JPH0731201B2 - 化学発光による測定法 - Google Patents
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Description
【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、1,2−ジオキセタン分子中の酵素よって切断
しうる基を酵素的に分解することによってもたらされる
光学的に検出可能な反応を用いて、特異的結合対の一員
を検出し、且つ定量化しうる検定法に関する。
しうる基を酵素的に分解することによってもたらされる
光学的に検出可能な反応を用いて、特異的結合対の一員
を検出し、且つ定量化しうる検定法に関する。
［従来の技術］ 1,2−ジオキセタンとして知られる４員環の有機ペルオ
キシドは既知化合物であるが、これまでめったに利用さ
れたことのない化合物群である。それらの化合物固有の
化学的不安定性ゆえに、いくつかの1,2−ジオキセタン
はある種の条件下で、例えば酵素の作用により化学発光
分解を示し、このことは“ジオキセタンの酵素的分解を
用いる物質の検出法”と題する係属中の米国特許出願題
889823号に開示されている。このような化学発光の間に
放出される光の量は発光物質の濃度の尺度であり、ひい
てはその前駆物質（すなわち1,2−ジオキセタン）の濃
度の尺度である。従って、発光の強度および持続時間を
測定することによって、1,2−ジオキセタンの濃度（そ
れゆえに検定すべき物質、すなわち特異的結合対に結合
した物質の濃度）を求めることができる。1,2−ジオキ
セタン環の置換基を適当に選択すると、その分子の化学
的安定性を調節することができ、ひいては化学発光の開
始をコントロールすることができ、それにより実施目的
のため、例えば上記出願明細書中にある化学発光イムノ
アッセイにおける、この種の化合物の化学発光作用の有
用性を高めることができる。
キシドは既知化合物であるが、これまでめったに利用さ
れたことのない化合物群である。それらの化合物固有の
化学的不安定性ゆえに、いくつかの1,2−ジオキセタン
はある種の条件下で、例えば酵素の作用により化学発光
分解を示し、このことは“ジオキセタンの酵素的分解を
用いる物質の検出法”と題する係属中の米国特許出願題
889823号に開示されている。このような化学発光の間に
放出される光の量は発光物質の濃度の尺度であり、ひい
てはその前駆物質（すなわち1,2−ジオキセタン）の濃
度の尺度である。従って、発光の強度および持続時間を
測定することによって、1,2−ジオキセタンの濃度（そ
れゆえに検定すべき物質、すなわち特異的結合対に結合
した物質の濃度）を求めることができる。1,2−ジオキ
セタン環の置換基を適当に選択すると、その分子の化学
的安定性を調節することができ、ひいては化学発光の開
始をコントロールすることができ、それにより実施目的
のため、例えば上記出願明細書中にある化学発光イムノ
アッセイにおける、この種の化合物の化学発光作用の有
用性を高めることができる。
発光を用いた従来の検定方法として代表的なものは、
標識酵素としてPODを用い、基質としてH2O2及びルミノ
ールを用いるEIA法、アクリジンエステルを標識体と
して用い、H2O2で発光させるCLEIA法が知られている。
標識酵素としてPODを用い、基質としてH2O2及びルミノ
ールを用いるEIA法、アクリジンエステルを標識体と
して用い、H2O2で発光させるCLEIA法が知られている。
［発明が解決しようとする課題］ しかしながら、従来の方法のの場合、低濃度のリガン
ド測定に対して定量性がなく、の場合はラベル体自体
の増幅ができない等の欠点を有していた。そのため、高
感度の測定を目指すにはより多くの光量をもった測定法
の開発が望まれていた。
ド測定に対して定量性がなく、の場合はラベル体自体
の増幅ができない等の欠点を有していた。そのため、高
感度の測定を目指すにはより多くの光量をもった測定法
の開発が望まれていた。
本発明は上述の如き従来方法の欠点を克服し得た。
すなわち、本発明の目的は、1,2−ジオキセタン類の化
学発光分解に基づく検出法を提供することである。
学発光分解に基づく検出法を提供することである。
［課題を解決するための手段］ 本発明の方法は、エンハンサーの存在下に、次式（Ｉ） （式中ＲはC1−C4のアルキルであり、Ｍはアルカリ金属
またはアンモニウムである） で表される1,2−ジオキセタン化合物にホスファターゼ
を反応させて、発光する光を測定することを特徴とする
化学発光による測定方法である。
またはアンモニウムである） で表される1,2−ジオキセタン化合物にホスファターゼ
を反応させて、発光する光を測定することを特徴とする
化学発光による測定方法である。
式（Ｉ）の1,2−ジオキセタン類では、ホスファターゼ
で切断可能なホスホノ基が酵素を介して発色団フェニレ
ンに結合している。ホスファターゼとの接触により結合
が切断され、発色団に結合した電子密度の高い酵素陰イ
オンが得られ；この部位が、２つの個々のケトン類へ分
解を開始する。
で切断可能なホスホノ基が酵素を介して発色団フェニレ
ンに結合している。ホスファターゼとの接触により結合
が切断され、発色団に結合した電子密度の高い酵素陰イ
オンが得られ；この部位が、２つの個々のケトン類へ分
解を開始する。
最も好適な酵素はアルカリ性ホスアターゼである。
エンハンサーは、発光を増幅する物質であって、蛋白
質、螢光剤またはビニルベンジル四級アンモニウム塩ポ
リマーあるいはそれらの混合物が挙げられる。エンハン
サーの例としては、蛋白質がウシ血清アルブミン、螢光
剤がフルオレセイン、ビニルベンジル四級アンモニウム
塩ポリマーがポリ［（ビニルベンジル）（ベンジル）
（ジメチル）アンモニウムクロライド］またはポリ
［（ビニルベンジル）（トリメチル）アンモニウムクロ
ライド］が挙げられる。
質、螢光剤またはビニルベンジル四級アンモニウム塩ポ
リマーあるいはそれらの混合物が挙げられる。エンハン
サーの例としては、蛋白質がウシ血清アルブミン、螢光
剤がフルオレセイン、ビニルベンジル四級アンモニウム
塩ポリマーがポリ［（ビニルベンジル）（ベンジル）
（ジメチル）アンモニウムクロライド］またはポリ
［（ビニルベンジル）（トリメチル）アンモニウムクロ
ライド］が挙げられる。
本発明に用いる1,2−ジオキセタンは以下の反応式で表
される方法により製造される。
される方法により製造される。
式中、R1及びＲは独立してC1-4アルキル基であり;W-は
ハロゲンイオン、例えば塩素イオンのような酸アニオン
であり；そしてＸはハロゲンであり、Ｔ−はアダマント
−２−イル基であり、Ｔ＝及びT1はアダマント−２−イ
リデン基であり、Ｙはフェニレン基である。
ハロゲンイオン、例えば塩素イオンのような酸アニオン
であり；そしてＸはハロゲンであり、Ｔ−はアダマント
−２−イル基であり、Ｔ＝及びT1はアダマント−２−イ
リデン基であり、Ｙはフェニレン基である。
前記の反応はそれぞれの反応生成物を単離しながら段階
的に実施される。しかしながら、段階VI（CN-または有
機スルフィネートイオンのような求核酸性化アニオンに
よるアルキル基切断）および段階VII（β−脱離反応を
経る脱保護）は中間体のリン酸エステル塩を単離するこ
となく有利に行われ、この種の中間体はその存在を確認
するときのみ単離する必要がある。
的に実施される。しかしながら、段階VI（CN-または有
機スルフィネートイオンのような求核酸性化アニオンに
よるアルキル基切断）および段階VII（β−脱離反応を
経る脱保護）は中間体のリン酸エステル塩を単離するこ
となく有利に行われ、この種の中間体はその存在を確認
するときのみ単離する必要がある。
前記の反応式の段階VIおよびVIIにおいて、段階VIで用
いられる塩のカチオンM+および段階VIIで用いられる塩
基のカチオンM+は、アルカリ金属イオン、例えばNa+又
はアンモニウムイオンである。
いられる塩のカチオンM+および段階VIIで用いられる塩
基のカチオンM+は、アルカリ金属イオン、例えばNa+又
はアンモニウムイオンである。
前記の合成経路IIIにおいて、次式： （式中、Ｔはカルボニル基に対してα位の炭素原子にス
ピロ結合されているアダマント−２−イル基である。）
で表される化合物と、アルキルサルフェート、トルエン
スルホネート（トシレート）、メタンスルホネート（メ
シレート）、トリフルオロメタンスルホネート（トリフ
レート）、およびクロロメチルエーテル並びにトリアル
キルオキソニウム塩より成る群から選ばれるアルキル化
剤とを、塩基性、極性、非プロトン性媒体（例えばジメ
チルスルホキシド中のアルカリ金属アルコキシド）中で
反応させることにより、次式： （式中、Ｔ＝、Ｒ、R1およびＹは先に定義した通りであ
る）で表される化合物を得る。
ピロ結合されているアダマント−２−イル基である。）
で表される化合物と、アルキルサルフェート、トルエン
スルホネート（トシレート）、メタンスルホネート（メ
シレート）、トリフルオロメタンスルホネート（トリフ
レート）、およびクロロメチルエーテル並びにトリアル
キルオキソニウム塩より成る群から選ばれるアルキル化
剤とを、塩基性、極性、非プロトン性媒体（例えばジメ
チルスルホキシド中のアルカリ金属アルコキシド）中で
反応させることにより、次式： （式中、Ｔ＝、Ｒ、R1およびＹは先に定義した通りであ
る）で表される化合物を得る。
さらに、次式： で表される化合物と、次式： （式中、Ｘはハロゲン、例えばクロロのような電気陰性
離脱基である）で表される化合物とを、液状芳香族化合
物（例えばベンゼン、トルエン）、エーテル（例えばグ
リム、ジグリム）または環状エーテル（例えばテトラヒ
ドロフラン（THF））のような非プロトン性有機溶媒中
に溶解した、第三アミン（例えばトリエチルアミン）の
ようなルイス塩基の存在下で反応させることにより、次
式： （式中、Ｔ＝、ＲおよびＹは先に定義した通りである）
で表される化合物が得られる。ハロホスフェートの使用
に代わるべきものとして、類似のハロホスフィットすな
わちXPO2（CH2）２を使用し、その後酸化および照射を
することにより、直接ジオキセタンを形成することもで
きる。
離脱基である）で表される化合物とを、液状芳香族化合
物（例えばベンゼン、トルエン）、エーテル（例えばグ
リム、ジグリム）または環状エーテル（例えばテトラヒ
ドロフラン（THF））のような非プロトン性有機溶媒中
に溶解した、第三アミン（例えばトリエチルアミン）の
ようなルイス塩基の存在下で反応させることにより、次
式： （式中、Ｔ＝、ＲおよびＹは先に定義した通りである）
で表される化合物が得られる。ハロホスフェートの使用
に代わるべきものとして、類似のハロホスフィットすな
わちXPO2（CH2）２を使用し、その後酸化および照射を
することにより、直接ジオキセタンを形成することもで
きる。
他の方法では、次式： で表される化合物と、次式： （式中、Ｘは先に定義した通りである）で表わされる化
合物とを、液状芳香族化合物（例えばベンゼン、トルエ
ン）、エーテル（例えばグリム、ジグリム）または環状
エーテル（例えばTHF）のような非プロトン性有機溶媒
中で第三アミン（例えばトリアルキルアミン）のような
ルイス塩基の存在下に反応させることにより、次式： （式中、Ｔ＝、ＲおよびＹは先に定義した通りである）
で表される化合物が製造される。
合物とを、液状芳香族化合物（例えばベンゼン、トルエ
ン）、エーテル（例えばグリム、ジグリム）または環状
エーテル（例えばTHF）のような非プロトン性有機溶媒
中で第三アミン（例えばトリアルキルアミン）のような
ルイス塩基の存在下に反応させることにより、次式： （式中、Ｔ＝、ＲおよびＹは先に定義した通りである）
で表される化合物が製造される。
本発明は、光学発光による測定法を提供するものであ
る。この方法は試料中の特定の物質の存在または濃度を
求めるために視覚的検出方法として利用することができ
る。上記の1,2−ジオキセタン類はこれらの検定法のい
ずれにも使用しうる。こうした検定法の例には、抗体ま
たは抗原（例、αまたはβ−hCG、TSH、LH等のホルモ
ン、AFP、CEAのような癌関連抗原）を検出する酵素免疫
測定法；酵素検定法（例、アルカリホスファターゼ）；
カリウムまたはナトリウムイオンなどを検出する化学検
定法；およびウィルス（例、HSVI、HTLV IIIもしくはサ
イトメガロウィルス）または細菌（例、大腸菌）などを
検出する核酸プローブ法が含まれる。
る。この方法は試料中の特定の物質の存在または濃度を
求めるために視覚的検出方法として利用することができ
る。上記の1,2−ジオキセタン類はこれらの検定法のい
ずれにも使用しうる。こうした検定法の例には、抗体ま
たは抗原（例、αまたはβ−hCG、TSH、LH等のホルモ
ン、AFP、CEAのような癌関連抗原）を検出する酵素免疫
測定法；酵素検定法（例、アルカリホスファターゼ）；
カリウムまたはナトリウムイオンなどを検出する化学検
定法；およびウィルス（例、HSVI、HTLV IIIもしくはサ
イトメガロウィルス）または細菌（例、大腸菌）などを
検出する核酸プローブ法が含まれる。
検出される物質が抗体、抗原または核酸である場合に
は、1,2−ジオキセタン類のホスホノ基を切断可能な酵
素を、検出される物質に特異的に親和性を有する物質
（例、抗原、抗体または核酸プローブ）に結合させるこ
とが好ましい。酵素を特異的親和性物質に結合させるた
めに常法（例、カルボジイミドカップリング）が使用さ
れる；結合はアミド結合を介することが好ましい。
は、1,2−ジオキセタン類のホスホノ基を切断可能な酵
素を、検出される物質に特異的に親和性を有する物質
（例、抗原、抗体または核酸プローブ）に結合させるこ
とが好ましい。酵素を特異的親和性物質に結合させるた
めに常法（例、カルボジイミドカップリング）が使用さ
れる；結合はアミド結合を介することが好ましい。
一般的に検定法は、下記のように実施することができ
る。検出される物質を含む試料を、検出される物質（例
えば抗原）に特異的に親和性を有する物質（例えば抗
体）に結合した酵素を含む緩衝液に接触させ、更に特異
的親和性を有するもう一つの物質（例えば抗体）が結合
した固相（例えば抗体結合のビーズ）に接触させる。一
定時間インキュベーションした後、過剰の特異的親和性
を有する物質に結合した酵素を洗い流し、その酵素部分
によって切断されうるホスホノ基を有する1,2−ジオキ
セタン類（基質）を添加する。酵素はホスホノ基を切断
して1,2−ジオキセタン類を２つのケトンに分解する；
ケトンの１つに結合している発色団 は、こうして励起されて発光する。この発光はキュベッ
トまたはカメラルミノメーターなどを用いて、試料中に
検出される物質が存在することの指標として検出され
る。物質の濃度を求めるために発光強度を測定すること
ができる。
る。検出される物質を含む試料を、検出される物質（例
えば抗原）に特異的に親和性を有する物質（例えば抗
体）に結合した酵素を含む緩衝液に接触させ、更に特異
的親和性を有するもう一つの物質（例えば抗体）が結合
した固相（例えば抗体結合のビーズ）に接触させる。一
定時間インキュベーションした後、過剰の特異的親和性
を有する物質に結合した酵素を洗い流し、その酵素部分
によって切断されうるホスホノ基を有する1,2−ジオキ
セタン類（基質）を添加する。酵素はホスホノ基を切断
して1,2−ジオキセタン類を２つのケトンに分解する；
ケトンの１つに結合している発色団 は、こうして励起されて発光する。この発光はキュベッ
トまたはカメラルミノメーターなどを用いて、試料中に
検出される物質が存在することの指標として検出され
る。物質の濃度を求めるために発光強度を測定すること
ができる。
検出される物質が酵素である場合には、特異的親和性物
質（例えば抗体）は不必要である。その代わりに検出さ
れる酵素によって切断されうるホスホノ基を有する1,2
−ジオキセタン類（その酵素の基質）を使用する。そこ
で、酵素の検出法は、酵素含有試料への1,2−ジオキセ
タン類の添加、および酵素の存在と濃度の指標として得
られる発光の検出を含むものである。
質（例えば抗体）は不必要である。その代わりに検出さ
れる酵素によって切断されうるホスホノ基を有する1,2
−ジオキセタン類（その酵素の基質）を使用する。そこ
で、酵素の検出法は、酵素含有試料への1,2−ジオキセ
タン類の添加、および酵素の存在と濃度の指標として得
られる発光の検出を含むものである。
［実施例］ 以下に本発明を詳細に説明するために実施例を記載する
が、本発明は何らそれらに限定されず、その要旨を逸脱
しない範囲での修飾および変法を含む。
が、本発明は何らそれらに限定されず、その要旨を逸脱
しない範囲での修飾および変法を含む。
参考例１ ３−メトキシフェニルアダマント−２′−イルケトン マグネシウム削り屑（1.64g、0.067モル）をアルゴン雰
囲気下で火炎乾燥フラスコに入れた。ヨウ素の小さい結
晶および乾燥テトラヒドロフラン（THF）（水素化アル
ミニウムリチウム上で新たに蒸留したもの）7mlを加え
た。一定量（7ml、0.055モル）の３−ブロモアニソール
を注射器から穏やかに攪拌した金属懸濁液に加えた。50
℃で短時間加熱後発熱反応が始まった。フラスコを室温
の水浴に入れ、その間THF（33ml）を滴下ロートから細
流として添加した。発熱反応がおさまった後、この混合
物を45分間還流した。その還流しつつあるグリニャール
試薬へ、乾燥THF50ml中の２−シアノアダマンタン（8.7
g、0.054モル；“Organic Synthesis",57,8（Wiley,197
7）またはvan Leusen,A.M.ら、J.Org.Chem.,42,3114（1
977）を参照されたい）の溶液を1.5時間にわたって滴下
した。この反応混合物を還流温度で一晩加熱した後、黄
色の懸濁液を得た。フラスコとその内容物を氷浴中で冷
却している間に、エーテル（50ml）を加えた。濃塩酸
（8ml、0.096モルHCl）を激しく攪拌しながら20分間に
わたり滴下した。沈殿物をろ過により分離し、エーテル
で洗い、乾燥してケテンイミン塩29gを若干の残留マグ
ネシウムを含む淡黄色の非吸湿性粉末として得た。この
塩をエタノール90mlと濃塩酸90mlとの混合物中に懸濁
し、３時間還流した。その間に混合物はかなり薄くなっ
た。氷浴で冷却後、得られた固形物を砕き、ろ過により
分離し、中性になるまで洗浄し、乾燥して薄い灰色のケ
トン13.65g（２−シアノアダマンタンに基づいて収率93
％）を得た（融点111〜114℃）。薄層クロマトグラフィ
ー（TLC）はこの生成物がその後の操作によって十分な
純度であること示した（Rf0.45;K5F−CH2CL2:ヘキサン
＝50:50）。ヘキサンから再結晶してプリズム晶として
表題化合物を得た（融点113〜115℃）。IR（CH2Cl2）29
00cm-1、1670cm-1（Ｃ＝０）、1590cm-1、1575cm-1によ
り、生成物の構造が次式の通りであることを確認した。
囲気下で火炎乾燥フラスコに入れた。ヨウ素の小さい結
晶および乾燥テトラヒドロフラン（THF）（水素化アル
ミニウムリチウム上で新たに蒸留したもの）7mlを加え
た。一定量（7ml、0.055モル）の３−ブロモアニソール
を注射器から穏やかに攪拌した金属懸濁液に加えた。50
℃で短時間加熱後発熱反応が始まった。フラスコを室温
の水浴に入れ、その間THF（33ml）を滴下ロートから細
流として添加した。発熱反応がおさまった後、この混合
物を45分間還流した。その還流しつつあるグリニャール
試薬へ、乾燥THF50ml中の２−シアノアダマンタン（8.7
g、0.054モル；“Organic Synthesis",57,8（Wiley,197
7）またはvan Leusen,A.M.ら、J.Org.Chem.,42,3114（1
977）を参照されたい）の溶液を1.5時間にわたって滴下
した。この反応混合物を還流温度で一晩加熱した後、黄
色の懸濁液を得た。フラスコとその内容物を氷浴中で冷
却している間に、エーテル（50ml）を加えた。濃塩酸
（8ml、0.096モルHCl）を激しく攪拌しながら20分間に
わたり滴下した。沈殿物をろ過により分離し、エーテル
で洗い、乾燥してケテンイミン塩29gを若干の残留マグ
ネシウムを含む淡黄色の非吸湿性粉末として得た。この
塩をエタノール90mlと濃塩酸90mlとの混合物中に懸濁
し、３時間還流した。その間に混合物はかなり薄くなっ
た。氷浴で冷却後、得られた固形物を砕き、ろ過により
分離し、中性になるまで洗浄し、乾燥して薄い灰色のケ
トン13.65g（２−シアノアダマンタンに基づいて収率93
％）を得た（融点111〜114℃）。薄層クロマトグラフィ
ー（TLC）はこの生成物がその後の操作によって十分な
純度であること示した（Rf0.45;K5F−CH2CL2:ヘキサン
＝50:50）。ヘキサンから再結晶してプリズム晶として
表題化合物を得た（融点113〜115℃）。IR（CH2Cl2）29
00cm-1、1670cm-1（Ｃ＝０）、1590cm-1、1575cm-1によ
り、生成物の構造が次式の通りであることを確認した。
参考例２ メキシ（３−メトキシフェニル）メチレンアダマンタン 参考例１に従って製造した一定量（11.3g、0.042モル）
の３−メトキシフェニルアダマント−２−イルケトンを
モレキュラーシーブ乾燥（３Å）ジメチルスルホキシド
（DMSO）90mlに懸濁した。懸濁固体を溶解するために加
熱した。攪拌しがら室温へ冷却すると、微細な懸濁液が
得られた。カリウムｔ−ブトキシ（8.5g、0.070モル）
をアルゴン雰囲気下に加えた。５分後、ほとんど均質な
橙色の溶液が得られ、これを50℃の水浴に入れた。硫酸
ジメチル（4ml、0.042モル）を注射器から10分間にわた
って滴下した。さらに15分攪拌した後、追加の硫酸ジメ
チル（3.3ml、0.034モル）を同じやり方で加えた後、無
色の溶液を室温で一晩攪拌した。氷浴で冷却後、K2CO3
0.5gおよび氷浴125mlを加え、この混合物を50mlずつ
の酢酸エチルで３回抽出した。合わせた有機画分を水で
３回、飽和NaCl水溶液50mlで１回洗い、K2CO3上で乾燥
した。溶媒を真空除去して油状物を得た。その油状物を
ヘキサンに溶かし、得られた溶液をセライトを通してろ
過し、真空濃縮して粘稠性のある淡黄色の油状物11.5g
（収率96％）を得た。TLCは微量のケトンの出発物質を
含むエノールエーテル（Rf0.68;E.Merck Al2O3−CH2C
l2:ヘキサン＝50:50）へのきれいな転化を示していた。
IR（CH2Cl2）:2900cm-1、1600cm-1、1590cm-1、1580cm
-1、1570cm-1、1095cm-1、1080cm-1;1H NMR（CDCl3）：
δ1.5−２（m,12H）、2.55（s,1H）、3.2（s,1H）、3.2
5（s,3H）、3.75（s,3H）、および6.7−7.3（m,4H）。
これらのデータにより、この生成物の構造が次式の通り
であることを確認した。
の３−メトキシフェニルアダマント−２−イルケトンを
モレキュラーシーブ乾燥（３Å）ジメチルスルホキシド
（DMSO）90mlに懸濁した。懸濁固体を溶解するために加
熱した。攪拌しがら室温へ冷却すると、微細な懸濁液が
得られた。カリウムｔ−ブトキシ（8.5g、0.070モル）
をアルゴン雰囲気下に加えた。５分後、ほとんど均質な
橙色の溶液が得られ、これを50℃の水浴に入れた。硫酸
ジメチル（4ml、0.042モル）を注射器から10分間にわた
って滴下した。さらに15分攪拌した後、追加の硫酸ジメ
チル（3.3ml、0.034モル）を同じやり方で加えた後、無
色の溶液を室温で一晩攪拌した。氷浴で冷却後、K2CO3
0.5gおよび氷浴125mlを加え、この混合物を50mlずつ
の酢酸エチルで３回抽出した。合わせた有機画分を水で
３回、飽和NaCl水溶液50mlで１回洗い、K2CO3上で乾燥
した。溶媒を真空除去して油状物を得た。その油状物を
ヘキサンに溶かし、得られた溶液をセライトを通してろ
過し、真空濃縮して粘稠性のある淡黄色の油状物11.5g
（収率96％）を得た。TLCは微量のケトンの出発物質を
含むエノールエーテル（Rf0.68;E.Merck Al2O3−CH2C
l2:ヘキサン＝50:50）へのきれいな転化を示していた。
IR（CH2Cl2）:2900cm-1、1600cm-1、1590cm-1、1580cm
-1、1570cm-1、1095cm-1、1080cm-1;1H NMR（CDCl3）：
δ1.5−２（m,12H）、2.55（s,1H）、3.2（s,1H）、3.2
5（s,3H）、3.75（s,3H）、および6.7−7.3（m,4H）。
これらのデータにより、この生成物の構造が次式の通り
であることを確認した。
参考例３ メトキシ（３−ヒドロキシフェニル）メチレンアダマン
タン モレキュラーシーブ乾燥（３Å）ジメチルホルホアミド
（DMF）70ml中の、参考例２に従って製造したメトキシ
（３−メトキシフェニル）メチレンアダマンタン（14
g、0.049モル）の溶液を、アルゴン雰囲気下で同じ溶媒
中のナトリウムチオエトキシド（7.4g、0.88モル）の溶
液に加えた。この混合物を３時間還流した。攪拌しなが
ら氷浴で冷却後、この反応を水200ml中のNH4Cl 62gで停
止させた。酢酸エチル（120ml）および少量の氷水を加
えた。水層を分離し、酢酸エチル75mlで抽出した。有機
抽出物を100mlずつの水で４回、次に飽和NaCl（100ml）
で洗い、すばやくNa2SO4上で乾燥した。この溶液をろ過
し、濃縮して油状物を得、それをヘキサン50mlで摩砕し
た。回転蒸発器で溶媒を除去すると固体が残り、それを
冷ヘキサンで細かくすりつぶし、ろ過し、ヘキサンで洗
った。粗製の灰白色フェノール系生成物（13g）は、５
％MeOH−CH3CNから再結晶して無色プリズム状結晶10gを
得た（融点131〜133℃）。IR（CH2Cl2）:3580cm-1、332
0cm-1、2910cm-1、1590cm-1、1580cm-1、1440cm-1によ
り、生成物の構造が次式の通りであることを確認した。
タン モレキュラーシーブ乾燥（３Å）ジメチルホルホアミド
（DMF）70ml中の、参考例２に従って製造したメトキシ
（３−メトキシフェニル）メチレンアダマンタン（14
g、0.049モル）の溶液を、アルゴン雰囲気下で同じ溶媒
中のナトリウムチオエトキシド（7.4g、0.88モル）の溶
液に加えた。この混合物を３時間還流した。攪拌しなが
ら氷浴で冷却後、この反応を水200ml中のNH4Cl 62gで停
止させた。酢酸エチル（120ml）および少量の氷水を加
えた。水層を分離し、酢酸エチル75mlで抽出した。有機
抽出物を100mlずつの水で４回、次に飽和NaCl（100ml）
で洗い、すばやくNa2SO4上で乾燥した。この溶液をろ過
し、濃縮して油状物を得、それをヘキサン50mlで摩砕し
た。回転蒸発器で溶媒を除去すると固体が残り、それを
冷ヘキサンで細かくすりつぶし、ろ過し、ヘキサンで洗
った。粗製の灰白色フェノール系生成物（13g）は、５
％MeOH−CH3CNから再結晶して無色プリズム状結晶10gを
得た（融点131〜133℃）。IR（CH2Cl2）:3580cm-1、332
0cm-1、2910cm-1、1590cm-1、1580cm-1、1440cm-1によ
り、生成物の構造が次式の通りであることを確認した。
参考例４ アンモニウムナトリウム・３−（アダマンチリデンメト
キシメチル）フェニルホスフェート 参考例３に従って製造したメトキシ（３−ヒドロキシフ
ェニル）メチレンアダマンタン（1.1g、0.004モル）
を、アルゴン雰囲気下でモレキュラーシーブ乾燥（３
Å）ベンエン15mlに溶解した。トリエチルアミン（0.57
ml、0.004モル）を注射器から加えた。この攪拌溶液を
氷浴で０℃に冷却し、２−クロロ−２−オキソ−1,3−
ジオキサホスホラン（0.37ml、0.004モル）を滴下し
た。氷浴中で10分後、粘稠な混合物を室温へ徐々に温
め、3.5時間攪拌した。ベンゼンを真空除去し、アルゴ
ン下でエーテル60mlを加えた。この懸濁液を不活性雰囲
気下でろ過し、得られた固形物を20mlずつのエーテルで
３回洗った。ろ液を真空除去してリン酸トリエステル1.
6gを粘稠な無色の油状物として得た。IR（CH2Cl2）:290
0cm-1、1600cm-1、1575cm-1、1300cm-1（Ｐ＝０）。フ
ェノール性OHの伸縮またはＣ＝０（1670cm-1）の吸収は
IRスペクトルに存在しなかった。TLCで出発物質のない
ことを確認した。これらのデータは３−（アダマンチリ
デンメトキシメチル）フェニルメチレンホスフェートの
下記構造と一致した。
キシメチル）フェニルホスフェート 参考例３に従って製造したメトキシ（３−ヒドロキシフ
ェニル）メチレンアダマンタン（1.1g、0.004モル）
を、アルゴン雰囲気下でモレキュラーシーブ乾燥（３
Å）ベンエン15mlに溶解した。トリエチルアミン（0.57
ml、0.004モル）を注射器から加えた。この攪拌溶液を
氷浴で０℃に冷却し、２−クロロ−２−オキソ−1,3−
ジオキサホスホラン（0.37ml、0.004モル）を滴下し
た。氷浴中で10分後、粘稠な混合物を室温へ徐々に温
め、3.5時間攪拌した。ベンゼンを真空除去し、アルゴ
ン下でエーテル60mlを加えた。この懸濁液を不活性雰囲
気下でろ過し、得られた固形物を20mlずつのエーテルで
３回洗った。ろ液を真空除去してリン酸トリエステル1.
6gを粘稠な無色の油状物として得た。IR（CH2Cl2）:290
0cm-1、1600cm-1、1575cm-1、1300cm-1（Ｐ＝０）。フ
ェノール性OHの伸縮またはＣ＝０（1670cm-1）の吸収は
IRスペクトルに存在しなかった。TLCで出発物質のない
ことを確認した。これらのデータは３−（アダマンチリ
デンメトキシメチル）フェニルメチレンホスフェートの
下記構造と一致した。
上記の油状物をDMF7mlに溶解し、DMF中のシアン化ナト
リウム（0.21g、0.004モル）を加え、この混合物を室温
で24時間攪拌した。得られた黄色の溶液を50℃で真空除
去し、2mlずつのキシレンで数回追い出し、残留物をエ
ーテルで摩砕してガムを得、そのガムをCH2Cl2に取り、
真空除去して淡黄色の非晶質発泡体1.5gを得た。IR（CH
2Cl2）:2240cm-1（弱い、CN）、1595cm-1、1570cm-1、1
475cm-1、1275cm-1（Ｐ＝０）、1235cm-1、1100cm-1。
これらのデータはナトリウム３−（アダマンチリデンメ
トキシメチル）フェニル−２′−シアノエチルホスフェ
ートの予測された下記構造と一致した。
リウム（0.21g、0.004モル）を加え、この混合物を室温
で24時間攪拌した。得られた黄色の溶液を50℃で真空除
去し、2mlずつのキシレンで数回追い出し、残留物をエ
ーテルで摩砕してガムを得、そのガムをCH2Cl2に取り、
真空除去して淡黄色の非晶質発泡体1.5gを得た。IR（CH
2Cl2）:2240cm-1（弱い、CN）、1595cm-1、1570cm-1、1
475cm-1、1275cm-1（Ｐ＝０）、1235cm-1、1100cm-1。
これらのデータはナトリウム３−（アダマンチリデンメ
トキシメチル）フェニル−２′−シアノエチルホスフェ
ートの予測された下記構造と一致した。
この塩（1.5g、0.0035モル）を水5mlに溶解した。次い
で、濃水酸化アンモニウム5mlを滴下した。この溶液を
室温で一晩攪拌した。得られた白色スラリーを氷浴中で
冷却し、アセトニトリル30mlで処理した。ろ過し、15ml
ずつの冷アセトニトリルで２回洗浄して、短時間の減圧
乾燥後に吸湿性の白色固体（115℃で焼結し、130〜133
℃で融解する）0.95gを得た。HPLC（逆相C18−0.1％酢
酸アンモニウム/CH3CN勾配）は１つの主要なピークを示
した。IR（ヌジョール）:1595cm-1、1575cm-1、1245cm
-1、1200cm-1、1095cm-1、1080cm-1、890cm-1。UV（20
％MeOH−ジオキサン）λmax260/nm;ε＝10,000。これら
のデータにより生成物の構造が次式の通りであることを
確認した。
で、濃水酸化アンモニウム5mlを滴下した。この溶液を
室温で一晩攪拌した。得られた白色スラリーを氷浴中で
冷却し、アセトニトリル30mlで処理した。ろ過し、15ml
ずつの冷アセトニトリルで２回洗浄して、短時間の減圧
乾燥後に吸湿性の白色固体（115℃で焼結し、130〜133
℃で融解する）0.95gを得た。HPLC（逆相C18−0.1％酢
酸アンモニウム/CH3CN勾配）は１つの主要なピークを示
した。IR（ヌジョール）:1595cm-1、1575cm-1、1245cm
-1、1200cm-1、1095cm-1、1080cm-1、890cm-1。UV（20
％MeOH−ジオキサン）λmax260/nm;ε＝10,000。これら
のデータにより生成物の構造が次式の通りであることを
確認した。
参考例５ ３−（２′−スピロ−アダマンタン）−４−メトキシ−
４−（３″−ホスホリルオキシ）フェニル−1,2−ジオ
キセタン・ナトリウムアンモニウム塩 大きい培養試験管中で、参考例４に従って製造したエタ
ノールエーテルホスフェート塩0.065g（0.00017モル）
をCHCl325mlに溶解した。シリカゲル上のメチレンブル
ー（シリカゲル1g当たり染料0.0026g）0.210gを増感剤
として加えた。試験管は水冷した浸漬ウェルの内部に25
0ワットの高圧ナトリウムランプを含む銀めっきしたデ
ュワーフラスコに入れた。一枚の５ミルカプトン（Kapt
on;DuPont社）をUVフィルターとしてウェルの内部に置
いた。この装置に氷水をポンプで送り、試料の温度を15
0℃以上に保った。乾燥酸素の連続流を毛細管を通して
反応容器に送った。気体流は固相増感剤の均一懸濁液を
維持するように調節した。25分の照射時間後、出発物質
のUV（260nm）吸収が消失した。淡黄色溶液をろ過し、
蒸発させ、水10mlで再調製した。この水性試料は0.45ミ
クロンのナイロンフィルターを通してろ過し、逆相C18
分離用HPLCカラムでクロマトグラフにかけ、水／アセト
ニトリル勾配で溶出した。277nmで弱いUV吸収を示す各
画分を合わせ、凍結乾燥してジオキセタンを白色の綿状
吸湿性固体として得た。この固体は融点を示さずに145
゜〜150℃で分解してアダマンタノンを生成して昇華
し、部分的に分解して残留した固体は270℃以下では融
解しない。1H NMR（D2O,ppm）:0.89−1.85（m,12H）、
2.10（s,1H）、3.15（s,3H）、4.65（s,HOD−NH4 +）、
7.10−7.36（m,4H）。I.R（ヌジョール、cm-1）:3120、
1970−1790（弱い、幅広−NH4＋）、1640（幅広）、160
0（弱い）、1580、1284、1273、1122、980、895。この
生成物の構造は上記IRおよびNMRスペクトルにより次式
の通りであると確認した。
４−（３″−ホスホリルオキシ）フェニル−1,2−ジオ
キセタン・ナトリウムアンモニウム塩 大きい培養試験管中で、参考例４に従って製造したエタ
ノールエーテルホスフェート塩0.065g（0.00017モル）
をCHCl325mlに溶解した。シリカゲル上のメチレンブル
ー（シリカゲル1g当たり染料0.0026g）0.210gを増感剤
として加えた。試験管は水冷した浸漬ウェルの内部に25
0ワットの高圧ナトリウムランプを含む銀めっきしたデ
ュワーフラスコに入れた。一枚の５ミルカプトン（Kapt
on;DuPont社）をUVフィルターとしてウェルの内部に置
いた。この装置に氷水をポンプで送り、試料の温度を15
0℃以上に保った。乾燥酸素の連続流を毛細管を通して
反応容器に送った。気体流は固相増感剤の均一懸濁液を
維持するように調節した。25分の照射時間後、出発物質
のUV（260nm）吸収が消失した。淡黄色溶液をろ過し、
蒸発させ、水10mlで再調製した。この水性試料は0.45ミ
クロンのナイロンフィルターを通してろ過し、逆相C18
分離用HPLCカラムでクロマトグラフにかけ、水／アセト
ニトリル勾配で溶出した。277nmで弱いUV吸収を示す各
画分を合わせ、凍結乾燥してジオキセタンを白色の綿状
吸湿性固体として得た。この固体は融点を示さずに145
゜〜150℃で分解してアダマンタノンを生成して昇華
し、部分的に分解して残留した固体は270℃以下では融
解しない。1H NMR（D2O,ppm）:0.89−1.85（m,12H）、
2.10（s,1H）、3.15（s,3H）、4.65（s,HOD−NH4 +）、
7.10−7.36（m,4H）。I.R（ヌジョール、cm-1）:3120、
1970−1790（弱い、幅広−NH4＋）、1640（幅広）、160
0（弱い）、1580、1284、1273、1122、980、895。この
生成物の構造は上記IRおよびNMRスペクトルにより次式
の通りであると確認した。
参考例６ ３−（２′−スピロ−アダマンタン）−４−メトキシ−
４−（３″−ホスホリルオキシ）フェニル−1,2−ジオ
キセタン・ジナトリウム塩 メトキシ（３−ホスホリルオキシフェニル）メチレンア
ダマンタン・ナトリウムアンモニウム塩（3.3g）を１滴
のピリジンを含有する15mlの水に溶解させた。この溶液
（該化合物をピリジニウム塩の形で含む）をアンバーラ
イトIR120（プラス）イオン交換樹脂（アルドリッチケ
ミカル社製）の3cm×25cmのカラムにゆっくり通した。
蒸留水でこのカラムを溶出すると、260nmに吸収を示す
フラクションが得られ、これらをいっしょにして凍結乾
燥した。得られたモノピリジニウム塩（1g、2.3ミリモ
ル）の１部を100mlのCHCl3（Al2O3で乾燥）に溶解し
た。得られた溶液を大きなシリンダー状の試験管に入
れ、5,10,15,20−テトラフェニル−21H,23H−ポルフィ
ン（2mg、1ml、CHCl3中）で処理した。得られた均一な
緑色の溶液を０℃に冷却し、スパージャー管を通して酸
素ガスで前以って飽和した。この混合物を銀デュワーフ
ラスコ中で一定のO2流下に照射した。このフラスコはデ
ュポンのカプトン（Kapton）ポリイミドフィルムの単一
シート（５ミル）でろ光された250ワットナトリウム蒸
気ランプの周りを囲む冷却された侵漬壁をも含んでい
る。デュワーフラスコ中の温度は、12分間の照射の間０
゜〜５℃に維持された。溶媒を真空で除去し、続いて50
0mgのNaHCO3を含有する100mlの蒸留水を添加した。得ら
れた淡いピンク色の溶液を冷却し、0.45ミクロンのテフ
ロン膜を通してろ過した。得られたジオキセタンの水溶
液を、ポリスチレンカラム中CH3CN−0.5％NaHCO3勾配を
使用した調製用逆相HPLCに付した。続いて２回目は、CH
3CN−H2O勾配を使用してカラムに通した。得られた溶液
（無機塩を含まない）を凍結乾燥して800mgの粒状のか
すかに黄色がかった白色固体を得た。この固体は融点を
示さずに145゜〜150℃で分解してアダマンタノンを生成
して昇華し、部分的に分解して残留した固体は270℃以
下では溶解しない。1H NMR（D2O）：δ0.85−1.75（m,1
2H）、2.15（s,1H）、2.75（s,1H）、3.10（s,3H）、7.
10−7.35（m,4H）。IR（ヌジョール）:1600cm-1（弱
い）、1580cm-1、1285cm-1、1275cm-1、1120cm-1（幅
広）、980cm-1、895cm-1。
４−（３″−ホスホリルオキシ）フェニル−1,2−ジオ
キセタン・ジナトリウム塩 メトキシ（３−ホスホリルオキシフェニル）メチレンア
ダマンタン・ナトリウムアンモニウム塩（3.3g）を１滴
のピリジンを含有する15mlの水に溶解させた。この溶液
（該化合物をピリジニウム塩の形で含む）をアンバーラ
イトIR120（プラス）イオン交換樹脂（アルドリッチケ
ミカル社製）の3cm×25cmのカラムにゆっくり通した。
蒸留水でこのカラムを溶出すると、260nmに吸収を示す
フラクションが得られ、これらをいっしょにして凍結乾
燥した。得られたモノピリジニウム塩（1g、2.3ミリモ
ル）の１部を100mlのCHCl3（Al2O3で乾燥）に溶解し
た。得られた溶液を大きなシリンダー状の試験管に入
れ、5,10,15,20−テトラフェニル−21H,23H−ポルフィ
ン（2mg、1ml、CHCl3中）で処理した。得られた均一な
緑色の溶液を０℃に冷却し、スパージャー管を通して酸
素ガスで前以って飽和した。この混合物を銀デュワーフ
ラスコ中で一定のO2流下に照射した。このフラスコはデ
ュポンのカプトン（Kapton）ポリイミドフィルムの単一
シート（５ミル）でろ光された250ワットナトリウム蒸
気ランプの周りを囲む冷却された侵漬壁をも含んでい
る。デュワーフラスコ中の温度は、12分間の照射の間０
゜〜５℃に維持された。溶媒を真空で除去し、続いて50
0mgのNaHCO3を含有する100mlの蒸留水を添加した。得ら
れた淡いピンク色の溶液を冷却し、0.45ミクロンのテフ
ロン膜を通してろ過した。得られたジオキセタンの水溶
液を、ポリスチレンカラム中CH3CN−0.5％NaHCO3勾配を
使用した調製用逆相HPLCに付した。続いて２回目は、CH
3CN−H2O勾配を使用してカラムに通した。得られた溶液
（無機塩を含まない）を凍結乾燥して800mgの粒状のか
すかに黄色がかった白色固体を得た。この固体は融点を
示さずに145゜〜150℃で分解してアダマンタノンを生成
して昇華し、部分的に分解して残留した固体は270℃以
下では溶解しない。1H NMR（D2O）：δ0.85−1.75（m,1
2H）、2.15（s,1H）、2.75（s,1H）、3.10（s,3H）、7.
10−7.35（m,4H）。IR（ヌジョール）:1600cm-1（弱
い）、1580cm-1、1285cm-1、1275cm-1、1120cm-1（幅
広）、980cm-1、895cm-1。
実施例１ ビーズ形式hCG検定（血清または尿） 抗hCG抗体被覆ビーズおよび抗hCG抗体：アルカリ性ホス
ファターゼコンジュゲートはハイブリテク・タンデム・
アッセイ・キット（Hybritech Tandem Assay Kit）から
得られた。
ファターゼコンジュゲートはハイブリテク・タンデム・
アッセイ・キット（Hybritech Tandem Assay Kit）から
得られた。
以下に参考例６で合成したAMPPDを、アルカリホスファ
ターゼの基質として用いた場合のhCGの検定を示した。
比較のため、ｐ−ニトロフェニルリン酸を基質として比
色定量検定した。
ターゼの基質として用いた場合のhCGの検定を示した。
比較のため、ｐ−ニトロフェニルリン酸を基質として比
色定量検定した。
1. ビーズから過剰の緩衝液を吸い取った後、各試験管
（12×75mm）に１個のビーズを入れた。
（12×75mm）に１個のビーズを入れた。
2. 各試験管に抗hCG抗体ホスファターゼコンジュゲー
ト100μを加えた。
ト100μを加えた。
3. 各試験管に試料100μを加えた。別の試験管に以
下のものを準備した。
下のものを準備した。
ａ）対照ゼロ試料（男性の血清または尿） ｂ）25mIU/ml hCG標品（血清または尿） ｃ）200mIU/ml hCG標品（血清または尿） ｄ）患者試料（血清または尿） 4. 混合後、試験管にカバーをかぶせて37℃で90分間イ
ンキュベートした。
ンキュベートした。
5. コンジュゲートおよび試料を含む反応液を吸引除去
した。
した。
6. ビーズを0.1％ツィーン20を含むリン酸緩衝溶液（p
H7.4）2.0mlで３回洗った。
H7.4）2.0mlで３回洗った。
12. 両検定のデータはhCGの各濃度でのシグナルをゼロ
hCGでのシグナルで割った値をhCGの濃度に対してプロッ
トした。代表的なデータを第１図に示す。ここでPNPPは
比色定量検定を、そしてAMPPDは化学発光検定表す。化
学発光検定は比色定量検定よりも４倍以上高感度であっ
た。
hCGでのシグナルで割った値をhCGの濃度に対してプロッ
トした。代表的なデータを第１図に示す。ここでPNPPは
比色定量検定を、そしてAMPPDは化学発光検定表す。化
学発光検定は比色定量検定よりも４倍以上高感度であっ
た。
実施例２ タンデムICON II hCGの検定（フィルム露光による） 市販のタンデムICON II検定キットを使用した。緩衝液
および抗体はすべてこのキットの中に含まれているもの
を使用し、アルカリホスファターゼの基質は参考例６で
合成したAMPPDを使用した。
および抗体はすべてこのキットの中に含まれているもの
を使用し、アルカリホスファターゼの基質は参考例６で
合成したAMPPDを使用した。
方 法 1. 被検試料として使用するために、対照陰性（雄）尿
で希釈した0,5,10,50mIU/mlのhCG標品を用意した。
で希釈した0,5,10,50mIU/mlのhCG標品を用意した。
2. ICONメンブラン容器の中央に、１度５滴の試料を滴
下した。
下した。
3. 各容器の中央に３滴の酵素抗体コンジュゲートを加
えた。
えた。
4. １分インキュベートした。
5. 装置にハイブリテクICON洗液2mlを加え、排出させ
た。
た。
6. 0.1Mトリス、1mM MgCl2（pH9.8）中の0.1％BSA500
μを加えた。排出させた。
μを加えた。排出させた。
7. 50μ/ml AMPPD、0.1％BSA、1mM MgCl2を含む0.
1Mトリス緩衝液（pH9.8）、200μを加えた。
1Mトリス緩衝液（pH9.8）、200μを加えた。
8. ICON膜をとり出し１枚のマイラーに移行させ、フィ
ルムを露光すべく暗箱に入れた（ポラロイド型612）。
ルムを露光すべく暗箱に入れた（ポラロイド型612）。
9. フィルムを30秒間露光した。代表的な検定の結果を
第２図に示す。陽性試料では強い化学発光が30秒の反応
時間内に起こった。
第２図に示す。陽性試料では強い化学発光が30秒の反応
時間内に起こった。
実施例３ アルカリ性ホスファターゼの検定 アルカリ性ホスファターゼ検定は次の方法で実施した。
成 分 緩衝液:0.05M炭酸塩、1mM MgCl2（pH9.5） 基質:0.4mM濃度のAMPPD アルカリ性ホスファターゼ：緩衝液中1.168μ/mlのア
ルカリ性ホスファターゼ原液の段階的希釈は試験管内で
次の最終酵素濃度となるように行った： 4.17×10-11M 1.67×10-15M 8.34×10-12M 8.34×10-16M 1.67×10-12M 4.17×10-16M 3.34×10-13M 2.09×10-16M 6.68×10-14M 1.34×10-14M 3.34×10-15M 手 順： 上記濃度のアルカリ性ホスファターゼを含みさらに0.4m
M AMPPDを含む２通りの試験管は30℃で20分インキュベ
ートした。インキュベーション後、ターナー20Eルミノ
メーターで30秒間の発光積分量を測定した。アルカリ性
ホスファターゼの検出限界を表IIに示す。第３図には、
0.4mM AMPPDを用いたアルカリ性ホスファターゼの検出
データを示す。発光は10-14〜10-11M酵素の間で直鎖状
であった。
ルカリ性ホスファターゼ原液の段階的希釈は試験管内で
次の最終酵素濃度となるように行った： 4.17×10-11M 1.67×10-15M 8.34×10-12M 8.34×10-16M 1.67×10-12M 4.17×10-16M 3.34×10-13M 2.09×10-16M 6.68×10-14M 1.34×10-14M 3.34×10-15M 手 順： 上記濃度のアルカリ性ホスファターゼを含みさらに0.4m
M AMPPDを含む２通りの試験管は30℃で20分インキュベ
ートした。インキュベーション後、ターナー20Eルミノ
メーターで30秒間の発光積分量を測定した。アルカリ性
ホスファターゼの検出限界を表IIに示す。第３図には、
0.4mM AMPPDを用いたアルカリ性ホスファターゼの検出
データを示す。発光は10-14〜10-11M酵素の間で直鎖状
であった。
1. 緩衝液:0.05M炭酸塩、1mM MgCl2、pH＝9.5。温度:
30℃。化学発光化合物濃度:0.4mM。
30℃。化学発光化合物濃度:0.4mM。
2.かっこ内の数字は表示濃度でのバックグランドレベル
の倍数である。
の倍数である。
実施例４ ウシ血清アルブミンおよび／またはフルオレセインの存
在下でのアルカリ性ホスファターゼ検定アルカリ性ホス
ファターゼ検定は次の方法で実施した。
在下でのアルカリ性ホスファターゼ検定アルカリ性ホス
ファターゼ検定は次の方法で実施した。
成 分 緩衝液:0.05M炭酸ナトリウム、1mM MgCl2（pH9.5） 基質:0.4mM濃度のAMPPD アルカリ性ホスファターゼ：緩衝液中1.168μ/mlの原
液。
液。
条 件： 1.緩衝液のみ（対照） 2.緩衝液＋ウシ血清アルブミン（BSA） 3.緩衝液＋BSA−フルオレセイン（BSA対フルオレセイン
の比1:3） 4.緩衝液＋ポリ［（ビニルベンジル）（ベンジル）（ジ
メチル）−アンモニウムクロライド］（BDMQ） 5.緩衝液＋BDMQ＋フルオレセイン（BDMQ1mlと混合した
フルオレセインジナトリウム塩0.01mg） アルカリ性ホスファターゼ原液の段階的希釈は試験管中
で次の最終酵素濃度となるように行った： ここで条件２〜５のエンハンサー成分（緩衝液以外の成
分）は系全体の0.1重量％存在する。
の比1:3） 4.緩衝液＋ポリ［（ビニルベンジル）（ベンジル）（ジ
メチル）−アンモニウムクロライド］（BDMQ） 5.緩衝液＋BDMQ＋フルオレセイン（BDMQ1mlと混合した
フルオレセインジナトリウム塩0.01mg） アルカリ性ホスファターゼ原液の段階的希釈は試験管中
で次の最終酵素濃度となるように行った： ここで条件２〜５のエンハンサー成分（緩衝液以外の成
分）は系全体の0.1重量％存在する。
ポリ［（ビニルベンジル）（トリメチル）−アンモニウ
ムクロライド］も上記条件４のエンハンサー成分と同等
の作用を有する。
ムクロライド］も上記条件４のエンハンサー成分と同等
の作用を有する。
4.17×10-11M 1.67×10-15M 8.34×10-12M 8.34×10-16M 1.67×10-12M 4.17×10-16M 3.34×10-13M 2.09×10-16M 6.68×10-14M 1.0×10-16M 1.34×10-14M 5.0×10-17M 3.34×10-15M 2.5×10-17M 手 順： いろいろな条件において、上記各種濃度のアルカリ性ホ
スファターゼに0.4mM AMPPDを加えた２通りの試験管を
30℃でインキュベートした。条件１、４および５は20分
インキュベートし、条件２および３は90分インキュベー
トした。
スファターゼに0.4mM AMPPDを加えた２通りの試験管を
30℃でインキュベートした。条件１、４および５は20分
インキュベートし、条件２および３は90分インキュベー
トした。
インキュベーション後、ターナー20Eルミノメーターで3
0秒間の発光積分量を測定した。アルカリ性ホスファタ
ーゼの検出限界に対するBSA、BDMQおよびフルオレセイ
ンの効果を第４図および表IIIに示す。第４図中−□−
は上記条件１、−−■−−は条件２、−−○−−は条件
３、−−●−−は条件４、−−△−−は条件５を各々示
す。
0秒間の発光積分量を測定した。アルカリ性ホスファタ
ーゼの検出限界に対するBSA、BDMQおよびフルオレセイ
ンの効果を第４図および表IIIに示す。第４図中−□−
は上記条件１、−−■−−は条件２、−−○−−は条件
３、−−●−−は条件４、−−△−−は条件５を各々示
す。
1.かっこ内の数字は表示濃度でのバックグランドレベル
の倍数である。
の倍数である。
実施例５ HSVI DNAプローブ検定 物質および緩衝液： 膜：ジーン・スクリーン・プラス社（Gene Screen Plu
s）の陽性荷電したナイロン膜 緩衝液：変性緩衝液:0.5M NaOH 中和緩衝液:0.4M NaH2PO4（pH2.0） 負荷緩衝液：変性緩衝液 １部 中和緩衝液 １部 膜湿潤緩衝液:0.4Mトリス（pH7.5） 膜プレハイブリダイゼーション緩衝液： 最終濃度 0.5ml 100×Denhardt′ｓ溶液 ５％ 0.5ml 10％SDS 0.5％ 2.5ml 20×SSPE ５％ 2.0mg 変性、超音波処理サケ精子DNA 200μg/mlddH2O 10ml 膜ハイブリダイゼーション緩衝液： 最終濃度 0.5ml 100×Denhardt′ｓ溶液 ５％ 0.5ml 10％SDS 0.5％ 2.5ml 20×SSPE ５％ 2.0mg サケ精子DNA 200μg/ml 2.0ml 50％硫酸デキストラン 10％ ddH2O 10ml 洗浄緩衝液I: １×SSPE/0.1％ SDS 20ml 20×SSPE 4ml 10％ SDS376ml ddH2O 400ml 洗浄緩衝液II:洗浄温度に予備加温した0.1×SSPE/0.1％
SDS 2ml 20×SSPE 4ml 10％ SDS394ml ddH2O 400ml（加温） 洗浄緩衝液III: 0.1×SSPE/0.1％ SDS 20ml 20×SSPE 4ml 10％ SDS376ml ddH2O 400ml 洗浄緩衝液III: 0.1×SSPE/0.1％ SDS 20ml 20×SSPE 4ml 10％ SDS376ml ddH2O 400ml 洗浄緩衝液IV: 3mM トリス−HCl（pH9.5） 0.6ml 1Mトリズマ塩基（Trizma Base）199.4ml ddH2O 200.0ml 100×Denhardt′ｓ溶液： 分子量40Kのポリビニルピロリドン（PVP−40）2gおよび
フィコール2gを65℃以上の沸点以下の温度で溶解した。
この溶液を約40℃に冷却し、BSA2gを加え、ddH2Oで最終
容量を100mlとした。アリコートに分けて、−20℃で貯
蔵した。
s）の陽性荷電したナイロン膜 緩衝液：変性緩衝液:0.5M NaOH 中和緩衝液:0.4M NaH2PO4（pH2.0） 負荷緩衝液：変性緩衝液 １部 中和緩衝液 １部 膜湿潤緩衝液:0.4Mトリス（pH7.5） 膜プレハイブリダイゼーション緩衝液： 最終濃度 0.5ml 100×Denhardt′ｓ溶液 ５％ 0.5ml 10％SDS 0.5％ 2.5ml 20×SSPE ５％ 2.0mg 変性、超音波処理サケ精子DNA 200μg/mlddH2O 10ml 膜ハイブリダイゼーション緩衝液： 最終濃度 0.5ml 100×Denhardt′ｓ溶液 ５％ 0.5ml 10％SDS 0.5％ 2.5ml 20×SSPE ５％ 2.0mg サケ精子DNA 200μg/ml 2.0ml 50％硫酸デキストラン 10％ ddH2O 10ml 洗浄緩衝液I: １×SSPE/0.1％ SDS 20ml 20×SSPE 4ml 10％ SDS376ml ddH2O 400ml 洗浄緩衝液II:洗浄温度に予備加温した0.1×SSPE/0.1％
SDS 2ml 20×SSPE 4ml 10％ SDS394ml ddH2O 400ml（加温） 洗浄緩衝液III: 0.1×SSPE/0.1％ SDS 20ml 20×SSPE 4ml 10％ SDS376ml ddH2O 400ml 洗浄緩衝液III: 0.1×SSPE/0.1％ SDS 20ml 20×SSPE 4ml 10％ SDS376ml ddH2O 400ml 洗浄緩衝液IV: 3mM トリス−HCl（pH9.5） 0.6ml 1Mトリズマ塩基（Trizma Base）199.4ml ddH2O 200.0ml 100×Denhardt′ｓ溶液： 分子量40Kのポリビニルピロリドン（PVP−40）2gおよび
フィコール2gを65℃以上の沸点以下の温度で溶解した。
この溶液を約40℃に冷却し、BSA2gを加え、ddH2Oで最終
容量を100mlとした。アリコートに分けて、−20℃で貯
蔵した。
20×SSC 20×SSC（全量100ml） 3.0M塩化ナトリウム 17.4g 0.3Mクエン酸ナトリウム 8.8g 容量を100mlとして、0.45μｍニトロセルロースフィル
ターを通してろ過し、室温で貯蔵した。
ターを通してろ過し、室温で貯蔵した。
20×SSPE 20×SSPE（pH7.4）（全長１） 3.6M NaCl 210.24g 200mMリン酸ナトリウム 23g二塩基性 5.92g一塩基性 20mM EDTA 7.44g 溶解し、5N NaOHでpH7.4に調整し、容量を１とし、0.
45μｍニトロセルロースフィルターを通してろ過した。
45μｍニトロセルロースフィルターを通してろ過した。
１×TE １×TE緩衝液 10mMトリス（pH7.0） 1mM EDTA オートクレーブ処理 方 法： 1. 膜を湿潤緩衝液で15分間前もって湿らせた。
2. 膜を真空マニホールド装置に挿入した。
3. DNA試料（既知コピー数のHSVI DNAを含む）50μ
を変性緩衝液200μに加えることによりDNA試料を変性
した。室温で10分インキュベートした。氷冷した中和緩
衝液250μを加え、変性DNAを氷上に保持した。
を変性緩衝液200μに加えることによりDNA試料を変性
した。室温で10分インキュベートした。氷冷した中和緩
衝液250μを加え、変性DNAを氷上に保持した。
4. 各ウェルに負荷緩衝液200μを加え、膜を通して
吸引した。
吸引した。
5. 各ウェルに変性DNA試料を加え、膜を通して吸引し
た。
た。
6. ステップ４を繰り返した。
7. マニホールドを解体し、膜を取り出した。
8. UVトランスイルミネーターを使ってDNAを膜へ５分
間UV固定した。
間UV固定した。
9. 膜プレハイブリダイゼーション緩衝液中70℃で１時
間インキュベートした。
間インキュベートした。
10. 膜ハイブリダイゼーション緩衝液に溶解したHSVI
に特異的なアルカリ性ホスファターゼ標識SNAPプローブ
を加えた。70℃で３〜５時間インキュベートした。
に特異的なアルカリ性ホスファターゼ標識SNAPプローブ
を加えた。70℃で３〜５時間インキュベートした。
11. 膜をハイブリダイゼーション緩衝液から取り出
し、洗浄緩衝液Ｉ 400ml中室温で攪拌しながら10分間
インキュベートした。
し、洗浄緩衝液Ｉ 400ml中室温で攪拌しながら10分間
インキュベートした。
12. 洗浄緩衝液II 400mlで50℃、30分洗浄した。
13. 洗浄緩衝液III 400mlで室温、10分洗浄した。
14. 洗浄緩衝液IV 200mlで室温、10分洗浄した。
15. 膜を１枚のWhatmanブロッティングペーパー上に置
いた。
いた。
16. 300μg/ml AMPPDを含む0.1Mトリス、1mM MgCl2
（pH9.8）2mlを加え、膜を通過させた。
（pH9.8）2mlを加え、膜を通過させた。
17. その膜を１枚のマイラーへ移行させ、その後612型
ポラロイドフィルムを含む暗箱へ入れた。
ポラロイドフィルムを含む暗箱へ入れた。
18. フィルムを30分露光した。代表的な結果を第５図
に示す。ここで第5A図は60μg/ml AMPPDでの結果を示
し、第5B図は300μg/ml AMPPDでの結果、そして第5C図
は300μg/ml AMPPDで初めの30分の反応後の結果を示
す。
に示す。ここで第5A図は60μg/ml AMPPDでの結果を示
し、第5B図は300μg/ml AMPPDでの結果、そして第5C図
は300μg/ml AMPPDで初めの30分の反応後の結果を示
す。
実施例６ α−フェトプロテイン（AFP）のためのビーズ形式AFP検
定 抗AFP抗体被覆ビーズおよび抗AFP抗体： アルカリホスファターゼコンジュゲートはハイブリテク
・タンデム・アッセイ・キットから得られた。
定 抗AFP抗体被覆ビーズおよび抗AFP抗体： アルカリホスファターゼコンジュゲートはハイブリテク
・タンデム・アッセイ・キットから得られた。
1. 各試験管に試料20μを加えた。試料は0,25,50,10
0,および200mg/ml AFPであった。
0,および200mg/ml AFPであった。
2. 各試験管に１個のビーズを入れた。
3. 各試験管に抗AFP抗体アルカリホスファターゼコン
ジュゲート200μを加えた。
ジュゲート200μを加えた。
4. ラックを振って試験管の内容物を混合した。
5. 試験管にカバーをかけた。
6. 37℃で２時間インキュベートした。
7. 抗体および試料を吸引除去した。
8. ビーズをリン酸緩衝溶液（pH7.4）中の0.1％ツィー
ン20 2.0mlで３回洗った。
ン20 2.0mlで３回洗った。
14. 両検定のデータはAFPの各濃度でのシグナルをゼロ
AFPでのシグナルで割った値をAFPの濃度に対してプロッ
トした。第６図に示すように、比色定量検定の結果はPN
PP曲線で表され、そして化学発光検定の結果はAMPPD曲
線で表される。後者の検定は前者の検定の約10倍の感度
であることが分かる。
AFPでのシグナルで割った値をAFPの濃度に対してプロッ
トした。第６図に示すように、比色定量検定の結果はPN
PP曲線で表され、そして化学発光検定の結果はAMPPD曲
線で表される。後者の検定は前者の検定の約10倍の感度
であることが分かる。
実施例７ 甲状腺刺激ホルモン（TSH）検定 物 質： 被分析体捕獲用の1/8インチビーズを、マウスモノクロ
ーナル抗TSH−β抗体で被覆した。マウスモノクローナ
ル抗TSH抗体はアルカリ性ホスファターゼと結合させ
て、検出用抗体（抗体酵素コンジュゲート）として使用
した。
ーナル抗TSH−β抗体で被覆した。マウスモノクローナ
ル抗TSH抗体はアルカリ性ホスファターゼと結合させ
て、検出用抗体（抗体酵素コンジュゲート）として使用
した。
TSHはCalbiochem社カタログ番号609396から得られ、BSA
（Ｖ型−脂肪酸不含）はSigma社カタログ番号A6003から
得られた。
（Ｖ型−脂肪酸不含）はSigma社カタログ番号A6003から
得られた。
被検液および抗体酵素コンジュゲートに用いた緩衝液は
0.1Mトリス−HCl、1mM MgCl2および２重量％BSA（pH7.
5）である。基質緩衝液は0.1Mトリス、0.1mM MgCl2（p
H9.5）および基質AMPPD（50μg/ml）を含んでいた。
0.1Mトリス−HCl、1mM MgCl2および２重量％BSA（pH7.
5）である。基質緩衝液は0.1Mトリス、0.1mM MgCl2（p
H9.5）および基質AMPPD（50μg/ml）を含んでいた。
手 順 TSH含有被検溶液（15μ）は抗体酵素コンジュゲート
溶液135μと混合した。この溶液に上記のように被覆
した1/8インチビーズ２個を加え、23℃で２時間インキ
ュベートした。その後、ビーズを0.1Mトリス（pH7.5）
で４回洗い、反応試験管へ移した。上記の基質を含む緩
衝液200μを試験管に加えた。20分インキュベーショ
ン後、ベルトールド・クリニルマット・ルミネッセンス
・アナライザー（Berthold Clinilumat Luminescence A
nalyzer）を使って10秒間のカウント数として発光量を
記録した。
溶液135μと混合した。この溶液に上記のように被覆
した1/8インチビーズ２個を加え、23℃で２時間インキ
ュベートした。その後、ビーズを0.1Mトリス（pH7.5）
で４回洗い、反応試験管へ移した。上記の基質を含む緩
衝液200μを試験管に加えた。20分インキュベーショ
ン後、ベルトールド・クリニルマット・ルミネッセンス
・アナライザー（Berthold Clinilumat Luminescence A
nalyzer）を使って10秒間のカウント数として発光量を
記録した。
第７図（下記表IVのデータのプロットである）は所定の
TSH濃度に対する発光強度を示す。１μU/mlと８μU/ml
のTSHの間で直線性を示した。
TSH濃度に対する発光強度を示す。１μU/mlと８μU/ml
のTSHの間で直線性を示した。
比較のために、BSAの不存在下で同じくTSH検定を行っ
た。第８図に示すように、BSA含有試料（曲線Ａ）はBSA
を含まない試料（曲線Ｂ）よりも所定のTSH濃度に対し
て強い発光強度を示した。
た。第８図に示すように、BSA含有試料（曲線Ａ）はBSA
を含まない試料（曲線Ｂ）よりも所定のTSH濃度に対し
て強い発光強度を示した。
実施例８ ビーズ形式による癌胎児性抗原（CEA）検定抗CEA被覆ビ
ーズおよび抗CEA抗体：アルカリ性ホスファターゼコン
ジュゲートはハイブリテク・タンデム・アッセイ・キッ
トのものを使用した。
ーズおよび抗CEA抗体：アルカリ性ホスファターゼコン
ジュゲートはハイブリテク・タンデム・アッセイ・キッ
トのものを使用した。
1. 各試験管に試料20μを加えた。試料は0,2.5,5,1
0,20および50ng/ml CEAの標準を使用した。
0,20および50ng/ml CEAの標準を使用した。
2. 各試験管に１個のビーズを入れた。
3. 各試験管に抗CEA抗体酵素コンジュゲート200μを
加えた。
加えた。
4. ラックを振って試験管の内容物を混合した。
5. 試験管にカバーをかけた。
6. 37℃で２時間インキュベートした。
7. 反応液を吸引除去した。
8. ビーズを0.1％ツィーン20を含むリン酸緩衝溶液（p
H7.4）2.0mlで３回洗った。
H7.4）2.0mlで３回洗った。
9. 0.05M炭酸ナトリウム、1mM MgCl2（pH9.5）で１回
洗った。
洗った。
10. 0.4mM AMPPDを含有する0.05M炭酸ナトリウム、1mM
MgCl2（pH9.5）250μを加えた。
MgCl2（pH9.5）250μを加えた。
11. 30℃で20分インキュベートした。
12. ターナー20Eルミノメーターで各試験管の発光を10
秒間の積分値としてカウントした。
秒間の積分値としてカウントした。
13. CEAの各濃度でのシグナルをゼロCEAでのシグナル
で割った値をCEAの濃度に対してプロットした。AMPPDを
用いたCEA検定の代表的データを第９図に示す、Ong/ml
と20ng/mlのCEA濃度の間で直線性を示した。
で割った値をCEAの濃度に対してプロットした。AMPPDを
用いたCEA検定の代表的データを第９図に示す、Ong/ml
と20ng/mlのCEA濃度の間で直線性を示した。
実施例９ ヒト黄体ホルモン（hLH）の検定 直径約3mmのナイロン膜（ポールイムノダイン（Pall lm
munodyne）製、孔サイズ0.45ミクロン）を、リン酸塩緩
衝液中に固相用の捕捉モノクローナル抗LH抗体（メディ
ックス（Medix）より市販、カタログ＃Ｌ−461−09）１
μg/mlの溶液５μで感作した。続いて、上記膜をpH7.
3のリン酸塩緩衝液添加生理塩水中２％カゼイン溶液で
ブロックした。次いでこの膜を第10図に示した装置（ブ
ロッティングペーパー層を含む）にセットした。
munodyne）製、孔サイズ0.45ミクロン）を、リン酸塩緩
衝液中に固相用の捕捉モノクローナル抗LH抗体（メディ
ックス（Medix）より市販、カタログ＃Ｌ−461−09）１
μg/mlの溶液５μで感作した。続いて、上記膜をpH7.
3のリン酸塩緩衝液添加生理塩水中２％カゼイン溶液で
ブロックした。次いでこの膜を第10図に示した装置（ブ
ロッティングペーパー層を含む）にセットした。
第10図中ａはプレフィルターカップを示し;bはプレキシ
グラストップを示し;cはポールイムノダインメンブレム
（孔サイズ0.45μ）を示し;dはポリプロピレンアセテー
トの羽毛状層を示し;eはブロッティングペーパーを示
し;fはプレキシグラスを示す。
グラストップを示し;cはポールイムノダインメンブレム
（孔サイズ0.45μ）を示し;dはポリプロピレンアセテー
トの羽毛状層を示し;eはブロッティングペーパーを示
し;fはプレキシグラスを示す。
使用された検出抗体は、メディックスより市販のマウス
モノクローナル抗LH抗体（カタログ＃Ｌ−461−03）を
用いた。この抗体を、グルタルアルデヒドカップリング
法［Voller,A et.al.Bull.World Health Org.,53,55（1
976）］によりアルカリ性ホスファイターゼ（バイオザ
イム（Biozyme）より市販、カタログ＃ALPI−11G）と結
合させて抗LH抗体アルカリ性ホスファターゼコンジュゲ
ートを調製した。
モノクローナル抗LH抗体（カタログ＃Ｌ−461−03）を
用いた。この抗体を、グルタルアルデヒドカップリング
法［Voller,A et.al.Bull.World Health Org.,53,55（1
976）］によりアルカリ性ホスファイターゼ（バイオザ
イム（Biozyme）より市販、カタログ＃ALPI−11G）と結
合させて抗LH抗体アルカリ性ホスファターゼコンジュゲ
ートを調製した。
方 法 50μの上記検出抗体コンジュゲートを下記濃度のhLH
溶液200μを含有する試験管に添加した： 各試験管の内容物を捕捉抗体（前述）であらかじめ感作
しておいた４枚のナイロン膜に加えた。５分間インキュ
ベーション後、プレフィルターカップを取り除き、上記
膜を、リン酸塩緩衝液添加生理塩水中0.05％トウィーン
（Tween）20溶液400μで洗った。続いて、0.05M炭酸
塩、1mM MgCl2、0.1重量％BSA（pH9.5）中0.4mM AMPP
D溶液100μを加えた。上記ナイロン膜をタイプ612ポ
ラロイドインスタント白黒フィルムを入れたカメラルネ
ミノメーターに入れ、１分間露光した。フィルムに画像
形成した検定結果を第11図に示す。
溶液200μを含有する試験管に添加した： 各試験管の内容物を捕捉抗体（前述）であらかじめ感作
しておいた４枚のナイロン膜に加えた。５分間インキュ
ベーション後、プレフィルターカップを取り除き、上記
膜を、リン酸塩緩衝液添加生理塩水中0.05％トウィーン
（Tween）20溶液400μで洗った。続いて、0.05M炭酸
塩、1mM MgCl2、0.1重量％BSA（pH9.5）中0.4mM AMPP
D溶液100μを加えた。上記ナイロン膜をタイプ612ポ
ラロイドインスタント白黒フィルムを入れたカメラルネ
ミノメーターに入れ、１分間露光した。フィルムに画像
形成した検定結果を第11図に示す。
次に、上記画像の反射濃度を、トビアスRBPポータブル
白黒反射デンシトメーター（Tobias RBP Portable Blac
k and White Reflection Densitometer）（ペンシルバ
ニア州18974−0347アイビーランド私書箱2699インダス
トリアルドライブ50のトビアスアソシエーツ（Tobias A
ssociates）製）を使用して測定した。反射濃度をLH濃
度に対してプロットして第12図に示すようなhLHについ
ての標準曲線を得た。
白黒反射デンシトメーター（Tobias RBP Portable Blac
k and White Reflection Densitometer）（ペンシルバ
ニア州18974−0347アイビーランド私書箱2699インダス
トリアルドライブ50のトビアスアソシエーツ（Tobias A
ssociates）製）を使用して測定した。反射濃度をLH濃
度に対してプロットして第12図に示すようなhLHについ
ての標準曲線を得た。
第１図は基質としてPNPPおよびAMPPDを用いたhCG検定の
結果の比較を示す図であり； 第２図はタンデムICON II hCG検定の結果を示す写真
である； 第３図は0.4mM AMPPDを用いたアルカリ性ホスファター
ゼ検定の結果を示す図であり； 第４図はウシ血清アルブミンおよび／または螢光物質の
存在下にアルカリ性ホスファターゼ検定を行った結果を
示す図であり； 第5A図は60μg/ml AMPPDを用いたHSVI DNAプローブ検
定の結果を示す写真であり、第５図Ｂは300μg/ml AMP
PDでの結果を示す写真であり、そして第5C図は300μg/m
l AMPPDでの初めの30分の反応の後の結果を示す写真で
あり； 第６図は基質としてAMPPDおよびPNPPを用いたAFP検定の
結果の比較を示す図であり； 第７図は基質としてAMPPDを用いたTSH検定の結果を示す
図であり； 第８図はBSAの存在下および不存在下でのTSH検定の結果
の比例を示す図であり； 第９図は基質としてAMPPDを用いたCEA検定の結果を示す
図であり； 第10図はhLH検定に使用した装置の構成を示す図であ
り； 第11図はhLH検定に使用したフィルム上の画像を示す写
真であり； 第12図はhLH検定に使用したhLH濃度の標準曲線を示す図
であり、縦軸は反射濃度である。
結果の比較を示す図であり； 第２図はタンデムICON II hCG検定の結果を示す写真
である； 第３図は0.4mM AMPPDを用いたアルカリ性ホスファター
ゼ検定の結果を示す図であり； 第４図はウシ血清アルブミンおよび／または螢光物質の
存在下にアルカリ性ホスファターゼ検定を行った結果を
示す図であり； 第5A図は60μg/ml AMPPDを用いたHSVI DNAプローブ検
定の結果を示す写真であり、第５図Ｂは300μg/ml AMP
PDでの結果を示す写真であり、そして第5C図は300μg/m
l AMPPDでの初めの30分の反応の後の結果を示す写真で
あり； 第６図は基質としてAMPPDおよびPNPPを用いたAFP検定の
結果の比較を示す図であり； 第７図は基質としてAMPPDを用いたTSH検定の結果を示す
図であり； 第８図はBSAの存在下および不存在下でのTSH検定の結果
の比例を示す図であり； 第９図は基質としてAMPPDを用いたCEA検定の結果を示す
図であり； 第10図はhLH検定に使用した装置の構成を示す図であ
り； 第11図はhLH検定に使用したフィルム上の画像を示す写
真であり； 第12図はhLH検定に使用したhLH濃度の標準曲線を示す図
であり、縦軸は反射濃度である。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｐ (56)参考文献 特開 昭52−57154（ＪＰ，Ａ) 特開 昭60−214752（ＪＰ，Ａ) 特開 昭60−214754（ＪＰ，Ａ) 特公 平５−21918（ＪＰ，Ｂ２) 米国特許4983779（ＵＳ，Ａ) 欧州特許公開254051（ＥＰ，Ａ) Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒ ｓ，ｖｏｌ．28，Ｎｏ．44，（1987） Ｐ．5319−22 Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒ ｓ，ｖｏｌ．28，Ｎｏ．９，（1987） Ｐ．935−938
Claims (8)
- 【請求項１】エンハンサーの存在下に、次式 （式中ＲはC1−C4のアルキルであり、Ｍはアルカリ金属
またはアンモニウムである） で表される1,2−ジオキセタン化合物にホスファターゼ
を反応させて発生する光を測定することを特徴とする化
学発光による測定方法。 - 【請求項２】抗原抗体反応を利用する測定法である請求
項１の方法。 - 【請求項３】酵素免疫分析法に用いる請求項１の方法。
- 【請求項４】核酸プローブ分析法に用いる請求項１の方
法。 - 【請求項５】Ｒがメチルである請求項１の方法。
- 【請求項６】ホスファターゼが、アルカリ性ホスファタ
ーゼである請求項１の方法。 - 【請求項７】エンハンサーが、蛋白質、螢光剤またはビ
ニルベンジル四級アンモニウム塩ポリマーあるいはそれ
らの混合物である請求項１の方法。 - 【請求項８】蛋白質がウシ血清アルブミン；螢光剤がフ
ルオレセイン；ビニルベンジル四級アンモニウム塩ポリ
マーがポリ［（ビニルベンジル）（ベンジル）（ジメチ
ル）アンモニウム・クロライド］またはポリ［（ビニル
ベンジル）（トリメチル）アンモニウムクロライド］で
ある請求項７の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US14019787A | 1987-12-31 | 1987-12-31 | |
| US140197 | 1987-12-31 |
Related Child Applications (4)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2033597A Division JPH0372489A (ja) | 1987-12-31 | 1990-02-14 | １，２―ジオキセタン化合物 |
| JP2033598A Division JPH03123791A (ja) | 1987-12-31 | 1990-02-14 | １，２―ジオキセタン化合物の製造方法 |
| JP2033599A Division JPH03139298A (ja) | 1987-12-31 | 1990-02-14 | 化学発光による酵素測定方法 |
| JP5026654A Division JPH0733346B2 (ja) | 1987-12-31 | 1993-02-16 | １，２−ジオキセタン化合物製造用中間体 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02724A JPH02724A (ja) | 1990-01-05 |
| JPH0731201B2 true JPH0731201B2 (ja) | 1995-04-10 |
Family
ID=22490169
Family Applications (9)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63185319A Expired - Lifetime JPH0731201B2 (ja) | 1987-12-31 | 1988-07-25 | 化学発光による測定法 |
| JP1501800A Expired - Lifetime JP3025280B2 (ja) | 1987-12-31 | 1989-01-03 | １，２‐ジオキセタン類およびその中間体の合成 |
| JP2033597A Granted JPH0372489A (ja) | 1987-12-31 | 1990-02-14 | １，２―ジオキセタン化合物 |
| JP2033599A Pending JPH03139298A (ja) | 1987-12-31 | 1990-02-14 | 化学発光による酵素測定方法 |
| JP2033598A Granted JPH03123791A (ja) | 1987-12-31 | 1990-02-14 | １，２―ジオキセタン化合物の製造方法 |
| JP4324674A Expired - Lifetime JPH0651708B2 (ja) | 1987-12-31 | 1992-11-11 | １，２−ジオキセタン化合物の中間体 |
| JP5026654A Expired - Lifetime JPH0733346B2 (ja) | 1987-12-31 | 1993-02-16 | １，２−ジオキセタン化合物製造用中間体 |
| JP11112353A Pending JPH11335342A (ja) | 1987-12-31 | 1999-04-20 | １，２―ジオキセタン類の中間体 |
| JP11234599A Expired - Lifetime JP3280342B2 (ja) | 1987-12-31 | 1999-04-20 | １，２−ジオキセタン類の中間体の合成 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1501800A Expired - Lifetime JP3025280B2 (ja) | 1987-12-31 | 1989-01-03 | １，２‐ジオキセタン類およびその中間体の合成 |
| JP2033597A Granted JPH0372489A (ja) | 1987-12-31 | 1990-02-14 | １，２―ジオキセタン化合物 |
| JP2033599A Pending JPH03139298A (ja) | 1987-12-31 | 1990-02-14 | 化学発光による酵素測定方法 |
| JP2033598A Granted JPH03123791A (ja) | 1987-12-31 | 1990-02-14 | １，２―ジオキセタン化合物の製造方法 |
| JP4324674A Expired - Lifetime JPH0651708B2 (ja) | 1987-12-31 | 1992-11-11 | １，２−ジオキセタン化合物の中間体 |
| JP5026654A Expired - Lifetime JPH0733346B2 (ja) | 1987-12-31 | 1993-02-16 | １，２−ジオキセタン化合物製造用中間体 |
| JP11112353A Pending JPH11335342A (ja) | 1987-12-31 | 1999-04-20 | １，２―ジオキセタン類の中間体 |
| JP11234599A Expired - Lifetime JP3280342B2 (ja) | 1987-12-31 | 1999-04-20 | １，２−ジオキセタン類の中間体の合成 |
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|---|---|
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| EP (2) | EP0582317B1 (ja) |
| JP (9) | JPH0731201B2 (ja) |
| AU (1) | AU2945189A (ja) |
| CA (1) | CA1341210C (ja) |
| DE (2) | DE68918230T2 (ja) |
| ES (1) | ES2012941A6 (ja) |
| GR (1) | GR1000118B (ja) |
| IL (1) | IL88798A (ja) |
| MX (1) | MX14411A (ja) |
| NZ (1) | NZ227525A (ja) |
| WO (1) | WO1989006226A1 (ja) |
| ZA (1) | ZA889659B (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1510822A2 (en) | 2003-08-28 | 2005-03-02 | Tosoh Corporation | Chemiluminescence method using a 1,2-dioxetane derivative, and composition for chemiluminescence comprising it |
Families Citing this family (24)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5004565A (en) * | 1986-07-17 | 1991-04-02 | The Board Of Governors Of Wayne State University | Method and compositions providing enhanced chemiluminescence from 1,2-dioxetanes |
| US4978614A (en) * | 1988-10-26 | 1990-12-18 | Tropix, Inc. | Method of detecting a substance using enzymatically-induced decomposition of dioxetanes |
| US4956477A (en) * | 1987-12-31 | 1990-09-11 | Tropix, Inc. | Synthesis of 1,2-dioxetanes |
| US4952707A (en) * | 1988-06-30 | 1990-08-28 | Tropix, Inc. | Enzymatically-cleavable chemiluminescent fused polycyclic ring-containing 1,2-dioxetanes |
| US4931569A (en) * | 1988-09-14 | 1990-06-05 | Tropix, Inc. | Purification of stable water-soluble dioxetanes |
| US6022964A (en) * | 1989-07-17 | 2000-02-08 | Tropix, Inc. | Chemiluminescent 1,2-dioxetanes |
| US5362916A (en) * | 1989-09-06 | 1994-11-08 | Tropix, Inc. | Synthesis of mercaptaryl or hydroxyaryl enol ether alkali metal salts |
| CA2035029C (en) * | 1989-09-06 | 2001-12-18 | Applied Biosystems, Llc | Synthesis of stable water-soluble chemiluminescent 1,2-dioxetanes and intermediates therefor |
| US5225584A (en) * | 1989-09-06 | 1993-07-06 | Tropix, Inc. | Synthesis of stable water-soluble chemiluminescent 1,2-dioxetanes and intermediates therefor |
| CA2141451C (en) * | 1992-07-31 | 2003-10-07 | John S. Pease | Photoactivatable chemiluminescent matrices |
| KR0148439B1 (ko) * | 1994-03-11 | 1998-11-02 | 마사까쓰 마쓰모또 | 1,2-디옥세탄 유도체 |
| US5631167A (en) * | 1995-07-31 | 1997-05-20 | Bayer Corporation | Capsule chemistry analytical methods employing dioxetane chemiluminescence |
| US5777135A (en) * | 1995-07-31 | 1998-07-07 | Lumigen, Inc. | Di-substituted 1,2-dioxetane compounds having increased water solubility and assay compositions |
| US5783381A (en) * | 1995-10-19 | 1998-07-21 | Tropix, Inc. | Chemiluminescent 1,2-dioxetanes |
| AU5237699A (en) * | 1998-07-28 | 2000-02-21 | Tropix, Inc. | Benzothiazole dioxetanes |
| US6660529B2 (en) * | 1998-07-28 | 2003-12-09 | Pe Corporation | Heteroaryl substituted benzothiazole dioxetanes |
| EP1185710A2 (en) * | 1999-04-16 | 2002-03-13 | Zymetx, Inc. | Viral detection method using viral encoded enzymes and chemiluminescent substrates |
| US20040038241A1 (en) * | 2000-07-26 | 2004-02-26 | Martin Glennsbjerg | Spatially resolved enzyme-linked assay |
| EP1342724B1 (en) * | 2002-03-08 | 2016-01-06 | Tosoh Corporation | 1,2-dioxetane derivates and reagents employing them |
| JP2012140330A (ja) * | 2010-12-28 | 2012-07-26 | Tosoh Corp | 水溶性リン酸エステルの精製方法 |
| SI2892900T1 (en) | 2012-09-10 | 2018-01-31 | Principia Biopharma Inc. | Pyrazolopyrimidine compounds as kinase inhibitors |
| DE102012109026A1 (de) * | 2012-09-25 | 2014-03-27 | Eads Deutschland Gmbh | Detektionsvorrichtung und Detektionsverfahren zur automatischen Bestimmung von Biomasse |
| US11198785B2 (en) | 2017-10-13 | 2021-12-14 | Mitsubishi Engineering-Plastics Corporation | Polycarbonate resin composition |
| JP7007862B2 (ja) * | 2017-10-31 | 2022-01-25 | アークレイ株式会社 | 化学発光試薬組成物及び化学発光試薬キット |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4983779A (en) | 1986-07-17 | 1991-01-08 | The Board Of Governors Of Wayne State University | Process for the preparation of vinyl ethers |
Family Cites Families (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US2909557A (en) * | 1955-09-07 | 1959-10-20 | Bayer Ag | Thiophosphoric acid esters and their production |
| NL6716437A (ja) | 1967-12-02 | 1969-06-04 | ||
| US3711556A (en) | 1968-06-13 | 1973-01-16 | Du Pont | 2-(bis(p-substituted phenyl)methylene)adamantanes |
| GB1497109A (en) * | 1975-10-29 | 1978-01-05 | Beecham Group Ltd | Naphthalene derivatives |
| JPS57159499A (en) * | 1981-03-26 | 1982-10-01 | Fuji Photo Film Co Ltd | Substrate for determining alkaline phosphatase and determining method |
| JPS62176941A (ja) * | 1986-01-28 | 1987-08-03 | Sumitomo Electric Ind Ltd | 光フアイバ |
| JPS639377A (ja) * | 1986-06-30 | 1988-01-16 | Sony Corp | マルチチヤンネル録画装置 |
| US5707559A (en) * | 1986-07-17 | 1998-01-13 | Tropix, Inc. | Chemiluminescent 1,2-dioxetane compounds |
| JPH0521918A (ja) * | 1991-07-11 | 1993-01-29 | Nippon Cement Co Ltd | セラミツクス回路基板用導電パターン形成用粉末組成物 |
| JP3217396B2 (ja) * | 1991-08-16 | 2001-10-09 | オリンパス光学工業株式会社 | 顕微鏡の粗微動機構 |
| JPH0723989B2 (ja) * | 1992-08-03 | 1995-03-15 | ビソーディスプレイ株式会社 | スクリーン装置 |
| JPH0733346A (ja) * | 1993-07-20 | 1995-02-03 | Hitachi Building Syst Eng & Service Co Ltd | エレベータの着床制御装置 |
| DE4423811C1 (de) * | 1994-07-06 | 1996-01-18 | Fraunhofer Ges Forschung | Hydrolysierbare und polymerisierbare Silane, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung |
-
1988
- 1988-07-25 JP JP63185319A patent/JPH0731201B2/ja not_active Expired - Lifetime
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1999
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2000
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Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4983779A (en) | 1986-07-17 | 1991-01-08 | The Board Of Governors Of Wayne State University | Process for the preparation of vinyl ethers |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔｅｒｓ，ｖｏｌ．２８，Ｎｏ．４４，（１９８７）Ｐ．５３１９−２２ |
| ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔｅｒｓ，ｖｏｌ．２８，Ｎｏ．９，（１９８７）Ｐ．９３５−９３８ |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1510822A2 (en) | 2003-08-28 | 2005-03-02 | Tosoh Corporation | Chemiluminescence method using a 1,2-dioxetane derivative, and composition for chemiluminescence comprising it |
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