JPH0279994A - モノクローナル抗体の作製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野Ｊ この発明は、癌マーカー糖鎖のような、糖鎖を抗原とす
るモノクローナル抗体の作製方法に関する。この発明の
方法により作製されたモノクローナル抗体は癌等の診断
薬としての用途を有する。

［従来の技術］ 細胞の癌化に伴って細胞表面の糖鎖抗原は糖鎖不全現象
や異常糖鎖への新規合成等による様々な異常をきたすこ
とが１９７０年第の初めから知られていた（木幡陽、「
癌化と療法Ｊ１３巻、３号、７４７頁、１９８６：神奈
木玲児ら、「化学と生物」、２６巻、４号、２２０頁、
１９８８）　、また、癌患者の血清等の体液中の癌細胞
由来の糖鎖抗原（糖タンパク質や糖脂質糖鎖）も癌性変
化を受けている場合が多く、従来からこれら抗原に対す
る抗体による免疫学的癌診断法が開発されている。特に
、近年モノクローナル抗体の作製により、ＣＡ１９−９
、ＣＡ１２−５、Ｃ３ＬＥＸ−１等が腫瘍詮所の良イマ
ーカーと成り得ることが示されている（木幡陽、−Ｏｎ
ｃｏ１ｏｇｉａ″１４巻、秋、７７頁（１９８５）　）
　。

これら臨床領域で注目を集めているモノクローナル抗体
は全て癌細胞そのものを免疫原にして得られた無数のハ
イブリドーマの産生ずる抗体の中から偶然的に選び出さ
れたものである（木幡陽、前出）。

さらに１診断に用い得る特異性の高いモノクローナル抗
体を作製するため、癌組織から糖タンパク質を精製し、
これを免疫原に用いることが試みられている（「総合臨
床」３４巻、１２号、２６２５、１９８５）　、　Ｉ、
かじ、この場合、糖鎖の癌性変化部分に対するモノクロ
ーナル抗体を効率よく得ることができないことが知られ
ている。これは糖鎖を担っているタンパク質部分の方が
免疫原性が高いため、糖鎖部分に対する抗体ができにく
いためと考えられている。

この問題を解決するために、特開昭６３−１７９００号
には、糖鎖のキャリアタ゛ンバク質として免疫する補乳
動物の自己タンパク質を用いることを特徴とする糖鎖抗
体の製造法が開示されている。特開昭６３−１７９００
号では、γ−ＧＴＰの糖鎖に対するモノクローナル抗体
を作製しているが、この方法では特定の癌性変化糖鎖そ
のものに対する抗体を作製することができず、抗体の認
識する糖鎖の分子構造の決定も容易ではない、従って、
特定の癌性変化糖鎖構造を特異的に認識するモノクロー
ナル抗体の効率的な製造技術の開発が要望されていた。

［発明が解決しようとする問題点］ 従って、この発明の目的は、癌マーカー糖鎖のような、
糖鎖を特異的に認識するモノクローナル抗体を効率良（
作製することができる新規な方法を提供することである
。

［問題点を解決するための手段］ 本願発明者らは、鋭意研究の結果、抗原となる糖鎖をタ
ンパク質のようなキャリアに結合したものを免疫原とし
て免疫した動物からの抗体産生細胞を用いてハイブリド
ーマを作製し、一方、所望の抗原を産生しているハイブ
リドーマを選択する際には上記糖鎖を上記キャリアとは
異なるキャリアに結合したものとの反応性をスクリーニ
ングすることにより、糖鎖を抗原とするモノクローナル
抗体を産生しているハイブリドーマを効率良く作製する
ことができることを見出しこの発明を完成した。

すなわち、この発明は、抗原となる糖鎖を、免疫原性を
有する第１のキャリアに結合したものを免疫原として用
いて免疫した動物がらの抗体産生細胞とミエローマ細胞
とを融合してハイブリドーマを作製する工程と、上記糖
鎖を上記第１のキャリアとは異なる第２のキャリアに結
合したものとの反応性をスクリーニングすることにより
、上記ハイブリドーマのうち上記糖鎖を抗原とするモノ
クローナル抗体を産生しているものを選択する工程と、
選択されたハイブリドーマからモノクローナル抗体を回
収する工程とを含む、糖鎖を抗原とするモノクローナル
抗体の作製方法を提供する。

［発明の効果］ この発明の方法によると１例えば癌マーカー糖鎖のよう
な糖鎖を抗原とするモノクローナル抗体を効率良く作製
することができる。これは、ハイブリドーマの選択に、
免疫原に用いたキャリアとは異なるキャリアに糖鎖を担
持したものに対する反応性をスクリーニングするため、
免疫原のキャリアを抗原としたものは反応せず、免疫原
の！鎖を抗原としたものだけが反応して選択されること
に基づく、癌によっては糖鎖が癌性変化することが知ら
れているので、このような癌性変化した糖鎖を抗原とし
て、モノクローナル抗体を作製すると、そのモノクロー
ナル抗体はその癌の診断薬として用いることができる。

従って、この発明により、このような癌診断薬としての
用途を有するモノクローナル抗体を効率良く作製するこ
とが可能になった。

［発明の詳細な説明］ この発明の方法において、免疫原として用いられるもの
は、抗原となる糖鎖を、免疫原性を有する第１のキャリ
アに結合したものである。ここで、抗原となる糖鎖とし
ては、特に限定されるものではないが、癌により癌性変
化を受けた糖タンパク質の糖鎖を挙げることができる。

後述の実施例ではヒト賊毛性性腺刺激ホルモン（ｈｃＧ
ｌの癌性変化糖鎖を用いている。上述のように、癌性変
化［１のいくつかは既にその構造が知られており。

また、糖鎖を有機化学的に合成する方法も知られている
（例えば、小川らの方法（５ａｄｏｚａｉ　Ｋ、　Ｋ。

ｅｔ　ａｌ、、　”Ａｇｒｉｃ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅ
Ｉｌｌ、　５０．２５１．１９８６：特開昭６３−３９
８９０号）ので、この発明の方法においては、癌性変化
槽を有機化学的に合成したものを好ましく用いることが
できる。もっとも、天然の糖タンパク質等から分離した
糖鎖も用いることができることは言うまでもない。

一般に、糖鎖には免疫原性がないか又は弱いので、糖鎖
に対する抗体を作製するためには糖鎖を免疫原性を有す
るキャリアに結合して免疫原として用いる必要がある。

免疫原におけるキャリアとしては、免疫原性を有する、
タンパク質のような物質であればいずれの物質であって
もよく、例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）メチル
化ウシ血清アルブミン、キーホールリンペットヘモシア
ニン、（ＫＬＨ）、血清アルブミン、血清グロブリン等
を挙げることができる。これらのうち、最も好ましいも
のはメチル化ウシ血清アルブミンである。

抗原となる糖鎖は、免疫原性を有する第１のキャリアに
直接結合することもできるし、スペーサーを介して結合
することもできる。スペーサーとしては、炭素数が８な
いし４０程度の炭素鎖な含むものが好ましい、抗原とな
る糖鎖が、免疫原性を有するキャリアから空間的な距離
をあけてキャリアに結合されている方が糖鎖を抗原とす
る抗体が産生され易いと考えられ、また、一般に、有機
化学的に糖鎖を合成する場合にはこのようなスペーサー
が付いたものの方が合成し易いので、糖鎖はスペーサー
を介してキャリアに結合することがより好ましい、スペ
ーサーを介して糖鎖をタンパク質等に結合することは、
いわゆるカルボジイミド法（文献二日本生化学会編「続
生化学実験講座５、免疫生化学研究法」、８２〜８３頁
、東京化学同人）により行なうことができる。

次いで、上記免疫原で動物を免疫し、抗体産生細胞を回
収する。これは、従来から、種々の抗体を産生ずるため
に行なわれている周知の操作により行なうことができる
。

次いで、回収された抗体産生細胞と、ミエローマ細胞と
を融合してハイブリドーマを作製する。これも、従来と
同様、周知のケーラーとミルシュタインの方法により行
なうことができる。

ＨＡＴ培地等を用いた常法により、ハイブリドーマを回
収した後、ハイブリドーマのうち糖鎖を抗原とする所望
のモノクローナル抗体を産生しているハイブリドーマを
選択する。この際、免疫原中に用いた抗原となる糖鎖を
、免疫原に用いた第１のキャリアとは異なる、第２のキ
ャリアに結合したものとの反応性をスクリーニングし、
反応したハイブリドーマを選択する。第２のキャリアと
しては、糖鎖を結合することができるものであって第１
のキャリアとは異なるものであればいずれのものでもよ
（、それ自体で免疫原性を有しているものであっても有
していないものであってもよい、第２のキャリアの例と
しては、第１のキャリアと同様なタンパク質やポリしリ
ジンやポリＤリジンのような合成ペプチドを挙げること
ができる。第２のキャリアとして特に好ましいものとし
てポリリジンを挙げることができる。第２のキャリアへ
の糖鎖の結合も、第１のキャリアへの糖鎖の結合と同様
な方法により、又は、キャリアの種類に応じて種々の公
知の方法により行なうことができる。

第２のキャリアにＦ＋鎖抗原を結合したものとの反応性
のスクリーニングは１例えば、これをマイクロプレート
のウェルにコートし、バイブリドーマの培養上清をウェ
ルに加えて、その反応の有無を周知のＥＬＩＳＡの手法
により、ペルオキシダーゼやアルカリフォスファターゼ
を用いて酵素免疫学的に検出することにより行なうこと
ができる。この際、糖鎖−第２キヤリア結合物をＮ−ア
セチル化処理することによりバックグランドを抑え、高
感度を得ることができる。Ｎ−アセチル化は、例えば、
無水酢酸で処理することにより行なうことができる。

次いで、このようにして選択された、糖鎖に特異的に反
応する所望のモノクローナル抗体を産生ずるハイブリド
ーマを培養し、これから所望のモノクローナル抗体を回
収する。ハイブリドーマの培養及びモノクローナル抗体
の回収は、この分野において周知の方法により行なうこ
とができる。

この発明の方法により作製されたモノクローナル抗体は
、対応抗原糖鎖の検出のための診断薬として用いること
ができる。すなわち、対応抗原糖鎖が癌性変化を受けた
糖タンパク質の糖鎖である場合には、その癌の診断薬と
して用いることができる。

以下、実施例に基づきこの発明をより具体的に説明する
が、この発明は下記実施例に限定されるものではない。

［実施例］ この実施例では、抗原となる糖鎖として、癌性変化を受
けたヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈｃＧｌの糖鎖を用
いた。

Ｌ［・・　糖鎖の　名 妊婦尿から精製したｈＣＧをヒドラジン分解（Ｔａｋａ
ｓａｋｉ　Ｓ、ら、”Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ
、、　８３巻。

２６３頁、１９８２１　にかけて遊離した少糖をＮａＢ
３Ｈａで還元標識後、ろ紙電気泳動で分割すると中性少
糖はほとんど検出されず、モノシアリル体とジシアリル
体の２群の酸性少糖が検出された。これらの酸性少糖に
は、図１のＡに示したような５種類の糖鎖が含まれてい
た０次に４例の腋毛癌患者尿から精製されたｈＣＧにつ
いて同様に調べたところ、図１のＢに示すように、Ｇａ
ｌ　Ｂ　ｌ　→４ＧｌｃＮａｃβｌ→４Ｍａｎ残基が付
いた複合型糖鎖構造が多数出現している。このことは、
絨毛癌では絨毛細胞にないＧｌｃＮＡｃβｌ→４Ｍａｎ
残基を作り出すＮ−アセチルグルコサミン転移酵素ＩＶ
が発現しているものと考えられる。

そこで、本発明者らは、この絨毛癌特異的糖鎖構造、す
なわち、異常二本鎖構造を認識するモノクローナル抗体
を作製することにした。

ｈＣＧの糖鎖の癌性変化部分の７糖は上記小川らの方法
により有機化学的に合成した。この合成７糖には８個の
炭素から成るスペーサーが結合されており、その構造は
次の通りであった。

スペーサー 一方、小川らの方法により、正常ｈＣＧに見出される。

下記の構造を有する５糖を合成した（以下、合成５糖と
言う）。

０（ＣＨ＊１ｓｃＯＯｃＨｚ ｆ２１　Ｆ鎖−キャリア結合物の作製 上記合成７糖及び合成５糖をハイブリドーマ法によるモ
ノクローナル抗体作製の免疫原とするために合成糖鎖の
スペーサ一部分を介して糖をキャリアタンパク質に結合
した。これは、以下のように行なった。

先ず、ガラクトースオキシダーゼとＮａＢ３Ｈ＜を用い
る合成糖鎖のサイミジン（’Ｈ）ラベルを次の手順で行
なった。

合成５糖又は合成７糖 ガラクトースオキシダーゼ処理 ０．０５Ｎ　ＮａＯＨ中ＮａＢ”Ｈ４による還元紙から
の抽出 この方法により、導入されたＳＨは、合成７糖について
１．２６　ｘ　１Ｇ”　ｃｐｓであった。

次に、このようにして標識した合成糖鎖を、キャリアに
結合した。用いたキャリアは。

ＢＳＡ、メチル化ＢＳＡ、ＫＬＨ、ポリ−Ｌ＋　＋７ジ
ン及びポリＤ−リジンであった。結合はカルボジイミド
法により行なった。この方法を具体的にチャートで示す
と以下のようになる。

合成５ｍ又は合成７糖０．１　Ｂ Ｎ−ヒドロキシサクシニイミド　０．１５　Ｂキャリア
タンパク質　０．１　ｍｇ の混合物（全量１００μｌ） ↓ 一夜インキュベート セフアブ・マウスＧ５０　（商品名　（１，６ｘ　１６
．Ｓ　ＰＢｓｔ合成５糖についての、タンパク質１モル
当りの糖鎖の数及び収率を下記表１に示す、また、図２
には生成物のゲルろ過クロマトグラムを示す。

表１ ３　　−キ　リア　Ａ　による 免疫に用いた抗原はポリーＬ−リジンー合成’１！（１
００μｇ１５０μｌ）とスクシニル化にＬＨ（５０μｇ
１５０ｕ　ｌ）との混合物及びメチル化ウシ血清アルブ
ミン−合成？ｐ（１００μｇ／１００μｌ）であった、
なお、キャリア分子１涸当りに約２０個の糖が結合して
いた。

上記免疫原をフロイントの完全アジュバントとよく混合
し、４週齢のＢＡＬＢ／Ｃマウスに、３回免疫を行なっ
た。また、免疫は、イ）尾静脈及び腹腔内接種並びに口
）背の皮下に接種の２経路により行なった。

４　ハイブリドーマの　１ ３回免疫後、各々のマウスの牌細胞を取り出し、ミエロ
ーマＭＳ−１細胞（入手先：　ＡＴＣＣＴＩＢＩ！ｌ）
と常法に従い、ケーラーとミルシュタインのポリエチレ
ングリコール法で細胞融合を行なった。さらに、ＨＡＴ
培地、ＨＴ培地選択法により一次スクリーニングを行な
いハイブリドーマを得た。この操作は具体的にはポリＤ
リジンー合成７糖をコートしたマイクロプレートにハイ
ブリドーマクローンの上清を１００μｍ加え、トウィー
ン２０ＰＢＳで洗浄後、通常のＥＬＩＳＡ法（酵素免疫
測定法）でペルオキシダーゼ染色で陽性のクローンを選
択することにより行なった。−次スクリーニングの結果
を下記表２に示す。

５　　Ａ　　　モノクローナル　　　　ハイブリ上記−
次スクリーニングで陽性が認められたハイブリドーマに
ついて、合成糖鎖−ポリ−ローリジン結合体を用いて、
その培養上清との反応性をスクリーニングした。このス
クリーニングは、合成糖鎖−ボリーＤ−リジン結合体を
ポリスチレン製マイクロタイタープレートのウェルに結
合させ、この中で培養上清をインキュベートし、洗浄後
、酵素免疫学的にウェルに結合した抗体を測定すること
により、合成糖鎖に対するモノクローナル抗体を産生じ
ているハイブリドーマを選択することができる。この操
作は具体的には以下のように行なった。

０．０５ Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液で洗浄 洗浄 ＡＢＴＳ　（基質）＋ＨｉＯｚ添加 り 室温で１５分〜３０分間インキュベート洗浄 測色（ＯＤ　４０５ｎｍ） 上記方法により、合成糖鎖を抗原とするモノクローナル
抗体を産生ずるハイブリドーマが４つ得られた。

（６）モノクローナル抗体の回収及び精製得られたモノ
クローナル抗体の回収及び精製を以下のように行なった
。すなわち、数度のクローニングにより単一の抗体産生
細胞株として樹立されたハイブリドーマ４種類はスピン
ナーカルチャーフラスコを用いて１〜５Ｉ２培養土清を
採取し、プロティンＡセファロースＣＬ−４旧ファルマ
シア社製）によるアフィニティクロマトグラフィー（富
山朔二、安東民衛編、［単りローン抗体実験マニエアル
」講談社すイエンティフィク１５５〜１５６頁）で精製
し、５ＯＳ−ＰＡＧＥで純度検定を行なった。

（７）モノクローナル抗体の特異性と性状得られたＪｆ
ｌ類のモノクローナル抗体の特性を表３に示す。

表３ ｏＡｂ サックラス 純度１１ 抗にバ カ仙Ｐ 反応性 匍に−１ ６２ｂ ２００μＸｌ園１ １：８ ＩＴＸ−２ ＮＴＯに−３ ｇＧ　２ａ ２００剃１ｍ１ １：８ ＮＴＯに−４ ｇＧ　２ａ ２００μ、ｇ／麿１ １：８ 合成７糖 合成５ｍ’！（非天然型） 合成５糖 合Ｉ＆２糖 フェツイン フェツイン（シアリダーゼ） ＋１１．−６０ ＋１−６０　　（シアリダーゼ） ０、Ｉ駕ＢＳＡ　ＰＩＩｓ　（ａｌ１７．２）、ＮａＮ
、なし凍結 ）純Ｉｆ＋Ａ；プロティンＡアフィニティにより精製Ｂ
：未精製培養上清 ２）力価測定法１合成糖鎖抗原キャリアーをコートした
マイクロプレートでベルオキシターゼ発色しθ宕り〃島
す蘭Ｎ綿 得られた４種類のモノクローナル抗体はいずれも合成２
糖と反応しないことからスペーサー及びキャリアクンバ
ク質部分に対する抗体ではないことが明らかである１合
成７１９！と反応して合成５糖と反応しないモノクロー
ナル抗体はこの場合異常二本鎖構造部分を認識している
と考えられる。

本実施例の場合の４種類のモノクローナル抗体では合成
７糖と反応した抗体は非天然型５糖とも反応した。

本発明の手法を用いて得られたモノクローナル抗体はス
ペーサーを有さす、またキャリアタンパク質部分を異に
するフェツイン細胞株ＨＬ−６０ｉＡＴｃｃ　ＣＣＬ２
４０１及びシアリダーゼ処理したものと特異性に応じて
反応することが確認された。このことは本発明のモノク
ローナル抗体が正しく目的の糖鎖部分と反応しているこ
とを示している。

【図面の簡単な説明】

図１は正常及び癌性変化したヒト絨毛性性腺刺激ホルモ
ンの糖鎖の構造を示す図、 図２はこの発明の方法において調製された免投原のゲル
ろ過クロマトグラムを示す。

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. （１）抗原となる糖鎖を、免疫原性を有するよう第１の
   キャリアに結合したものを免疫原として用いて免疫した
   動物からの抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合、し
   てハイブリドーマを作製する工程と、上記糖鎖を上記第
   １のキャリアとは異なる第２のキャリアに結合したもの
   との反応性をスクリーニングすることにより、上記ハイ
   ブリドーマのうち上記糖鎖を抗原とするモノクローナル
   抗体を産生しているものを選択する工程と、選択された
   ハイブリドーマからモノクローナル抗体を回収する工程
   とを含む、糖鎖を抗原とするモノクローナル抗体の作製
   方法。
2. （２）前記第１のキャリアはタンパク質である請求項１
   記載の方法。
3. （３）前記タンパク質はメチル化ウシ血清アルブミンで
   ある請求項２記載の方法。
4. （４）前記第２のキャリアはポリリジンである請求項１
   又は２のいずれか１項に記載の方法。
5. （５）前記第２のキャリアであるポリリジンをＮ−アセ
   チル化でブロッキングしてポリリジンの非特異的反応を
   防止する請求４記載の方法。 （５）前記糖鎖は、スペーサーを介して前記第１のキャ
   リアに結合されている請求項１ないし４のいずれか１項
   に記載の方法。
6. （６）前記糖鎖は癌性変化を受けた糖タンパク質の糖鎖
   である請求項１ないし５のいずれか１項に記載の方法。
7. （７）前記糖鎖は合成されたものである請求項１ないし
   ６のいずれか１項に記載の方法。