JPH0284194A - エピデルミンの製造、単離及び精製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ポリペプチドであるエピデルミンを製造する
方法に関するものである。

抗生物質エピデルミンは、欧州特許出願８５１１３９０
８．９号（公開番号０１８１５７８）号で公知である。

上記明細書は、スタフィロコッカスエピデルミディス（
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉ
ｓ）の耐性菌株を用いて得られる培養液から始まって、
この物質を製造し、単離、精製する方法を記載している
。

この耐性株は「トイチエ　ザムルング　フォンミクロオ
ルガニズメン」に番号ＤＳＭ３０９５で１９８４年１０
月２６日に寄託された。この物質を単離するためには、
まず細胞と石灰を除去した培養濾液をｎ−ブタノールで
抽出し、このブタノール抽出物を蒸発乾燥し、この残留
物をメタノールに溶解し、脂溶性不純物を分離除去する
ために冷却した大量のジエチルエーテルに撹拌して加え
沈殿物に活性物を残す方法でこの活性物質を濃縮するか
、もしくは、エピデルミンを濃縮するために遠心分離し
た培養濾液をアンバーライ）ＸＡＤ−３（Ａｍｂｅｒｌ
ｉｔｅ　　Ｘ　Ａ　Ｄ　−８）か、またはアクリルエス
テル基体としたこの重合体の関連物（セル式３ｅｒｖａ
社製）に吸着させ、吸着したエピデルミンを該樹脂から
メタノール／濃塩酸（９９：　１）で解離させ、該塩酸
／メタノール溶液をアンモニアで中和して蒸発乾燥して
この溶液から単離するかのいずれかである。それにつづ
く、該アンバーライ）ＸＡＤ溶出液もしくは脂質を除去
した該ブタノール抽出液のクロマトグラフィーでは、セ
ファデックスＬＨ−２０をメタノール／酢酸（９５：５
）で使用して、多量の小ペブタイド、アミノ酸、塩類を
溶媒中の該抗生物質から分離する。次に行うフレイブ（
ｆ：ｒａｉｇ）法による多重向流分配法では、該抗生物
質はｎ−ブタノール／酢酸エチル１０．１規定酢酸（３
：　ｌ　：　３）系を用いる最初の液相一液相分配のス
タート点に残される。２−ブタノール１０．０５規定ア
ンモニウム酢酸（１：　１）の中性系を用いる２回目の
フレイブ分配で、抗生物質は装置の中央にくる。アンモ
ニウム酢酸を高真空下凍結乾燥で除去し、凍結乾燥後生
産されたエピデルミンが白い粉末として得られ、水晶は
使用したすべての薄層系で単品であることが示される。

この方法では８０Ｉ！の培養濾液から２．６ｇの凍結乾
燥したエピデルミンが得られる（アンバーライトＸＡＤ
−８、セファデックスＬＨ−２０のゲルクロマトグラフ
ィー及びクライブ法に従った多重分配法による）。

上述の明細書に記述されたように、生産菌であるスタフ
ィロコッカスエピデルミディスＤＳＭ３０９５は、２−
４％肉エキス、１−３％麦芽エキスと０．２５−１％Ｃ
ａＣＯ５または０．２５−０．５％Ｃａ　（ＯＨ）　２
　（重量％）で作った複合培養液で、３７℃で好気的に
培養する。１８時間から２３時間後に最大抗菌力に達す
る。

培養濾液やまだ微生物を含む培養スープ中に産生された
抗生物質をアンバーライ）ＸＡＤ−１１８０若しくはア
ンバーライトＸＡＤ−１６、またはスチレン−ジビニル
共重合体を基体とした関連の重合体にカラムを通して吸
着させるか、もしくは培養スープの場合には少量の該樹
脂を加えて吸着させると非常に高収量かつ簡単な方法で
抗生物質エピデルミンを得ることができることがわかっ
た。

この活性物質は、メタノール／特に０．０１規定希塩酸
（９：１容積対容積）を用いた溶出で該樹脂から解離さ
せ、この溶出液のｐＨを５．３から５．８に調製しアン
バーライトＩＲＣ−５０のような弱陽イオン交換樹脂ま
たはアンバーライトＩ　ＲＣ−８４のような関連樹脂に
かけるが、たとえばこのイオン交換はカラム内で行なっ
てもまたは少量を加えて行なってもよく、後者の場合は
該樹脂の３％量をＸＡＤ溶出液に１時間以内に２回加え
るのが好ましい。吸着の後にレジンをカラムに充填し、
結合していない物質を０．０５規定のリン酸す）　ＩＪ
ウム緩衝水溶液ｐＨ７，０により洗い出し、エピデルミ
ンはｐＨ６，０から８．０の間で、好ましくはｐＨ７，
０で、１．５規定の食塩と２０％容のメタノールを含む
上述のリン酸ナトリウム緩衝液の８０％溶液によって溶
出される。

塩を取り除くために該溶出液をｐＨ６，０に調製し、吸
着のために、上述のスチレン−ジビニル共重合型の、例
えばアンバーライ）ＸＡＤ−１１８０の樹脂に少量を加
える。塩を水で洗出し、結合したエピデルミンを、メタ
ノール１５０％酢酸（９：１容量：容量）で溶出する。

溶媒を除去し凍結乾燥後、凍結乾燥された粗抽出のエピ
デルミンが得られる。この中からヌクレオシル（Ｎｕｃ
ｌｅｏｓｉｌ）　１００Ｃ−１８（１０／−１ｒｎ）ま
たはりクロソーブ（Ｌｉｃｈｒ。

５ｏｒｂ）　　ＲＰセレクト（Ｓｅｌｅｃｔ）　Ｂを用
いた分取型ＨＰＬＣクロマトグラフィー（高速液体クロ
マトグラフィー）により純粋なエピデルミンを単離する
。この目的のために、まず、１重量％の蟻酸を含む水か
ら成る溶媒Ａで、次に１１重量％の蟻酸を含むメタノー
ル／水（８：　２０　　Ｖ　：　Ｖ）から成る溶媒已に
よりエピデルミンを徐々に溶出する。

用いる発酵法については、エピデルミンをバッチ（ｂａ
ｔｃｈ）発酵、各物質を発酵中に加える補栄養発酵関連
法（ａ　ｒｅｌａｔｅｄ　ｆｅｅｄｉｎｇ　ｆｅｒｍｅ
ｎｔａｔｉｏｎ）、生成したエピデルミンをオンライン
（ｏｎｌｉｎｅ）吸着しつつ非連続的に吸着吸着を行う
発酵法、又は連続的にオンライン（ｏｎ−１ｉｎｅ）吸
着を行う発酵法によって産生じてもよい。

いわゆるバッチ発酵では、次の組成を有する栄養液で最
良の結果を得た。即ち３．３％肉エキス、３％麦芽エキ
ス水酸化カルシウム０．３７％（重量％）である。塩化
ナトリウム、塩化カリウムのような塩化アルカリ金属と
、０．００１から０．００２重量％の例えばＦｅＣＩ　
ｓ及び／又はＦｅ５０＊の形態である鉄イオン１．そし
て塩化アンモニウム又は硫化アンモニウム（５７−２０
０ｍＭ）によって収量は有利に影響をうける。塩化ナト
リウムは３重量％、塩化第２鉄は０．００１２５重量％
が好ましい濃度である。食塩３％を共通にして、塩化第
２鉄濃度を変えた場合に、初期濃度がエピデルミン生産
に与える影響を第１図に示す。すべての炭素源のうちマ
ルトースが麦芽エキスの次に最も良い結果を与えた。グ
ルコースは、他の炭素源が共存する場合に限って使用す
ることが得策である。マルトースとラクトースまたはマ
ルトースとガラクトースを組み合わせても同様に良好な
結果が得られた。グルコースをマルトースまたはラクト
ースまたはガラクトースと組み合わせても麦芽エキスと
同じ収量が得られた。他の通常の炭素源では、極少量の
エピデルミンが得られたか若しくは全くエピデルミンが
得られないという結果に終った。

発酵は、換気を良くして３４℃から３７℃の間で好まし
くは３６℃で行なう。発酵前のｐＨ値が６．０から７．
０の場合に最良の産生パターンを得る。

炭酸カルシウムまたは水酸化カルシウムのような二価陽
イオンの炭酸化物若しくは水酸化物がない場合には極少
量の産生しかおこらない。炭酸カルシウムを例にとると
、これを加えたあとは、ｐＨ値が酸性に下がるという特
徴的なパターンを示すが、この時点の産生はごくわずか
である。その後、ｐＨ値があがりアルカリ性になると産
生が始まる。炭酸カルシウムのかわりに、炭酸マグネシ
ウムの使用も可能であるが、水酸化カルシウムの方が炭
酸カルシウムよりも結果は良好である。２５ｍＭの炭酸
カルシウムよりもむしろ５０ｍＭの水酸化カルシウムを
用いると、いくぶん産生は増加された。

菌株が炭素源（糖分）を利用すると、酢酸などの有機酸
が生ずるが、これは二価陽イオンにより錯体となると同
時に培養液は緩衝化される。Ｄ　Ｓ　Ｍ３０９５菌株の
最大生産時における活性増加を拡散試験（マイクロコツ
カス　ルテウスｍ　＋ｃｒｏｃｏｃｃｕｓｌｕｔｅｕｓ
　　ＡＴＣＣ９３４１に対する阻止帯の直径をｍｍで定
量）により対照菌株を用いて、欧州特許−Ａ−００２７
７１０の脳−心臓浸出（ｂｒａｉｎｌｌｅａｒｊ　１ｎ
ｆｕｓｉｏｎ）培養液での抗菌力を１００％として定量
すると次のとおりであった： 従来の技術の方法による場合 ａ）　欧州特許−Ａ−００２７７１０の脳心臓−浸出液
寒天　　　　　　　　　　　　１００％ｂ）　欧州特許
−Ａ−０１８１５７８の３％肉エキス、２％麦芽エキス
と２５ｍＭ炭酸カルシウム２００％ Ｃ）　欧州特許−Ａ−０１８１５７８の３％肉エキス、
２％麦芽エキスと５０ｍＭ水酸化カルシウム　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　３２０％
本発明の方法による場合 ｄ）　　３．３％肉エキス、３％麦芽エキス、５０ｍＭ
水酸化カルシウム　　　　　　　　４４０％ｅ）３．３
％肉エキス、３％麦芽エキス、５０ｍＭ水酸化カルシウ
ム、３％塩化ナトリウム、７５μｍ塩化第二鉄（■価）
を用いる。１，７２０％ｆ）　　３．３％肉エキス、３
％麦芽エキス、５０ｍＭ水酸化カルシウムと、さらにグ
ルコース、リン酸化カリウムと塩化アンモニウムを用い
る。

１、９５０％ ｇ）　　３．３％肉エキス、３％麦芽エキス１．５Ｑｍ
Ｍ水酸化カルシウムにさらに最初の単離の段階の後に生
成されたエピデルミンをオンラインｌする方法を加える
。他の添加物については、ｆ）項を参照。　　　　　　
　　　　　２．７８０％第２図は、上述ｄ）に記載され
た発酵の経過を表わしている。第１図はｅ）に述べたよ
うに３％塩化ナトリウムと種々の濃度の塩化鉄（Ｉ）を
添加に対するエピデルミン生産の依存性を表わしている
。上述に示した％はすべで重量パーセントである。第３
図は、ｆ）項に述べた発酵の経過を表わしている。第４
図は上述のｇ）項に記したように、オンライン吸着が含
まれた場合の発酵経過を示している。

平板希釈試験法またはＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラ
フィー）で得られた値を比較すると、それ自体既知の手
法と比べて変更点を伴う本発明の方法を使用した場合エ
ピデルミンの産生は３２０％から２７８０％に有意に増
加することがわかる。

本発明の方法に実施する際の各段階と各条件をさらに詳
しく以下に記述する。

産生菌は３．３％重量肉エキス、３％重量の麦芽エキス
、０．３７％重量水酸化カルシウムを含む４０％重量グ
リセロール（残部は水）に最良の状態で凍結保存＜−ｓ
　８℃）されている。各発酵のために前培養苓、１！中
にラブレンコ（Ｌａｂ　Ｌｅｍｃｏ）粉末（オキソイド
社製）８ｇ１ペプトン１０ｇ１食塩３　ｇ　−、Ｎａ２
ＨＰＯ４２ｇ寒天１５ｇと滅菌グルコース１０ｇを含む
寒天培地上で３６℃で１８時間培養させる。

発酵は、適当な振盪フラスコで行うことができ、さらに
多量の物質を得るためには２００１またはそれ以上の容
量の培養器を用いることができる。

フラスコ試験には側面に開口部をもつ５０〇−の三角フ
ラスコを用いる。このフラスコに栄養液１００ｍ１を入
れて、１２１℃で２０分間高圧滅菌する。使用する釣菌
（ｉｎｏｃｕｌａｎｔ）は８時間前培養の１％である。

培養は３６℃で、１分間に１６０回転（ｒｐｍ）の振盪
器で行う。

１５リツトル容量の発酵に関しては、２０リツトルの培
養器（タイプｂ２０ブラウン（Ｂｒａｕｎ）　／メルセ
ンケン（Ｍｅｌｓｕｎｇｅｎ）　　またはジオバノーラ
（Ｇｉｏｖａｎｏｌａ）　　フレーレス（Ｆｒｅｒｅｓ
）スイス、マンセイ製、再循環系をもっているもの）に
対して、栄養液を１５Ａ充填し、ポリオール（プロピレ
ングリコール）０．５ｍ１ｌ！を加え、用時に１２１℃
で３０分間滅菌する。使用した釣菌は８時間前培養の１
５０＋ｙ１を使用した。発酵は３５℃から３７℃の間で
０．２から０．６ｖｖｍ　、　７００−１０００ｒｌ）
ｍの間で、特に３６℃、Ｑ、　４　ｖｖｍかつ９００ｒ
ｐｍで行った。

バッチ発酵によるエピデルミン産生： 使用した生反応系では３６℃、換気速度Ｑ、　４　ｖｖ
ｍ。

振盪速度９００ｒｐｍで最良の発育とエピデルミンの最
大生産が得られた。換気速度の減少と振盪速度の減少は
エピデルミンの収量を減少させる（第５図）。さらに強
力な換気と振盪で収量は若干改良するが過剰な発泡も起
こる。これは抗生物質の強力な界面活性のためで、活性
の損失なしには、この発泡を機械的にまたは化学的に抑
えることはできなかった。

第２図は、１１中に３３ｇの肉エキス、３０ｇ麦芽エキ
ス３．８ｇの水酸化カルシウムを含む栄養液中で強力な
生産菌株ＤＳＭ３０９５を用いた２０リツトル容量での
バッチ培養の経過を表わしている。この菌株は１リツト
ル中に８０ｍｇまでの量のエピデルミンを産生ずる。集
中的な菌の発育は、供与された炭素源の消費と酢酸塩の
形成が伴うので、ｐＨ値の低下により知ることができる
。

３０時間後に最大の細胞数に達する。このあと、グルコ
ースとマルトースのような発酵に利用できる主たる炭素
源が消耗される。加えられたリン酸は８時間後に用足さ
れる。４８時間後に該抗生物質の最大濃度であるｉｉ！
中８０ｍｇに達する。

塩化ナトリウムまたは塩化カリウムのような塩化物を１
１あたり７０ｇの量まで添加すること、及び塩化第２鉄
または硫酸鉄を１５０ｍＭまでの添加することの両者に
より発酵経過を延長することなしにエピデルミンの収量
が増加したく第１図）。

塩化ナトリウム３％と塩化第二鉄（ＩＩ［）７５ｍＭを
生産培地に同時に加えることで３１０ｍｇ／Ａのエピデ
ルミン最大収量が得られた。

このような速いエピデルミン産生は、使用した培地を高
度に消費して連続した発酵過程を進展させる最良の方法
になる。

補栄養発酵（ｆｅｅｄｉｎｇ　ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏ
ｎ）によるエピデルミン産生： 成長の段階を延長し高い細胞密度を達成することにより
エピデルミンの収量増加を可能にするためには、より高
濃度の炭素源とリン酸塩を必要とした。エピデルミン産
生は炭素源の分解代謝産物による強い生産阻害を受けや
すく　（第６図）、培地のリン酸含有量によっても制御
される（第７図）。

全発酵過程を通じて、窒素濃度は１５０ｍＭ以上であり
、この含有物の大部分は微生物は利用できない。フラス
コ培養ではアンモニウム塩を１５０ｍＭまで加えると第
８図（塩化アンモニウムに関して）に示したようにエピ
デルミン産生を有意に刺激する。

グルコースはまずはじめに代謝され、酢酸塩を形成する
ことは培地の酸性化によって示されるとふりである。も
し、該糖類が不足した場合、有機酸は追加の炭素源とし
て使用され、ｐＨはアルカリ性に変ってくる。それ故に
グルコースを発酵中のｐＨに従って加える。ｐＨは６．
０に維持され、酸性化は抑制されない。

リン酸塩は連続的に加える。添加速度は１０ｍＭリン酸
塩が加えられたバッチ発酵でのリン酸塩の消費速度から
算出した。

グルコースもしくはリン酸塩を単独もしくは一緒に加え
ても発酵中にエピデルミンの収量を有意に増加しなかっ
た。発酵中にｐＨを制御しつつグルコースを添加すると
きに見られたエピデルミンの高含有量は、加えられた炭
素源に依存するのではなく、酸性の培地中で該抗生物質
の分解が遅いことによって引き起こされる。このことは
硫酸を加えてｐＨ値を一定に保つ発酵によって証明する
ことができる。補栄養発酵にｐＨ依存性のグルコース添
加と、リン酸塩及びアンモニウム窒素の連続添加を組み
合わてはじめて、バイオマスの有意な増加と抗生物質の
収量の増加となる。第３図は組み合わせた補栄養発酵の
経過を示している。

細胞集団は３倍まで増殖し、１ｍｊ！中２Ｘ１０”細胞
数になり、エピデルミンの最大収量は３５０ｍｇ／ｌに
なる。最大細胞濃度には、２４時間後に達するのに、エ
ピデルミンの最大収量に達するのは７２時間後の定常期
の間になってからである。

補栄養発酵の経過では、バッチ発酵の特徴である成長期
と産生期の一致がみられなくなる。それにもかかわらず
エピデルミン産生は、微生物の成長と密接に連関してい
る。まず、第一に全収量の８０％は対数増殖期（ｌｏｇ
　ｐｈａｓｅ）に生成され、第二にバイオマスは生きて
いる細胞群により作られている。このことは定常状態は
生育している細胞と融解する細胞により作られる平衡状
態であると見なせることを意味する。

補栄養発酵中に塩化す）　ＩＪウムを添加してもバッチ
発酵で見られるのと同様の刺激作用を生じない。最初の
２４時間では補栄養発酵の場合よりも産生速度は４０％
高く、また増殖速度は７０％高かった。従って、この微
生物の特異的生産性は２０％低く、２４時間後にエピデ
ルミンの生成は停止する。このことはこれまで知られて
いない要素による栄養の限界によるものかまたは代謝的
副産物生成によるこの微生物固有の毒性によるものと見
なすことができる。

この補栄養発酵組合わせ方法も、試験工場の２００リツ
トル容量に移し、換気速度、振盪速度、添加物の条件は
同じものを使用した。何ら至適化のための条件を加える
ことなく２０リツトル容量で達成した収量の８０−９０
％の範囲でエピデルミンが得られた。

産生されたエピデルミンのオンライン（ｏｎ−１ｉｎｅ
）吸着を用いたエピデルミン製造方法： 非連続的吸着法： フィードバック抑制と生産菌に与えろる他の影響を防ぐ
ために、そして生成したエピデルミンをプロテアーゼと
熱による分解から保護するために、エピデルミンを発酵
中に発酵液から非連続的に取り除いた。

これを行うために、生産菌を含む全発酵液を圧力下にア
ンバーライトＸＡＤ−１１８０を充填した球状の吸着用
容器に噴霧した。この操作により該樹脂を激しく撹乱し
結果としてエピデルミンを急速に吸着させた。浮遊する
レジンの小球をふるい（直径０．２５ｍｍ）により濾去
し、培養液はバイオマスとともに反応系に再循環させる
（第９図）。

エピデルミンの非連続的に吸着を伴う補栄養発酵の経過
を第４図に示す。培養のパラメーターと付加する条件は
上述したものと同一にした。最大細胞数は４６時間後に
４Ｘ１０”細胞に達し、該樹脂から溶出後のエピデルミ
ン最大収量は５００ｍｇ／ｌであった。全体の発酵時間
は補栄養発酵と等しかった。

単離の最初の段階を発酵工程中に組み込むことではじめ
の精製もしくは粗精製が単純化される。

すなわちこのはじめの精製段階の後でのエピデルミンの
収量は、通常の補栄養発酵における精製前の収量と比べ
ると５０％高い。

連続吸着法： 発酵工程中のエピデルミン連続オンライン吸着は、対流
（ｃｒｏｓｓ−ｆ　ｌｏｗ）濾過装置を用いて行なう。

残留された材料は反応系へ再循環させ、一方法液は、ア
ンバーライトＸＡＤ−１１８０カラムに吸着させる。こ
の溶出液も反応系に再循環させる（第１０図参照）。吸
着は１２−１５時間の発酵後に開始される吸着樹脂から
遊離後のエピデルミンの最大収量が５００ｍｇ／ｆに達
するのは８０がら９０時間後である。

第１０図に示すように最適化された該単離方法は、エピ
デルミン産生を増加させる試みを大いに達成するもので
ある。本発明の吸着方法をイオン交換クロマトグラフィ
ーとの組み合わせると８０％純度の生成物が最終的に得
られる。バッチ法とオンライン吸着法の併用は迅速なエ
ピデルミン精製法となる。

発酵の経過をモニターするために、培養中の各時点で無
菌的に試料を採取する。試料を次のように評価した。

ａ）ｐＨ値： 実験用ｐＨメーターを使用して計測 にツクｐＨ−ｍｖメーター） ｂ）増殖パターン： 生菌数の増加により増殖をモニターした。

無菌的に取り出した０、５ｍＩ！の培地を生理食塩中に
希釈しその０．１ａｌｌ：を平板上に拡げた（培地：Ｉ
Ａ中にペプトン１０ｇ１肉エキス８ｇ、食塩３ｇ、Ｉ）
ン酸二ナトリウム２ｇ１グルコース１０ｇ）。３７℃で
１８時間の培養後、それぞれのコロニーを数えた。

Ｃ）抗生物質の濃度： 試料はエッベンドルフ遠心管３２００中で２分間遠心分
離し、上清１０ｍｆｌ！を拡散希釈試験法か、以下に述
べるＨＰＬＣにより試験した。平行して既知濃度を用い
た較正曲線を作った。

ＨＰＬＣシステム： 吸入容量：１０μβ 溶出剤　：ＡニアＱ％過塩素酸をＯ，０５％含む水 Ｂニアセトニトリル 勾　配：　分　　Ａ　　　　Ｂ ０　７７．５　２２．５ ８　６３．０　３７．０ ８．５　０　１００ ９．５　０　１００ １０　７７．５　２２．５ １４　７７．５　２２．５ 流　　速：２−７分 検　　　出：２１０ｎｍ カラム　：予備カラムの付随しているヌクレオシルア　
　Ｃ−１８ ｄ）リン酸塩測定： 培養濾液中のリン酸濃度はイタヤ（Ｉ　ｔａｙａ）　　
とライ（［Ｊｉ）　（１９６６年、Ｃｌ１ｎ、　Ｃｈｉ
ｍ、　Ａｃｔａ　１４巻、３６１−３６６頁）の方法を
用いた。

ｅ）窒素の測定： 窒素濃度は、自動希釈装置（テカトール（Ｔｅｃａｔｏ
ｒ）社製のケルダールシステム■型のもの）を用いたミ
クローケルプール法により測定した。

ｆ）グルコースとマルトースの測定： 培地中のグルコースとマルトースの濃度はべ一すンガー
マンハイム社製の試験キットを用いて酵素的に決定した
。

ｇ）酢酸塩の測定： これはプラテン（Ｐｌａｔｅｎ）とシンク（Ｓｃｈｉｎ
ｋ）（１９８７年、Ａｒｃｈ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｉ、
１４９巻、１３９−１４１頁）の指示に従ってガスクロ
マトグラフィーによって行った。

ｈ）エピデルミンの測定： 培養液中のエピデルミンの濃度は生物検定により一度測
定し、また別にフィードラ−（Ｆｉｅｄｌｅｒ）ら（Ｃ
ｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉａ　２４巻、４３３−４３
８頁、１９８７年）によるＨＰＬＣ法によって測定した
。

産生がピークに達したのち、培養液は連続遠心分離（遠
心分離器ＬＡ７１６−４タイプ、ローエル（Ｌｏｈｅｒ
）　　とゾーネ（Ｓｏｈｎｅ）　、ルハストルフ（Ｒｕ
ｈｓｔｏｒｆ）　／　０７ト（Ｒｏｔｔ）　）により１
３８０回転で遠心分離した。細胞の分離を最適に行なう
ために流速は非常におそく保った。活性成分の初期濃縮
は上述したようなスチレン−ジビニル共重合体への吸着
により達せられた。

抗生物質吸着の他の方法、例えばバッチ吸着と細胞集団
の分離がある場合とない場合の断続的吸着法と連続的吸
着法は、すでに上述しである。

次の実施例は、本発明を例示するものである。

実施例１ スタフィロコッカスエピデルミディスＤＳＭ３０９５菌
株を用いたバッチ発酵： 培　地：３．３重量％　ラブＬ／　ン：］　（Ｌａｂ　
Ｌｅｍｃｃ）粉末 ３．０重量％　麦芽エキス ０．３８重量％　水酸化カルシウム ｐＨ６，５（３規定　硫酸） 反応系：培地１５Ｉ！のタイプｂ２０　（ジオバノーラ
、Ｇ　１ｏｖａｎｏ　ｌａ） 換気速度：　０．４　ｖｖｍ 振盪速度：　９００ｒｐｍ 温度二３６℃ 結　果：４８時間後の最大エピデルミン収量は１βｃｌ
ｌＯｍｇ：結果については第２図参照のこと。

実施例２ スタフィロコッカスエビデルディスＤ　Ｓ　Ｍ３０９５
菌株を用いた補栄養発酵： 培　地：３．３重量％　ラブシンク（Ｌａｂ　Ｌｅｍｃ
ｏ）粉末 ３．０重量％　麦芽エキス ０．３８重量％　水酸化カルシウム ｐＨ６，５（３規定　硫酸） 反応系：培地１５７のタイプｂ２０（ジオバノーラ） 換気速度：０．４ｖｖｍ 振盪速度：　９０　Ｑｒｐｍ 温度：３６℃ 添加条件： 溶液１ニ ゲルコース１ｋｇ、水１ｊ！、ｐＨ６，０゜この溶液は
ｐＨに従って加え、培地のｐＨを６．０に調整した。

溶液２　： 塩化アンモニウム５００ｇ５ＫＨ，ＰＯ４１２０ｇ。

水１．５　ｆｐＨ６，０（無水水酸化ナトリウムで調整
する）。この溶液は１時間に１リツトルにつきｌｄの一
定流速で添加した。添加は４時間後に開始した。

結果： 最大エピデルミン収量ニア２時間後に３５０ｍｇ／β。

結果については第３図も参照のこと。

実施例３ 抗生物質のオンライン吸着を伴う補栄養発酵：培　地　
：実施例２を参照のこと 反応系　：実施例２を参照のこと 吸　着　：アンバーライトＸＡＤ−１，１８０乾燥重量
１５０ｇ上に吸着 結　果　：最大エビデルミソ収量１７２時間後に５００
ｍｇ／β。エピデルミン収量 は単離の第一段階（実施例４参照） の後に測定した。結果については第 ４図を参照のこと。

実施例４ オンライン吸着後の１５β培養液からのエピデルミンの
単離と精製： 培養中のエピデルミンのオンライン吸着のあと、該樹脂
（実施例３を参照）を１５０１の水で洗浄した。吸着用
容器を使用した場合には、さらに洗浄溶出するためにカ
ラムに移した。

洗　浄：　５１メタノール／水　１：１（容量：容量　
ｖ：ｖ） 溶　出：　５βメタノール１０．０１規定塩酸９：ｌｖ
：ｖ） 溶出液のｐＨは５．５に調整した；各々４５ｇのアンバ
ーライトＩＲＣ−５０からなる２つのバッチを溶出液に
１時間以上加えることによってエピデルミンを該樹脂に
吸着した。該樹脂は洗浄、溶出のためにカラム内に移し
た。

洗　浄：　２リツトルの０．０５規定リン酸ナトリウム
緩衝液（ｐｔｌ　７．０　） 溶　出：　１０リツトルの水／メタノール８：２　（Ｖ
：Ｖ）１０．０５ 規定リン酸す）　ＩＪウム／１．５規定食塩（ｐＨ７，
０＞ 塩を除去するため溶出液のｐＨは６．０に調整し、エピ
デルミンはアンバーライトＸＡＤ−１１８０のバッチに
吸着した。２つのバッチは各々乾燥重量７５ｇからなり
１時間以内で加えた。該樹脂は洗浄と溶出のためにカラ
ムに充填した。

洗浄：水２０β 溶　出：２．５βのメタノール１０．０１規定塩酸９：
ｌ（ｖ：ｖ） 溶媒の蒸発と溶出液の凍結乾燥後６５００ｍｇの物質が
得られ、これにはエピデルミン５２００ｍｇ含まれてい
た（８０％純度）。最終的な精製は、分取型ＨＰＬＣに
より勾配溶出により行なった：カラム：ヌクレオシル１
００　　Ｃ−１８（１０μ）溶　媒：Ａ：１重量％のギ
酸を含む水 Ｂ：１重量％のギ酸を含むメタノール ／水８：２ 分取型ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）と凍結
乾燥後に純粋なエピデルミン４．９４　ｇが得られた。

該抗生物質は行なったすべての試験で単一品であること
がわかった。工程図を第１０図に示す。

エピデルミンの製造と単離の間に、モニターと生物学的
定性試験のために、平板希釈試験法を使用した。この本
主題に関するさらに詳しい情報は欧州特許Ａ−８５１１
３９０８，８に見出すことができるＱこの刊行物には、
スタフィロコッカスエビデルミゾイスＤＳＭ−３０９５
菌株がさらに詳細に定義されている。

ＤＳＭ−３０９５株により得られる培養液をＮＣｌＢ１
１５３６　　（アーベルディ−ン（Ａｂｅｒｄｅｅｎ）
のナショナルコレクンヨン　オブ　インダストリアルバ
クテリアに寄託されている）により得られる培養液に変
えても、エピデルミンを製造し単離しそれにつづき精製
するこが可能である。しかし、エピデルミン産生の点で
はＭＣｌ８１１５３６株はＤＳＭ３０９５株よりも劣っ
ている。

エピデルミンは湿疹、膿伽疹、蜂巣織炎、にきびのよう
な皮膚疾患に抗生物質として作用する。

【図面の簡単な説明】

第１図は３％塩化ナトリウムに種々の濃度の塩化鉄（Ｉ
Ｉ［＞の添加に対するエピデルミン産生の依存性を示す
。 第２図は、３．３％肉エキス３％麦芽エキス５０ｍＭ水
酸化カルシウム下の発酵経過を示す。 第３図は、３．３％肉エキス、３％麦芽エキス、５０ｍ
Ｍ水酸化カルシウム、グルコース、ＫＨ２ＰＯ，、そし
て塩化アンモニウムの発酵の経過を示す。 第４図はオンライン吸着を含んだ３．３％肉エキス、３
％麦芽エキス５０、ｍＭ水酸化カルシウムの発酵の経過
を示す。 第５図は換気速度と振盪速度がエピデルミン収量に与え
る影響を示す。 第６図は炭素源分解代謝産物による生産阻害を示す。 第７図はリン酸塩濃度による制御を示す。 第８図はアンモニア濃度とエピデルミン濃度の関係を示
し、アンモニア１５０ｍＭまでの添加でエピデルミン産
生が１ｌｆｆｉされることを示す。 第９図は非連続吸着における培養液とバイオマスの再循
環を示す。 第１０図は連続吸着において、培養液とバイオマスと培
を濾液からエピデルミンを吸着した後の溶出液の再循環
を示す流れ図である。 下 ○ エピデルミ ン濃度 （ｍｇ／ｆｆ：１ エピデルミ ン濃度 ［ｍｇ／β〕

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、スタフィロコッカスエピデルミディス株の培養液若
   しくは培養濾液からエピデルミンを単離する方法であっ
   て、以下の工程： ａ）該培養濾液若しくは培養液をスチレン−ジビニル共
   重合体に加える工程、 ｂ）該活性成分を該樹脂からメタール／希塩酸を用いた
   溶出により解離する工程、 ｃ）該溶出液をｐＨ５．３から５．８に調整する工程、 ｄ）該溶出液を弱陽イオン交換樹脂に付する工程、 ｅ）引き続き非結合物質をｐＨ７の緩衝液で洗出する工
   程、 ｆ）該活性物質を緩衝剤、塩化ナトリウム及びメタノー
   ルを含むｐＨ６．０から８．０の溶液で該陽イオン交換
   樹脂から精製のために溶出する工程、及び ｇ）該溶出液の該活性成分をスチレン−ジビニル共重合
   体に再吸着させて、塩をとり除くために該樹脂を水で洗
   浄し、エピデルミンをメタノール／酢酸混合液で該樹脂
   から解離させ、その溶液を蒸発又は凍結乾燥し、さらに
   このようにして得られたエピデルミンを精製するために
   ひき続き高速液体クロマトグラフィーに任意に付する工
   程 を含むこと特徴とする方法。 ２、該培養液または培養濾液からスチレン−ジビニル共
   重合体への吸着によりエピデルミンを抽出し、該樹脂か
   らメタノール／０．０１規定塩酸（９：１ｖ：ｖ）を用
   いて該活性物質を解離し、該溶出液のｐＨを５．３と５
   ．８の間に調製してアンバーライトＩＲＣ−５０又はＩ
   ＲＣ−８０のようなイオン交換樹脂としてのメタクリル
   酸−ジビニルベンゼン共重合体に付し、該イオン交換は
   カラム内で行ってもよく、又は少量を添加して行っても
   よく、非結合物質は、ｐＨ７．０の０．０５規定リン酸
   ナトリウム緩衝液で該樹脂から洗出し、該活性物質は食
   塩１．５規定の８０％リン酸ナトリウム緩衝液／２０％
   メタノールを含むｐＨ７．０の溶液で該樹脂から解離さ
   せ、そのようにして得られた該溶出液のｐＨを６．０に
   調整してスチレン−ジビニル共重合体樹脂に加えて塩を
   洗出してさらに精製し、エピデルミンをこの樹脂からメ
   タノール／５０％酢酸（９：１ｖ：ｖ）で解離し、該溶
   出液を蒸発または凍結乾燥し、このようにして得られた
   エピデルミンは必要であれば分取型高速液体クロマトグ
   ラフィーで最終的な精製に付してもよいことを特徴とす
   る、請求項１記載の方法。 ３、エピデルミン産生を温度３５−３７℃、換気速度０
   ．２−０．６ｖｖｍ、振盪速度７００−１０００ｒｐｍ
   で７０ｇ／ｌまでの塩化物、好ましくは塩化ナトリウム
   及び／又は１５０ｍＭまでの鉄塩を添加した生反応系で
   のバッチ型発酵で行うことを特徴とする、請求項１又は
   ２記載の方法。 ４、炭素源及び／又はリン酸塩及び／又はアンモニア若
   しくはアンモニウム塩を連続的または非連続的に発酵中
   の発酵液に供給することを特徴とする、請求項３に記載
   の方法。 ５、発酵中に生成したエピデルミンをスチレン−ジビニ
   ル共重合体に吸着させて非連続的に培地から除去し、該
   処理した該培養液とバイオマスを発酵器に再循環させる
   ことを特徴とする、請求項１ないし４のいずれか１項に
   記載の方法。 ６、発酵中に生成したエピデルミンをスチレン−ジビニ
   ル共重合体に連続的オンライン吸着により培養液から除
   去し、残留物を連続的に反応系に再循環させることを特
   徴とする、請求項１ないし４のいずれか１項に記載の方
   法。 ７、２から４重量％の肉エキス、１から３重量％の麦芽
   エキス又はマルトース、ガラクトース、ラクトース、グ
   ルコース、若しくはラクトース及びマルトースの混合物
   、ガラクトース及びマルトースの混合物、及び０．２５
   から１重量％の炭酸カルシウムまたは０．２５から０．
   ５重量％の水酸化カルシウム、０．００１から０．００
   ２重量％の鉄イオンと５７から２００ミリモルに相当す
   るアンモニウム塩がｐＨ６から７の間で培養液に含まれ
   ることを特徴とする、請求項１ないし３のいずれか１項
   に記載の方法。 ８、３．３重量％の肉エキス、３重量％の麦芽エキス又
   はマルトース、０．３７重量％の水酸化カルシウム、及
   び任意に１から６重量％の塩化ナトリウム及び／又は塩
   化カリウム、好ましくは塩化第２鉄または硫酸鉄の形態
   である０．００１から０．００２重量％の鉄イオン、及
   び好ましくは塩化アンモニウムまたは硫酸アンモニウム
   である５７から２００ミリモル溶液相当のアンモニウム
   塩、任意にリン酸二水素カリウムまたはリン酸二水素ナ
   トリウムがｐＨ６から７で培養液に含まれることを特徴
   とする、請求項７に記載の方法。９、スタフィロコッカ
   スエピデルミディスＤＳＭ−３０９５をエピデルミン産
   生株として使用することを特徴とする、請求項１ないし
   ８のいずれか１項に記載の方法。 １０、スタフィロコッカスエピデルミディスＮＣＩＢ−
   １１５３６をエピデルミン産生株として使用することを
   特徴とする、請求項１ないし８のいずれか１項に記載の
   方法。