JPH027633B2 - - Google Patents
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- JPH027633B2 JPH027633B2 JP58063304A JP6330483A JPH027633B2 JP H027633 B2 JPH027633 B2 JP H027633B2 JP 58063304 A JP58063304 A JP 58063304A JP 6330483 A JP6330483 A JP 6330483A JP H027633 B2 JPH027633 B2 JP H027633B2
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- phospholipid
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- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、酵素法によるリン脂質一級アルコー
ル誘導体の製法に関し、従来酵素法によつて製造
できないとされていたリン脂質一級アルコール誘
導体を包含して広い範囲のリン脂質一級アルコー
ル誘導体の製造を可能とした酵素法リン脂質一級
アルコール誘導体の製法に関する。更に詳しく
は、従来酵素法で使用されたキヤベツ由来のホス
ホリパーゼＤ（至適温度40℃以下、至適PH5.4〜
5.6）とは異なつて、至適温度60〜70℃、至適PH
７付近のホスホリパーゼDMの存在下で、リン脂
質と一級アルコールとを反応させるリン脂質一級
アルコール誘導体の製法に関する。 尚、本発明に於て、リン脂質一級アルコール誘
導体とは、出発物質であるリン脂質のリン酸構造
部分と該リン脂質の（塩基もしくは）アルコール
構造部分とのエステル結合を、ホスホリパーゼ
DMの作用で加水分解すると同時に、上記反応に
用いる一級アルコールへ転移させて誘導した、出
発物質とは異なる新しいリン脂質を意味する。 特に、本発明は、下記式（） 但し式中、Ａは下記(i)又は(ii) 【式】 【式】 を示し、ここで、R1及びR2は共に−Ｏ−COR11
であるか、もしくは共に−Ｏ−R12であるか、も
しくは式(i)においてR1とR2は一緒になつて
【式】〔ここで、ｎは11〜19の数 を示す〕を表わし、上記に於て、R11及びR12は
同一でも異つていてもよく、夫々、C7〜C21の飽
和もしくは不飽和の脂肪族炭化水素基を示し、 Ｂは−（CH2）2N（CH3）3、−（CH2）2NH2、−
CH2CH（NH2）COOH、−CH2CH2NH（CH3）、−
CH2CH2N（CH3）2、−CH2CHOHCH2OHもしく
は−（CH2）nＨ〔ここで、ｍは１〜５の数を示す〕
を示す、 で表わされるリン脂質と、下記式（） Ｒ−OH ……（） 但し式中、Ｒは下記(1)〜(3)よりなる群からえら
ばれた員を示す、 (1) C6（ただし、ヘキサノールを除く）〜C26の飽
和もしくは不飽和の脂肪族又は芳香族炭化水素
残基、ここで該炭化水素残基はハロゲン、アミ
ノ、アセチル及び水酸基より選ばれた置換基で
置換されていてもよい、 又は 分子内にエーテル、エステル及びアミド結合
よりなる群からえらばれた結合を有する上記炭
化水素残基、 (2) プレグナン系ステロイド化合物残基、 (3) ガラクトノ−γ−ラクトン、Ｎ（２−ヒドロ
キシエチル）フタルイミド、２−（３−インド
ール）エタノール、２−（２−ヒドロキシエチ
ル）ピリジン、ピリドキシン、Ｎ（２−ヒドロ
キシエチル）モルホリン、５−ヒドロキシメチ
ルシトシン、シチジン、ウリジン、アラビノシ
チジン、チアミン、２−（２−ヒドロキシエチ
ル）ピペラジン、アデノシン、グアノシン及び
サイクロシチジンより成る群からえらばれた複
素環化合物残基、 で表わされる一級アルコールとを、ホスホリパー
ゼDMの存在下に反応させることを特徴とする下
記式（） 但し式中、Ａ及びＲは上記したと同義である、
で表わされるリン脂質一級アルコール誘導体の製
法に関する。 従来、ホスホリパーゼＤが、リン脂質たとえば
ホスフアチジルコリンのコリン塩基−リン酸エス
テルを加水分解し、遊離塩基とホスフアチジン酸
を生ずる反応を触媒することが知られている
〔M.Kates Can.J.Biochem.Physiol.32 571
（1954）〕。 更に、リン脂質たとえばレシチンとエチルアル
コールとをホスホリパーゼＤの存在下に反応させ
ると、リン脂質のリン酸構造部分と該リン脂質の
アルコール構造部分とのエステル結合が加水分解
されると同時にホスフアチジル基転移作用によ
り、ホスフアチジルエタノールを生成することが
報告されている〔R.M..Dawson；Biochem.J.、
102、205（1967）〕：〔S.F.Yang；J.Biol.Chem.、
242、477（1967）〕。 上述のようなホスホリパーゼＤのホスフアチジ
ル基転移作用が知られて以来、この分野における
研究が進められ、英国特許No.1581810（対応西ドイ
ツ国公開No.2717547）の提案が知られている。こ
の提案によれば、この提案の一般式で示されたリ
ン脂質と、水酸基、ハロゲン、アミノその他の置
換基で置換されていてもよいC5までの直鎖もし
くは分枝のアルキル基を有する一級アルコールと
の前記キヤベツ由来のホスホリパーゼＤの酵素作
用を利用した一級アルコール転移反応について開
示されている。そして、該反応は、５を超える炭
素原子を含有しない一級アルコールでのみ起り、
若し、５を超える炭素原子を含有する該アルコー
ルの場合には、反応の主生成物は対応するホスフ
アチジン酸であると記載されている。更に、該提
案にはアルコール成分の選択は、上記の要求を満
した一級アルコールである限りとくべつな制約の
ないことも記載されている。 又、上記提案の発明者等であるS.Kovatchev及
びH.Eibl等は、Adv.Exp.Med.Biol.、Vol.101、
221（1978）に於て、ホスホリパーゼＤの酵素作用
を利用した一級アルコール転移反応について、
C7−C10のアルカノールでは転移反応が認められ
ないがC6のヘキサノールについては20％の転移
反応が生じたと報告している。一方、
Rokhimov、M.Mは、Uzb.Biol.Zh.、Vol.3、６
−９（1979）に於て、C5以上のアルコール例えば
C6のヘキサノールについては転移反応は起らな
かつたと報告している。 本発明者等は、従来公知のキヤベル由来ホスホ
リパーゼＤとは、その至適温度、至適PH等で異な
るホスホリパーゼＤ生産能を有する微生物の存在
を発見して、既に、特願昭56−161076号、特願昭
56−163475号に提案した。 更に研究を進めた結果、該ホスホリパーゼＤ生
産性微生物の生産する酵素は、C6以上の一級ア
ルコール（ただし、ヘキサノールを除く）を包含
して、従来、リン脂質一級アルコール誘導体を形
成できないとされていた及び従来全く言及された
ことのない前記(1)、(2)及び(3)よりなる群からえら
ばれた一級アルコールとの転移反応を可能とする
酵素的触媒作用を示すという驚くべき事実を発見
した。 本発明者等の研究によれば、リン脂質とたとえ
ばC10一級アルコールであるゲラニオールとの間
におけるリン脂質一級アルコール誘導体の形成を
触媒する本発明に於て新たにホスホリパーゼDM
と呼称する酵素が存在し、このホスホリパーゼ
DMの存在下に、前記式（）で表わされるリン
脂質と前記式（）の一級アルコールとを反応さ
せることにより、従来製造できないと云われてい
たリン脂質一級アルコール誘導体を包含して新し
い誘導体を製造できることが発見された。 斯くて、煩雑且つ不利益な化学的合成手段を要
することなしに、温和且つ容易な条件及び手段
で、副反応を伴うおそれもなしに、酵素法によつ
て新しいリン脂質一級アルコール誘導体を好収率
で製造できることがわかつた。 従つて、本発明の目的は新しい酵素法リン脂質
一級アルコール誘導体の製法を提供するにある。 本発明の上記目的及び更に多くの他の目的なら
びに利点は、以下の記載から一層明らかとなるで
あろう。 本発明方法で利用する原料リン脂質は下記式
（）で表わされる。 但し式中、Ａは下記(i)又は(ii) 【式】 【式】 を示し、ここで、R1及びR2は共に−Ｏ−COR11
であるか、もしくは共に−Ｏ−R12であるか、も
しくは式(i)においてR1とR2は一緒になつて
【式】〔ここで、ｎは11〜19の数 を示す〕を表わし、上記に於て、R11及びR12は
同一でも異つていてもよく、夫々、C7〜C21の飽
和もしくは不飽和の脂肪族炭化水素基を示し、 Ｂは−（CH2）2N（CH3）3、−（CH2）2NH2、−
CH2CH（NH2）COOH、−CH2CH2NH（CH3）、−
CH2CH2N（CH3）2、−CH2CHOHCH2OHもしく
は−（CH2）nＨ〔ここで、ｍは１〜５の数を示す〕
を示す。 上記式（）原料リン脂質は公知化合物であつ
て、市場でも入手可能であり、それ自体公知の方
法によつて天然物より抽出採取又は合成すること
ができる。例えば、動植物組織から公知の手段で
抽出して得られるレシチン、ケフアリン、ホスフ
アチジルセリン、ホスフアチジル−Ｎ−メチルエ
タノールアミン、ホスフアチジル−Ｎ，Ｎ−ジメ
チルエタノールアミン、ホスフアチジルグリセロ
ール、ホスフアチジン酸アルキルエステル等の単
独或いは混合物をそのまま若しくは精製して用い
ることができるし、β型リン脂質やアルキルエー
テル型リン脂質についても、それ自体公知の方法
によつてその構造の一部もしくは全部を化学合成
して利用することができる。 本発明方法に於て、上記式（）原料リン脂質
とホスホリパーゼDMの存在下に反応せしめる一
級アルコールは、下記式（）で表わされる。 Ｒ−OH ……（） 但し式中、Ｒは下記(1)〜(3)よりなる群からえら
ばれた員を示す、 (1) C6（ただし、ヘキサノールを除く）〜C26の飽
和もしくは不飽和の脂肪族又は芳香族炭化水素
残基、ここで該炭化水素残基はハロゲン、アミ
ノ、アセチル及び水酸基より選ばれた置換基で
置換されていてもよい、 又は 分子内にエーテル、エステル及びアミド結合
よりなる群からえらばれた結合を有する上記炭
化水素残基、 (2) プレグナン系ステロイド化合物残基、 (3) ガラクトノ−γ−ラクトン、Ｎ（２−ヒドロ
キシエチル）フタルイミド、２−（３−インド
ール）エタノール、２−（２−ヒドロキシエチ
ル）ピリジン、ピリドキシン、Ｎ（２−ヒドロ
キシエチル）モルホリン、５−ヒドロキシメチ
ルシトシン、シチジン、ウリジン、アラビノシ
チジン、チアミン、２−（２−ヒドロキシエチ
ル）ピペラジン、アデノシン、グアノシン及び
サイクロシチジンより成る群からえらばれた複
素環化合物残基。 このような式（）一級アルコールの具体例と
しては、下記のような一級アルコールを例示する
ことができる。 上記(1)の群に属する一級アルコールの例として
は、脂肪族アルコールのうち置換基をもたないも
のとしては１−ヘプタノール（C7）、１−オクタ
ノール（C8）、２−エチル−１−ヘキサノール
（C8）、１−ノナノール（C9）、１−デカノール
（C10）、１−ウンデカノール（C11）、１−ドデカ
ノール（C12）、１−テトラデカノール（C14）、１
−ヘキサデカノール（C16）、１−オクタデカノー
ル（C18）、１−ドコサノール（C20）、１−エイコ
サノール（C22）、１−ヘキサコサノール（C26）、
ゲラニオール（C10）、シトロネロール（C10）、フ
アルネソール（C15）、フイトール（C20）など；
多価アルコールとしては１，６−ヘキサンジオー
ル（C6）、１，２，６−ヘキサントリオール
（C6）、ソルビトール（C6）マンニトール（C6）、
２−ｎ−ブチル−２−エチル−１，３−プロパン
ジオール（C9）、２−エチル−１，３−ヘキサン
ジオール（C8）、１，１，１−トリス（ヒドロキ
シメチル）プロパン（C6）、３，３−ビス（ヒド
ロキシメチル）ヘプタン（C9）、１，10−デカン
ジオール（C10）、１，12−ドデカンジオール
（C12）、トリメチロールプロパン、ジペンタエリ
スリトール、ガラクチトールなど；アミノ基をも
つものとしては６−アミノ−１−ヘキサノール
（C6）、トリエタノールアミン、Ｎ−ブチルジエ
タノールアミン、セリンエチルエステル、ジヒド
ロキシエチルグリシン、スフインゴシン（C18）、
Ｎ−メチルペンタノールアミン、Ｎ−メチルヘキ
サノールアミン、Ｎ−エチルブタノールアミン、
Ｎ−エチルペンタノールアミン、Ｎ−エチルヘキ
サノールアミン、Ｎ−プロピルプロパノールアミ
ン、Ｎ−プロピルブタノールアミン、Ｎ−プロピ
ルペンタノールアミン、Ｎ−プロピルヘキサノー
ルアミン、Ｎ−ブチルエタノールアミン、Ｎ−ブ
チルプロパノールアミン、Ｎ−ブチルブタノール
アミン、Ｎ−ブチルペンタノールアミン、Ｎ−ブ
チルヘキサノールアミン、Ｎ−ペンチルエタノー
ルアミン、Ｎ−ヘキシルエタノールアミン、Ｎ，
Ｎ−ジメチルブタノールアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチ
ルペンタノールアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチルヘキサ
ノールアミン、Ｎ，Ｎ−ジエチルエタノールアミ
ン、Ｎ，Ｎ−ジエチルプロパノールアミン、Ｎ，
Ｎ−ジエチルブタノールアミン、Ｎ，Ｎ−ジエチ
ルペンタノールアミン、Ｎ，Ｎ−ジエチルヘキサ
ノールアミン、Ｎ，Ｎ−ジプロピルエタノールア
ミン、Ｎ，Ｎ−ジプロピルプロパノールアミン、
Ｎ，Ｎ−ジプロピルブタノールアミン、Ｎ，Ｎ−
ジプロピルペンタノールアミン、Ｎ，Ｎ−ジプロ
ピルヘキサノールアミン、Ｎ，Ｎ−ジブチルプロ
パノールアミン、Ｎ，Ｎ−ジブチルブタノールア
ミン、Ｎ，Ｎ−ジブチルペンタノールアミン、
Ｎ，Ｎ−ジブチルヘキサノールアミン、Ｎ，Ｎ−
ジペンチルエタノールアミン、Ｎ，Ｎ−ジヘキシ
ルエタノールアミン、Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルプ
ロパノールアミン、Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルブタ
ノールアミン、Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルペンタノ
ールアミン、Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルヘキサノー
ルアミン、Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリエチルエタノールア
ミン、Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリエチルプロパノールアミ
ン、Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリエチルブタノールアミン、
Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリエチルペンタノールアミン、
Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリエチルヘキサノールアミン、
Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリプロピルエタノールアミン、
Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリプロピルプロパノールアミン、
Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリプロピルブタノールアミン、
Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリプロピルペンタノールアミン、
Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリプロピルヘキサノールアミン、
Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリブチルエタノールアミン、Ｎ，
Ｎ，Ｎ−トリブチルプロパノールアミン、Ｎ，
Ｎ，Ｎ−トリブチルブタノールアミン、Ｎ，Ｎ，
Ｎ−トリブチルペンタノールアミン、Ｎ，Ｎ，Ｎ
−トリブチルヘキサノールアミン、Ｎ，Ｎ，Ｎ−
トリペンチルエタノールアミン、Ｎ，Ｎ，Ｎ−ト
リヘキシルエタノールアミン、Ｎ，Ｎ−ジブチル
エタノールアミン、Ｎ−（３−アミノプロピル）
ジエタノールアミン、など；カルボキシル基をも
つものとして、16−ヒドロキシヘキサデカン酸
（C16）、グルコン酸、ガラクトン酸など；ハロゲ
ン基を持つものとして、６−クロロ−１−ヘキサ
ノール（C6）など、エステル結合を有するもの
としてモノラウリン（C15）、モノオレイン
（C21）、１，２−ジラウリン（C27）、１，２−ジ
ステアリン（C39）、メタクリル酸２−ヒドロキシ
エチル（C6）、エチレングリコールモノラウレー
ト、ジエチレングリコールモノラウレート、エチ
レングリコールモノステアレート、ジエチレング
リコールモノステアレート、エチレングリコール
モノオレート、ジエチレングリコールモノオレー
ト、エチレングリコールモノパルミテート、ジエ
チレングリコールモノパルミテートなど；アミド
結合を有するものとしてパントテニルアルコール
（C9）、パンテテイン（C11）、トリ−Ｌ−セリン、
Ｌ−セリル−Ｌ−ロイシン、Ｌ−セリル−Ｌ−メ
チオニン、Ｌ−セリル−Ｌ−アルギニン、Ｌ−セ
リル−Ｌ−リジン、Ｌ−セリル−Ｌ−グルタミ
ン、Ｎ−カプリロイルエタノールアミン、Ｎ−カ
プロイルエタノールアミン、Ｎ−ラウロイルエタ
ノールアミン、Ｎ−ミリストイルエタノールアミ
ン、Ｎ−パルミトイルエタノールアミン、Ｎ−ス
テアロイルエタノールアミン、Ｎ−オレオイルエ
タノールアミン、Ｎ−パルミトオレオイルエタノ
ールアミン、Ｎ−リノロイルエタノールアミン、
Ｎ−リノレイルエタノールアミン、Ｎ−アラキド
ノイルエタノールアミン、Ｎ−エイコサノイルエ
タノールアミン、Ｎ−ドコサノイルエタノールア
ミン、ラウリン酸ジエタノールアミド、ステアリ
ン酸ジエタノールアミド、オレイン酸ジエタノー
ルアミド、パルミチン酸ジエタノールアミド、ト
リオキシエチレンラウリン酸アミド、テトラオキ
シエチレンラウリルエーテル硫酸トリエタノール
アミン、ラウリル硫酸トリエタノールアミンな
ど；エーテル結合を有するものとして、トリエチ
レングリコール（C6）、ジエチレングリコールモ
ノブチルエーテル（C8）、エチレングリコールモ
ノラウリルエーテル、ジエチレングリコールモノ
ラウリルエーテル、エチレングリコールモノセチ
ルエーテル、ジエチレングリコールモノセチルエ
ーテル、エチレングリコールモノステアリルエー
テル、ジエチレングリコールモノステアリルエー
テル、エチレングリコールモノオレイルエーテ
ル、ジエチレングリコールモノオレイルエーテ
ル、エチレングリコールモノブチルエーテル、エ
チレングリコールモノ（２−ジエチルアミノエチ
ル）エーテル、エチレングリコールモノヘキシル
エーテル、エチレングリコールモノトリルエーテ
ル、ジエチレングリコールモノエチルエーテル、
ジエチレングリコールモノヘキシルエーテル、テ
トラエチレングリコール、ペンタエチレングリコ
ール、ヘキサエチレングリコール、オクタエチレ
ングリコール、デカエチレングリコール、ドデカ
エチレングリコール、ジグリセロール、トリグリ
セロール、テトラグリセロール、ペンタグリセロ
ール、ヘシサグリセロール、ヘプタグリセロー
ル、オクタグリセロールなどが例示でき、又、芳
香族アルコールではベンジルアルコール（C7）、
β−フエネチルアルコール（C8）、３−フエニル
−１−プロパノール（C9）、ケイ皮アルコール
（C9）Ｌ−セリル−Ｌ−チロシン、Ｌ−セリル−
Ｌ−フエニルアラニン、Ｌ−セリンベンジルエス
テル、Ｌ−セリンβ−ナフチルアミド、Ｌ−ジニ
トロフエニル−Ｌ−セリン、Ｎ−（１−ジメチル
アミノナフタレン−５−スルフオニル）−Ｌ−セ
リン、エチレングリコールモノベンジルエーテ
ル、エチレングリコールモノオクチルフエノール
エーテル、ジエチレングリコールモノオクチルフ
エノールエーテル、エチレングリコールモノノニ
ルフエノールエーテル、ジエチレングリコールモ
ノノニルフエノールエーテルなど；置換基をもつ
ものとしてはｐ−クロルベンジルアルコール
（C7）、ｐ−アミノフエネチルアルコール（C8）、
Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−ｍ−
トルイジン（C11）、β−ヒドロキシエチルアニリ
ン（C8）、Ｎ−（２−シアノエチル）−Ｎ−（２−
ヒドロキシエチル）−アニリン（C11）、Ｎ−フエ
ニルジエタノールアミン（C10）、アニスアルコー
ル（C8）、１，４−ジ（２−ヒドロキシエトキ
シ）ベンゼン（C10）、エチレングリコールモノフ
エニルエーテル（C8）、メフエネシン（C10）、２
−ヒドロキシエチルサリチル酸（C9）エチレン
グリコールモノクロロフエニルエーテルなど；多
環化合物ではＯ，Ｏ−ビス（２−ヒドロキシエチ
ル）テトラブロムビスフエノール（C19）、２−ナ
フタリンエタノール（C12）などが例示でき、更
に、脂環式アルコールではレチノール（C20）、
１，４−ジヒドロキシメチルシクロヘキサン
（C8）、などを例示することができる。 又、上記(2)の群に属する一級アルコールの例と
しては、アルドステロン、コルチコステロン、コ
ルチゾン、デヒドロコルチコステロン、デオキシ
コルチコステロン、ハイドロコルチゾン、プレド
ニゾロン、プレドニゾン、テトラヒドロコルチゾ
ール、テトラヒドロコルチゾン、トリアムシノロ
ンなどを例示することができる。 更に、上記(3)の群に属する一級アルコールの例
としては、ガラクトノ−γ−ラクトン、Ｎ−（２
−ヒドロキシエチル）フタルイミド、２−（３−
インドール）エタノール、２−（２−ヒドロキシ
エチル）ピリジン、ピリドキシン、ピリドキサー
ル、ピリドキサミン、Ｎ−（２−ヒドロキシエチ
ル）モルホリン、５−ヒドロキシメチルシトシ
ン、シチジン、ウリジン、アラビノシチジン、ア
デノシン、グアノシン、サイクロシチジン、アデ
ニンデオキシリボシド、シトシンデオキシリボシ
ド、グアニンデオキシリボシド、５−ヒドロキシ
メチルウラシル、チミンデオキシリボシド、ウラ
シルデオキシリボシド、イノシン、オロチジン、
２−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン、チア
ミン、トキソピリミジンなどを例示することがで
きる。 上記例示の如き式（）一級アルコールは、天
然物、合成品いずれでも利用できるが、目的とす
る一級アルコール以外のアルコールを含まないよ
うに予め適当な公知手段を用い精製して利用する
のが好ましい。このような精製手段の例として
は、たとえば、蒸留、再結晶、アルミナ、シリカ
ゲル、活性炭、イオン交換樹脂などを用いたカラ
ムクロマトグラフイー、薄層クロマトグラフイー
及びこれらの適当な組み合わせ精製手段を例示で
きる。 本発明方法によれば、前記例示の如き式（）
リン脂質と上記例示の如き式（）一級アルコー
ルとをホスホリパーゼDMの存在下に反応させ
る。 この際利用するホスホリパーゼDMとしては、
従来公知のキヤベツから抽出されたホスホリパー
ゼＤの至適温度40℃以下、至適PH5.4〜5.6に対し
て、至適温度60〜70℃、至適PH７付近である点で
公知ホスホリパーゼＤと区別できるホスホリパー
ゼDM生産菌の生産するホスホリパーゼDMが例
示できる。該ホスホリパーゼDMは、C10一級ア
ルコールであるゲラニオールと式（）リン脂質
との間におけるリン脂質一級アルコール誘導体の
形成を触媒する点でも公知ホスホリパーゼＤと区
別できる。 このようなホスホリパーゼDM生産菌の例とし
ては、同一出願人の出願に係わる特願昭56−
161076号に開示されたノカルデイオプシス
（Nocardiopsis）属に属するホスホリパーゼDM
生産菌たとえばノルカデイオプシス属NO779株
〔FERM−Ｐ No.6133〕、同一出願人の出願に係
わる特願昭56−163475号に開示されたアクチノマ
デユーラ（Actinomadura）属に属するホスホリ
パーゼDM生産菌たとえばアクチノマデユーラ属
NO362株〔FERM−Ｐ No.6132〕等を挙げるこ
とができる。至適温度及び至適PHの相違と共に他
のいくつかの相違点と共に、下掲第１表に、本発
明方法で利用するホスホリパーゼDMと公知ホス
ホリパーゼＤとの酵素学的性質の差異を示した。 【表】 【表】 公知ホスホリパーゼＤを用いては得られなかつ
たリン脂質一級アルコール誘導体が、本発明方法
で形成できる理由には、この酵素的触媒反応に関
与する公知ホスホリパーゼＤと本発明方法で用い
るホスホリパーゼDMとの上記の如き酵素学的性
質の差異が関与しているものと推測される。勿
論、本発明方法はこのような作用の推測によつて
何等の制約もうけるものではない。 本発明方法で利用できるホスホリパーゼDMを
生産する前記ホスホリパーゼDM生産菌ノカルデ
イオプシス属NO779株［FERM−Ｐ No.6133］
及びアクチノマデユーラ属NO362株［FERM−
Ｐ No.6132］の菌学的性状及びそれらが生産する
ホスホリパーゼDMの力価測定法、理化学的性質
について以下に述べる。 ノカルデイオプシス属NO779株［FERM−Ｐ
No.6133］の菌学的性状：− (a) 形態 グルコースアスパラギン寒天、グリセリンア
スパラギン寒天、酵母麦芽寒天培地等では良好
に、また澱粉無機塩培地では中程度に生育して
気菌糸の集落を着生する。 胞子を着生した菌叢の色は培地の種類、観察
時期により若干変化するが、おおむね白色ない
し灰白色から明るい灰色を呈する。 シユークロース硝酸塩寒天、栄養寒天、オー
トミール寒天培地では気菌糸を着生しないか、
貧弱にしか着生しない。 寒天培地上に生育させた本菌株を顕微鏡で観
察すると、気菌糸は0.5〜0.8μで直線状でゆる
く波形又は屈曲を混じえながら分枝をもつて長
く伸び、気菌糸全体は数10から100ケ以上のす
べて胞子からなる連鎖によつて形成されてい
る。 胞子の大きさは0.5〜0.8×0.7×1.0μで、ほぼ
短円筒形で大きさはやや不規則である。 基生菌糸は巾0.5〜0.8μで分枝をもつて伸長
し、寒天培地上ではかならずしも分断しない
が、液体培養することによりほとんどの場合細
かく分断する。 しかし遊走胞子、胞子のう、菌核等は形成さ
れない。 (b) 各種培地上での性状 以下に記載する実験方法は主としてイー・ビ
ー・シヤーリング（Int.J.Syst.Bacteriol.16巻、
313〜340、1966年）の方法にしたがつて行つ
た。 色調は「色の標準」（財団法人日本色彩研究
所、1964年）を用いて決定し、色相名とともに
括弧内に色相名、彩度番号、明度番号の順に色
相記号を記入した。 培養は25℃で行い、最も生育の旺盛な２〜３
週間目の各培地上における観察結果を第２表に
示した。但し第２表中、生育項目に記載した基
生菌糸表面の色は胞子着生前の培養一週間目に
おける観察結果を示しており、胞子着生が早く
基生菌糸表面の色の判定困難な培地について
は、記載していない。 【表】 可溶性 メラニン様ブラウン色素を生
色素 ずる
【表】 可溶性 生産しない
色素
(c) 生理的性質 １ 生育温度：５℃〜30℃附近で生育し、20〜
30℃で最もよく生育する。 ２ ゼラチンの液化：液化しない（グルコー
ス・ペプトン・ゼラチン培地上、25℃、３週
間培養）。 ３ スターチの加水分解：分解する（スターチ
寒天培地上、25℃、３週間培養）。 ４ 脱脂牛乳の凝固、ペプトン化：凝固、ペプ
トン化共にせず（30℃、３〜４週間培養）。 ５ メラニン様色素の生成：ペプトンイースト
鉄寒天、チロシン寒天で生成する（25℃、２
〜４日間）。 (d) 炭素源の同化性（30℃、10〜16日培養） Ｌ−アラビノース−シユクロース− Ｄ−キシロース−イノシトール− Ｄ−グルコース＋Ｌ−ラムノース− Ｄ−フラクトース−ラフイノース− (e) 細胞の化学分析 本菌株のデイアミノピメリン酸はメソ型であ
り、ヒドロキシデイアミノピメリン酸を含まな
い。細胞壁の糖組成は、アラビノース、キシロ
ース、マデユロース、ラムノース等を有せず、
ガラクトース、マンノース等を有する。又本菌
株はノカルドミコール酸を有しない。 以上の分析結果についてBergey's Manual of
the Dterminative Bacteriology第８版、657
頁〜658頁（1974年）や、レシエバリエ（Inter.J.
System.Bacteriol.20巻、435頁〜443頁、1970
年）、メイヤー（Int.J.Syst.Bacteriol.26巻、487
頁〜493頁1976年）らの分類法にしたがつて判定
すると、本菌は細胞壁類型（cell wall type）
型、糖組成類型（cell wall sugar pattern）Ｃ
型となる。 以上本菌は、細胞壁類型が、糖組成類型がＣ
であることから、レシエバリエの分類法によれば
ダソンビレイタイプのアクチノマデユーラ属、サ
ーモアクチノミセス属、アクチノビイフイダス
属、ゲオダーマトフイラス属のいづれかに属す
る。 しかし本菌は、その形態において気菌糸のすべ
てが胞子の長い連鎖から成り、基生菌糸を細かく
分断するが、内生胞子、遊走胞子、胞子のうが見
い出されないことより、ダソンビレイタイプのア
クチノマデユーラ属Genus Actinomadura
dassonvillei type）に同定するのが分類上妥当で
ある。なお、近年ダソンビレイタイプのアクチノ
マデユーラ属はメイヤーの提起した新属ノカルデ
イオプシス属に統合され、ノカルデイオプシス属
の名称で取り扱われることが一般的である。 そこで本菌は、ノカルデイオプシス属NO779
（Genus Nocardiopsis sp NO779）と称するこ
とにした。そして本菌は工業技術院微生物工業技
術研究所に寄託されており、その受託番号は「微
工研菌寄第6133号（FERM−ＰNo.6133）」であ
る。本菌は昭和59年３月21日に微工研条寄第512
号（FERM BP−512）としてブダベスト条約に
基づく国際寄託に移管された。 本発明で用いるホスホリパーゼDMを生産する
のに用いる使用菌としては、ノカルデイオプシス
属NO779および本菌株を変異処理した変異株だ
けでなく、ノカルデイオプシス属（旧属名アクチ
ノマデユーラ ダソンビレイタイプ属）に属しホ
スホリパーゼDMを生産する菌であれば全て利用
できる。 アクチノマデユーラ属NO362株［FERM−Ｐ
No.6132］の菌学的性状：− (a) 形態 澱粉無機塩寒天、チロシン寒天、酵母・麦芽
寒天、オートミール寒天培地等では良好に、ま
たグリセリンアスパラギン寒天では中程度に生
育して気菌糸の集落を着生する。 胞子を着生した菌叢の色は培地の種類、観察
時期により若干変化するが、おおむねやや紫味
を持つた灰白色から灰色を呈する。 シユークロース硝酸塩寒天、栄養寒天、グル
コースアスパラギン寒天では気菌糸を着生しな
いか、貧弱にしか着生しない。 寒天培地上に生育させた本菌株を顕微鏡で観
察すると、気菌糸は巾0.8〜1.2μで分枝し、一
部ループ状又は螺旋状をなし、屈曲を混じえな
がら主として直線状に長く伸び、先端はループ
状にゆるく巻いている場合が多い。 胞子は数10から100以上の連鎖状をなして着
生し、ほぼ気菌糸全体を形成する。 胞子の大きさは0.8〜1.2×1.2〜1.7μで、短円
筒又は卵形で、大きさ形ともやや不規則であ
る。 基生菌糸は巾0.6〜1.0μで、不規則な分枝を
もつて屈曲しながら伸長し、遊走胞子、胞子の
う、菌核等は形成されない。 また通常、隔壁、菌糸の分断は見られない
が、液体培養により菌糸の分断が見られること
もある。 (b) 各種培地状での性状 以下に記載する実験方法は、主としてイー・
ビー・シヤーリング（Int.J.Syst.Bacteriol.16
巻、313〜340、1966年）の方法にしたがつて行
つた。 色調は、「色の標準」（財団法人日本色彩研究
所、1964年）を用いて決定し、色相名とともに
括弧内に色相名、彩度番号、明度番号の順に色
相記号を記入した。 培養は25℃で行い、最も生育の旺盛な２〜３
週間目の各培地上における観察結果を第３表に
示した。但し第３表中、生育項目に記載した基
生菌糸表面の色は胞子着生前の培養一週間目に
おける観察結果を示しており、胞子着生が早く
基生菌糸表面の色の判定困難な培地については
記載していない。 【表】 可溶性 生産しない
色素
【表】 可溶性 生産しない
色素
(c) 生理的性質 １ 生育温度：10℃〜37℃附近で生育し、20〜
30℃で最もよく生育する。 ２ ゼラチンの液化：液化しない（グルコー
ス・ペプトン・ゼラチン培地上、25℃、３週
間培養）。 ３ スターチの加水分解：分解する（スターチ
寒天培地上、25℃、３週間培養）。 ４ 脱脂牛乳の凝固、ペプトン化：凝固せず、
ペプトン化する（30℃、３〜４週間培養）。 ５ メラニン様色素の生成：ペプトンイースト
鉄寒天、チロシン寒天で生成する（25℃、２
〜４日）。 (d) 炭素源の同化性（30℃、10〜16日培養） Ｌ−アラビノース＋シユークロース− Ｄ−キシロース＋イノシトール± Ｄ−グルコース＋Ｌ−ラムノース− Ｄ−フラクトース−ラフイノース− (e) 細胞の化学分析 本菌株のデイアミノピメリン酸はメソ型であ
り、細胞壁の糖組成は、アラビノース、キシロ
ース、ラムノース等を有せず、マデユロース、
ガラクトース、マンノース等を有する。 以上の分析結果についてBergey's Manual of
the Determinative Bacteriology第８版、657頁
〜658頁（1974年）や、レシエバリエ（Inter.J.
System.Bacteriol.20巻、435頁〜443頁、1970年）
等の分類法にしたがつて判定すると、本菌は細胞
壁類型（cell wall type）型、糖組成類型
（cell wall sugar pattern）Ｂ型となる。 以下本菌は、細胞壁類型が、糖組成類型がＢ
であることから、ミクロピスポラ属、ストレプト
スポランギウム属、スピリロスポラ属、ブラノモ
ノスポラ属、デルマトフイラス属、アクチノマデ
ユーラ属のいづれかに属する。しかし本菌はその
形態において多数の胞子から成る胞子連鎖を着生
し、菌核、胞子嚢、遊走胞子が見い出されないこ
とより、アクチノマデユーラ属（Genus
Actinomadura）に同定するのが分類学上、最も
妥当である。 そこで本菌は、アクチノマデラーラ属NO362
（Actinomadura sp NO362）と称することにし
た。そして本菌は工業技術院微生物工業技術研究
所に寄託されており、その受託番号は「微工研菌
寄第6132号（FERM Ｐ−6132）」である。本菌
は昭和59年３月21日に微工研条寄第511号
（FERM BP−511）としてブダベスト条約に基
づく国際寄託に移管された。 本発明で用いるホスホリパーゼDMを生産する
のに利用する使用菌としては、上記したアクチノ
マデユーラ属NO362、及び本菌株を変異処理し
た変異株だけでなく、アクチノマデユーラ属に属
しホスホリパーゼDMを生産する菌であれば全て
用いる事ができる。 本発明方法で利用するホスホリパーゼDMを、
上記例示の如きホスホリパーゼDM生産菌を用い
てするには、上記例示の如きホスホリパーゼDM
生産菌を培地に培養し、培養物よりホスホリパー
ゼDMを採取すればよい。その培養形態として
は、液体培養、固体培養いづれも用いることが出
来るが、工業的には深部通気撹拌培養を行うのが
有利である。 また使用する培養源としては、一般に微生物培
養に用いられる炭素源、窒素源、無機塩、及びそ
の他の微量栄養素の他、ノカルデイオプシス属や
アクチノマデユーラ属に属するホスホリパーゼ
DM生産微生物の利用することの出来る栄養源で
あれば、すべて使用することが出来る。 培地の炭素源としては、例えばブドウ糖、果
糖、シヨ糖、乳糖、澱粉、グリセリン、デキスト
リン、糖蜜、ソルビトール等の他、脂肪酸、油
脂、粗レシチン、アルコール、有機酸などを例示
でき、これらは単独でまたは組合せて用いること
ができる。 窒素源としては、無機窒素源、有機窒素源いづ
れでも利用可能であり、無機窒素源としては、例
えば硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、尿
素、硝酸ソーダ、燐酸１アンモニウム、燐酸２ア
ンモニウム、塩化アンモニウム等が挙げられ、ま
た有機窒素源としては、大豆、米、とうもろこ
し、綿実、菜種、小麦などの粉、糠、脱脂粕をは
じめ、コーンスチープリカー、ペプトン、酵母エ
キス、肉エキス、カゼイン、アミノ酸等が例示で
きる。 無機塩及び微量栄養素としては、例えばリン
酸、マグネシウム、カリウム、鉄、アルミニウ
ム、カルシウム、マンガン、亜鉛等の塩類の他、
ビタミン、非イオン界面活性剤、消泡剤等菌の生
育やホスホリパーゼDMの生産を促進する適当な
物質を例示でき、必要に応じて使用出来る。 培養は好気的条件で行なわれる。培養温度は菌
が発育し、ホスホリパーゼDMを生産する温度範
囲で適宜変更選択できるが、特に好ましいのは約
20〜約35℃である。 培養時間は条件により異なるが、ホスホリパー
ゼDMが最高生成量に達するまで培養すればよ
い。液体培養の場合は例えば１〜３日程度であ
る。 培養物中に生成したホスホリパーゼDMは、液
内培養では主として培養液中に溶けているので、
培養終了液より固形物を別して得られる培養
液よりホスホリパーゼDMを採取できる。 培養液中よりホスホリパーゼDMを採取する
に当つては、通常酵素精製に用いられるあらゆる
方法が利用出来る。例えば硫安、食塩等による塩
析、アセトン、エタノール、メタノール等の有機
溶剤による沈澱、透析、イオン交換クロマトグラ
フイー、吸着クロマトグラフイー、ゲル過、吸
着剤、等電点沈澱等の方法が使用出来る。さらに
これ等の方法を適当に組み合せることによつて、
ホスホリパーゼDMの精製効果が上る場合には、
組合せて行うことが出来る。 上述のようにして得ることのできる本発明方法
で利用できるホスホリパーゼDMは、たとえば安
定化剤として各種塩類、糖質、蛋白質、脂質、界
面活性剤等を加えるか、もしくは加えることな
く、減圧濃縮、減圧乾燥、凍結乾燥等の方法によ
り液状又は固形のホスホリパーゼDMの形態にす
ることが出来る。本発明方法で利用するホスホリ
パーゼDMの酵素活性測定法は、基質グリセロ燐
脂質に作用してリン酸と含窒素塩基とのエステル
結合を分解して生ずる塩基の量を測定して求め
る。ホスホリパーゼDMの活性は、特に記載しな
いかぎり、以下に記載するコリンオキシダーゼ法
により測定した。 力価測定法： １％卵黄精製レシチンエマルジヨン（0.1ｇレ
シチン、１mlエチルエーテル、10ml蒸留水の超音
波乳化液）0.1mlに、0.2MPH7.2トリス−塩酸緩衝
液0.1ml、0.1M CaCl2水溶液0.05ml、蒸留水0.15
mlを混合し、これに酵素液0.1mlを加え、37℃で
20分反応後、50ｍＭ EDTA−2Naを含む1Mト
リス−塩酸緩衝液（PH8.0）0.2mlを加え、直ちに
５分間煮沸して反応を完全に停止する。次にコリ
ンエステラーゼ測定用試薬〔日本商事(株)製造〕の
キツトに含まれるコリン呈色剤を呈色溶解液に溶
解した溶液４mlを加え、37℃で20分間反応させた
後、500nｍの吸光度を測定する。 対照としては、あらかじめ熱失活した酵素液を
用いて同様に反応させたものの吸光度を測定す
る。 そして１分間に1μモルのコリンを遊離する酵
素活性を１単位とする。 前述したノカルデイオプシス属NO779株及び
アクチノマデユーラ属NO362株の夫々を用い、
後記９精製方法に記載した方法により精製した酵
素標品を用いた本発明方法で利用できるホスホリ
パーゼDMの理化学的性質について以下にのべ
る。 １ 作用 グリセロリン脂質のリン酸と含窒素塩基との
エステル結合を分解してホスフアチジン酸と塩
基を遊離する。 ２ 基質特異性 基質としてレシチン、リゾレシチン、スフイ
ンゴミエリンのいづれか１つを0.5μモル含むエ
マルジヨン0.1mlを用い、蒸留水の代りに１％
Triton Ｘ−100を含む水溶液を用いる以外は、
上記力価測定法と同様にして反応させ遊離した
コリン量を測定し、各基質に対するホスホリパ
ーゼDM活性を測定した。その結果、レシチン
に対する活性を100とした時の相対活性は、 ノカルデイオプシス属ホスホリパーゼDM：− リゾレシチン4.9；スフインゴミエリン0.3、 アクチノマデユーラ属ホスホリパーゼDM：− リゾレシチン3.6；スフインゴミエリン0.3、 であつた。 ３ 至適PH 力価測定法において用いる緩衝液の代りにPH
3.0〜4.0では蟻酸・蟻酸ソーダ緩衝液、PH4.0〜
5.5では酢酸・酢酸ソーダ緩衝液、PH5.5〜8.5で
はトリス・マレイン酸・苛性ソーダ緩衝液、PH
7.0〜9.0ではトリス・塩酸緩衝液、PH9.0〜10.0
ではグリシン・苛性ソーダ緩衝液を用いてホス
ホリパーゼDMの活性を測定し、至適PHを求め
た。また同測定法で用いる蒸溜水0.15mlの代り
に１％Triton Ｘ−100（和光純薬）水溶液0.15
mlを用いた時の至適PHについても求めた。 その結果、蒸留水を用いた場合、 ノカルデイオプシス属ホスホリパーゼDM：− 至適PH７付近（6.5〜7.0）、 アクチノマデユーラ属ホスホリパーゼDM：− 至適PH７付近、 であり、１％Triton Ｘ−100水溶液を用いた
場合、 ノカルデイオプシス属ホスホリパーゼDM：− 至適PH５付近、 マクチノマデユーラ属ホスホリパーゼDM：− 至適PH5.5付近、 であつた。 ４ 至適温度 力価測定法において、反応温度条件を10、
20、25、37、40、50、55、60、70、80および90
℃で酵素活性を測定した。その結果、 ノカルデイオプシス属ホスホリパーゼDM：− 至適温度60℃〜80℃、とくには60℃〜70℃、 アクチノマデユーラ属ホスホリパーゼDM：− 至適温度55℃〜80℃、とくには60℃〜70℃、 と認められた。 ５ PH安定性 酵素溶液0.1mlに、ノカルデイオプシス属ホ
スホリパーゼDMの場合は0.2mlのアクチノマ
デユーラ属ホスホリパーゼDMの場合には0.9
mlの0.1Mの各種緩衝液、すなわちPH3.0〜3.5で
はグリシン・塩酸緩衝液、PH3.5〜7.0では酢
酸・酢酸ソーダ緩衝液、PH5.0〜8.0ではトリ
ス・マレイン酸・苛性ソーダ緩衝液、PH7.0〜
9.0ではトリス・塩酸緩衝液、PH9.0〜9.5ではグ
リシン・苛性ソーダ緩衝液を夫々加え、25℃で
２時間保つた。その後、これら酵素緩衝溶液に
0.5Mトリス・塩酸緩衝液（PH7.2）を、ノカル
デイオプシス属ホスホリパーゼDMの場合には
1.2ml、マクチノマデユーラ属ホスホリパーゼ
DMの場合には9.0ml加え、PHを7.0〜7.3とし
た。この溶液0.1mlを用い、力価測定法に従つ
て力価を測定し、安定PH範囲を調べた結果、 ノカルデイオプシス属ホスホリパーゼDM：− 特に安定なPH4.0〜7.0、 アクチノマデユーラ属ホスホリパーゼDM：− 特に安定なPH4.0〜8.0、 と認められた。 また、力価測定法で用いる蒸溜水0.15mlの代
りに１％Triton Ｘ−100水溶液0.15mlを用いる
土地は、上記と同様に操作してPH安定範囲を調
べたが、結果は上記したところと殆んど変らな
かつた。 ６ 熱安定性 酵素溶液0.1mlに0.1Mトリス−塩酸緩衝液
（PH7.2）を、ノカルデイオプシス属ホスホリパ
ーゼDMの場合には４ml、アクチノマデユーラ
属ホスホリパーゼDMの場合には9.9ml加え、
20、30、37、40、50、60および65℃に30分間放
置した後、残存する酵素活性を測定した。その
結果、 ノカルデイオプシス属ホスホリパーゼDM：− 30℃で30分の熱処理では殆んど失活せず、50
℃で30分の熱処理で80％の活性が残存、 アクチノマデユーラ属ホスホリパーゼDM：− 30℃で30分の熱処理では殆んど失活せず、50
℃で30分の熱処理で60％の活性が残存、 という結果であつた。 ７ 各種物質による影響 力価測定法においてCaCl2水溶液の代りに各
種物質の水溶液を0.05ml加え、酵素反応系中で
１ｍＭ濃度に成るようにして活性を測定した。
その結果は水添加の時の活性を100とし、相対
活性として賦活作用のあつたものは、 ノカルデイオプシス属ホスホリパーゼDM：− 例えば、AlCl3、CuSO4、ZnSO4、CoCl2、
CaCl2、FeCl3、FeSO4、MgCl2、SnCl2、デオ
キシコール酸ソーダ、エタノール、イソプロパ
ノール、ｔ−ブタノール、Triton Ｘ−100、 アクチノマデユーラ属ホスホリパーゼDM：− 例えば、AlCl3、CaCl2、FeSO4、FeCl3、
MgCl2、SnCl2、デオキシコール酸ソーダ、エ
タノール、イソプロパノール、ｔ−ブタノー
ル、 で、一方、阻害作用のあつたものは、 ノカルデイオプシス属ホスホリパーゼDM：− 例えば、ドデシル硫酸ソーダ、セチルピリジ
ニウムクロライド、 アクチノマデユーラ属ホスホリパーゼDM：− 例えば、セチルピリジニウムクロライド、 であつた。 ８ 力価の測定法 前述したとおりである。 ９ 精製方法 きな粉3.0ｇ、コーンスチープリカー1.0％、
ペプトン0.5ｇ、粉末酵母エキス0.1％、グルコ
ース1.0ｇ、NH4NO30.25％、K2HPO40.4％、
MgSO4・7H2O0.01％、ツウイン（Tween）−
85 0.1％から成る培地（PH6.0）約15を30
ジヤーフアーメンターに入れ、120℃で15分間
減菌後、シード培養液1.5を植菌し、27℃で
40時間培養を行つた。尚、上記シード培養液
は、澱粉１％（NH4）H2PO40.25％、ペプトン
0.25％、K2HPO40.2％、MgSO4・7H2O0.01％
を含む水溶液培地（PH6.8）100mlを500ml坂口
フラスコに入れ、蒸気殺菌後、ノカルデイオプ
シス属NO779株［FERM−Ｐ No.6133］又は
アクチノマデユーラ属NO362株［FERM−Ｐ
No.6132］の胞子を一白金耳接種し、培養温度
30℃、120回転／分の条件で２日間振盪培養し
て調製した。 培養後、菌体固形物を遠心分離により除去
し、遠心上清13（ノカルデイオプシス属
FERM−Ｐ No.6133株を用いた場合は0.54u／
ml；アクチノマデユーラ属FERM−Ｐ No.
6132株を用いた場合は1.7u／mlであつた。）を
得た。この遠心上清を５℃に冷却した後、−20
℃のアセトンを加えてアセトン濃度30〜70％画
分に相当するホスホリパーゼDMを含む沈澱物
を遠心分離により集めた。この沈澱物を、ノカ
ルデイオプシス属FERM−Ｐ No.6133株を用
いた場合はPH6.0、アクチノマデユーラ属
FERM−Ｐ No.6132株を用いた場合にはPH6.5
のトリマ−マレイン酸緩衝液に溶解し、0.02M
の同緩衝液に対して透析した後、同緩衝液で平
衡化したDEAE−セルロースに通塔し、通過区
分を集めた。次に堀内等の方法〔J.Biochem.
81、1639（1977）〕で調整したパルミトイルガー
ゼをカラムに充填し、充分に水洗してから上記
DEAE−セルロース通過液を注入し、活性を吸
着した。これを0.05Mトリス−塩酸緩衝液（PH
7.2）で洗浄後、0.2％Triton Ｘ−100を含む同
緩衝液を加え活性を溶出した。活性区分を集め
てバイオエンジニアリング社製の限外過膜
（Type Ｇ−10T）を用いて濃縮した後、ゲル
過担体としてトヨパールHW−55F〔東洋曹
達(株)製〕充填カラムに注入し、蒸留水を用いて
通塔し、活性区分を集めて凍結乾燥を行つた。 この乾燥粉末を、ノカルデイオプシス属ホス
ホリパーゼDMの場合には0.025Mイミダゾー
ル−塩酸（PH7.4）に溶解後、アクチノマデユ
ーラ属ホスホリパーゼDMの場合には0.025M
トリス−酢酸（PH8.3）に溶解後、フアルマシ
ア・フアインケミカルス社製のポリバツフア交
換体PBETN94（20ml）充填カラムに通塔して活
性を吸着後、同社製の溶出用ポリバツフア（PH
5.0）を用いてPH勾配により溶出した。溶出し
たホスホリパーゼDMの活性区分を集めて限外
過膜にて濃縮し、セフアデツクスＧ−75充填
カラムに通塔し、ホスホリパーゼDM活性区分
を集めて凍結乾燥した。 斯くて、ノカルデイオプシス属ホスホリパー
ゼDMの場合には、約40％の活性回収率で、比
活性178.3u／mg蛋白質として、アクチノマデユ
ーラ属ホスホリパーゼDMの場合には約43％の
活性回収率で、比活性218.3u／mg蛋白質とし
て、ホスホリパーゼDMが回収された。 等電点 ノカルデイオプシス属ホスホリパーゼDM：− 4.85±0.1（アンホライン電気泳動法により測
定） アクチノマデユーラ属ホスホリパーゼDM：− 6.4±0.1（アンホライン電気泳動法により測
定） 転移作用 従来公知のホスホリパーゼＤは、既述のよう
に、レシチンからホスフアチジン酸を生成し、
これを炭素数１から６までの直鎖の１級アルコ
ールに転移してエステルを形成することが知ら
れている。ホスホリパーゼDMについても同様
に転移作用を調べた結果、本酵素では、公知ホ
スホリパーゼＤでは転移を生じないことの記載
された一級アルコールを包含して、更に広範囲
のアルコールに転移が起りエステルが形成する
ことが判明した。 本発明方法で利用するホスホリパーゼDMは、
後記転移作用の実験方法（TLCによる転移生成
物の生成確認方法）に従つて反応を行い、C10一
級アルコール例えばゲラニオールとリン脂質例え
ばレシチンとの間におけるリン脂質一級アルコー
ル誘導体形成反応を触媒して、該リン脂質の該一
級アルコール誘導体を形成する。公知ホスホリパ
ーゼＤは、上記誘導体を形成しない。 本発明方法によれば、前記例示の如き式（）
リン脂質と前記例示の如き式（）一級アルコー
ルとを、上記に詳しく述べたホスホリパーゼDM
の存在下に反応させることにより、下記式（） 但し式中、Ａ及びＲは前記したと同義である、 で表わされるリン脂質一級アルコール誘導体を製
造することができる。この際、ホスホリパーゼ
DMは精製品として使用する必要はなく粗製品で
あつてもよい。更に、適当な固定化担体たとえば
ポリプロピレン膜、セライト粒、ガラスビーズな
どの如き各種の重合体樹脂類や無機材料の粒状物
やフイルム状物に担持固定化して利用することも
できる。 反応は、ホスホリパーゼDMの存在下で、好ま
しくは溶媒の存在下に、式（）リン脂質と式
（）一級アルコールとを接触せしめることによ
り行うことができる。利用する溶媒の例として
は、水性溶媒及び水性溶媒と有機溶媒との混合溶
媒を例示することができる。式（）一級アルコ
ールそれ自体に溶媒の役目を兼ねさせることもで
きる。また、ホスホリパーゼDMの酵素学的触媒
作用を阻害しない任意の他の添加剤を含む溶媒も
利用でき、たとえば該作用を促進したり、酵素の
安定化に役立つ適当な添加剤を含有した溶媒であ
ることができる。例えば、酢酸、クエン酸、リン
酸などの緩衝剤を含有したり、塩化カルシウムそ
の他の中性塩を含有したりした水性溶媒であるこ
とができる。更に、有機溶媒の例としては、式
（）一級アルコールそれ自体を包含して、例え
ば、ｎ−ヘプタン、ｎ−ヘキサンなどの如き脂肪
族炭化水素類；シクロペンタン、シクロヘキサ
ン、シクロブタンなどの如き脂環続炭化水素類；
ベンゼン、トルエン、キシレンなどの如き芳香族
炭化水素類；アセトン、メチルイソプロピルケト
ンなどの如きケトン類；ジメチルエーテル、ジエ
チルエーテル、ジイソプロピルエーテルなどの如
きエーテル類；酢酸メチル、酢酸エチルなどの如
きエステル類；四塩化炭素、クロロホルム、塩化
メチレンなどの如きハロゲン化炭化水素類；ジメ
チルホルムアミドの如きアミド溶媒類；ジメチル
スルホキシドの如きスルホキシド溶媒類などを例
示することができる。 水性溶媒を有機溶媒との混合溶媒の形で利用す
る場合の両者の混合比は適当に選択できるが、例
えば水性溶媒：有機溶媒（ｖ／ｖ比）の比で50：
１〜１：10の如き混合比を例示することができ
る。 反応モル比、ホスホリパーゼDMの使用量、溶
媒の使用量などは、適宜に選択できるが、例え
ば、式（）リン脂質１モルに対して式（）一
級アルコール約１：１〜約１：1000、好ましくは
約１：10〜約１：100モルの反応モル比を例示す
ることができる。また、ホスホリパーゼDMの使
用量としては、例えば、式（）リン脂質１ｇ当
り約10〜約100000、好ましくは約100〜約1000単
位程度の使用量を例示することができる。さら
に、溶媒の使用量としては、例えば、式（）リ
ン脂質に対して約10倍〜約500倍（容量）程度の
使用量を例示できる。 反応は、室温で進行するので、とくに冷却或は
加熱の必要はないが、所望により適宜に冷却もし
くは加温条件を採用することができる。例えば、
約０℃〜約90℃、好ましくは約20℃〜約60℃の如
き反応温度を例示することができる。また反応時
間も適宜に選択できるが、例えば約１分〜約10
日、好ましくは約0.1時間〜約72時間、更に好ま
しくは約１時間〜約72時間、とくに好ましくは約
１時間〜約24時間の如き反応時間を例示すること
ができる。所望により、たとえばTLC（薄層クロ
マトグラフイー）などの手法を利用して反応経過
を追跡し、所望の目的物の形成を確認することに
より反応時間を適宜に変更することができる。 ホスホリパーゼDMの存在下で式（）リン脂
質と式（）一級アルコールとを接触せしめる態
様は適宜に選択できるが、撹拌もしくは振盪条件
下で行うのが普通である。又、前記のように適当
な粒状物やフイルム状物担体に担持固定化した固
定化酵素の形でホスホリパーゼDMを利用する場
合には、例えば、固定化酵素膜もしくは固定化酵
素粒子層を介して反応組成液を循環ポンプを用い
て通過させる態様で行うことができる。 上述のようにして反応を行つた後、形成された
式（）リン脂質一級アルコール誘導体は、その
まゝ又は塩の形で沈澱させて分離し利用すること
ができる。更に、ケイ酸カラムクロマト、アルミ
ナカラムクロマト、高速液体クロマト、向流分
配、ゲル過、吸着クロマト等の適当な公知の方
法を利用して分離精製することができる。 本発明方法によれば、上述したようにして、式
（）リン脂質と式（）一級アルコールとを、
ホスホリパーゼDMの存在下に反応させて式
（）リン脂質一級アルコール誘導体を製造する
ことができる。 得られる式（）リン脂質一級アルコール誘導
体は、すぐれた界面活性作用を有し細胞膜の透過
性に大きな影響を持つ。この意味から、該式
（）誘導体はリポソーム形成基材として、又、
化粧品たとえばクリーム、乳液に配合して皮膚生
理に役立つ乳化剤として、更に脂肪系薬剤の乳化
剤、殺虫剤、除草剤などの如き農薬の乳化剤など
の広い乳化剤用途に有用である。 更に、多くの場合、リン脂質はそれぞれ特異な
生理活性を有することが知られているが、本発明
方法で得られる式（）誘導体の多くは、その近
似的構造を有するところから、各種の生理活性が
期待できる。又、一級アルコール水酸基を有する
或は一級アルコール水酸基を導入した薬理活性化
合物を、リン脂質に転移させることによつて、該
化合物の薬理的副作用を弱めたり或は薬理効果を
高めてその投与量を低減させたりすることも期待
できる。さらに又、上記薬理活性化合物をリン脂
質に転移させて、該化合物を患部に的確に集中さ
せるための薬理活性化合物のキヤリヤーとして、
さらには、薬理活性化合物の保護基として有用な
役割をはたすことも期待できる。 又更に、各種医薬品をはじめとする化学合成の
中間体として有用であり、例えば、反応性の高い
ハロゲンやアミン置換基を有するアルコールを転
移させた誘導体を利用できる。更に又三重水素や
14Cでラベルした一級アルコールを転移するこ
とによつてラベルされたリン脂質誘導体が得ら
れ、リン脂質の代謝経路の解明に利用する事もで
きる。 以下、実施例により本発明方法実施の数態様に
ついて、更に詳しく例示する。 参考例 １ ホスホリパーゼDMの調製。 前記精製方法の項に従つて、ノカルデイオプ
シス属NO779株〔FERM−Ｐ No.6133〕及びア
クチノマデユーラ属NO362株〔FERM−Ｐ No.
6132〕の夫々を用いて、該項に記載したとおりの
活性回収率及び比活性でホスホリパーゼDMを得
た。 実施例 １ （Run No.１〜No.91） 後掲第４表に示した下記式（）リン脂質 基質：Ｌ−α−レシチン，β，γ−ジミリスト
イル（シグマ社） （１，２−ジテトラデカノイル−sn−グリセロ
ール−３−ホスホリルコリン） 基質：Ｌ−α−レシチン，β，γ−ジヘキサデ
シル（カルビオケム−ベーリング社） （１，２−ジヘキサデシル−sn−グリセロール
−３−ホスホリルコリン） 基質：Ｌ−α−レシチン，β，γ−ヘキサデシ
リジン（同上） （１，２−シクロヘキサデシリデン−sn−グリ
セロール−３−ホスホリルコリン） 基質：β−レシチン−α，γ−ジパルミトイル
（同上） （１，３−ジヘキサデカノイル−グリセロール
−２−ホスホリルコリン） と、後掲第４表に示した多数種の式（）一級ア
ルコールとを、後記TLCによる転移生成物（リ
ン脂質一級アルコール）の生成確認方法に従つ
て、ホスホリパーゼDMの存在下で反応させて、
転移生成物の形成を確認した。そのRf値を後掲
第４表に示した。 TLCによる転移生成物の生成確認方法：− 下記組成 １％リン脂質乳化液 0.1ml 0.4M酢酸緩衝液（PH5.7） 0.1ml 0.1M塩化カルシウム水溶液 0.05ml 蒸留水 0.1ml 10％一級アルコール溶液 0.1ml の反応液に、ホスホリパーゼDM水溶液0.1ml
（0.2〜1.0u／0.1ml）を加え、37℃で１〜５時間静
置した。 尚、上記１％リン脂質乳化液は、リン脂質100
mgに、ジエチルエーテル１ml及び蒸留水10mlを加
え、氷冷条件下に、600W、20KHzの条件で５分
間超音波処理して形成する。上記反応液の形成に
際して、必要な場合には、水又はジエチルエーテ
ル、アセトン等の有機溶媒を加えて上記10％一級
アルコール溶液を調製した。 上記静置後、50ｍＭのEDTA（エチレンジアミ
ン四酢酸）水溶液0.2mlを加え、更にクロロホル
ム−メタノール混液（２：１容量比）５mlを加え
激しく撹拌し、脂質（生成物）を抽出した。この
懸濁液を2000×ｇの条件で10分間遠心処理し、下
層のクロロホルム層を分取し、30℃で減圧乾固し
た後、クロロホルム−メタノール混液（１：１容
量比）75μに溶解してTLCの試料とした。この
うち10μをシリカゲル薄層（フナゲル60Å、20
cm×20cmフナコシ薬品）にスポツトし、ジイソブ
チルケトン−酢酸−水（40：25：５）を展開溶媒
として展開した。スポツトの検出には下記の試薬
を用いた。検出されたスポツトで未分解の基質、
及びその加水分解物（ホスフアチジン酸及びその
類縁体）以外のリン脂質のスポツトが検出された
場合、これを転移生成物と認めた。 検出試薬 リン酸の呈色：Zinzadeの試薬（Beiss.U.J.
Chromatog.13 104、1964） 一級アミンの呈色：ニンヒドリン試薬（ニンヒド
リンの0.25％アセトン溶液） 二級アミンの呈色：次亜塩素酸−ベンジジン試薬
（Bischel M.C.らBiochim、Biophys、Acta
70 598 1963） プリン及びピリミジンの呈色：フルオレツセイン
−アンモニア試薬（Wieland T.らAngew
chem.63 511 1951） グリコール結合の呈色：過ヨウ素酸−シツフの試
薬（Shaw N.Biochim.Biophys.Acta.164 435
1968） 17−ケトステロイドの呈色：ｍ−ジニトロベンゼ
ン試薬（Jisboa B.P.J.Chromatog.16 136
1964） 比較例 １ 実施例１に於て、ホスホリパーゼDMの代り
に、キヤベツ由来の公知ホスホリパーゼＤ（Ｐ−
Ｌ Biochemicals Inc.）を用いるほかは、実施
例１と同様に行つた。その結果、後掲第４表に示
したすべての一級アルコールについて転移生成物
の生成は認められなかつた。 【表】 【表】 【表】 試薬を用いて呈色した。
実施例 ２ （Run No.１〜No.23） Ｌ−α−レシチン，β，γ−ジミリストイル
（シグマ ケミカル カンパニー製、純度98％）
400mg、ジエチルエーテルル１ml、蒸留水10mlを
超音波用セルに入れ、氷冷しながら600W、20K
Hzで５分間超音波処理をし、乳白色の乳化液を得
た。 このレシチン乳化液２ml（レシチン80mg）、
0.4M酢酸緩衝液（PH5.7）２ml、0.1M塩化カルシ
ウム水溶液１ml及び10％β−ヒドロキシエチルア
ニリン−ジエチルエーテル溶液２mlを共栓付試験
管中に入れ、ホスホリパーゼDM水溶液（2.5u／
ml）２mlを加えてよく混合した後、37℃で３時間
静置した。反応液に0.5N塩酸を0.5ml加えて反応
を停止した後更にクロロホルム−メタノール
（２：１）混液15mlを加えて、激しく混和し、リ
ン脂質を抽出した。この混合液を2000×ｇ10分間
遠心し、下層のクロロホルム層を分取した。 上層の水層にはもう一度クロロホルム10mlを加
えて、同様の抽出操作を行い、抽出液を合わせ、
次いで10mlの0.02N塩酸で洗つた。この混合液か
ら遠心によつて再びクロロホルム層を分取し、減
圧乾固した後、１mlのｎ−ヘキサン−２−プロパ
ノール−水（60：80：７）混液に溶解した。 この試料20μをシリカゲル薄層（フナゲルフ
ナコシ薬品）にスポツトし、ジイソブチルケトン
−酢酸−水（40：25：５）の溶媒系で展開したと
ころ、３種類のリン脂質が検出され、そのうちの
二つは、ホスフアチジン酸及びレシチンとRf値
が一致した。 この試料を高速液体クロマトグラフイーによつ
て精製した。カラムはラジアルパツクカートリツ
ジシリカ８mm×10cm（ウオーターズ社製）、溶離
液は上述したｎ−ヘキサン−２−プロパノール−
水＝60：80：７、流速２ml／分でピークの検出に
は441型紫外線検出器（ウオーターズ社）による
214nｍの吸収、及びR401型示差屈折計（同）を
用いた。試料は４回に分け0.25mlずつ注入した。 まずこの溶離液で混入しているβ−ヒドロキシ
エチルアニリン、及びホスフアチジン酸、ホスフ
アチジン酸のβ−ヒドロキシエチルアニリンエス
テルの３成分を分取し、次いで、溶離液をｎ−ヘ
キサン−２−プロパノール−水＝60：80：14とし
て、カラムに吸着している未分解のレシチンを溶
出した。得られた３種類のリン脂質は、それぞれ
もう一度同様の操作により高速液体クロマトグラ
フイーで精製した。 ３種類のリン脂質はホスフアチジン酸約10％、
転移生成物約80％未分解のレシチン約10％（モル
比）であり、約40mgの精製された転移生成物であ
るホスフアチジン酸のβ−ヒドロキシエチルアニ
リンエステルが得られた。この化合物のIRスペ
クトルは日本分光A202型赤外分光光度計を用い、
液膜法で測定した。その結果を第５表に示した
（Run No.14）。 第５表に示した他の式（）一級アルコールを
用いて、上記と同様に行つた。その結果を第５表
に示した（Run No.１〜13、15〜24及び26〜33）。
ただし、反応液に該一級アルコールを加える際、
そのアルコールの溶解性に応じて、適宜、水、又
はジエチルエーテル、あるいはアセトン溶液とし
て加えた。 【表】 【表】 【表】 【表】 実施例 ３ （Run No.１〜No.24） Ｌ−α−レシチンβ，γ−ジヘキサデシル（カ
ルビオケム−ベーリング社製）400mg、ジエチル
エーテル１ml及び蒸留水10mlの混合物を実施例２
と同様の方法で乳化させ、この乳化液２mlを用い
て、以下、実施例２と同様の方法で反応を行なつ
た。ただし、一級アルコールとして、チアミン塩
酸塩の10％水溶液を用いた。 この反応液を実施例２と同様に処理して、転移
生成物30mgを得た。この化合物のIRスペクトル
を第６表に示した（Run No.23）。 第６表に示した他の式（）一級アルコールを
用いて、上記と同様に行つた。その結果を第６表
に示した（Run No.１〜22及び24）。 【表】 【表】 実施例 ４ （Run No.１〜No.24） Ｌ−α−レシチンβ，γ−ヘキサデシリジン
（カルビオケム−ベーリング社製）400mgを実施例
２と同様の方法で乳化し、80mg相当の乳化液を用
い、転移反応の受容体としてゲラニオールを加え
以下、実施例２と同様の方法で反応、抽出、精製
を行なつた。その結果、転移生成物50mgを得た。
この化合物のIRスペクトルを第７表に示した
（Run No.４）。 第７表に示した他の式（）一級アルコールを
用いて上記と同様に行つた。その結果を第７表に
示した（Run No.１〜３及び５〜24）。 【表】 【表】 【表】 実施例 ５ （Run No.１〜No.24） β−レシチン、α，γ−ジヘキサデカノイル
（カルビオケム−ベーリング社製）400mgを実施例
２と同様に乳化し、80mg相当の乳化液を用い、転
移反応の受容体としてパントテニルアルコールを
加えて、以下実施例２と同様の方法で、反応、抽
出、精製を行なつた。その結果、転移生成物25mg
を得た。この化合物のIRスペクトルを第８表に
示した（Run No.９）。 第８表に示した他の式（）一級アルコールを
用いて上記と同様に行なつた。その結果を第８表
に示した（Run No.１〜８及び10〜24）。 【表】 【表】 【表】 実施例 ６ （Run No.１〜No.５） Ｌ−α−ホスフアチジルエタノールアミン、
β，γ−ジミリストイル（）、Ｌ−α−ホスフ
アチジル−Ｎ−メチルエタノールアミン、β，γ
−ジミリストイル（）、Ｌ−α−ホスフアチジ
ル−DL−グリセロールβ，γ−ジミストイル
（）（以上、いずれもカルビオケム−ベーリング
社）、Ｌ−α−ホスフアチジルセリン（）（シグ
マ社）、及びS.F.Yangら（J.Biol.Chem 242、
477、1967）の方法で調整したＬ−α−ホスフア
チジエタノール、β，γ−ジミリストイル（）
を、実施例２と同様の方法で乳化した。各リン脂
質50mgを含む乳化液1.5mlをそれぞれ別の共栓付
試験管に入れ、アルコールとしてゲラニオールの
10％ジエチルエーテル溶液10ml、0.4M酢酸緩衝
液１ml、蒸留水１ml、0.01M塩化カルシウム水溶
液0.5mlを加えて、更に、この反応液を600W、
20KHz、１分間超音波処理した。次いで各反応液
にホスホリパーゼDM水溶液（8u／ml）１mlづつ
加え、37℃で６時間静置した。以下、リン脂質の
抽出及び精製は実施例２と同様に処理し、共通の
転移生成物であるホスフアチジン酸−ゲラニオー
ルエステルを得た。収量はに対して12mg、に
対して20mg、に対して10mg、に対して24mg、
に対して22mgであつた。 そのIRスペクトルを第９表に示した。 【表】
ル誘導体の製法に関し、従来酵素法によつて製造
できないとされていたリン脂質一級アルコール誘
導体を包含して広い範囲のリン脂質一級アルコー
ル誘導体の製造を可能とした酵素法リン脂質一級
アルコール誘導体の製法に関する。更に詳しく
は、従来酵素法で使用されたキヤベツ由来のホス
ホリパーゼＤ（至適温度40℃以下、至適PH5.4〜
5.6）とは異なつて、至適温度60〜70℃、至適PH
７付近のホスホリパーゼDMの存在下で、リン脂
質と一級アルコールとを反応させるリン脂質一級
アルコール誘導体の製法に関する。 尚、本発明に於て、リン脂質一級アルコール誘
導体とは、出発物質であるリン脂質のリン酸構造
部分と該リン脂質の（塩基もしくは）アルコール
構造部分とのエステル結合を、ホスホリパーゼ
DMの作用で加水分解すると同時に、上記反応に
用いる一級アルコールへ転移させて誘導した、出
発物質とは異なる新しいリン脂質を意味する。 特に、本発明は、下記式（） 但し式中、Ａは下記(i)又は(ii) 【式】 【式】 を示し、ここで、R1及びR2は共に−Ｏ−COR11
であるか、もしくは共に−Ｏ−R12であるか、も
しくは式(i)においてR1とR2は一緒になつて
【式】〔ここで、ｎは11〜19の数 を示す〕を表わし、上記に於て、R11及びR12は
同一でも異つていてもよく、夫々、C7〜C21の飽
和もしくは不飽和の脂肪族炭化水素基を示し、 Ｂは−（CH2）2N（CH3）3、−（CH2）2NH2、−
CH2CH（NH2）COOH、−CH2CH2NH（CH3）、−
CH2CH2N（CH3）2、−CH2CHOHCH2OHもしく
は−（CH2）nＨ〔ここで、ｍは１〜５の数を示す〕
を示す、 で表わされるリン脂質と、下記式（） Ｒ−OH ……（） 但し式中、Ｒは下記(1)〜(3)よりなる群からえら
ばれた員を示す、 (1) C6（ただし、ヘキサノールを除く）〜C26の飽
和もしくは不飽和の脂肪族又は芳香族炭化水素
残基、ここで該炭化水素残基はハロゲン、アミ
ノ、アセチル及び水酸基より選ばれた置換基で
置換されていてもよい、 又は 分子内にエーテル、エステル及びアミド結合
よりなる群からえらばれた結合を有する上記炭
化水素残基、 (2) プレグナン系ステロイド化合物残基、 (3) ガラクトノ−γ−ラクトン、Ｎ（２−ヒドロ
キシエチル）フタルイミド、２−（３−インド
ール）エタノール、２−（２−ヒドロキシエチ
ル）ピリジン、ピリドキシン、Ｎ（２−ヒドロ
キシエチル）モルホリン、５−ヒドロキシメチ
ルシトシン、シチジン、ウリジン、アラビノシ
チジン、チアミン、２−（２−ヒドロキシエチ
ル）ピペラジン、アデノシン、グアノシン及び
サイクロシチジンより成る群からえらばれた複
素環化合物残基、 で表わされる一級アルコールとを、ホスホリパー
ゼDMの存在下に反応させることを特徴とする下
記式（） 但し式中、Ａ及びＲは上記したと同義である、
で表わされるリン脂質一級アルコール誘導体の製
法に関する。 従来、ホスホリパーゼＤが、リン脂質たとえば
ホスフアチジルコリンのコリン塩基−リン酸エス
テルを加水分解し、遊離塩基とホスフアチジン酸
を生ずる反応を触媒することが知られている
〔M.Kates Can.J.Biochem.Physiol.32 571
（1954）〕。 更に、リン脂質たとえばレシチンとエチルアル
コールとをホスホリパーゼＤの存在下に反応させ
ると、リン脂質のリン酸構造部分と該リン脂質の
アルコール構造部分とのエステル結合が加水分解
されると同時にホスフアチジル基転移作用によ
り、ホスフアチジルエタノールを生成することが
報告されている〔R.M..Dawson；Biochem.J.、
102、205（1967）〕：〔S.F.Yang；J.Biol.Chem.、
242、477（1967）〕。 上述のようなホスホリパーゼＤのホスフアチジ
ル基転移作用が知られて以来、この分野における
研究が進められ、英国特許No.1581810（対応西ドイ
ツ国公開No.2717547）の提案が知られている。こ
の提案によれば、この提案の一般式で示されたリ
ン脂質と、水酸基、ハロゲン、アミノその他の置
換基で置換されていてもよいC5までの直鎖もし
くは分枝のアルキル基を有する一級アルコールと
の前記キヤベツ由来のホスホリパーゼＤの酵素作
用を利用した一級アルコール転移反応について開
示されている。そして、該反応は、５を超える炭
素原子を含有しない一級アルコールでのみ起り、
若し、５を超える炭素原子を含有する該アルコー
ルの場合には、反応の主生成物は対応するホスフ
アチジン酸であると記載されている。更に、該提
案にはアルコール成分の選択は、上記の要求を満
した一級アルコールである限りとくべつな制約の
ないことも記載されている。 又、上記提案の発明者等であるS.Kovatchev及
びH.Eibl等は、Adv.Exp.Med.Biol.、Vol.101、
221（1978）に於て、ホスホリパーゼＤの酵素作用
を利用した一級アルコール転移反応について、
C7−C10のアルカノールでは転移反応が認められ
ないがC6のヘキサノールについては20％の転移
反応が生じたと報告している。一方、
Rokhimov、M.Mは、Uzb.Biol.Zh.、Vol.3、６
−９（1979）に於て、C5以上のアルコール例えば
C6のヘキサノールについては転移反応は起らな
かつたと報告している。 本発明者等は、従来公知のキヤベル由来ホスホ
リパーゼＤとは、その至適温度、至適PH等で異な
るホスホリパーゼＤ生産能を有する微生物の存在
を発見して、既に、特願昭56−161076号、特願昭
56−163475号に提案した。 更に研究を進めた結果、該ホスホリパーゼＤ生
産性微生物の生産する酵素は、C6以上の一級ア
ルコール（ただし、ヘキサノールを除く）を包含
して、従来、リン脂質一級アルコール誘導体を形
成できないとされていた及び従来全く言及された
ことのない前記(1)、(2)及び(3)よりなる群からえら
ばれた一級アルコールとの転移反応を可能とする
酵素的触媒作用を示すという驚くべき事実を発見
した。 本発明者等の研究によれば、リン脂質とたとえ
ばC10一級アルコールであるゲラニオールとの間
におけるリン脂質一級アルコール誘導体の形成を
触媒する本発明に於て新たにホスホリパーゼDM
と呼称する酵素が存在し、このホスホリパーゼ
DMの存在下に、前記式（）で表わされるリン
脂質と前記式（）の一級アルコールとを反応さ
せることにより、従来製造できないと云われてい
たリン脂質一級アルコール誘導体を包含して新し
い誘導体を製造できることが発見された。 斯くて、煩雑且つ不利益な化学的合成手段を要
することなしに、温和且つ容易な条件及び手段
で、副反応を伴うおそれもなしに、酵素法によつ
て新しいリン脂質一級アルコール誘導体を好収率
で製造できることがわかつた。 従つて、本発明の目的は新しい酵素法リン脂質
一級アルコール誘導体の製法を提供するにある。 本発明の上記目的及び更に多くの他の目的なら
びに利点は、以下の記載から一層明らかとなるで
あろう。 本発明方法で利用する原料リン脂質は下記式
（）で表わされる。 但し式中、Ａは下記(i)又は(ii) 【式】 【式】 を示し、ここで、R1及びR2は共に−Ｏ−COR11
であるか、もしくは共に−Ｏ−R12であるか、も
しくは式(i)においてR1とR2は一緒になつて
【式】〔ここで、ｎは11〜19の数 を示す〕を表わし、上記に於て、R11及びR12は
同一でも異つていてもよく、夫々、C7〜C21の飽
和もしくは不飽和の脂肪族炭化水素基を示し、 Ｂは−（CH2）2N（CH3）3、−（CH2）2NH2、−
CH2CH（NH2）COOH、−CH2CH2NH（CH3）、−
CH2CH2N（CH3）2、−CH2CHOHCH2OHもしく
は−（CH2）nＨ〔ここで、ｍは１〜５の数を示す〕
を示す。 上記式（）原料リン脂質は公知化合物であつ
て、市場でも入手可能であり、それ自体公知の方
法によつて天然物より抽出採取又は合成すること
ができる。例えば、動植物組織から公知の手段で
抽出して得られるレシチン、ケフアリン、ホスフ
アチジルセリン、ホスフアチジル−Ｎ−メチルエ
タノールアミン、ホスフアチジル−Ｎ，Ｎ−ジメ
チルエタノールアミン、ホスフアチジルグリセロ
ール、ホスフアチジン酸アルキルエステル等の単
独或いは混合物をそのまま若しくは精製して用い
ることができるし、β型リン脂質やアルキルエー
テル型リン脂質についても、それ自体公知の方法
によつてその構造の一部もしくは全部を化学合成
して利用することができる。 本発明方法に於て、上記式（）原料リン脂質
とホスホリパーゼDMの存在下に反応せしめる一
級アルコールは、下記式（）で表わされる。 Ｒ−OH ……（） 但し式中、Ｒは下記(1)〜(3)よりなる群からえら
ばれた員を示す、 (1) C6（ただし、ヘキサノールを除く）〜C26の飽
和もしくは不飽和の脂肪族又は芳香族炭化水素
残基、ここで該炭化水素残基はハロゲン、アミ
ノ、アセチル及び水酸基より選ばれた置換基で
置換されていてもよい、 又は 分子内にエーテル、エステル及びアミド結合
よりなる群からえらばれた結合を有する上記炭
化水素残基、 (2) プレグナン系ステロイド化合物残基、 (3) ガラクトノ−γ−ラクトン、Ｎ（２−ヒドロ
キシエチル）フタルイミド、２−（３−インド
ール）エタノール、２−（２−ヒドロキシエチ
ル）ピリジン、ピリドキシン、Ｎ（２−ヒドロ
キシエチル）モルホリン、５−ヒドロキシメチ
ルシトシン、シチジン、ウリジン、アラビノシ
チジン、チアミン、２−（２−ヒドロキシエチ
ル）ピペラジン、アデノシン、グアノシン及び
サイクロシチジンより成る群からえらばれた複
素環化合物残基。 このような式（）一級アルコールの具体例と
しては、下記のような一級アルコールを例示する
ことができる。 上記(1)の群に属する一級アルコールの例として
は、脂肪族アルコールのうち置換基をもたないも
のとしては１−ヘプタノール（C7）、１−オクタ
ノール（C8）、２−エチル−１−ヘキサノール
（C8）、１−ノナノール（C9）、１−デカノール
（C10）、１−ウンデカノール（C11）、１−ドデカ
ノール（C12）、１−テトラデカノール（C14）、１
−ヘキサデカノール（C16）、１−オクタデカノー
ル（C18）、１−ドコサノール（C20）、１−エイコ
サノール（C22）、１−ヘキサコサノール（C26）、
ゲラニオール（C10）、シトロネロール（C10）、フ
アルネソール（C15）、フイトール（C20）など；
多価アルコールとしては１，６−ヘキサンジオー
ル（C6）、１，２，６−ヘキサントリオール
（C6）、ソルビトール（C6）マンニトール（C6）、
２−ｎ−ブチル−２−エチル−１，３−プロパン
ジオール（C9）、２−エチル−１，３−ヘキサン
ジオール（C8）、１，１，１−トリス（ヒドロキ
シメチル）プロパン（C6）、３，３−ビス（ヒド
ロキシメチル）ヘプタン（C9）、１，10−デカン
ジオール（C10）、１，12−ドデカンジオール
（C12）、トリメチロールプロパン、ジペンタエリ
スリトール、ガラクチトールなど；アミノ基をも
つものとしては６−アミノ−１−ヘキサノール
（C6）、トリエタノールアミン、Ｎ−ブチルジエ
タノールアミン、セリンエチルエステル、ジヒド
ロキシエチルグリシン、スフインゴシン（C18）、
Ｎ−メチルペンタノールアミン、Ｎ−メチルヘキ
サノールアミン、Ｎ−エチルブタノールアミン、
Ｎ−エチルペンタノールアミン、Ｎ−エチルヘキ
サノールアミン、Ｎ−プロピルプロパノールアミ
ン、Ｎ−プロピルブタノールアミン、Ｎ−プロピ
ルペンタノールアミン、Ｎ−プロピルヘキサノー
ルアミン、Ｎ−ブチルエタノールアミン、Ｎ−ブ
チルプロパノールアミン、Ｎ−ブチルブタノール
アミン、Ｎ−ブチルペンタノールアミン、Ｎ−ブ
チルヘキサノールアミン、Ｎ−ペンチルエタノー
ルアミン、Ｎ−ヘキシルエタノールアミン、Ｎ，
Ｎ−ジメチルブタノールアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチ
ルペンタノールアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチルヘキサ
ノールアミン、Ｎ，Ｎ−ジエチルエタノールアミ
ン、Ｎ，Ｎ−ジエチルプロパノールアミン、Ｎ，
Ｎ−ジエチルブタノールアミン、Ｎ，Ｎ−ジエチ
ルペンタノールアミン、Ｎ，Ｎ−ジエチルヘキサ
ノールアミン、Ｎ，Ｎ−ジプロピルエタノールア
ミン、Ｎ，Ｎ−ジプロピルプロパノールアミン、
Ｎ，Ｎ−ジプロピルブタノールアミン、Ｎ，Ｎ−
ジプロピルペンタノールアミン、Ｎ，Ｎ−ジプロ
ピルヘキサノールアミン、Ｎ，Ｎ−ジブチルプロ
パノールアミン、Ｎ，Ｎ−ジブチルブタノールア
ミン、Ｎ，Ｎ−ジブチルペンタノールアミン、
Ｎ，Ｎ−ジブチルヘキサノールアミン、Ｎ，Ｎ−
ジペンチルエタノールアミン、Ｎ，Ｎ−ジヘキシ
ルエタノールアミン、Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルプ
ロパノールアミン、Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルブタ
ノールアミン、Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルペンタノ
ールアミン、Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルヘキサノー
ルアミン、Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリエチルエタノールア
ミン、Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリエチルプロパノールアミ
ン、Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリエチルブタノールアミン、
Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリエチルペンタノールアミン、
Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリエチルヘキサノールアミン、
Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリプロピルエタノールアミン、
Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリプロピルプロパノールアミン、
Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリプロピルブタノールアミン、
Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリプロピルペンタノールアミン、
Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリプロピルヘキサノールアミン、
Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリブチルエタノールアミン、Ｎ，
Ｎ，Ｎ−トリブチルプロパノールアミン、Ｎ，
Ｎ，Ｎ−トリブチルブタノールアミン、Ｎ，Ｎ，
Ｎ−トリブチルペンタノールアミン、Ｎ，Ｎ，Ｎ
−トリブチルヘキサノールアミン、Ｎ，Ｎ，Ｎ−
トリペンチルエタノールアミン、Ｎ，Ｎ，Ｎ−ト
リヘキシルエタノールアミン、Ｎ，Ｎ−ジブチル
エタノールアミン、Ｎ−（３−アミノプロピル）
ジエタノールアミン、など；カルボキシル基をも
つものとして、16−ヒドロキシヘキサデカン酸
（C16）、グルコン酸、ガラクトン酸など；ハロゲ
ン基を持つものとして、６−クロロ−１−ヘキサ
ノール（C6）など、エステル結合を有するもの
としてモノラウリン（C15）、モノオレイン
（C21）、１，２−ジラウリン（C27）、１，２−ジ
ステアリン（C39）、メタクリル酸２−ヒドロキシ
エチル（C6）、エチレングリコールモノラウレー
ト、ジエチレングリコールモノラウレート、エチ
レングリコールモノステアレート、ジエチレング
リコールモノステアレート、エチレングリコール
モノオレート、ジエチレングリコールモノオレー
ト、エチレングリコールモノパルミテート、ジエ
チレングリコールモノパルミテートなど；アミド
結合を有するものとしてパントテニルアルコール
（C9）、パンテテイン（C11）、トリ−Ｌ−セリン、
Ｌ−セリル−Ｌ−ロイシン、Ｌ−セリル−Ｌ−メ
チオニン、Ｌ−セリル−Ｌ−アルギニン、Ｌ−セ
リル−Ｌ−リジン、Ｌ−セリル−Ｌ−グルタミ
ン、Ｎ−カプリロイルエタノールアミン、Ｎ−カ
プロイルエタノールアミン、Ｎ−ラウロイルエタ
ノールアミン、Ｎ−ミリストイルエタノールアミ
ン、Ｎ−パルミトイルエタノールアミン、Ｎ−ス
テアロイルエタノールアミン、Ｎ−オレオイルエ
タノールアミン、Ｎ−パルミトオレオイルエタノ
ールアミン、Ｎ−リノロイルエタノールアミン、
Ｎ−リノレイルエタノールアミン、Ｎ−アラキド
ノイルエタノールアミン、Ｎ−エイコサノイルエ
タノールアミン、Ｎ−ドコサノイルエタノールア
ミン、ラウリン酸ジエタノールアミド、ステアリ
ン酸ジエタノールアミド、オレイン酸ジエタノー
ルアミド、パルミチン酸ジエタノールアミド、ト
リオキシエチレンラウリン酸アミド、テトラオキ
シエチレンラウリルエーテル硫酸トリエタノール
アミン、ラウリル硫酸トリエタノールアミンな
ど；エーテル結合を有するものとして、トリエチ
レングリコール（C6）、ジエチレングリコールモ
ノブチルエーテル（C8）、エチレングリコールモ
ノラウリルエーテル、ジエチレングリコールモノ
ラウリルエーテル、エチレングリコールモノセチ
ルエーテル、ジエチレングリコールモノセチルエ
ーテル、エチレングリコールモノステアリルエー
テル、ジエチレングリコールモノステアリルエー
テル、エチレングリコールモノオレイルエーテ
ル、ジエチレングリコールモノオレイルエーテ
ル、エチレングリコールモノブチルエーテル、エ
チレングリコールモノ（２−ジエチルアミノエチ
ル）エーテル、エチレングリコールモノヘキシル
エーテル、エチレングリコールモノトリルエーテ
ル、ジエチレングリコールモノエチルエーテル、
ジエチレングリコールモノヘキシルエーテル、テ
トラエチレングリコール、ペンタエチレングリコ
ール、ヘキサエチレングリコール、オクタエチレ
ングリコール、デカエチレングリコール、ドデカ
エチレングリコール、ジグリセロール、トリグリ
セロール、テトラグリセロール、ペンタグリセロ
ール、ヘシサグリセロール、ヘプタグリセロー
ル、オクタグリセロールなどが例示でき、又、芳
香族アルコールではベンジルアルコール（C7）、
β−フエネチルアルコール（C8）、３−フエニル
−１−プロパノール（C9）、ケイ皮アルコール
（C9）Ｌ−セリル−Ｌ−チロシン、Ｌ−セリル−
Ｌ−フエニルアラニン、Ｌ−セリンベンジルエス
テル、Ｌ−セリンβ−ナフチルアミド、Ｌ−ジニ
トロフエニル−Ｌ−セリン、Ｎ−（１−ジメチル
アミノナフタレン−５−スルフオニル）−Ｌ−セ
リン、エチレングリコールモノベンジルエーテ
ル、エチレングリコールモノオクチルフエノール
エーテル、ジエチレングリコールモノオクチルフ
エノールエーテル、エチレングリコールモノノニ
ルフエノールエーテル、ジエチレングリコールモ
ノノニルフエノールエーテルなど；置換基をもつ
ものとしてはｐ−クロルベンジルアルコール
（C7）、ｐ−アミノフエネチルアルコール（C8）、
Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−ｍ−
トルイジン（C11）、β−ヒドロキシエチルアニリ
ン（C8）、Ｎ−（２−シアノエチル）−Ｎ−（２−
ヒドロキシエチル）−アニリン（C11）、Ｎ−フエ
ニルジエタノールアミン（C10）、アニスアルコー
ル（C8）、１，４−ジ（２−ヒドロキシエトキ
シ）ベンゼン（C10）、エチレングリコールモノフ
エニルエーテル（C8）、メフエネシン（C10）、２
−ヒドロキシエチルサリチル酸（C9）エチレン
グリコールモノクロロフエニルエーテルなど；多
環化合物ではＯ，Ｏ−ビス（２−ヒドロキシエチ
ル）テトラブロムビスフエノール（C19）、２−ナ
フタリンエタノール（C12）などが例示でき、更
に、脂環式アルコールではレチノール（C20）、
１，４−ジヒドロキシメチルシクロヘキサン
（C8）、などを例示することができる。 又、上記(2)の群に属する一級アルコールの例と
しては、アルドステロン、コルチコステロン、コ
ルチゾン、デヒドロコルチコステロン、デオキシ
コルチコステロン、ハイドロコルチゾン、プレド
ニゾロン、プレドニゾン、テトラヒドロコルチゾ
ール、テトラヒドロコルチゾン、トリアムシノロ
ンなどを例示することができる。 更に、上記(3)の群に属する一級アルコールの例
としては、ガラクトノ−γ−ラクトン、Ｎ−（２
−ヒドロキシエチル）フタルイミド、２−（３−
インドール）エタノール、２−（２−ヒドロキシ
エチル）ピリジン、ピリドキシン、ピリドキサー
ル、ピリドキサミン、Ｎ−（２−ヒドロキシエチ
ル）モルホリン、５−ヒドロキシメチルシトシ
ン、シチジン、ウリジン、アラビノシチジン、ア
デノシン、グアノシン、サイクロシチジン、アデ
ニンデオキシリボシド、シトシンデオキシリボシ
ド、グアニンデオキシリボシド、５−ヒドロキシ
メチルウラシル、チミンデオキシリボシド、ウラ
シルデオキシリボシド、イノシン、オロチジン、
２−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン、チア
ミン、トキソピリミジンなどを例示することがで
きる。 上記例示の如き式（）一級アルコールは、天
然物、合成品いずれでも利用できるが、目的とす
る一級アルコール以外のアルコールを含まないよ
うに予め適当な公知手段を用い精製して利用する
のが好ましい。このような精製手段の例として
は、たとえば、蒸留、再結晶、アルミナ、シリカ
ゲル、活性炭、イオン交換樹脂などを用いたカラ
ムクロマトグラフイー、薄層クロマトグラフイー
及びこれらの適当な組み合わせ精製手段を例示で
きる。 本発明方法によれば、前記例示の如き式（）
リン脂質と上記例示の如き式（）一級アルコー
ルとをホスホリパーゼDMの存在下に反応させ
る。 この際利用するホスホリパーゼDMとしては、
従来公知のキヤベツから抽出されたホスホリパー
ゼＤの至適温度40℃以下、至適PH5.4〜5.6に対し
て、至適温度60〜70℃、至適PH７付近である点で
公知ホスホリパーゼＤと区別できるホスホリパー
ゼDM生産菌の生産するホスホリパーゼDMが例
示できる。該ホスホリパーゼDMは、C10一級ア
ルコールであるゲラニオールと式（）リン脂質
との間におけるリン脂質一級アルコール誘導体の
形成を触媒する点でも公知ホスホリパーゼＤと区
別できる。 このようなホスホリパーゼDM生産菌の例とし
ては、同一出願人の出願に係わる特願昭56−
161076号に開示されたノカルデイオプシス
（Nocardiopsis）属に属するホスホリパーゼDM
生産菌たとえばノルカデイオプシス属NO779株
〔FERM−Ｐ No.6133〕、同一出願人の出願に係
わる特願昭56−163475号に開示されたアクチノマ
デユーラ（Actinomadura）属に属するホスホリ
パーゼDM生産菌たとえばアクチノマデユーラ属
NO362株〔FERM−Ｐ No.6132〕等を挙げるこ
とができる。至適温度及び至適PHの相違と共に他
のいくつかの相違点と共に、下掲第１表に、本発
明方法で利用するホスホリパーゼDMと公知ホス
ホリパーゼＤとの酵素学的性質の差異を示した。 【表】 【表】 公知ホスホリパーゼＤを用いては得られなかつ
たリン脂質一級アルコール誘導体が、本発明方法
で形成できる理由には、この酵素的触媒反応に関
与する公知ホスホリパーゼＤと本発明方法で用い
るホスホリパーゼDMとの上記の如き酵素学的性
質の差異が関与しているものと推測される。勿
論、本発明方法はこのような作用の推測によつて
何等の制約もうけるものではない。 本発明方法で利用できるホスホリパーゼDMを
生産する前記ホスホリパーゼDM生産菌ノカルデ
イオプシス属NO779株［FERM−Ｐ No.6133］
及びアクチノマデユーラ属NO362株［FERM−
Ｐ No.6132］の菌学的性状及びそれらが生産する
ホスホリパーゼDMの力価測定法、理化学的性質
について以下に述べる。 ノカルデイオプシス属NO779株［FERM−Ｐ
No.6133］の菌学的性状：− (a) 形態 グルコースアスパラギン寒天、グリセリンア
スパラギン寒天、酵母麦芽寒天培地等では良好
に、また澱粉無機塩培地では中程度に生育して
気菌糸の集落を着生する。 胞子を着生した菌叢の色は培地の種類、観察
時期により若干変化するが、おおむね白色ない
し灰白色から明るい灰色を呈する。 シユークロース硝酸塩寒天、栄養寒天、オー
トミール寒天培地では気菌糸を着生しないか、
貧弱にしか着生しない。 寒天培地上に生育させた本菌株を顕微鏡で観
察すると、気菌糸は0.5〜0.8μで直線状でゆる
く波形又は屈曲を混じえながら分枝をもつて長
く伸び、気菌糸全体は数10から100ケ以上のす
べて胞子からなる連鎖によつて形成されてい
る。 胞子の大きさは0.5〜0.8×0.7×1.0μで、ほぼ
短円筒形で大きさはやや不規則である。 基生菌糸は巾0.5〜0.8μで分枝をもつて伸長
し、寒天培地上ではかならずしも分断しない
が、液体培養することによりほとんどの場合細
かく分断する。 しかし遊走胞子、胞子のう、菌核等は形成さ
れない。 (b) 各種培地上での性状 以下に記載する実験方法は主としてイー・ビ
ー・シヤーリング（Int.J.Syst.Bacteriol.16巻、
313〜340、1966年）の方法にしたがつて行つ
た。 色調は「色の標準」（財団法人日本色彩研究
所、1964年）を用いて決定し、色相名とともに
括弧内に色相名、彩度番号、明度番号の順に色
相記号を記入した。 培養は25℃で行い、最も生育の旺盛な２〜３
週間目の各培地上における観察結果を第２表に
示した。但し第２表中、生育項目に記載した基
生菌糸表面の色は胞子着生前の培養一週間目に
おける観察結果を示しており、胞子着生が早く
基生菌糸表面の色の判定困難な培地について
は、記載していない。 【表】 可溶性 メラニン様ブラウン色素を生
色素 ずる
【表】 可溶性 生産しない
色素
(c) 生理的性質 １ 生育温度：５℃〜30℃附近で生育し、20〜
30℃で最もよく生育する。 ２ ゼラチンの液化：液化しない（グルコー
ス・ペプトン・ゼラチン培地上、25℃、３週
間培養）。 ３ スターチの加水分解：分解する（スターチ
寒天培地上、25℃、３週間培養）。 ４ 脱脂牛乳の凝固、ペプトン化：凝固、ペプ
トン化共にせず（30℃、３〜４週間培養）。 ５ メラニン様色素の生成：ペプトンイースト
鉄寒天、チロシン寒天で生成する（25℃、２
〜４日間）。 (d) 炭素源の同化性（30℃、10〜16日培養） Ｌ−アラビノース−シユクロース− Ｄ−キシロース−イノシトール− Ｄ−グルコース＋Ｌ−ラムノース− Ｄ−フラクトース−ラフイノース− (e) 細胞の化学分析 本菌株のデイアミノピメリン酸はメソ型であ
り、ヒドロキシデイアミノピメリン酸を含まな
い。細胞壁の糖組成は、アラビノース、キシロ
ース、マデユロース、ラムノース等を有せず、
ガラクトース、マンノース等を有する。又本菌
株はノカルドミコール酸を有しない。 以上の分析結果についてBergey's Manual of
the Dterminative Bacteriology第８版、657
頁〜658頁（1974年）や、レシエバリエ（Inter.J.
System.Bacteriol.20巻、435頁〜443頁、1970
年）、メイヤー（Int.J.Syst.Bacteriol.26巻、487
頁〜493頁1976年）らの分類法にしたがつて判定
すると、本菌は細胞壁類型（cell wall type）
型、糖組成類型（cell wall sugar pattern）Ｃ
型となる。 以上本菌は、細胞壁類型が、糖組成類型がＣ
であることから、レシエバリエの分類法によれば
ダソンビレイタイプのアクチノマデユーラ属、サ
ーモアクチノミセス属、アクチノビイフイダス
属、ゲオダーマトフイラス属のいづれかに属す
る。 しかし本菌は、その形態において気菌糸のすべ
てが胞子の長い連鎖から成り、基生菌糸を細かく
分断するが、内生胞子、遊走胞子、胞子のうが見
い出されないことより、ダソンビレイタイプのア
クチノマデユーラ属Genus Actinomadura
dassonvillei type）に同定するのが分類上妥当で
ある。なお、近年ダソンビレイタイプのアクチノ
マデユーラ属はメイヤーの提起した新属ノカルデ
イオプシス属に統合され、ノカルデイオプシス属
の名称で取り扱われることが一般的である。 そこで本菌は、ノカルデイオプシス属NO779
（Genus Nocardiopsis sp NO779）と称するこ
とにした。そして本菌は工業技術院微生物工業技
術研究所に寄託されており、その受託番号は「微
工研菌寄第6133号（FERM−ＰNo.6133）」であ
る。本菌は昭和59年３月21日に微工研条寄第512
号（FERM BP−512）としてブダベスト条約に
基づく国際寄託に移管された。 本発明で用いるホスホリパーゼDMを生産する
のに用いる使用菌としては、ノカルデイオプシス
属NO779および本菌株を変異処理した変異株だ
けでなく、ノカルデイオプシス属（旧属名アクチ
ノマデユーラ ダソンビレイタイプ属）に属しホ
スホリパーゼDMを生産する菌であれば全て利用
できる。 アクチノマデユーラ属NO362株［FERM−Ｐ
No.6132］の菌学的性状：− (a) 形態 澱粉無機塩寒天、チロシン寒天、酵母・麦芽
寒天、オートミール寒天培地等では良好に、ま
たグリセリンアスパラギン寒天では中程度に生
育して気菌糸の集落を着生する。 胞子を着生した菌叢の色は培地の種類、観察
時期により若干変化するが、おおむねやや紫味
を持つた灰白色から灰色を呈する。 シユークロース硝酸塩寒天、栄養寒天、グル
コースアスパラギン寒天では気菌糸を着生しな
いか、貧弱にしか着生しない。 寒天培地上に生育させた本菌株を顕微鏡で観
察すると、気菌糸は巾0.8〜1.2μで分枝し、一
部ループ状又は螺旋状をなし、屈曲を混じえな
がら主として直線状に長く伸び、先端はループ
状にゆるく巻いている場合が多い。 胞子は数10から100以上の連鎖状をなして着
生し、ほぼ気菌糸全体を形成する。 胞子の大きさは0.8〜1.2×1.2〜1.7μで、短円
筒又は卵形で、大きさ形ともやや不規則であ
る。 基生菌糸は巾0.6〜1.0μで、不規則な分枝を
もつて屈曲しながら伸長し、遊走胞子、胞子の
う、菌核等は形成されない。 また通常、隔壁、菌糸の分断は見られない
が、液体培養により菌糸の分断が見られること
もある。 (b) 各種培地状での性状 以下に記載する実験方法は、主としてイー・
ビー・シヤーリング（Int.J.Syst.Bacteriol.16
巻、313〜340、1966年）の方法にしたがつて行
つた。 色調は、「色の標準」（財団法人日本色彩研究
所、1964年）を用いて決定し、色相名とともに
括弧内に色相名、彩度番号、明度番号の順に色
相記号を記入した。 培養は25℃で行い、最も生育の旺盛な２〜３
週間目の各培地上における観察結果を第３表に
示した。但し第３表中、生育項目に記載した基
生菌糸表面の色は胞子着生前の培養一週間目に
おける観察結果を示しており、胞子着生が早く
基生菌糸表面の色の判定困難な培地については
記載していない。 【表】 可溶性 生産しない
色素
【表】 可溶性 生産しない
色素
(c) 生理的性質 １ 生育温度：10℃〜37℃附近で生育し、20〜
30℃で最もよく生育する。 ２ ゼラチンの液化：液化しない（グルコー
ス・ペプトン・ゼラチン培地上、25℃、３週
間培養）。 ３ スターチの加水分解：分解する（スターチ
寒天培地上、25℃、３週間培養）。 ４ 脱脂牛乳の凝固、ペプトン化：凝固せず、
ペプトン化する（30℃、３〜４週間培養）。 ５ メラニン様色素の生成：ペプトンイースト
鉄寒天、チロシン寒天で生成する（25℃、２
〜４日）。 (d) 炭素源の同化性（30℃、10〜16日培養） Ｌ−アラビノース＋シユークロース− Ｄ−キシロース＋イノシトール± Ｄ−グルコース＋Ｌ−ラムノース− Ｄ−フラクトース−ラフイノース− (e) 細胞の化学分析 本菌株のデイアミノピメリン酸はメソ型であ
り、細胞壁の糖組成は、アラビノース、キシロ
ース、ラムノース等を有せず、マデユロース、
ガラクトース、マンノース等を有する。 以上の分析結果についてBergey's Manual of
the Determinative Bacteriology第８版、657頁
〜658頁（1974年）や、レシエバリエ（Inter.J.
System.Bacteriol.20巻、435頁〜443頁、1970年）
等の分類法にしたがつて判定すると、本菌は細胞
壁類型（cell wall type）型、糖組成類型
（cell wall sugar pattern）Ｂ型となる。 以下本菌は、細胞壁類型が、糖組成類型がＢ
であることから、ミクロピスポラ属、ストレプト
スポランギウム属、スピリロスポラ属、ブラノモ
ノスポラ属、デルマトフイラス属、アクチノマデ
ユーラ属のいづれかに属する。しかし本菌はその
形態において多数の胞子から成る胞子連鎖を着生
し、菌核、胞子嚢、遊走胞子が見い出されないこ
とより、アクチノマデユーラ属（Genus
Actinomadura）に同定するのが分類学上、最も
妥当である。 そこで本菌は、アクチノマデラーラ属NO362
（Actinomadura sp NO362）と称することにし
た。そして本菌は工業技術院微生物工業技術研究
所に寄託されており、その受託番号は「微工研菌
寄第6132号（FERM Ｐ−6132）」である。本菌
は昭和59年３月21日に微工研条寄第511号
（FERM BP−511）としてブダベスト条約に基
づく国際寄託に移管された。 本発明で用いるホスホリパーゼDMを生産する
のに利用する使用菌としては、上記したアクチノ
マデユーラ属NO362、及び本菌株を変異処理し
た変異株だけでなく、アクチノマデユーラ属に属
しホスホリパーゼDMを生産する菌であれば全て
用いる事ができる。 本発明方法で利用するホスホリパーゼDMを、
上記例示の如きホスホリパーゼDM生産菌を用い
てするには、上記例示の如きホスホリパーゼDM
生産菌を培地に培養し、培養物よりホスホリパー
ゼDMを採取すればよい。その培養形態として
は、液体培養、固体培養いづれも用いることが出
来るが、工業的には深部通気撹拌培養を行うのが
有利である。 また使用する培養源としては、一般に微生物培
養に用いられる炭素源、窒素源、無機塩、及びそ
の他の微量栄養素の他、ノカルデイオプシス属や
アクチノマデユーラ属に属するホスホリパーゼ
DM生産微生物の利用することの出来る栄養源で
あれば、すべて使用することが出来る。 培地の炭素源としては、例えばブドウ糖、果
糖、シヨ糖、乳糖、澱粉、グリセリン、デキスト
リン、糖蜜、ソルビトール等の他、脂肪酸、油
脂、粗レシチン、アルコール、有機酸などを例示
でき、これらは単独でまたは組合せて用いること
ができる。 窒素源としては、無機窒素源、有機窒素源いづ
れでも利用可能であり、無機窒素源としては、例
えば硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、尿
素、硝酸ソーダ、燐酸１アンモニウム、燐酸２ア
ンモニウム、塩化アンモニウム等が挙げられ、ま
た有機窒素源としては、大豆、米、とうもろこ
し、綿実、菜種、小麦などの粉、糠、脱脂粕をは
じめ、コーンスチープリカー、ペプトン、酵母エ
キス、肉エキス、カゼイン、アミノ酸等が例示で
きる。 無機塩及び微量栄養素としては、例えばリン
酸、マグネシウム、カリウム、鉄、アルミニウ
ム、カルシウム、マンガン、亜鉛等の塩類の他、
ビタミン、非イオン界面活性剤、消泡剤等菌の生
育やホスホリパーゼDMの生産を促進する適当な
物質を例示でき、必要に応じて使用出来る。 培養は好気的条件で行なわれる。培養温度は菌
が発育し、ホスホリパーゼDMを生産する温度範
囲で適宜変更選択できるが、特に好ましいのは約
20〜約35℃である。 培養時間は条件により異なるが、ホスホリパー
ゼDMが最高生成量に達するまで培養すればよ
い。液体培養の場合は例えば１〜３日程度であ
る。 培養物中に生成したホスホリパーゼDMは、液
内培養では主として培養液中に溶けているので、
培養終了液より固形物を別して得られる培養
液よりホスホリパーゼDMを採取できる。 培養液中よりホスホリパーゼDMを採取する
に当つては、通常酵素精製に用いられるあらゆる
方法が利用出来る。例えば硫安、食塩等による塩
析、アセトン、エタノール、メタノール等の有機
溶剤による沈澱、透析、イオン交換クロマトグラ
フイー、吸着クロマトグラフイー、ゲル過、吸
着剤、等電点沈澱等の方法が使用出来る。さらに
これ等の方法を適当に組み合せることによつて、
ホスホリパーゼDMの精製効果が上る場合には、
組合せて行うことが出来る。 上述のようにして得ることのできる本発明方法
で利用できるホスホリパーゼDMは、たとえば安
定化剤として各種塩類、糖質、蛋白質、脂質、界
面活性剤等を加えるか、もしくは加えることな
く、減圧濃縮、減圧乾燥、凍結乾燥等の方法によ
り液状又は固形のホスホリパーゼDMの形態にす
ることが出来る。本発明方法で利用するホスホリ
パーゼDMの酵素活性測定法は、基質グリセロ燐
脂質に作用してリン酸と含窒素塩基とのエステル
結合を分解して生ずる塩基の量を測定して求め
る。ホスホリパーゼDMの活性は、特に記載しな
いかぎり、以下に記載するコリンオキシダーゼ法
により測定した。 力価測定法： １％卵黄精製レシチンエマルジヨン（0.1ｇレ
シチン、１mlエチルエーテル、10ml蒸留水の超音
波乳化液）0.1mlに、0.2MPH7.2トリス−塩酸緩衝
液0.1ml、0.1M CaCl2水溶液0.05ml、蒸留水0.15
mlを混合し、これに酵素液0.1mlを加え、37℃で
20分反応後、50ｍＭ EDTA−2Naを含む1Mト
リス−塩酸緩衝液（PH8.0）0.2mlを加え、直ちに
５分間煮沸して反応を完全に停止する。次にコリ
ンエステラーゼ測定用試薬〔日本商事(株)製造〕の
キツトに含まれるコリン呈色剤を呈色溶解液に溶
解した溶液４mlを加え、37℃で20分間反応させた
後、500nｍの吸光度を測定する。 対照としては、あらかじめ熱失活した酵素液を
用いて同様に反応させたものの吸光度を測定す
る。 そして１分間に1μモルのコリンを遊離する酵
素活性を１単位とする。 前述したノカルデイオプシス属NO779株及び
アクチノマデユーラ属NO362株の夫々を用い、
後記９精製方法に記載した方法により精製した酵
素標品を用いた本発明方法で利用できるホスホリ
パーゼDMの理化学的性質について以下にのべ
る。 １ 作用 グリセロリン脂質のリン酸と含窒素塩基との
エステル結合を分解してホスフアチジン酸と塩
基を遊離する。 ２ 基質特異性 基質としてレシチン、リゾレシチン、スフイ
ンゴミエリンのいづれか１つを0.5μモル含むエ
マルジヨン0.1mlを用い、蒸留水の代りに１％
Triton Ｘ−100を含む水溶液を用いる以外は、
上記力価測定法と同様にして反応させ遊離した
コリン量を測定し、各基質に対するホスホリパ
ーゼDM活性を測定した。その結果、レシチン
に対する活性を100とした時の相対活性は、 ノカルデイオプシス属ホスホリパーゼDM：− リゾレシチン4.9；スフインゴミエリン0.3、 アクチノマデユーラ属ホスホリパーゼDM：− リゾレシチン3.6；スフインゴミエリン0.3、 であつた。 ３ 至適PH 力価測定法において用いる緩衝液の代りにPH
3.0〜4.0では蟻酸・蟻酸ソーダ緩衝液、PH4.0〜
5.5では酢酸・酢酸ソーダ緩衝液、PH5.5〜8.5で
はトリス・マレイン酸・苛性ソーダ緩衝液、PH
7.0〜9.0ではトリス・塩酸緩衝液、PH9.0〜10.0
ではグリシン・苛性ソーダ緩衝液を用いてホス
ホリパーゼDMの活性を測定し、至適PHを求め
た。また同測定法で用いる蒸溜水0.15mlの代り
に１％Triton Ｘ−100（和光純薬）水溶液0.15
mlを用いた時の至適PHについても求めた。 その結果、蒸留水を用いた場合、 ノカルデイオプシス属ホスホリパーゼDM：− 至適PH７付近（6.5〜7.0）、 アクチノマデユーラ属ホスホリパーゼDM：− 至適PH７付近、 であり、１％Triton Ｘ−100水溶液を用いた
場合、 ノカルデイオプシス属ホスホリパーゼDM：− 至適PH５付近、 マクチノマデユーラ属ホスホリパーゼDM：− 至適PH5.5付近、 であつた。 ４ 至適温度 力価測定法において、反応温度条件を10、
20、25、37、40、50、55、60、70、80および90
℃で酵素活性を測定した。その結果、 ノカルデイオプシス属ホスホリパーゼDM：− 至適温度60℃〜80℃、とくには60℃〜70℃、 アクチノマデユーラ属ホスホリパーゼDM：− 至適温度55℃〜80℃、とくには60℃〜70℃、 と認められた。 ５ PH安定性 酵素溶液0.1mlに、ノカルデイオプシス属ホ
スホリパーゼDMの場合は0.2mlのアクチノマ
デユーラ属ホスホリパーゼDMの場合には0.9
mlの0.1Mの各種緩衝液、すなわちPH3.0〜3.5で
はグリシン・塩酸緩衝液、PH3.5〜7.0では酢
酸・酢酸ソーダ緩衝液、PH5.0〜8.0ではトリ
ス・マレイン酸・苛性ソーダ緩衝液、PH7.0〜
9.0ではトリス・塩酸緩衝液、PH9.0〜9.5ではグ
リシン・苛性ソーダ緩衝液を夫々加え、25℃で
２時間保つた。その後、これら酵素緩衝溶液に
0.5Mトリス・塩酸緩衝液（PH7.2）を、ノカル
デイオプシス属ホスホリパーゼDMの場合には
1.2ml、マクチノマデユーラ属ホスホリパーゼ
DMの場合には9.0ml加え、PHを7.0〜7.3とし
た。この溶液0.1mlを用い、力価測定法に従つ
て力価を測定し、安定PH範囲を調べた結果、 ノカルデイオプシス属ホスホリパーゼDM：− 特に安定なPH4.0〜7.0、 アクチノマデユーラ属ホスホリパーゼDM：− 特に安定なPH4.0〜8.0、 と認められた。 また、力価測定法で用いる蒸溜水0.15mlの代
りに１％Triton Ｘ−100水溶液0.15mlを用いる
土地は、上記と同様に操作してPH安定範囲を調
べたが、結果は上記したところと殆んど変らな
かつた。 ６ 熱安定性 酵素溶液0.1mlに0.1Mトリス−塩酸緩衝液
（PH7.2）を、ノカルデイオプシス属ホスホリパ
ーゼDMの場合には４ml、アクチノマデユーラ
属ホスホリパーゼDMの場合には9.9ml加え、
20、30、37、40、50、60および65℃に30分間放
置した後、残存する酵素活性を測定した。その
結果、 ノカルデイオプシス属ホスホリパーゼDM：− 30℃で30分の熱処理では殆んど失活せず、50
℃で30分の熱処理で80％の活性が残存、 アクチノマデユーラ属ホスホリパーゼDM：− 30℃で30分の熱処理では殆んど失活せず、50
℃で30分の熱処理で60％の活性が残存、 という結果であつた。 ７ 各種物質による影響 力価測定法においてCaCl2水溶液の代りに各
種物質の水溶液を0.05ml加え、酵素反応系中で
１ｍＭ濃度に成るようにして活性を測定した。
その結果は水添加の時の活性を100とし、相対
活性として賦活作用のあつたものは、 ノカルデイオプシス属ホスホリパーゼDM：− 例えば、AlCl3、CuSO4、ZnSO4、CoCl2、
CaCl2、FeCl3、FeSO4、MgCl2、SnCl2、デオ
キシコール酸ソーダ、エタノール、イソプロパ
ノール、ｔ−ブタノール、Triton Ｘ−100、 アクチノマデユーラ属ホスホリパーゼDM：− 例えば、AlCl3、CaCl2、FeSO4、FeCl3、
MgCl2、SnCl2、デオキシコール酸ソーダ、エ
タノール、イソプロパノール、ｔ−ブタノー
ル、 で、一方、阻害作用のあつたものは、 ノカルデイオプシス属ホスホリパーゼDM：− 例えば、ドデシル硫酸ソーダ、セチルピリジ
ニウムクロライド、 アクチノマデユーラ属ホスホリパーゼDM：− 例えば、セチルピリジニウムクロライド、 であつた。 ８ 力価の測定法 前述したとおりである。 ９ 精製方法 きな粉3.0ｇ、コーンスチープリカー1.0％、
ペプトン0.5ｇ、粉末酵母エキス0.1％、グルコ
ース1.0ｇ、NH4NO30.25％、K2HPO40.4％、
MgSO4・7H2O0.01％、ツウイン（Tween）−
85 0.1％から成る培地（PH6.0）約15を30
ジヤーフアーメンターに入れ、120℃で15分間
減菌後、シード培養液1.5を植菌し、27℃で
40時間培養を行つた。尚、上記シード培養液
は、澱粉１％（NH4）H2PO40.25％、ペプトン
0.25％、K2HPO40.2％、MgSO4・7H2O0.01％
を含む水溶液培地（PH6.8）100mlを500ml坂口
フラスコに入れ、蒸気殺菌後、ノカルデイオプ
シス属NO779株［FERM−Ｐ No.6133］又は
アクチノマデユーラ属NO362株［FERM−Ｐ
No.6132］の胞子を一白金耳接種し、培養温度
30℃、120回転／分の条件で２日間振盪培養し
て調製した。 培養後、菌体固形物を遠心分離により除去
し、遠心上清13（ノカルデイオプシス属
FERM−Ｐ No.6133株を用いた場合は0.54u／
ml；アクチノマデユーラ属FERM−Ｐ No.
6132株を用いた場合は1.7u／mlであつた。）を
得た。この遠心上清を５℃に冷却した後、−20
℃のアセトンを加えてアセトン濃度30〜70％画
分に相当するホスホリパーゼDMを含む沈澱物
を遠心分離により集めた。この沈澱物を、ノカ
ルデイオプシス属FERM−Ｐ No.6133株を用
いた場合はPH6.0、アクチノマデユーラ属
FERM−Ｐ No.6132株を用いた場合にはPH6.5
のトリマ−マレイン酸緩衝液に溶解し、0.02M
の同緩衝液に対して透析した後、同緩衝液で平
衡化したDEAE−セルロースに通塔し、通過区
分を集めた。次に堀内等の方法〔J.Biochem.
81、1639（1977）〕で調整したパルミトイルガー
ゼをカラムに充填し、充分に水洗してから上記
DEAE−セルロース通過液を注入し、活性を吸
着した。これを0.05Mトリス−塩酸緩衝液（PH
7.2）で洗浄後、0.2％Triton Ｘ−100を含む同
緩衝液を加え活性を溶出した。活性区分を集め
てバイオエンジニアリング社製の限外過膜
（Type Ｇ−10T）を用いて濃縮した後、ゲル
過担体としてトヨパールHW−55F〔東洋曹
達(株)製〕充填カラムに注入し、蒸留水を用いて
通塔し、活性区分を集めて凍結乾燥を行つた。 この乾燥粉末を、ノカルデイオプシス属ホス
ホリパーゼDMの場合には0.025Mイミダゾー
ル−塩酸（PH7.4）に溶解後、アクチノマデユ
ーラ属ホスホリパーゼDMの場合には0.025M
トリス−酢酸（PH8.3）に溶解後、フアルマシ
ア・フアインケミカルス社製のポリバツフア交
換体PBETN94（20ml）充填カラムに通塔して活
性を吸着後、同社製の溶出用ポリバツフア（PH
5.0）を用いてPH勾配により溶出した。溶出し
たホスホリパーゼDMの活性区分を集めて限外
過膜にて濃縮し、セフアデツクスＧ−75充填
カラムに通塔し、ホスホリパーゼDM活性区分
を集めて凍結乾燥した。 斯くて、ノカルデイオプシス属ホスホリパー
ゼDMの場合には、約40％の活性回収率で、比
活性178.3u／mg蛋白質として、アクチノマデユ
ーラ属ホスホリパーゼDMの場合には約43％の
活性回収率で、比活性218.3u／mg蛋白質とし
て、ホスホリパーゼDMが回収された。 等電点 ノカルデイオプシス属ホスホリパーゼDM：− 4.85±0.1（アンホライン電気泳動法により測
定） アクチノマデユーラ属ホスホリパーゼDM：− 6.4±0.1（アンホライン電気泳動法により測
定） 転移作用 従来公知のホスホリパーゼＤは、既述のよう
に、レシチンからホスフアチジン酸を生成し、
これを炭素数１から６までの直鎖の１級アルコ
ールに転移してエステルを形成することが知ら
れている。ホスホリパーゼDMについても同様
に転移作用を調べた結果、本酵素では、公知ホ
スホリパーゼＤでは転移を生じないことの記載
された一級アルコールを包含して、更に広範囲
のアルコールに転移が起りエステルが形成する
ことが判明した。 本発明方法で利用するホスホリパーゼDMは、
後記転移作用の実験方法（TLCによる転移生成
物の生成確認方法）に従つて反応を行い、C10一
級アルコール例えばゲラニオールとリン脂質例え
ばレシチンとの間におけるリン脂質一級アルコー
ル誘導体形成反応を触媒して、該リン脂質の該一
級アルコール誘導体を形成する。公知ホスホリパ
ーゼＤは、上記誘導体を形成しない。 本発明方法によれば、前記例示の如き式（）
リン脂質と前記例示の如き式（）一級アルコー
ルとを、上記に詳しく述べたホスホリパーゼDM
の存在下に反応させることにより、下記式（） 但し式中、Ａ及びＲは前記したと同義である、 で表わされるリン脂質一級アルコール誘導体を製
造することができる。この際、ホスホリパーゼ
DMは精製品として使用する必要はなく粗製品で
あつてもよい。更に、適当な固定化担体たとえば
ポリプロピレン膜、セライト粒、ガラスビーズな
どの如き各種の重合体樹脂類や無機材料の粒状物
やフイルム状物に担持固定化して利用することも
できる。 反応は、ホスホリパーゼDMの存在下で、好ま
しくは溶媒の存在下に、式（）リン脂質と式
（）一級アルコールとを接触せしめることによ
り行うことができる。利用する溶媒の例として
は、水性溶媒及び水性溶媒と有機溶媒との混合溶
媒を例示することができる。式（）一級アルコ
ールそれ自体に溶媒の役目を兼ねさせることもで
きる。また、ホスホリパーゼDMの酵素学的触媒
作用を阻害しない任意の他の添加剤を含む溶媒も
利用でき、たとえば該作用を促進したり、酵素の
安定化に役立つ適当な添加剤を含有した溶媒であ
ることができる。例えば、酢酸、クエン酸、リン
酸などの緩衝剤を含有したり、塩化カルシウムそ
の他の中性塩を含有したりした水性溶媒であるこ
とができる。更に、有機溶媒の例としては、式
（）一級アルコールそれ自体を包含して、例え
ば、ｎ−ヘプタン、ｎ−ヘキサンなどの如き脂肪
族炭化水素類；シクロペンタン、シクロヘキサ
ン、シクロブタンなどの如き脂環続炭化水素類；
ベンゼン、トルエン、キシレンなどの如き芳香族
炭化水素類；アセトン、メチルイソプロピルケト
ンなどの如きケトン類；ジメチルエーテル、ジエ
チルエーテル、ジイソプロピルエーテルなどの如
きエーテル類；酢酸メチル、酢酸エチルなどの如
きエステル類；四塩化炭素、クロロホルム、塩化
メチレンなどの如きハロゲン化炭化水素類；ジメ
チルホルムアミドの如きアミド溶媒類；ジメチル
スルホキシドの如きスルホキシド溶媒類などを例
示することができる。 水性溶媒を有機溶媒との混合溶媒の形で利用す
る場合の両者の混合比は適当に選択できるが、例
えば水性溶媒：有機溶媒（ｖ／ｖ比）の比で50：
１〜１：10の如き混合比を例示することができ
る。 反応モル比、ホスホリパーゼDMの使用量、溶
媒の使用量などは、適宜に選択できるが、例え
ば、式（）リン脂質１モルに対して式（）一
級アルコール約１：１〜約１：1000、好ましくは
約１：10〜約１：100モルの反応モル比を例示す
ることができる。また、ホスホリパーゼDMの使
用量としては、例えば、式（）リン脂質１ｇ当
り約10〜約100000、好ましくは約100〜約1000単
位程度の使用量を例示することができる。さら
に、溶媒の使用量としては、例えば、式（）リ
ン脂質に対して約10倍〜約500倍（容量）程度の
使用量を例示できる。 反応は、室温で進行するので、とくに冷却或は
加熱の必要はないが、所望により適宜に冷却もし
くは加温条件を採用することができる。例えば、
約０℃〜約90℃、好ましくは約20℃〜約60℃の如
き反応温度を例示することができる。また反応時
間も適宜に選択できるが、例えば約１分〜約10
日、好ましくは約0.1時間〜約72時間、更に好ま
しくは約１時間〜約72時間、とくに好ましくは約
１時間〜約24時間の如き反応時間を例示すること
ができる。所望により、たとえばTLC（薄層クロ
マトグラフイー）などの手法を利用して反応経過
を追跡し、所望の目的物の形成を確認することに
より反応時間を適宜に変更することができる。 ホスホリパーゼDMの存在下で式（）リン脂
質と式（）一級アルコールとを接触せしめる態
様は適宜に選択できるが、撹拌もしくは振盪条件
下で行うのが普通である。又、前記のように適当
な粒状物やフイルム状物担体に担持固定化した固
定化酵素の形でホスホリパーゼDMを利用する場
合には、例えば、固定化酵素膜もしくは固定化酵
素粒子層を介して反応組成液を循環ポンプを用い
て通過させる態様で行うことができる。 上述のようにして反応を行つた後、形成された
式（）リン脂質一級アルコール誘導体は、その
まゝ又は塩の形で沈澱させて分離し利用すること
ができる。更に、ケイ酸カラムクロマト、アルミ
ナカラムクロマト、高速液体クロマト、向流分
配、ゲル過、吸着クロマト等の適当な公知の方
法を利用して分離精製することができる。 本発明方法によれば、上述したようにして、式
（）リン脂質と式（）一級アルコールとを、
ホスホリパーゼDMの存在下に反応させて式
（）リン脂質一級アルコール誘導体を製造する
ことができる。 得られる式（）リン脂質一級アルコール誘導
体は、すぐれた界面活性作用を有し細胞膜の透過
性に大きな影響を持つ。この意味から、該式
（）誘導体はリポソーム形成基材として、又、
化粧品たとえばクリーム、乳液に配合して皮膚生
理に役立つ乳化剤として、更に脂肪系薬剤の乳化
剤、殺虫剤、除草剤などの如き農薬の乳化剤など
の広い乳化剤用途に有用である。 更に、多くの場合、リン脂質はそれぞれ特異な
生理活性を有することが知られているが、本発明
方法で得られる式（）誘導体の多くは、その近
似的構造を有するところから、各種の生理活性が
期待できる。又、一級アルコール水酸基を有する
或は一級アルコール水酸基を導入した薬理活性化
合物を、リン脂質に転移させることによつて、該
化合物の薬理的副作用を弱めたり或は薬理効果を
高めてその投与量を低減させたりすることも期待
できる。さらに又、上記薬理活性化合物をリン脂
質に転移させて、該化合物を患部に的確に集中さ
せるための薬理活性化合物のキヤリヤーとして、
さらには、薬理活性化合物の保護基として有用な
役割をはたすことも期待できる。 又更に、各種医薬品をはじめとする化学合成の
中間体として有用であり、例えば、反応性の高い
ハロゲンやアミン置換基を有するアルコールを転
移させた誘導体を利用できる。更に又三重水素や
14Cでラベルした一級アルコールを転移するこ
とによつてラベルされたリン脂質誘導体が得ら
れ、リン脂質の代謝経路の解明に利用する事もで
きる。 以下、実施例により本発明方法実施の数態様に
ついて、更に詳しく例示する。 参考例 １ ホスホリパーゼDMの調製。 前記精製方法の項に従つて、ノカルデイオプ
シス属NO779株〔FERM−Ｐ No.6133〕及びア
クチノマデユーラ属NO362株〔FERM−Ｐ No.
6132〕の夫々を用いて、該項に記載したとおりの
活性回収率及び比活性でホスホリパーゼDMを得
た。 実施例 １ （Run No.１〜No.91） 後掲第４表に示した下記式（）リン脂質 基質：Ｌ−α−レシチン，β，γ−ジミリスト
イル（シグマ社） （１，２−ジテトラデカノイル−sn−グリセロ
ール−３−ホスホリルコリン） 基質：Ｌ−α−レシチン，β，γ−ジヘキサデ
シル（カルビオケム−ベーリング社） （１，２−ジヘキサデシル−sn−グリセロール
−３−ホスホリルコリン） 基質：Ｌ−α−レシチン，β，γ−ヘキサデシ
リジン（同上） （１，２−シクロヘキサデシリデン−sn−グリ
セロール−３−ホスホリルコリン） 基質：β−レシチン−α，γ−ジパルミトイル
（同上） （１，３−ジヘキサデカノイル−グリセロール
−２−ホスホリルコリン） と、後掲第４表に示した多数種の式（）一級ア
ルコールとを、後記TLCによる転移生成物（リ
ン脂質一級アルコール）の生成確認方法に従つ
て、ホスホリパーゼDMの存在下で反応させて、
転移生成物の形成を確認した。そのRf値を後掲
第４表に示した。 TLCによる転移生成物の生成確認方法：− 下記組成 １％リン脂質乳化液 0.1ml 0.4M酢酸緩衝液（PH5.7） 0.1ml 0.1M塩化カルシウム水溶液 0.05ml 蒸留水 0.1ml 10％一級アルコール溶液 0.1ml の反応液に、ホスホリパーゼDM水溶液0.1ml
（0.2〜1.0u／0.1ml）を加え、37℃で１〜５時間静
置した。 尚、上記１％リン脂質乳化液は、リン脂質100
mgに、ジエチルエーテル１ml及び蒸留水10mlを加
え、氷冷条件下に、600W、20KHzの条件で５分
間超音波処理して形成する。上記反応液の形成に
際して、必要な場合には、水又はジエチルエーテ
ル、アセトン等の有機溶媒を加えて上記10％一級
アルコール溶液を調製した。 上記静置後、50ｍＭのEDTA（エチレンジアミ
ン四酢酸）水溶液0.2mlを加え、更にクロロホル
ム−メタノール混液（２：１容量比）５mlを加え
激しく撹拌し、脂質（生成物）を抽出した。この
懸濁液を2000×ｇの条件で10分間遠心処理し、下
層のクロロホルム層を分取し、30℃で減圧乾固し
た後、クロロホルム−メタノール混液（１：１容
量比）75μに溶解してTLCの試料とした。この
うち10μをシリカゲル薄層（フナゲル60Å、20
cm×20cmフナコシ薬品）にスポツトし、ジイソブ
チルケトン−酢酸−水（40：25：５）を展開溶媒
として展開した。スポツトの検出には下記の試薬
を用いた。検出されたスポツトで未分解の基質、
及びその加水分解物（ホスフアチジン酸及びその
類縁体）以外のリン脂質のスポツトが検出された
場合、これを転移生成物と認めた。 検出試薬 リン酸の呈色：Zinzadeの試薬（Beiss.U.J.
Chromatog.13 104、1964） 一級アミンの呈色：ニンヒドリン試薬（ニンヒド
リンの0.25％アセトン溶液） 二級アミンの呈色：次亜塩素酸−ベンジジン試薬
（Bischel M.C.らBiochim、Biophys、Acta
70 598 1963） プリン及びピリミジンの呈色：フルオレツセイン
−アンモニア試薬（Wieland T.らAngew
chem.63 511 1951） グリコール結合の呈色：過ヨウ素酸−シツフの試
薬（Shaw N.Biochim.Biophys.Acta.164 435
1968） 17−ケトステロイドの呈色：ｍ−ジニトロベンゼ
ン試薬（Jisboa B.P.J.Chromatog.16 136
1964） 比較例 １ 実施例１に於て、ホスホリパーゼDMの代り
に、キヤベツ由来の公知ホスホリパーゼＤ（Ｐ−
Ｌ Biochemicals Inc.）を用いるほかは、実施
例１と同様に行つた。その結果、後掲第４表に示
したすべての一級アルコールについて転移生成物
の生成は認められなかつた。 【表】 【表】 【表】 試薬を用いて呈色した。
実施例 ２ （Run No.１〜No.23） Ｌ−α−レシチン，β，γ−ジミリストイル
（シグマ ケミカル カンパニー製、純度98％）
400mg、ジエチルエーテルル１ml、蒸留水10mlを
超音波用セルに入れ、氷冷しながら600W、20K
Hzで５分間超音波処理をし、乳白色の乳化液を得
た。 このレシチン乳化液２ml（レシチン80mg）、
0.4M酢酸緩衝液（PH5.7）２ml、0.1M塩化カルシ
ウム水溶液１ml及び10％β−ヒドロキシエチルア
ニリン−ジエチルエーテル溶液２mlを共栓付試験
管中に入れ、ホスホリパーゼDM水溶液（2.5u／
ml）２mlを加えてよく混合した後、37℃で３時間
静置した。反応液に0.5N塩酸を0.5ml加えて反応
を停止した後更にクロロホルム−メタノール
（２：１）混液15mlを加えて、激しく混和し、リ
ン脂質を抽出した。この混合液を2000×ｇ10分間
遠心し、下層のクロロホルム層を分取した。 上層の水層にはもう一度クロロホルム10mlを加
えて、同様の抽出操作を行い、抽出液を合わせ、
次いで10mlの0.02N塩酸で洗つた。この混合液か
ら遠心によつて再びクロロホルム層を分取し、減
圧乾固した後、１mlのｎ−ヘキサン−２−プロパ
ノール−水（60：80：７）混液に溶解した。 この試料20μをシリカゲル薄層（フナゲルフ
ナコシ薬品）にスポツトし、ジイソブチルケトン
−酢酸−水（40：25：５）の溶媒系で展開したと
ころ、３種類のリン脂質が検出され、そのうちの
二つは、ホスフアチジン酸及びレシチンとRf値
が一致した。 この試料を高速液体クロマトグラフイーによつ
て精製した。カラムはラジアルパツクカートリツ
ジシリカ８mm×10cm（ウオーターズ社製）、溶離
液は上述したｎ−ヘキサン−２−プロパノール−
水＝60：80：７、流速２ml／分でピークの検出に
は441型紫外線検出器（ウオーターズ社）による
214nｍの吸収、及びR401型示差屈折計（同）を
用いた。試料は４回に分け0.25mlずつ注入した。 まずこの溶離液で混入しているβ−ヒドロキシ
エチルアニリン、及びホスフアチジン酸、ホスフ
アチジン酸のβ−ヒドロキシエチルアニリンエス
テルの３成分を分取し、次いで、溶離液をｎ−ヘ
キサン−２−プロパノール−水＝60：80：14とし
て、カラムに吸着している未分解のレシチンを溶
出した。得られた３種類のリン脂質は、それぞれ
もう一度同様の操作により高速液体クロマトグラ
フイーで精製した。 ３種類のリン脂質はホスフアチジン酸約10％、
転移生成物約80％未分解のレシチン約10％（モル
比）であり、約40mgの精製された転移生成物であ
るホスフアチジン酸のβ−ヒドロキシエチルアニ
リンエステルが得られた。この化合物のIRスペ
クトルは日本分光A202型赤外分光光度計を用い、
液膜法で測定した。その結果を第５表に示した
（Run No.14）。 第５表に示した他の式（）一級アルコールを
用いて、上記と同様に行つた。その結果を第５表
に示した（Run No.１〜13、15〜24及び26〜33）。
ただし、反応液に該一級アルコールを加える際、
そのアルコールの溶解性に応じて、適宜、水、又
はジエチルエーテル、あるいはアセトン溶液とし
て加えた。 【表】 【表】 【表】 【表】 実施例 ３ （Run No.１〜No.24） Ｌ−α−レシチンβ，γ−ジヘキサデシル（カ
ルビオケム−ベーリング社製）400mg、ジエチル
エーテル１ml及び蒸留水10mlの混合物を実施例２
と同様の方法で乳化させ、この乳化液２mlを用い
て、以下、実施例２と同様の方法で反応を行なつ
た。ただし、一級アルコールとして、チアミン塩
酸塩の10％水溶液を用いた。 この反応液を実施例２と同様に処理して、転移
生成物30mgを得た。この化合物のIRスペクトル
を第６表に示した（Run No.23）。 第６表に示した他の式（）一級アルコールを
用いて、上記と同様に行つた。その結果を第６表
に示した（Run No.１〜22及び24）。 【表】 【表】 実施例 ４ （Run No.１〜No.24） Ｌ−α−レシチンβ，γ−ヘキサデシリジン
（カルビオケム−ベーリング社製）400mgを実施例
２と同様の方法で乳化し、80mg相当の乳化液を用
い、転移反応の受容体としてゲラニオールを加え
以下、実施例２と同様の方法で反応、抽出、精製
を行なつた。その結果、転移生成物50mgを得た。
この化合物のIRスペクトルを第７表に示した
（Run No.４）。 第７表に示した他の式（）一級アルコールを
用いて上記と同様に行つた。その結果を第７表に
示した（Run No.１〜３及び５〜24）。 【表】 【表】 【表】 実施例 ５ （Run No.１〜No.24） β−レシチン、α，γ−ジヘキサデカノイル
（カルビオケム−ベーリング社製）400mgを実施例
２と同様に乳化し、80mg相当の乳化液を用い、転
移反応の受容体としてパントテニルアルコールを
加えて、以下実施例２と同様の方法で、反応、抽
出、精製を行なつた。その結果、転移生成物25mg
を得た。この化合物のIRスペクトルを第８表に
示した（Run No.９）。 第８表に示した他の式（）一級アルコールを
用いて上記と同様に行なつた。その結果を第８表
に示した（Run No.１〜８及び10〜24）。 【表】 【表】 【表】 実施例 ６ （Run No.１〜No.５） Ｌ−α−ホスフアチジルエタノールアミン、
β，γ−ジミリストイル（）、Ｌ−α−ホスフ
アチジル−Ｎ−メチルエタノールアミン、β，γ
−ジミリストイル（）、Ｌ−α−ホスフアチジ
ル−DL−グリセロールβ，γ−ジミストイル
（）（以上、いずれもカルビオケム−ベーリング
社）、Ｌ−α−ホスフアチジルセリン（）（シグ
マ社）、及びS.F.Yangら（J.Biol.Chem 242、
477、1967）の方法で調整したＬ−α−ホスフア
チジエタノール、β，γ−ジミリストイル（）
を、実施例２と同様の方法で乳化した。各リン脂
質50mgを含む乳化液1.5mlをそれぞれ別の共栓付
試験管に入れ、アルコールとしてゲラニオールの
10％ジエチルエーテル溶液10ml、0.4M酢酸緩衝
液１ml、蒸留水１ml、0.01M塩化カルシウム水溶
液0.5mlを加えて、更に、この反応液を600W、
20KHz、１分間超音波処理した。次いで各反応液
にホスホリパーゼDM水溶液（8u／ml）１mlづつ
加え、37℃で６時間静置した。以下、リン脂質の
抽出及び精製は実施例２と同様に処理し、共通の
転移生成物であるホスフアチジン酸−ゲラニオー
ルエステルを得た。収量はに対して12mg、に
対して20mg、に対して10mg、に対して24mg、
に対して22mgであつた。 そのIRスペクトルを第９表に示した。 【表】
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 下記式（） 但し式中、Ａは下記(i)又は(ii) 【式】 【式】 を示し、ここで、R1及びR2は共に−Ｏ−COR11
であるか、もしくは共に−Ｏ−R12であるか、も
しくは式(i)においてR1とR2は一緒になつて
【式】〔ここで、ｎは11〜19の数 を示す〕を表わし、上記に於て、R11及びR12は
同一でも異つていてもよく、夫々、C7〜C21の飽
和もしくは不飽和の脂肪族炭化水素基を示し、 Ｂは−（CH2）2＋Ｎ（CH3）3、−（CH2）2NH2、−
CH2CH（NH2）COOH、−CH2CH2NH（CH3）、−
CH2CH2N（CH3）2、−CH2CHOHCH2OHもしく
は−（CH2）nＨ〔ここで、ｍは１〜５の数を示す〕
を示す、 で表わされるリン脂質と、下記式（） Ｒ−OH ……（） 但し式中、Ｒは下記(1)〜(3)よりなる群からえら
ばれた員を示す、 (1) C6（ただし、ヘキサノールを除く）〜C26の飽
和もしくは不飽和の脂肪族又は芳香族炭化水素
残基、ここで該炭化水素残基はハロゲン、アミ
ノ、アセチル及び水酸基より選ばれた置換基で
置換されていてもよい、 又は 分子内にエーテル、エステル及びアミド結合
よりなる群からえらばれた結合を有する上記炭
化水素残基、 (2) プレグナン系ステロイド化合物残基、 (3) ガラクトノ−γ−ラクトン、Ｎ（２−ヒドロ
キシエチル）フタルイミド、２−（３−インド
ール）エタノール、２−（２−ヒドロキシエチ
ル）ピリジン、ピリドキシン、Ｎ（２−ヒドロ
キシエチル）モルホリン、５−ヒドロキシメチ
ルシトシン、シチジン、ウリジン、アラビノシ
チジン、チアミン、２−（２−ヒドロキシエチ
ル）ピペラジン、アデノシン、グアノシン及び
サイクロシチジンより成る群からえらばれた複
素環化合物残基、 で表わされる一級アルコールとを、ホスホリパー
ゼDMの存在下に反応させることを特徴とする下
記式（） 但し式中、Ａ及びＲは上記したと同義である、
で表わされるリン脂質一級アルコール誘導体の製
法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58063304A JPS6041494A (ja) | 1983-04-11 | 1983-04-11 | 酵素法リン脂質一級アルコ−ル誘導体の製法 |
| DE8484302444T DE3476770D1 (en) | 1983-04-11 | 1984-04-10 | Production of primary or secondary alcohol derivatives of phospholipids by the enzymatic technique |
| US06/598,697 US4783402A (en) | 1983-04-11 | 1984-04-10 | Production of primary or secondary alcohol derivatives of phospholipids by the enzymatic technique |
| EP84302444A EP0122151B1 (en) | 1983-04-11 | 1984-04-10 | Production of primary or secondary alcohol derivatives of phospholipids by the enzymatic technique |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58063304A JPS6041494A (ja) | 1983-04-11 | 1983-04-11 | 酵素法リン脂質一級アルコ−ル誘導体の製法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6041494A JPS6041494A (ja) | 1985-03-05 |
| JPH027633B2 true JPH027633B2 (ja) | 1990-02-20 |
Family
ID=13225419
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58063304A Granted JPS6041494A (ja) | 1983-04-11 | 1983-04-11 | 酵素法リン脂質一級アルコ−ル誘導体の製法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6041494A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2011527566A (ja) * | 2008-07-08 | 2011-11-04 | ケミー ソシエタ ペル アチオニ | Ｎ−アシル−ホスファチジル−エタノールアミンを生産する方法 |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6236195A (ja) * | 1985-08-09 | 1987-02-17 | Nisshin Oil Mills Ltd:The | ホスファチジル基転位方法 |
| GB8531150D0 (en) * | 1985-12-18 | 1986-01-29 | Smiths Industries Plc | Optical multiplex systems |
| JPS63245684A (ja) * | 1987-03-31 | 1988-10-12 | Japanese Res & Dev Assoc Bio Reactor Syst Food Ind | ホスフアチジン酸誘導体の製造法 |
| JPS63245685A (ja) * | 1987-03-31 | 1988-10-12 | Japanese Res & Dev Assoc Bio Reactor Syst Food Ind | リン脂質にホスホリパーゼを作用させる方法 |
| JPH02227132A (ja) * | 1988-11-22 | 1990-09-10 | Kao Corp | リポソーム形成剤及びリポソーム |
| JPWO2022190967A1 (ja) * | 2021-03-09 | 2022-09-15 |
-
1983
- 1983-04-11 JP JP58063304A patent/JPS6041494A/ja active Granted
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2011527566A (ja) * | 2008-07-08 | 2011-11-04 | ケミー ソシエタ ペル アチオニ | Ｎ−アシル−ホスファチジル−エタノールアミンを生産する方法 |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6041494A (ja) | 1985-03-05 |
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