性化エネルギー（Ｅωからして、カルボニル開裂生成
物の１個を一重項励起状態にもたらすのに十分なエネル
ギーが放出される。したがって最大量子収率は１．０で
ある。関係ある他のパラメターは化学励起量子収率（Φ
０゜）であり、これは分解されたジオキセタンに対する
形成励起状態の割合と定義される。化学励起量子収率は
化学発光量子収率と、ジオキセタン開裂物の発光量子収
率（ＩＩＩＦ）を介し、つまり方程式ΦＣＬ＝Φ。×ｅ
Ｆで表される関係で関連する。
発光減衰の動力学的測定に用いたのと同じ方法を化学発
光量子収率を求めるのに、以下の修正を加えて用いた。
既知濃度のジオキセタン貯蔵溶液の精密に秤量した一定
量を、予め恒温に保つようにした有機溶媒または水性緩
衝液の３４に加えた。
次に適当した化学試薬または酵素を加えることにより反
応を誘発した。合計の光強度（積分光強度）を、−７８
℃に冷却したＲＣＡ　　Ａ−３１０３４Ａヒ化ガリウム
増倍型光電管を用い光子計数用蛍光光度計により加算し
て求めた。曝気ＤＭＳＯ中での塩基によるルミノールの
化学発光反応について正確に知られている量子収率に基
づく検定因数（ｃａｌ　１ｂｒａ　−ｔｉｏｎ　ｆａｃ
ｔｏｒ）を用いて、光強度を光量子数に換算した。ルミ
ノール反応は、０．０１１　（１，１％）の化学発光量
子収率をもつと測定されている（Ｊ、Ｌｅｅａｎｄ　Ｈ
，Ｈ，Ｓｅｌｉｇｅｒ　：　Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ、　Ｐ
ｈｏｔｏｂｉｏｌ、　１５，２２７（１９７２）、Ｐ、
　Ｒ，Ｍｉｃｈａｅｌ　　ａｎｄ　　Ｌ、　Ｒ，ｌ’；
’ａｕｌｋｎｅｒ　　：Ａｎａｌ、Ｃｈｅｍ、４８．１
１８８　（１９７６））。
化学発光スペクトルの取得 化学的または酵素的に誘発したジオキセタン類の化学発
光スペクトルを、３ｐｅｘ　　Ｆｌｕｏｒｏｌｏｇ蛍光
分光光度計の試料室で１１平方の石英製キュベツト中に
おいて常温で反応を行なわせることにより得た。波長走
査中の化学発光の減衰に対する補正は比率モードでスペ
クトルを蓄積することで行なうこととし、合計の信号を
時間の関数として測定する補助検出器（ＥＭＩ　　９７
８１Ｂ）からの信号で観測されるスペクトルを割った。
モノクロメータ−の波長帯域は、典型的には１８ｎｍで
あった。弱い光放出を行なう試料については同一の走査
を数回繰返えし、信号対ノイズ比を改善するように加え
合せた。
常温で過剰量のテトラ−ｎ−ブチルアンモニウムヒドロ
キシドにより処理することによって、強い青色の化学発
光が生じ数分間で減衰した。この化学発光の極大波長は
４７０　ｎｍであった。開裂生成物（３−１＝）／ロキ
シ安息香酸メチノペＭＨＢ）のアニオンの蛍光は、化学
発光スペクトルに一致する。
これらの結果から化学発光過程が、（ａ）塩基による誘
発に基づく不安定なアリールオキシド型のジオキセタン
の形成、（ｂ）次いでの本ジオキセタンの開裂による一
重項励起状態のＭＨＢの生成、ｆｃｌ　Ｍ　ＨＢの蛍光
に基づく全体としての量子収率（ΦｃＩ）０．２５での
発光産生を、包含するものであることが示される。
ＤＭＳＯ中のジオキセタン２ａの１０Ｍ溶液を安定 不安定 一重項励起 臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）のよう
なカチオン性界面活性剤を、適当に置換されたジオキセ
タン類の水溶液中での化学発光の化学的誘発速度を高め
るために使用することができる。
例えばＣＴＡＢは、アセトキシ置換ジオキセタン２ｂの
塩基誘導開裂に対し触媒作用を及ぼす。このジオキセタ
ンは界面活性剤によって形成されたミセル中で可溶化さ
れ、ＮａＯＨを加えることによって化学発光を開始する
。カチオン性の頭部基と水酸化物アニオンとのクーロン
引カにょって、顕著な触媒作用が与えられる。実験は典
型的には〔２ｂ〕＝９．ｌＸｌ０　　Ｍ、（ＣＴＡＢ）
＝２ｘ　１０−３Ｍ、（ＯＨ−）　＝　９．　Ｉ　Ｘ　
１０−’　Ｍを用い、３７℃で行なった。
ミセル的環境下での高化学発光効率・・・ＤＭＳＯ中で
の塩基を用いたジオキセタン２ａ及び２ｂの光取率は０
．２５で極めて高いのに対し、これらのジオキセタンの
水中での光取率は僅かに８．９Ｘ３−１０−６である。
この大幅な収率減少の主な理由は、開裂生成物（ＭＨＢ
）が水中で弱くしか発光しないといった事実に由来する
。しかしながら次の実験によって示される通り、ジオキ
セタンをミセル中で誘発することにより発光を高めるこ
とができる。ジオキセタン２ｂの塩基誘発条件は、ＣＴ
ＡＢの濃度を０から５　Ｘ　１０−’Ｍに変更した点を
除いては上述したのと同様とした。第２図は、ＣＴＡＢ
の臨界ミセル濃度（ｃｍｃｗ　１　ｘ　１０　　　Ｍ猿
り高い部分での化学発光収率の１９倍の増加（＃（：＋
＝１．７　Ｘ　１０　’）を示している。ミセル的環境
で向上せしめられる化学発光効率は、ΦＦ及び／または
ΦＣＨの増大の結果である。
蛍光性頭部基を有する共存性界面活性剤をミセル中に加
えることによって、化学的及び酵素的の何れによって誘
発されるジオキセタンについても劇的に高い化学発光収
率が与えられる。励起状態の開裂生成物から蛍光界面活
性剤へのエネルギー移動は、誘発可能なジオキセタンと
エネルギー受容体（蛍光体）との両者が第２ａ図に示さ
れているようにミセル中で極（近接した位置関係に保た
れていることからして、極めて効果的に行なわれる。
例えば、フルオレセイン界面活性剤３とジオキセタン２
ｂとを含むＣＴＡＢ　ミセルを、最終濃度で１．５　ｘ
　１０−”ＭのＣＴＡＢ、９Ｘ１０−’Ｍの界面活性剤
３．９Ｘ１０　　Ｍの７オキ七タン２ｂといった組成の
水溶液の形で調製した。３７℃で塩基を加えることによ
って通常の青色放出ではなく強い黄色の化学発光が生じ
、その化学発光効率は１．４９６（Φｃｔ、＝　０．０
１４　）であり、ＣＴＡＢ及び界面活性剤３の不存在下
でのジオキセタン２ｂの発光効率と比較して５００倍に
もなった。
類似の実験を、ベンゾチアミド界面活性剤４を用いて実
施した。化学発光効率は０．３９６であり、λｍａｘは
５０６ｎｍであった。
ジオキセタン２ｃの貯蔵溶液を、アルケン１ｃの光酸化
によりジオキセタン／水（１：　１　、ｖ／／ｖ）の形
で作製した。新鮮な血液試料を健康な提供者から得、赤
血球を遠心分離により除去して実験用の血清を取得した
。０．７５Ｍの２−アミノ−２−メチル−１−プロパツ
ール（２２１）緩衝液（ｐＨ１０，３’）中のジオキセ
タン２ｃの１０−’Ｍ溶液３−を、１００１Ｌｌの血清
により３７℃で処理することによって、第３図に示す典
型的な強度−時間関係を得た。第３図において血清は時
間０（零）で注入した。本条件下で光強度は、約２．３
ＸｌＯ’　　カウント数／秒で一定のレベルに到達する
。２Ｃの非酵素的加水分解からするバックグランド発光
信号は、酵素により発生せしめられた値の０．０５％よ
りも少ない。プラトーでの光強度は、１ＯＯｔＬＩ！の
血清を用いた一連の実験によって示されるように（第４
図）、酵素の濃度に直接に比例する。他のどの時間点で
の光強度も、酵素濃度の直接的な尺度として利用できる
（第５図）。
衝液中のジオキセタン２Ｃの２．５６　Ｘ　１０−”Ｍ
貯蔵溶液５０ｕｌを、８．０ＸｌＯ’ＭのＭｇ　（ＯＡ
ｃ）ｔ　を含む３−の２２１緩衝液（０，７５Ｍ、　ｐ
Ｈ９，１）に加えて、最終ジオキセタン濃度を４．３　
ｘ　１０””Ｍとした。溶液中に３７℃で１０１Ｌ！！
量の希釈酵素を注入することによって、量子収率が３．
　Ｉ　Ｘ　１０　　である化学発光が生じた。化学的な
誘発の場合と同様ニ、ＣＴＡＢ　（１，１３ｘ　１０−
’Ｍ）　を加えることにより＃ＣＩの２、Ｉ　Ｘ　１０
−’へのまずまずの増加がみられた。酵素による誘発の
動力学的挙動は、界面活性剤の存在によって有意義には
変更されなかった。
安　　定 不安定 ウシ腸粘膜から取得したアルカリホスファターゼヲＳ　
ｉｇｍａ　　Ｃｈｅｍｉ　ｃａ　Ｉ　　Ｃｏ−から、３
．２Ｍの（ＮＨ４）。
Ｓ０４溶液の１−当り５．１哩のタンパク質を含む懸濁
液として入手した。典型的な実験では２２１緩酵素によ
り誘発されるジオキセタン２ｃの化学発光の効率は、ミ
セル中に共存性のフルオレセイン界面活性剤３を加える
ことによって劇的に向上させることができる。ジオキセ
タン２Ｃについてアルカリホスファターゼを用いた実験
を、ジオキセタン２Ｃ（４，３Ｘ１０−５Ｍ）　、２２
１緩衝液（０，７５Ｍ、　ｐＨ９，１）　、Ｍｇ（ＯＡ
ｃ）２（８，Ｏｘ　１０　’Ｍ、）、ＣＴＡＢ　（１，
１３ｘｌＯ−３Ｍ）、及びフルオレセイン界面活性剤３
　（５，６ｘ　１０’　Ｍ）を含む３−の溶液を用いて
３７℃で実施した。アルカリフォスファターゼ（Ｓ　ｉ
ｇｍａ　　Ｃｈｅｍｉｃａ　ｌ　　Ｃｏ　、　、　　ウ
シの刀易粘膜からのもの）を１２　ｐｇ／−１の最終タ
ンパク質濃度が与えられるように加えると、４５分間に
わたり化学発光が生じた。光放出の全過程の光強度の積
算値（積分光強度）からｌｌ’ｃ＋　＝０．０１５　（
化学発光効率でいうと１．５％）と求められ、これはＣ
ＴＡＢ及び界面活性剤３が存在しない場合の酵素反応と
比較して５００倍の増加に相当する。ジオキセタン２ｂ
の化学的誘発の場合におけるのと同様に化学発光スペク
トルは、通常の青色光放出（第６図の曲線Ａ）から典型
的なフルオレセイン光放出（第６図の曲線Ｂ）へとシフ
トされ、エネルギー移動過程の包含が示された。界面活
性剤３による青色光の単なる再吸収及び次いでの蛍光発
生はこのような効率向上を生じさせるスベトルシフトの
機序とはなりえない点に、留意されるべきである。
溶液中のアルカリホスファターゼのｉｌｌ！’に関連し
た本化学発光法の感応性を検べるために、３ｉｇｍａＣ
ｈｅｍｉｃａｌ　　Ｃｏ、から入手した市販試料を希釈
して調製した酵素貯蔵溶液を用いて一連の実験を行なっ
た。試料中のホスファターゼ濃度は控え目に、試料１４
当り５．１■りのタンパク質が１００％純粋なアルカリ
ホスファターゼに相当するとみなして評価した。酵素の
モル量を計算するのには、分子量１４０．０００　を用
いた。実験条件−はジオキセタン２Ｃ，ＣＴＡＢ及び蛍
光体３については上述したのと同様とし、３−溶液中の
酵素の最終量は次のように設定した。
Ａ＝３．６ｘｌＯモル Ｂ＝３．３Ｘ１０　　モル Ｃ＝３．０Ｘ１０　　モル Ｄ＝２．７Ｘ１０　　モル Ｅ＝２．５Ｘ１０　　モル Ｆ＝２．３Ｘ１０　　モル これらの条件下で緩衝液／共存性−ミセル環境中でのジ
オキセタン２Ｃの非酵素的加水分解からするバックグラ
ンド化学発光は極く遅く、数カウント数／秒といった極
く小さな一定信号にまで上昇する（第７図）。試料３−
当り２．７Ｘ１０　　モルのホスファターゼ濃度（実験
Ｄ）での酵素的誘発についての典型的な強度対時間の関
係が、第７図に示されている。光強度は酵素濃度に依存
して３０−６０分の期間にわたり、時間と共に増す。こ
の期間後に光は、ジオキセタンが費消されつくすまで一
定に留まる。定常状態前の期間は、ジオキセタン及び酵
素を含む試料を蛍光光度計での分析前に３７−４５℃で
数分間養生することによって無くしつる。
積分光強度または特定時間での強度対酵素量を座標平面
上にプロットすると、高い相関々係が示される。例えば
第８図は、ｌｏｇ（０−３分の間の酵素による積分光強
度）対Ｉｏｇ（アルカリホスファターゼのモル数）のプ
ロットを示している。各実験の再現性は４９６よりもよ
く、第８図に示したようなプロットは０，９９より大き
な相関係数を与えた。
上述したような酵素による誘発実験は、１）ｙｎａ　ｔ
ｅｃｈ。
Ｉｎｃ、から入手した透明ポリスチレン製の工ｍｍｕｌ
ｏｎ（商標名）ミクロ滴定ウェル中でも行なった。ウェ
ルを個別的に用い、恒温制御可能な光遮断性ホルダー中
に置いた。化学発光はウェルの底で、前述した光子計数
蛍光光度計に接続した光ファイバーを用いて検出した。
本実験法によると使用する反応物量がずっと少なくて済
む。例えば、５Ｘ１０＝’モルから２×１０　モル（２
アトモル）の範囲のアルカリホスファターゼ量を含む２
００ｄの２２１緩衝液中でジオキセタン２Ｃ，ＣＴＡＢ
、及び界面活性剤３を用いる一連の実験を行なった。第
９図は、２．３Ｘ１０　　モルの酵素を用いて行なった
実験について強度対時間の関係を示している。酵素試料
の純度についてのより実際的な仮定は１０％であったか
もしれない。ジオキセタン２ｃを用いる本化学発光法は
第１０図にみられるように、０．２アトモルより少ない
アルカリホスファターゼの検出を可能とする。
ジオキセタン２ｃの酵素的誘発によって生ぜしめられる
化学発光はまた、Ｘ線フィルム及びインスタント写真フ
ィルムを用いて写真によっても検出できる。例えば第１
１図及び第１２図はそれぞれ、ＡＳＡ　　３０００　　
Ｐｏ１ａｒｏｉｄ　（商標名）　Ｔｙｐｅ　５７　フィ
ルムで記録した化学発光を示している。ジオキセタン２
　ｃ　（４，３ｘ　１０　’Ｍ）　、Ｍｇ（ＯＡｃ）２
（８，ＯＸ　１０−’Ｍ）　、ＣＴＡＢ　（１，１３ｘ
　１０−３Ｍ）　、及びフルオレセイン界面活性剤３　
（５，６ｘ　１０　’Ｍ）を含む２２１緩衝液（１００
ｕｔ　、　　０．７５　Ｍ、ｐＨ９，Ｉｌの溶液を、前
述したＡ−Ｆのように量を変更したアルカリホスファタ
ーゼを存在させたＤｙｎａｔｅｃｈ■ｍｍｕｌｏｎ　　
（商標名）ウェル中で養生した。ウェルについて３７℃
で１時間養生を行ない、次にウェルを光遮断性の保温器
中でフィルム上に直接のせることによって同じ温度で１
５分間、感光させた。
フィルムに記録された光強度は明白に、酵素濃度の尺度
となる。
４、化学発光性の酵素結合検定 適当に置換したジオキセタン類を酵素により誘発するこ
とで、酵素結合生物検定のための極めて感応性大な検出
法が提供される。例えばリン酸塩置換ジオキセタン２ｃ
を、アルカリホスファターゼを検出用標識として利用す
る酵素結合免疫測定及びＤＮＡ探査に用いることができ
る。以前の検出法は、本酵素と反応して色を発現するか
蛍光性のものとなる基質を利用するものであった。ジオ
キセタン２ｃを用いる化学発光法の感応性を網膜タンパ
ク質、Ｓ−抗源用の酵素結合免疫吸収検定（ＥＬ　Ｉ　
ＳＡ　）　　を例にとって明らかにする。Ｌ、　ＡＤｏ
ｎｏｓｏ　（１）方法（Ｌ、　Ａ、　Ｄｏｎｏｓｏ、　
Ｃ１Ｆ、　Ｍｅｒｒｙｍａｎ、　Ｋ。
Ｅ、　Ｅｄｅｌｂｅｒｇ、　Ｒ，Ｎａ１ｄｓ、　ａｎｄ
　Ｃ，Ｋａｌｓａｗ：　ＩｎｖｅｓｔｉｇａＨｖｅ　Ｏ
ｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ　＆　Ｖｉｓｕａｌ　　５ｃ
ｉｅｎｃｅ　２６．５６１（１９８ｓ））を用い、一連
の７個のＩｍｍｕｌ　ｏｎ　（商標名）ウェルに異なっ
た量のＳ　−抗源（１１２，５６゜２８、　１４．　７
．　３．　１．３ｕｇ）をコーティングし、マウス中で
発達させたモノクローナル抗体（ＭＡＩ）Ａ９−０６）
と反応させ、最後にアルカリホスファターゼに結合した
抗マウスＩｇＧと反応させた。次に各ウェルについて個
別的に化学発光検定を、Ｍｇ０Ａｃ）。
（８，ＯＸ　１０−’Ｍ）　、ＣＴＡＢ　（１，１３Ｘ
　１０−”Ｍ）、及びフルオレセイン界面活性剤３　（
５，６ＸＩ　Ｏ−’Ｍ）を含む１００ｔＬｌ！の２２１
緩衝液（０，７５Ｍ。
ｐＨ９，１）を加えて実施した。ウェルをミクロ蛍光光
度計中に移し、３７℃で３分間平衡化し、２２１緩衝液
中のジオキセタン２Ｃの貯蔵溶液１０ｉを注入してジオ
キセタン２Ｃの最終濃度を１．３６　Ｘ１０４Ｍとした
。典型的な化学発光強度対時間の関係が、第１３図に示
されている。試薬バックグランド発光は極く低く、１５
−２０力ウント数／秒で一定である（第１３図）。第１
４図に示すように積分光強度は、ウェルにコーティング
した抗源の量と相関々係にある。蛍光光度計を用いた実
験に引続いて同じ溶液を次に、写真による検出実験に用
いた（第１５図）。７個のウェルをホルダー中に置き、
３７℃で３０分間養生し、次に同温度でＡＳＡ　３００
０　Ｐｏ１ａｒｏｉｄ　　（商標名）　Ｔｙｐｅ　５７
　フィルムを用いて光遮断性の保温器中で１５分間、感
光させた。第１５図に示すようにフィルムに記録された
光強度も、ウェルにコーティングしたＳ−抗源の量と相
関々係にある。写真検定法の再現性を第１６図に示す。
５０ｎｇの抗源をコーティングした４個のウェルを上述
のように緩衝液とジオキセタンで処理し、４５℃で１時
間養生し、次に同温度で３０秒間、フィルムに感光させ
た。両写真検定実験において緩衝液及びジオキセタンの
みを含む対照標準ウェルが視認できず、これによっても
またジオキセタンの非酵素的分解により生じるバックグ
ランドが極く低いことが示される。
１６０−９のＣＴＡＢと１２．４ｕのフルオレセイン界
面活性剤３を２００４の蒸留水に加えて、溶液を調製し
た。尿素溶液を、１００−１の蒸留水に２００即の尿素
を溶解しＥＤＴＡを加えて、０．４ｍＭの最終濃度で作
製した。ウレアーゼ実験用の基質溶液を、１０−の各貯
蔵溶液を加えることによって得た。
実験はつＬ／７−ゼ（Ｓｉｇｍａ　　Ｃｈｅｍｉｃａｌ
　　Ｃｏ、　）を用い、常温で０．５−２時間養生して
行なった。次に１０、／の３ｘｌＯ’Ｍジオキセタン２
ａを注入して、発生する化学発光を蛍光光度計及びイン
スタント写真フィルムで鑑視した。化学発光の強度は、
ウレアーゼの濃度の尺度となるものであった。
要　　　約 好ましい方法及び組成物中でジオキセタンは約１０’−
１０−’Ｍの量、界面活性剤は約１０−’Ｍより多い量
、そして共存性フルオレセイン界面活性剤は約１０−３
−１０−’Ｍの量だけ、用いられる。
共存性界面活性剤は、溶液中でそれを単独に用いると自
己消光する。一般にジオキセタンと蛍光化合物とのモル
比は、溶液中か固体組成物中かを問わず約１０００　：
　１からｌｏｌまでの間に設定する。
緩衝液は、酵素活性を最大とするようにｐＨを調整する
のに用いられる。リン酸塩（Ｘ−オキシ基として）置換
ジオキセタン類に関してはｐＨを９と１０との間とする
と、リン酸基の非酵素的加水分解が極小化されてバック
グランド発光が低くなる。
２−アミノ−２−メチル−１−プロパツールＣ２１）は
、好ましい緩衝液である。他の緩衝剤にはトリス（ヒド
ロキシメチル）アミノメタン及びカーボナートカずある
。酢酸マグネシウムのような無機塩類も、酵素を活性化
するために使用できる。緩衝系は酵素について、またリ
ン酸塩のようにジオキセタンから開裂されるＸ−オキシ
基用の受容体について、最大の触媒活性が附与されるよ
うに選択される。
この発明は安定なジオキセタンと蛍光エネルギー受容体
を、十分なエネルギー移動を可能ならしめるミセルのよ
うな組織化された分子集合物中で用いるものである。本
方法は逆ミセル、リボソーム、ミクロエマルジョン、フ
ィルム、単分子膜及びポリマーを含む他の組織化集合物
を利用しても、実施可能である。
ジオキセタンと受容体を溶媒中の溶液としても、フィル
ム等の上の固体の形でも、用いうることに留意されるべ
きである。固体相はこれらの化合物分子を相互に位置付
けることを容易とする。
【図面の簡単な説明】
第１図はリン酸塩置換ジオキセタン２Ｃの熱分解につい
て、−次速度定数と時間との関係をアレニウス式に従っ
て座標平面にプロットした図である。 第２図はジオキセタン２ｂの塩基誘発反応について、化
学発光量子収率と臭化セチルトリメチルアンモニウム（
ＣＴＡＢ）の濃度との関係を座標平面にプロットした図
である。 第２ａ図は、ミセル中でのジオキセタンとエネルギー受
容体との位置関係を画いたものである。 第３図はヒト血清アルカリホスファターゼにより誘発し
たジオキセタン２Ｃの化学発光について、光強度と時間
との関係を示すグラフである。 第４図は第３図の場合と同様の化学発光について、プラ
トーでの光強度と血清量との関係を示すグラフである。 第５図は第３図と同様の化学発光について、積分光強度
と血清ｌとの関係を示すグラフである。 第６図はアルカリホスファターゼにより誘発したジオキ
セタン２Ｃの化学発光について、分子間エネルギー移動
を伴なわない場合と伴なう場合とを対比して示したスペ
クトル図である。 第７図はＣＴＡＢ及び蛍光体の存在下でアルカリホスフ
ァターゼにより誘発したジオキセタン２Ｃの化学発光に
ついて、光強度と時間との関係を示すグラフである。 第８図は第７図の場合と同様の化学発光について、積分
光強度とアルカリホスファターゼの量との関係を示すグ
ラフである。 第９図はＣＴＡＢ及び蛍光体の存在下でアルカリホスフ
ァターゼにより誘発したジオキセタン２ｃの化学発光に
ついて、光強度と時間との関係を示すグラフである。 第１０図は第９図の場合と同様の化学発光について、積
分光強度とアルカリホスファターゼの量との関係を示す
グラフである。 第１１図はジオキセタン２ｃの化学発光により感光させ
たインスタント写真フィルムについて、コンピューター
処理により光強度を線図化して示した図である。 第１２図は第１１図と同様の図で、第１１図の場合とは
感光時間を変えた場合についてのものである。 第１３図は、ジオキセタン２Ｃを用いた免疫検定実験で
得た光強度と時間との関係を示すグラフである。 第１４図は、第１３図の場合と同様の実験で得た積分光
強度とＳ−抗源の量との関係を示すグラフである。 第１５図及び第１６図はそれぞれ、ジオキセタン２ｃを
用いるＳ−抗源の検定実験において化学発光により感光
させたインスタント写真フィルムを、コンピューター処
理により光強度を線図化して示した図である。 ご千へＦ３ＩルｌＪ（Ｍ） ＦＩＧＵＲＥ　　２ ＦＩＧＵＲＥ　　２ａ ＦＩＧＵＲＥ　　２゜ ＦＩＧＵＲＥ　　３ １０（］　　（５０に７　で’ｆ）：）ｆ、’ｒ’ｊ、
Ｉ、己ｒｓ）１０９（フブトーぜＯ舶ニリンｌ、ｃＰう
）Ｑ　！’Ａ　（分） ＦＩＧＵＲＥ　　Ｖ ｌｏｇ　（ア）ｖ’４Ｊ　’）　”ｊニス１アゲーイｎ
、モー、４）ＦＩＧＵＲＥ　１１ ＦＩＯ［、ｉ’ＲＥ　ｉ２ ｄ　ルゴく９） ＦＩＧＵＲＥ９ １０９（アｊＶ勇ソ木スフどデー七グの三１／起）時閉
（ケ） ＦＩＧＵＲＥ　　１３ ＦＩＧＵＲＥ　　１４

Claims (42)

    【特許請求の範囲】
  1. 　１．化学発光を発生させる方法であつて、（ａ）．蛍
    光性化合物を、一般式 ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中、ＡｒＯＸはＸ−オキシ基で置換されたアリール
    基であつて、活性化剤でｘを除去して反応を誘発すると
    不安定なオキシド中間体の１，２−ジオキセタン化合物
    を形成しその不安定な１，２ージオキセタン化合物が電
    子エネルギーを放出して分解し光と一般式 ▲数式、化学式、表等があります▼ の２個のカルボニル含有化合物とを生成し、またｘは活
    性化剤により除去されて不安定なオキシド中間体の１，
    ２−ジオキセタンを形成させる化学的に易反応性の基で
    あり、Ａはそれぞれ光の生成を許容する受動性の有機性
    基である。〕 で表される安定な１，２−ジオキセタンと近接した位置
    に保持されるように設け、 （ｂ）．安定な１，２−ジオキセタンを活性化剤により
    分解させ不安定な１，２−ジオキセタン化合物の分解に
    よつて放出される電子エネルギーを蛍光性化合物に受け
    とらせて、ジオキセタン単独の誘発によつて生成される
    光よりも強い光を生成させる、 発光法。
  2. ２．基Ｘを除去する活性化剤として生物源から得た酵素
    を用いて１，２−ジオキセタン化合物を分解する、請求
    項１に記載の発光法。
  3. ３．１，２−ジオキセタンがＸ−オキシ基としてリン酸
    基を有し、前記酵素としてアルカリホスフアターゼを用
    いる、請求項２に記載の発光法。
  4. ４．　１，２−ジオキセタンがＯＸ基としてアセトキシ
    基を有し、前記酵素としてアセチルコリンエステラーゼ
    を用いる、請求項２に記載の発光法。
  5. ５．　１，２−ジオキセタンがＯＸ基としてアセトキシ
    基を有し、前記酵素としてアリールエステラーゼを用い
    る、請求項２に記載の発光法。
  6. ６．　免疫測定または核酸探査の一部として実施される
    、請求項１に記載の発光法。
  7. ７．　蛍光性化合物を１，２−ジオキセタンとの混合物
    として設ける、請求項１に記載の発光法。
  8. ８．　カチオン性の界面活性剤と蛍光性化合物とを１，
    ２−ジオキセタンとの混合物として設ける、請求項１に
    記載の発光法。
  9. ９．　前記界面活性剤としてセチルトリメチルアンモニ
    ウム塩を用いる、請求項８に記載の発光法。
  10. １０．　蛍光性化合物がフルオレセイン化合物である、
    請求項９に記載の発光法。
  11. １１．　蛍光性化合物として、界面活性剤としてのセチ
    ルトリメチルアンモニウム塩と共にミセルを形成する界
    面活性剤としても機能する５−（Ｎ−テトラデカ−ノニ
    ルアミノ−フルオレセイン）を用いる、請求項１に記載
    の発光法。
  12. １２．　蛍光性化合物として、界面活性剤としてのセチ
    ルトリメチルアンモニウムと共に共存性界面活性剤とし
    ても機能する１−ヘキサデシル−６−ヒドロキシ−２−
    ベンゾトリアゾミドを用いる、請求項１に記載の発光法
    。
  13. １３．　ジオキセタンと蛍光性化合物とをミセル、リボ
    ソーム、逆ミセル、ミクロエマルジヨン、フイルム、単
    分子膜またはポリマー中で近接した位置関係に維持する
    、請求項１に記載の発光法。
  14. １４．　化学発光を発生させる方法であつて、（ａ）．
    蛍光性化合物を、一般式 ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中、Ｒ＿１とＲ＿２及びＲ＿３とＲ＿３はそれぞれ
    、炭素及びアリール環の他に異種原子（Ｎ，Ｓ，Ｏまた
    はＰ）を含みうるスピロ結合アルキレンとして結合させ
    てもよく、Ｒ＿１とＲ＿２またはＲ＿３とＲ＿４のうち
    の少なくとも１個はＸ−オキシ基で置換されたアリール
    基であつて酸，塩基，塩，酵素，有機触媒，無機触媒及
    び電子供与体から選択された活性化剤でＸを除去して反
    応を誘発すると不安定なオキシド中間体の１，２−ジオ
    キセタン化合物を形成しその不安定な１，２−ジオキセ
    タン化合物が電子エネルギーを放出して分解し光と一般
    式 ▲数式、化学式、表等があります▼ の２個のカルボニル含有化合物とを生成し、またＸ−オ
    キシ基で置換されていないＲ＿１，Ｒ＿２，Ｒ＿３また
    はＲ＿４は１，２−ジオキセタン化合物に安定性を与え
    る炭素及び異種原子含有の有機性基であり、Ｘは活性化
    剤により除去されて不安定なオキシド中間体を形成させ
    る化学的に易反応性の基である。〕で表される安定な１
    ，２−ジオキセタン化合物と近接した位置に保持される
    ように設け、 （ｂ）．安定な１，２−ジオキセタンを活性化剤により
    分解させ不安定なオキシド中間体の分解によつて放出さ
    れる電子エネルギーを蛍光性化合物に受けとらせて、ジ
    オキセタン単独の誘発によつて生成される光よりも強い
    光を生成させる、 発光法。
  15. １５．　Ｒ＿３とＲ＿４が互に結合して６−３０個の炭
    素または異種原子（Ｎ，Ｏ，ＳまたはＰ）を含有する多
    環式ポリアルキレン基を形成している１，２−ジオキセ
    タンを用いる、請求項１４に記載の発光法。
  16. １６．　Ｒ＿２がＸ−オキシ基を含有するナフチル基及
    びフエニル基から選択されたものでありＲ＿１がメトキ
    シ基である１，２−ジオキセタンを用いる、請求項１５
    に記載の発光法。
  17. １７．　Ｘ−オキシ基がヒドロキシル基，トリアルキル
    またはアリールシリルオキシ基，無機オキシ酸塩，ピラ
    ノシド酸素、アリールカルボキシルエステル及びアルキ
    ルカルボキシルエステルから選択されたものであり、Ｘ
    が活性化剤により除去されるものである１，２−ジオキ
    セタンを用いる、請求項１６に記載の発光法。
  18. １８．　Ｘ−オキシ基が活性化剤としてのホスフアター
    ゼにより除去されるリン酸塩である１，２−ジオキセタ
    ンを用いる、請求項１７に記載の発光法。
  19. １９．　Ｘ−オキシ基がアルキルカルボキシルエステル
    基及びアリールカルボキシルエステル基から選択された
    ものであり、そのカルボキシル基がエステラーゼによつ
    て除去されるものである１，２−ジオキセタンを用いる
    、請求項１７に記載の発光法。
  20. ２０．　基Ｘを除去する活性化剤として生物源から得た
    酵素を用いて１，２−ジオキセタン化合物を分解する、
    請求項１４に記載の発光法。
  21. ２１．　１，２−ジオキセタンがＸ−オキシ基としてリ
    ン酸塩を有し、前記酵素としてアルカリホスフアターゼ
    を用いる、請求項２０に記載の発光法。
  22. ２２．　１，２−ジオキセタンがＸ−オキシ基としてア
    セトキシ基を有し、前記酵素としてアセチルコリンエス
    テラーゼを用いる、請求項２０に記載の発光法。
  23. ２３．　１，２−ジオキセタンがＸ−オキシ基としてア
    セトキシ基を有し、前記酵素としてアリールエステラー
    ゼを用いる、請求項２０に記載の発光法。
  24. ２４．　免疫測定または核酸探査の一部として実施され
    る、請求項１４に記載の発光法。
  25. ２５．　Ｒ＿１がアルコキシ基である１，２−ジオキセ
    タンを用いる、請求項１４に記載の発光法。
  26. ２６．　Ｒ＿１がメトキシ基であり、Ｒ＿２がＸ−オキ
    シ基で置換されたフエニル基であり、Ｒ＿３とＲ＿４が
    互に結合してアダマンチル基を形成している１，２−ジ
    オキセタンを用いる、請求項１４に記載の発光法。
  27. ２７．　Ｘ−オキシ基がヒドロキシ基、アセトキシ基、
    リン酸基及びピラノシド酸素から選択されたものである
    １，２−ジオキセタンを用いる、請求項２６に記載の発
    光法。
  28. ２８．　化学発光を発生させる方法であつて、（ａ）．
    蛍光性化合物を、一般式 ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中、Ｒ＿１はＲ＿２とスピロ結合したアリール基を
    含むアルキル基，アルコキシ基，アリールオキシ基，ジ
    アルキルアミノ基，トリアルキルシリルオキシ基、アリ
    ールシリルオキシ基，及びアリール基から選択されたも
    のであり、またＲ＿２はＲ＿１を含んでもよく且つＸ−
    オキシ基で置換されたアリール基であつて酸，塩基，塩
    ，酵素，無機触媒，有機触媒及び電子供与体から選択さ
    れた活性化剤でＸを除去して反応を誘発すると不安定な
    オキシド中間体の１，２−ジオキセタン化合物を形成し
    その不安定な１，２−ジオキセタン化合物が電子エネル
    ギーを放出して分解し光と一般式 ▲数式、化学式、表等があります▼ の２個のカルボニル含有化合物を生成し、またＸは活性
    化剤により除去されて不安定なオキシド中間体を形成さ
    せる化学的に易反応性の基であり、さらにＲ＿３及びＲ
    ＿４はスピロ結合の多環式アルキル基及び多環式アリー
    ル基として互に結合させてもよいアリール基，ヘテロア
    ルキル基及びアルキル基から選択されたものである。〕 で表される安定な１，２−ジオキセタン化合物と近接し
    た位置に保持されるように設け、 （ｂ）．安定な１，２−ジオキセタンを活性化剤により
    分解させ不安定なオキシド中間体の分解によつて放出さ
    れる電子エネルギーを蛍光性化合物に受けとらせて、ジ
    オキセタン単独の誘発によつて生成される光よりも強い
    光を生成させる、 発光法。
  29. ２９．　誘発されると光を発出する組成物であつて、（
    ａ）．蛍光性化合物、及び （ｂ）．一般式 ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中、ＡｒＯＸはＸ−オキシ基で置換されたアリール
    基であつて、活性化剤でＸを除去して反応を誘発すると
    不安定なオキシド中間体の１，２−ジオキセタン化合物
    を形成しその不安定な１，２−ジオキセタン化合物が電
    子エネルギーを放出して分解し光と一般式 ▲数式、化学式、表等があります▼ の２個のカルボニル含有化合物とを生成し、またＸは活
    性化剤により除去されて不安定なオキシド中間体の１，
    ２−ジオキセタンを形成させる化学的に易反応性の基で
    あり、Ａはそれぞれ光の生成を許容する受動性の有機性
    基である。〕 で表される安定な１，２−ジオキセタン、 を含み、安定な１，２−ジオキセタンが活性化剤により
    分解されると、不安定なオキシド中間体の分解によつて
    生成される電子エネルギーを蛍光性化合物が受けとつて
    ジオキセタン単独の誘発によつて生成される光よりも強
    い光を生成する発光用組成物。
  30. ３０．　ジオキセタンと蛍光性化合物とのモル比が約１
    ０００：１と１：１との間にある、請求項２９に記載の
    発光用組成物。
  31. ３１．　蛍光性化合物がフルオレセイン化合物である、
    請求項２９に記載の発光用組成物。
  32. ３２．　カチオン性の表面活性剤を含む、請求項２９に
    記載の発光用組成物。
  33. ３３．　ジオキセタンと蛍光性化合物とがミセル、リボ
    ソーム、逆ミセル、ミクロエマルジヨン、フイルム、単
    分子膜またはポリマー中で互に近接した位置関係に維持
    されている、請求項２９に記載の発光用組成物。
  34. ３４．　誘発されると光を発生する組成物であつて、（
    ａ）．蛍光性化合物、及び （ｂ）．一般式 ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中、Ｒ＿１とＲ＿２及びＲ＿３とＲ＿３はそれぞれ
    、炭素及びアリール環の他に異種原子（Ｎ，Ｓ，Ｏまた
    はＰ）を含みうるスピロ結合アルキレンとして結合させ
    てもよく、Ｒ＿１とＲ＿２またはＲ＿３とＲ＿４のうち
    の少なくとも１個はＸ−オキシ基で置換されたアリール
    基であつて酸，塩基，塩，酵素，有機触媒，無機触媒及
    び電子供与体から選択された活性化剤でＸを除去して反
    応を誘発すると不安定なオキシド中間体の１，２−ジオ
    キセタン化合物を形成しその不安定な１，２−ジオキセ
    タン化合物が電子エネルギーを放出して分解し光と一般
    式 ▲数式、化学式、表等があります▼ の２個のカルボニル含有化合物とを生成し、またＸ−オ
    キシ基で置換されていないＲ＿１，Ｒ＿２，Ｒ＿３また
    はＲ＿４は１，２−ジオキセタン化合物に安定性を与え
    る炭素含有の有機性基であり、Ｘは活性化剤により除去
    されて不安定なオキシド中間体を形成させる化学的に易
    反応性の基である。〕 で表される安定な１，２−ジオキセタン化合物、を含み
    、安定な１，２−ジオキセタンが活性化剤により分解さ
    れると、不安定なオキシド中間体の分解によつて生成さ
    れる電子エネルギーを蛍光性化合物が受けとつてジオキ
    セタン単独の誘発によつて生成される光よりも強い光を
    生成する発光用組成物。
  35. ３５．　Ｒ＿１がメトキシ基であり、Ｒ＿２がＸ−オキ
    シ基で置換されたフエニル基であり、Ｒ＿３とＲ＿４が
    互に結合してアダマンチル基を形成している、請求項３
    ４に記載の発光用組成物。
  36. ３６．　Ｘ−オキシ基がヒドロキシル基、トリアルキル
    シリルオキシ基、アリールシリルオキシ基、無機オキシ
    酸塩、ピラノシド酸素、アリールカルボキシルエステル
    及びアルキルカルボキシルエステルから選択されたもの
    であり、Ｘが活性化剤で除去されるものである、請求項
    ３５に記載の発光用組成物。
  37. ３７．　蛍光性化合物がフルオレセイン化合物である、
    請求項３６に記載の発光用組成物。
  38. ３８．　カチオン性の界面活性剤を含み、蛍光性化合物
    が炭化水素鎖と結合して共存性界面活性剤を形成してお
    り、ジオキセタンが約１０＾−＾２−１０＾−＾６モル
    、界面活性剤が１０＾−＾４モル以上、そして共存性界
    面活性剤が１０＾−＾３−１０＾−＾６モルの量だけ含
    まれている、請求項３７に記載の発光用組成物。
  39. ３９．　界面活性剤がセチルトリメチルアンモニウム塩
    である、請求項３８に記載の発光用組成物。
  40. ４０．　ジオキセタンと蛍光性化合物とがミセル、リボ
    ソーム、逆ミセル、ミクロエマルジヨン、フイルム、単
    分子膜またはポリマー中で互に近接した位置関係に維持
    されている、請求項３４に記載の発光用組成物。
  41. ４１．　誘発されると光を発生する組成物であつて、（
    ａ）．蛍光性化合物、及び （ｂ）．一般式 ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中、Ｒ＿１はＲ＿２とスピロ結合したアリール基を
    含むアルキル基，アルコキシ基，アリールオキシ基，ジ
    アルキルアミノ基，トリアルキルシリルオキシ基、アリ
    ールシリルオキシ基，及びアリール基から選択されたも
    のであり、またＲ＿２はＲ＿１を含んでもよく且つＸ−
    オキシ基で置換されたアリール基であつて酸，塩基，塩
    ，酵素，無機触媒，有機触媒及び電子供与体から選択さ
    れた活性化剤でＸを除去して反応を誘発すると不安定な
    オキシド中間体の１，２−ジオキセタン化合物を形成し
    その不安定な１，２−ジオキセタン化合物が電子エネル
    ギーを放出して分解し光と一般式 ▲数式、化学式、表等があります▼ の２個のカルボニル含有化合物を生成し、またＸは活性
    化剤により除去されて不安定なオキシド中間体を形成さ
    せる化学的に易反応性の基であり、さらにＲ＿３及びＲ
    ＿４はスピロ結合の多環式アルキル基及び多環式アリー
    ル基として互に結合させてもよいアリール基，ヘテロア
    ルキル基及びアルキル基から選択されたものである。〕 で表される安定な１，２−ジオキセタン化合物、を含み
    、安定な１，２−ジオキセタンが活性化剤により分解さ
    れると、不安定なオキシド中間体の分解によつて生成さ
    れる電子エネルギーを蛍光性化合物が受けとつてジオキ
    セタン単独の誘発によつて生成される光よりも強い光を
    生成する発光用組成物。
  42. ４２．　ジオキセタンと蛍光性化合物とがミセル、リボ
    ソーム、逆ミセル、ミクロエマルジヨン、フイルム、単
    分子膜またはポリマー中で互に近接した位置関係に維持
    されている、請求項４１に記載の発光用組成物。
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