JPS6255837B2 - - Google Patents
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- JPS6255837B2 JPS6255837B2 JP55036882A JP3688280A JPS6255837B2 JP S6255837 B2 JPS6255837 B2 JP S6255837B2 JP 55036882 A JP55036882 A JP 55036882A JP 3688280 A JP3688280 A JP 3688280A JP S6255837 B2 JPS6255837 B2 JP S6255837B2
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D487/00—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, not provided for by groups C07D451/00 - C07D477/00
- C07D487/22—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, not provided for by groups C07D451/00 - C07D477/00 in which the condensed system contains four or more hetero rings
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
- C12P17/18—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing at least two hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system, e.g. rifamycin
- C12P17/182—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring heteroatoms in the condensed system
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/06—Arthrobacter
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、コプロポルフイリン及びウロポルフ
イリンの両者を含有する培養ずみブロスから、こ
れらの両成分を、容易な操作で且つ分離回収効率
よく、工業的に有利に分離回収できるポルフイリ
ン類の分離回収方法に関する。 更に詳しくは、本発明はコプロポルフイリン及
びウロポルフイリンを含有する培養ずみブロスの
の液相部のPHを４〜約2.5の範囲のPH値に調節し
て該コプロポルフイリン及びウロポルフイリン含
有混合固形分を形成させ、該混合固形分を採取し
てその水性アルカリ溶液を調製し、該溶液のPHを
４を超え約６以下の範囲のPH値に調節してコプロ
ポルフイリン含有固形分を形成して該固形分を採
取し、残液のPHを４〜約１の範囲のPH値に調節し
てウロポルフイリン含有固形分を形成して該固形
分を採取することを特徴とするポルフイリン類の
分離回収方法に関する。 ポルフイリン類は、各種の生物の組織内に広く
存在しており、生体内の酸素の運搬、生体内の酸
化還元反応の触媒などの生理学的作用に関連する
ヘムタンパクの構成成分として重要な化合物であ
り、その医薬的用途に関しても、例えば肝機能改
善など臓器に対する調節作用に興味ある生理学的
に注目される活性物質である。 ポルフイリン類は、血液中の血色素からの抽出
或はポルフイリン類生産性微生物の培養などによ
つて製造されるが一般的であるが、共存する他の
生体組織成分から、ポルフイリン類の単離を効率
よく行なうことは、必ずしも容易でない。特に、
微生物菌体を包含して生体内で生産される際に、
コプロポルフイリンとウロポルフイリンの両者が
生産される場合があり、これらを効率よく分離回
収する手段の開発が望まれる。 従来、例えば、コプロポルフイリンもしくはウ
ロポルフイリンの一方を含む水性系からこれらを
分離回収する手段はいくつか知られている。しか
しながら、コプロポルフイリン及ぼウロポルフイ
リンの両者を含有する系から、これを効率よく分
離回収する手段については知られていない。上記
ポルフイリン類の一方を含む系からの分離回収手
段としては、例えば、酢酸―酢酸エチルの如き溶
媒を用いて溶媒抽出し、ついで抽出されたポルフ
イリンをメチルエステル化し、次いで、アルミナ
の如き吸着剤を用いて吸着クロマトグラフイー手
段に賦する方法〔J.Chromatog.，５（1961）277
〜299；Biochem.J.，62（1956）78〕、イオン交換
樹脂で処理する方法〔日本農芸化学会誌，50
（1976）41〜47〕、クロロホルムに溶解し過した
のち、多量のメタノール中に投入して再結晶を行
う方法などが知られている。 これらは、実際の操作が煩雑で、また効率のよ
い回収が行い難い難点がある。更に、例えば、コ
プロポルフイリン及びウロポルフイリンの両者を
含有する系から、これら両成分を効率よく分離回
収するのに転用することはできない。 本発明者等は、例えば、アースロバクター・ヒ
アリナス、アースロバクター・パツセンス、更に
はそれらの変異ないし、変種菌の如き菌類が、コ
プロポルフイリン及びウロポルフイリンの両者を
生産できる能力を有することを知り、このような
コプロポルフイリン及びウロポルフイリン生産菌
を培養して得られた培養ずみブロスから、これら
両者を容易な操作で効率よく分離（分別）し、回
収できる手段を開発すべく研究を行つてきた。そ
の結果、コプロポルフイリン及びウロポルフイリ
ンを含有する培養ずみブロスの液相部を採取し、
特定のPH条件下のPH調節による混合沈澱物の形
成、特定のPH条件下の該沈澱物の再溶解及び特定
のPH条件下のPH調節による再沈澱の組み合わせか
らなる容易な操作によつて且つ分離回収効率よ
く、コプロポルフイリン及びウロポルフイリンを
分離回収できことを発見した。 本発明者等の研究によれば、該液相部のPHを４
〜約2.5の範囲のPH値に調節することによつて、
該液相部中のコプロポルフイリン及びウロポルフ
イリンを選択的に且つ容易に沈澱せしめることが
でき、このようにして形成されるコプロポルフイ
リン及びウロポルフイリン含有固形分を採取し、
アルカリの存在下に溶解して該混合固形分の水性
アルカリ溶液を調製し、該溶液のPHを４を超え約
６以下、好ましくは4.2〜約６の範囲のPH値に調
節すると、コプロポルフイリンを選択的に効率よ
く析出せしめることができ、一方、残液のPHを４
〜約１の範囲のPH値に調節するとウロポルフイリ
ンを効率よく析出せしめることができ、斯くし
て、きわめて容易且つ安価な操作で、これら両成
分を効率よく分離回収できることが発見された。 従つて、本発明の目的はコプロポルフイリン及
びウロポルフイリンの両者を含有する系から、こ
れらを、容易な操作で且つ分離回収効率よく、工
業的に有利に分離回収できるポルフイリン類の分
離回収方法を提供するにある。 本発明の上記目的及び更に多くの他の目的なら
びに利点は、以下の記載から一層明らかとなるで
あろう。 本発明方法によつて処理されるコプロポルフイ
リン及びウロポルフイリンを含有する培養ずみブ
ロスは、これら両者を含有するブロスであればよ
く、使用するポルフイリン生産菌株、培養条件な
どに、とくべつな制約はない。例えば、コプロポ
ルフイリン生産菌株とウロポルフイリン生産菌株
との共培養手段たとえば同時もしくは任意の順序
の共培養手段、これらの組み合わせ等によつて形
成されたコプロポルフイリン及びウロポルフイリ
ン含有ブロスであつてもよいし、或は又、コプロ
ポルフイリン生産菌株の培養ブロスとウロポルフ
イリン生産菌株の倍養ブロスとの混合系であつて
もよいが、好ましくは、これらの両者を生産する
能力を有する菌株、とくには、アースロバクター
属に属するコプロポルフイリン及びウロポルフイ
リン生産菌を培養することにより形成されたブロ
スが好ましい。 このようなコプロポルフイリン及びウロポルフ
イリン生産菌としては、例えばアースロバクタ
ー・ヒアリナス（Arthrobacter hyalinus：微工
研菌寄第3125号、ATCC31263）、アースロバクタ
ー・パツセンス（Arthrobacter Pascens：
ATCC13346、IFO12139）及びそれらの変異ない
し変種菌よりなる群からえらばれた生産菌を例示
することができる。これら生産菌はコプロポルフ
イリン及びウロポルフイリンの両者を生産す
る能力を有する。 又、コプロポルフイリンのみを実質的に生産
する菌としては、下記の如き公知菌を例示するこ
とができる。 ロドプソイドモナス・スフエロイデス（Rhcdo
―Pseudmonas spheroides）、ミクロコツカス・
リゾデクチカス（Micrococcus lysodeikticus
IFO3333）、スタフイロコツカス・エピデラミデ
ス（Staphylococcus epidermidis IFO3762，
IFO12993）、サツカロミセス・セレビシエ
（Saccharomyces ereuisiae IFO）、バチルス・セ
レウス（Bacillus cereus）、ストレプトミセス・
グリセウス（Streptomyces griseus）、ストレプ
トミセス・オリバシウス（Streptomyes
oliuaceus）、ミコバクテリウム・スメグマチス
（Mycobacterium smqgmatis）、コリネバクテ
ム・ジフテリア（Corynebacterium
diphtheriae）、コリネバクテリウム・シンプレツ
クス（Corynebacterium simplex）。 更に、ウロポルフイリンのみを生産する微生
物としては、ロドプソイドモス・スフエロイデス
（Rhodcpseudomonas spherordes）、プロピオニ
バクテリウム・グラヌロサム
（Propionibacterium granulosum）、プロピオニ
バクテリウム・アクネス（Propionibacterium
acnes）などを例示することができる。 以上に例示したボルフイン類生産菌は、上記に
例示において記載した寄託番号で該寄託機関に寄
託された自由分譲菌であつて、当業者はこれら寄
託機関から容易に入手できる。 又、アースロバクター属に属する上記例示の好
ましいコプロポルフイリン及びウロポルフイリ
ン生産菌は、従来公知の他の属に属する生産菌
が培養ブロス中に生産するコプロポルフイリン
10〜40mg／、ウロポルフイリン４mg／の生
産量に比して、コプロポルフイリンについては
約10倍の500mg／、ウロポルフイリンについ
ては25倍の100mg／にも達する量を生産する点
で、本発明方法の実施に利用する原料ブロスの製
造に、とくに好ましいもである。 本発明方法で用いるコプロポルフイリン及びウ
ロポルフイリンを含有する培養ずみブロスの液相
部は、上記例示の如き微生物を利用して得られる
培養ブロスから菌体その他の固形分を除いた液相
部として得ることができる。例えば遠心分離の如
き手段で上記分離を行なうことができる。 上記ブロスを形成するための倍養は、例えば、
適当な炭素源、窒素源、ミネラル源などを含有す
る倍地を用いて、前記例示の如き菌株に公知の至
適PHＨ条件、至適温度条件付近の適当な培養条件
を選択して行うことができる。例えば、本発明方
法の実施にとくに適したコプロポルフイリン及び
ウロポルフイリンを含有する培養ずみ原料ブロス
を得るには、アースロバクター属に属するコプロ
ポルフイリン及びウロポルフイリン生産菌を、例
えば、温度約20゜〜約40℃、PHＨ約４〜約9.5の
如き培養条件の採用を例示することができる。培
養時間は適宜に選択でき、例えば、約２日〜約８
日の如き培養時間を例示することができる。 上記窒素源の例としては、たとえば、コーン・
スチープ・リカー、酵母エキス、肉エキス、ペプ
トン、アミノ酸類、蛋白水解物、フイツシユミー
ル、アンモニウム塩類、硝酸塩類、尿素などをあ
げることができる。これらは複数種利用すること
ができる。又、炭素源の例として、糖質、アルコ
ール類、炭化水素類、ふすま、などを例示でき、
これらも複数種利用することができる。さらに、
ミネラル源の例としては、リン酸塩類、マグネシ
ユム塩類、亜鉛塩類、カルシウム塩類、マンガン
塩類、モリブデン塩類、銅塩類などを例示するこ
とができ、複数種利用してよい。 本発明方法によれば、上記例示の如くして得る
ことのできるコプロポルフイリン及びウロポルフ
イリンを含有する培養ずみブロスの液相部のPHを
４〜約2.5、好ましくは約3.8〜2.8の範囲のPH値に
調節して、該液相部中のコプロポルフイリン及び
ウロポルフイリンの両者を含有する混合固形分を
形成させる。混合固形分は、通常、沈澱物の形で
形成され、該固形分を任意の固―液分離手段、た
とえば、遠心分離、過などの手段で採取する。 上記PH調節に利用する酸性物質の例としては、
硫酸、塩酸、硝酸、リン酸などの如き無機酸類、
及びギ酸、酢酸、シユウ酸、乳酸などの如き有機
酸類を例示することができる。 上述のようにして採取される混合固形分は、液
相部中に包含され得る炭素源、窒素源、ミネラル
類その他の挾離成分から可成り良好に選択的に分
離されたコプロポルフイリン及びウロポルフイリ
ンから成る固形分として取得することができる。 次いで、該混合固形分を再溶解して水性アルカ
リ溶液を調製する。この際利用するアルカリ類と
しては、コプロポルフイリン及びウロポルフイリ
ンの両者を溶解できる種類及び濃度の任意のアル
カリ類を利用することができる。好ましいアルカ
リ類の例としては、苛性ソーダ、苛性カリ、炭酸
ソーダ、炭酸カリ、炭酸カルシウムなどを例示す
ることができる。 上述のようにして再溶解された水性アルカリ溶
液のPHＨを、４を超え約６以下、好ましくは約
4.2〜約６、より好ましくは約4.4〜約4.8の範囲の
PHＨ値に調節することにより、該溶液中のコプロ
ポルフイリンを選択的に析出させ、析出したコプ
ロポルフイリン含有固形分を採取することによ
り、好純度のコプロポルフイリン成分を分離回収
することができる。このPHＨ調節に利用する酸性
物質の例として、前記混合固形分の形成について
例示したと同様な酸類を例示することができる。
固形分の採取は、過、遠心分離、その他任意の
固―液分離手段により行うことができる。このよ
うにしてコプロポルフイリン含有固形分を分離採
取した残液は、そのPHを、４〜約１の範囲のPHＨ
値、好ましくは約3.8〜約1.4の範囲のPHＨ値に調
節することにより、ウロポルフイリン含有固形分
を析出させ、析出したウロポルフイリン含有固形
分を採取することにより好純度のウロポルフイリ
ン成分を分離回収することができる。このPHＨ調
節に利用する酸性物質の例としては上記同様な酸
類が例示でき、固形分の採取も上記同様にして行
うことができる。 本発明方法によれば、上述のようにして、コプ
ロポルフイリン及びウロポルフイリンを含有する
培養ずみブロスの液相部からこれら成分を容易な
操作で、効率よく、好収率をもつて分離（分別）
採取することができる。また、更に精製する際の
操作を容易にすることができる。斯くして回収さ
れた各成分は、所望により、従来公知の手段によ
り更に精製することができる。このような精製手
段としては、たとえば、CH3OH―H2SO4混液で
メチルエステルとしたのち、アルミナ、またはシ
リカゲル等のカラムクロマトグラフイーで精製す
る方法、メチルエステル化ののち、ベンゼン、ト
ルエン、ピリジン、シクロルエタン、テトラヒド
ロフラン等の溶媒に投入し沸盪させ、放冷後、析
出させる方法などを例示することができる。更
に、本発明の実施に際しては、コプロポルフイリ
ン及びウロポルフイリン含有混合固形分の形成及
びその再溶解の操作を、くりかえしたのち、コプ
ロポルフイリン含有固形分形成のためのPHＨ調節
を行なうことができる。 以下、実施例により、本発明方法実施の数態様
について、更に詳しく説明する。 実施例 １ アースロバクター・ヒアリナス〔微工研菌寄受
託番号第3125号〕をイオン交換純水１あたり、
グリコース10ｇ、酵母エキス1.0ｇ、ペプトン3.0
ｇ、硝酸アンモニウム3.0ｇ、リン酸―カリウム
0.4ｇ、リン酸二ナトリウム1.5ｇ、硫酸マグネシ
ユウム5.0ｇ、硫酸マンガン10mg、硫酸亜鉛10
mg、硫酸銅200μｇ、三酸化モリブデン10μｇ、
炭酸カルシウム5.0ｇを含有する殺菌した培地200
mlを収容した500ml容三角フラスコに植菌して、
30℃で３日間振盪培養した。以後、２〜３日毎に
グルコース50％水溶液を添加し培養17日間の生産
濃度はコプロポルフイリンが200mg／、ウロ
ポルフイリンが89mg／であつた。 次に500ml容三角フラスコ20本に収容された４
の培養液を10000Gで10分間遠心分離した。得
られた上澄液を3NHClでPH3.0にしたあと、
1000Gで10分間遠心分離して沈殿物を得た。次に
この沈殿物を1NNaOH水１に溶かしたのち、
3NHClによりPH4.7に調整して、沈殿物を生じさ
せ、1000Gで10分間遠心分離して沈殿物中のコプ
ロポルフイリン790mg（回収率99％）を回収し
た。この沈殿物の薄層クロマトの結果、ポルフイ
リンとして１スポツトであることを確認した。ま
た沈殿物のメチルエステルの可視部吸収スペクト
ル、IR、NMR、融点等よりコプロポルフイリン
であることを確認した。 次に、コプロポルフイリンを除いた上澄液に
さらに3NHClを加えPH2.6に調整して沈殿を生じ
させ、1000Gで10分間遠心分離して沈殿物中のウ
ロポルフイリン350mg（回収率98％）を回収し
た。この沈殿物の薄層クロマトの結果、ポルフイ
リンとして１スポツトであることを確認した。ま
たこの沈殿物のメチルエステルの、可視部吸収ス
ペクトル、IR、NMR、融点等により、ウロポル
フイリンであることを確認した。 実施例 ２ アースロバクター・パツセンス（IFO12139）
を用いるほか実施例１と同様に17日間培養を行つ
た。得られた培養液中のコプロポルフイリンの
濃度は80mg／であり、ウロポルフイリンの濃
度は38mg／であつた。この培養液４を3NHCl
でPHH3.2にしたあと、1000Gで10分間遠心分離し
て沈殿物を得た。次にこの沈殿物を1NNaOH水１
に溶かした。 次に3NHClによりこの溶液のPHＨを4.4に調整
して沈殿物を生じさせ、1000Gで10分間遠心分離
して、コプロポルフイリン320mg（回収率100
％）を回収した。この上澄液にさらに3NHClを加
えPHH2.0に調整して、沈殿を生じさせ1000Gで10
分間遠心分離してウロポルフイリン151mg（回
収率99％）を回収した。
イリンの両者を含有する培養ずみブロスから、こ
れらの両成分を、容易な操作で且つ分離回収効率
よく、工業的に有利に分離回収できるポルフイリ
ン類の分離回収方法に関する。 更に詳しくは、本発明はコプロポルフイリン及
びウロポルフイリンを含有する培養ずみブロスの
の液相部のPHを４〜約2.5の範囲のPH値に調節し
て該コプロポルフイリン及びウロポルフイリン含
有混合固形分を形成させ、該混合固形分を採取し
てその水性アルカリ溶液を調製し、該溶液のPHを
４を超え約６以下の範囲のPH値に調節してコプロ
ポルフイリン含有固形分を形成して該固形分を採
取し、残液のPHを４〜約１の範囲のPH値に調節し
てウロポルフイリン含有固形分を形成して該固形
分を採取することを特徴とするポルフイリン類の
分離回収方法に関する。 ポルフイリン類は、各種の生物の組織内に広く
存在しており、生体内の酸素の運搬、生体内の酸
化還元反応の触媒などの生理学的作用に関連する
ヘムタンパクの構成成分として重要な化合物であ
り、その医薬的用途に関しても、例えば肝機能改
善など臓器に対する調節作用に興味ある生理学的
に注目される活性物質である。 ポルフイリン類は、血液中の血色素からの抽出
或はポルフイリン類生産性微生物の培養などによ
つて製造されるが一般的であるが、共存する他の
生体組織成分から、ポルフイリン類の単離を効率
よく行なうことは、必ずしも容易でない。特に、
微生物菌体を包含して生体内で生産される際に、
コプロポルフイリンとウロポルフイリンの両者が
生産される場合があり、これらを効率よく分離回
収する手段の開発が望まれる。 従来、例えば、コプロポルフイリンもしくはウ
ロポルフイリンの一方を含む水性系からこれらを
分離回収する手段はいくつか知られている。しか
しながら、コプロポルフイリン及ぼウロポルフイ
リンの両者を含有する系から、これを効率よく分
離回収する手段については知られていない。上記
ポルフイリン類の一方を含む系からの分離回収手
段としては、例えば、酢酸―酢酸エチルの如き溶
媒を用いて溶媒抽出し、ついで抽出されたポルフ
イリンをメチルエステル化し、次いで、アルミナ
の如き吸着剤を用いて吸着クロマトグラフイー手
段に賦する方法〔J.Chromatog.，５（1961）277
〜299；Biochem.J.，62（1956）78〕、イオン交換
樹脂で処理する方法〔日本農芸化学会誌，50
（1976）41〜47〕、クロロホルムに溶解し過した
のち、多量のメタノール中に投入して再結晶を行
う方法などが知られている。 これらは、実際の操作が煩雑で、また効率のよ
い回収が行い難い難点がある。更に、例えば、コ
プロポルフイリン及びウロポルフイリンの両者を
含有する系から、これら両成分を効率よく分離回
収するのに転用することはできない。 本発明者等は、例えば、アースロバクター・ヒ
アリナス、アースロバクター・パツセンス、更に
はそれらの変異ないし、変種菌の如き菌類が、コ
プロポルフイリン及びウロポルフイリンの両者を
生産できる能力を有することを知り、このような
コプロポルフイリン及びウロポルフイリン生産菌
を培養して得られた培養ずみブロスから、これら
両者を容易な操作で効率よく分離（分別）し、回
収できる手段を開発すべく研究を行つてきた。そ
の結果、コプロポルフイリン及びウロポルフイリ
ンを含有する培養ずみブロスの液相部を採取し、
特定のPH条件下のPH調節による混合沈澱物の形
成、特定のPH条件下の該沈澱物の再溶解及び特定
のPH条件下のPH調節による再沈澱の組み合わせか
らなる容易な操作によつて且つ分離回収効率よ
く、コプロポルフイリン及びウロポルフイリンを
分離回収できことを発見した。 本発明者等の研究によれば、該液相部のPHを４
〜約2.5の範囲のPH値に調節することによつて、
該液相部中のコプロポルフイリン及びウロポルフ
イリンを選択的に且つ容易に沈澱せしめることが
でき、このようにして形成されるコプロポルフイ
リン及びウロポルフイリン含有固形分を採取し、
アルカリの存在下に溶解して該混合固形分の水性
アルカリ溶液を調製し、該溶液のPHを４を超え約
６以下、好ましくは4.2〜約６の範囲のPH値に調
節すると、コプロポルフイリンを選択的に効率よ
く析出せしめることができ、一方、残液のPHを４
〜約１の範囲のPH値に調節するとウロポルフイリ
ンを効率よく析出せしめることができ、斯くし
て、きわめて容易且つ安価な操作で、これら両成
分を効率よく分離回収できることが発見された。 従つて、本発明の目的はコプロポルフイリン及
びウロポルフイリンの両者を含有する系から、こ
れらを、容易な操作で且つ分離回収効率よく、工
業的に有利に分離回収できるポルフイリン類の分
離回収方法を提供するにある。 本発明の上記目的及び更に多くの他の目的なら
びに利点は、以下の記載から一層明らかとなるで
あろう。 本発明方法によつて処理されるコプロポルフイ
リン及びウロポルフイリンを含有する培養ずみブ
ロスは、これら両者を含有するブロスであればよ
く、使用するポルフイリン生産菌株、培養条件な
どに、とくべつな制約はない。例えば、コプロポ
ルフイリン生産菌株とウロポルフイリン生産菌株
との共培養手段たとえば同時もしくは任意の順序
の共培養手段、これらの組み合わせ等によつて形
成されたコプロポルフイリン及びウロポルフイリ
ン含有ブロスであつてもよいし、或は又、コプロ
ポルフイリン生産菌株の培養ブロスとウロポルフ
イリン生産菌株の倍養ブロスとの混合系であつて
もよいが、好ましくは、これらの両者を生産する
能力を有する菌株、とくには、アースロバクター
属に属するコプロポルフイリン及びウロポルフイ
リン生産菌を培養することにより形成されたブロ
スが好ましい。 このようなコプロポルフイリン及びウロポルフ
イリン生産菌としては、例えばアースロバクタ
ー・ヒアリナス（Arthrobacter hyalinus：微工
研菌寄第3125号、ATCC31263）、アースロバクタ
ー・パツセンス（Arthrobacter Pascens：
ATCC13346、IFO12139）及びそれらの変異ない
し変種菌よりなる群からえらばれた生産菌を例示
することができる。これら生産菌はコプロポルフ
イリン及びウロポルフイリンの両者を生産す
る能力を有する。 又、コプロポルフイリンのみを実質的に生産
する菌としては、下記の如き公知菌を例示するこ
とができる。 ロドプソイドモナス・スフエロイデス（Rhcdo
―Pseudmonas spheroides）、ミクロコツカス・
リゾデクチカス（Micrococcus lysodeikticus
IFO3333）、スタフイロコツカス・エピデラミデ
ス（Staphylococcus epidermidis IFO3762，
IFO12993）、サツカロミセス・セレビシエ
（Saccharomyces ereuisiae IFO）、バチルス・セ
レウス（Bacillus cereus）、ストレプトミセス・
グリセウス（Streptomyces griseus）、ストレプ
トミセス・オリバシウス（Streptomyes
oliuaceus）、ミコバクテリウム・スメグマチス
（Mycobacterium smqgmatis）、コリネバクテ
ム・ジフテリア（Corynebacterium
diphtheriae）、コリネバクテリウム・シンプレツ
クス（Corynebacterium simplex）。 更に、ウロポルフイリンのみを生産する微生
物としては、ロドプソイドモス・スフエロイデス
（Rhodcpseudomonas spherordes）、プロピオニ
バクテリウム・グラヌロサム
（Propionibacterium granulosum）、プロピオニ
バクテリウム・アクネス（Propionibacterium
acnes）などを例示することができる。 以上に例示したボルフイン類生産菌は、上記に
例示において記載した寄託番号で該寄託機関に寄
託された自由分譲菌であつて、当業者はこれら寄
託機関から容易に入手できる。 又、アースロバクター属に属する上記例示の好
ましいコプロポルフイリン及びウロポルフイリ
ン生産菌は、従来公知の他の属に属する生産菌
が培養ブロス中に生産するコプロポルフイリン
10〜40mg／、ウロポルフイリン４mg／の生
産量に比して、コプロポルフイリンについては
約10倍の500mg／、ウロポルフイリンについ
ては25倍の100mg／にも達する量を生産する点
で、本発明方法の実施に利用する原料ブロスの製
造に、とくに好ましいもである。 本発明方法で用いるコプロポルフイリン及びウ
ロポルフイリンを含有する培養ずみブロスの液相
部は、上記例示の如き微生物を利用して得られる
培養ブロスから菌体その他の固形分を除いた液相
部として得ることができる。例えば遠心分離の如
き手段で上記分離を行なうことができる。 上記ブロスを形成するための倍養は、例えば、
適当な炭素源、窒素源、ミネラル源などを含有す
る倍地を用いて、前記例示の如き菌株に公知の至
適PHＨ条件、至適温度条件付近の適当な培養条件
を選択して行うことができる。例えば、本発明方
法の実施にとくに適したコプロポルフイリン及び
ウロポルフイリンを含有する培養ずみ原料ブロス
を得るには、アースロバクター属に属するコプロ
ポルフイリン及びウロポルフイリン生産菌を、例
えば、温度約20゜〜約40℃、PHＨ約４〜約9.5の
如き培養条件の採用を例示することができる。培
養時間は適宜に選択でき、例えば、約２日〜約８
日の如き培養時間を例示することができる。 上記窒素源の例としては、たとえば、コーン・
スチープ・リカー、酵母エキス、肉エキス、ペプ
トン、アミノ酸類、蛋白水解物、フイツシユミー
ル、アンモニウム塩類、硝酸塩類、尿素などをあ
げることができる。これらは複数種利用すること
ができる。又、炭素源の例として、糖質、アルコ
ール類、炭化水素類、ふすま、などを例示でき、
これらも複数種利用することができる。さらに、
ミネラル源の例としては、リン酸塩類、マグネシ
ユム塩類、亜鉛塩類、カルシウム塩類、マンガン
塩類、モリブデン塩類、銅塩類などを例示するこ
とができ、複数種利用してよい。 本発明方法によれば、上記例示の如くして得る
ことのできるコプロポルフイリン及びウロポルフ
イリンを含有する培養ずみブロスの液相部のPHを
４〜約2.5、好ましくは約3.8〜2.8の範囲のPH値に
調節して、該液相部中のコプロポルフイリン及び
ウロポルフイリンの両者を含有する混合固形分を
形成させる。混合固形分は、通常、沈澱物の形で
形成され、該固形分を任意の固―液分離手段、た
とえば、遠心分離、過などの手段で採取する。 上記PH調節に利用する酸性物質の例としては、
硫酸、塩酸、硝酸、リン酸などの如き無機酸類、
及びギ酸、酢酸、シユウ酸、乳酸などの如き有機
酸類を例示することができる。 上述のようにして採取される混合固形分は、液
相部中に包含され得る炭素源、窒素源、ミネラル
類その他の挾離成分から可成り良好に選択的に分
離されたコプロポルフイリン及びウロポルフイリ
ンから成る固形分として取得することができる。 次いで、該混合固形分を再溶解して水性アルカ
リ溶液を調製する。この際利用するアルカリ類と
しては、コプロポルフイリン及びウロポルフイリ
ンの両者を溶解できる種類及び濃度の任意のアル
カリ類を利用することができる。好ましいアルカ
リ類の例としては、苛性ソーダ、苛性カリ、炭酸
ソーダ、炭酸カリ、炭酸カルシウムなどを例示す
ることができる。 上述のようにして再溶解された水性アルカリ溶
液のPHＨを、４を超え約６以下、好ましくは約
4.2〜約６、より好ましくは約4.4〜約4.8の範囲の
PHＨ値に調節することにより、該溶液中のコプロ
ポルフイリンを選択的に析出させ、析出したコプ
ロポルフイリン含有固形分を採取することによ
り、好純度のコプロポルフイリン成分を分離回収
することができる。このPHＨ調節に利用する酸性
物質の例として、前記混合固形分の形成について
例示したと同様な酸類を例示することができる。
固形分の採取は、過、遠心分離、その他任意の
固―液分離手段により行うことができる。このよ
うにしてコプロポルフイリン含有固形分を分離採
取した残液は、そのPHを、４〜約１の範囲のPHＨ
値、好ましくは約3.8〜約1.4の範囲のPHＨ値に調
節することにより、ウロポルフイリン含有固形分
を析出させ、析出したウロポルフイリン含有固形
分を採取することにより好純度のウロポルフイリ
ン成分を分離回収することができる。このPHＨ調
節に利用する酸性物質の例としては上記同様な酸
類が例示でき、固形分の採取も上記同様にして行
うことができる。 本発明方法によれば、上述のようにして、コプ
ロポルフイリン及びウロポルフイリンを含有する
培養ずみブロスの液相部からこれら成分を容易な
操作で、効率よく、好収率をもつて分離（分別）
採取することができる。また、更に精製する際の
操作を容易にすることができる。斯くして回収さ
れた各成分は、所望により、従来公知の手段によ
り更に精製することができる。このような精製手
段としては、たとえば、CH3OH―H2SO4混液で
メチルエステルとしたのち、アルミナ、またはシ
リカゲル等のカラムクロマトグラフイーで精製す
る方法、メチルエステル化ののち、ベンゼン、ト
ルエン、ピリジン、シクロルエタン、テトラヒド
ロフラン等の溶媒に投入し沸盪させ、放冷後、析
出させる方法などを例示することができる。更
に、本発明の実施に際しては、コプロポルフイリ
ン及びウロポルフイリン含有混合固形分の形成及
びその再溶解の操作を、くりかえしたのち、コプ
ロポルフイリン含有固形分形成のためのPHＨ調節
を行なうことができる。 以下、実施例により、本発明方法実施の数態様
について、更に詳しく説明する。 実施例 １ アースロバクター・ヒアリナス〔微工研菌寄受
託番号第3125号〕をイオン交換純水１あたり、
グリコース10ｇ、酵母エキス1.0ｇ、ペプトン3.0
ｇ、硝酸アンモニウム3.0ｇ、リン酸―カリウム
0.4ｇ、リン酸二ナトリウム1.5ｇ、硫酸マグネシ
ユウム5.0ｇ、硫酸マンガン10mg、硫酸亜鉛10
mg、硫酸銅200μｇ、三酸化モリブデン10μｇ、
炭酸カルシウム5.0ｇを含有する殺菌した培地200
mlを収容した500ml容三角フラスコに植菌して、
30℃で３日間振盪培養した。以後、２〜３日毎に
グルコース50％水溶液を添加し培養17日間の生産
濃度はコプロポルフイリンが200mg／、ウロ
ポルフイリンが89mg／であつた。 次に500ml容三角フラスコ20本に収容された４
の培養液を10000Gで10分間遠心分離した。得
られた上澄液を3NHClでPH3.0にしたあと、
1000Gで10分間遠心分離して沈殿物を得た。次に
この沈殿物を1NNaOH水１に溶かしたのち、
3NHClによりPH4.7に調整して、沈殿物を生じさ
せ、1000Gで10分間遠心分離して沈殿物中のコプ
ロポルフイリン790mg（回収率99％）を回収し
た。この沈殿物の薄層クロマトの結果、ポルフイ
リンとして１スポツトであることを確認した。ま
た沈殿物のメチルエステルの可視部吸収スペクト
ル、IR、NMR、融点等よりコプロポルフイリン
であることを確認した。 次に、コプロポルフイリンを除いた上澄液に
さらに3NHClを加えPH2.6に調整して沈殿を生じ
させ、1000Gで10分間遠心分離して沈殿物中のウ
ロポルフイリン350mg（回収率98％）を回収し
た。この沈殿物の薄層クロマトの結果、ポルフイ
リンとして１スポツトであることを確認した。ま
たこの沈殿物のメチルエステルの、可視部吸収ス
ペクトル、IR、NMR、融点等により、ウロポル
フイリンであることを確認した。 実施例 ２ アースロバクター・パツセンス（IFO12139）
を用いるほか実施例１と同様に17日間培養を行つ
た。得られた培養液中のコプロポルフイリンの
濃度は80mg／であり、ウロポルフイリンの濃
度は38mg／であつた。この培養液４を3NHCl
でPHH3.2にしたあと、1000Gで10分間遠心分離し
て沈殿物を得た。次にこの沈殿物を1NNaOH水１
に溶かした。 次に3NHClによりこの溶液のPHＨを4.4に調整
して沈殿物を生じさせ、1000Gで10分間遠心分離
して、コプロポルフイリン320mg（回収率100
％）を回収した。この上澄液にさらに3NHClを加
えPHH2.0に調整して、沈殿を生じさせ1000Gで10
分間遠心分離してウロポルフイリン151mg（回
収率99％）を回収した。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ コプロポルフイリン及びウロポルフイリンを
含有する培養ずみブロスの液相部のPHを４〜約
2.5の範囲のPH値に調節して該コプロポルフイリ
ン及びウロポルフイリン含有混合固形分を形成さ
せ、該混合固形分を採取してその水性アルカリ溶
液を調製し、該溶液のPHを４を超え約６以下の範
囲のPH値に調節してコプロポルフイリン含有固形
分を形成して該固形分を採取し、残液のPHを４〜
約１の範囲のPH値に調節してウロポルフイリン含
有固形分を形成して該固形分を採取することを特
徴とするポルフイリン類の分離回収方法。 ２ 該コプロポルフイリンが、コプロポルフイリ
ンであることを特徴とする特許請求の範囲１記
載の方法。 ３ 該ウロポルフイリンが、ウロポルフイリン
であることを特徴とする特許請求の範囲１又は２
記載の方法。 ４ 該培養ずみブロスがアースロバクター属に属
するコプロポルフイリン及びウロポルフイリン生
産菌を培養することにより形成されたブロスであ
る特許請求の範囲１〜３のいずれかに記載の方
法。 ５ 該コプロポルフイリン及びウロポルフイリン
生産菌が、アースロベクター・ヒアリナス、アー
スロバクター・パツセンス及びそれらの変異ない
し変種菌よりなる群からえらばれた該生産菌であ
る特許請求の範囲４記載の方法。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3688280A JPS56134994A (en) | 1980-03-25 | 1980-03-25 | Separating and recovering method of porphyrin |
| GB8108835A GB2072670B (en) | 1980-03-25 | 1981-03-20 | Process for separating and recovering coproporphyrin and uroporphyrin from a culture broth containing them |
| DE19813111607 DE3111607A1 (de) | 1980-03-25 | 1981-03-24 | Verfahren zur abtrennung und gewinnung von coproporphyrin und uroporphyrin aus einer sie enthaltenden kulturbruehe |
| FR8105965A FR2479260A1 (fr) | 1980-03-25 | 1981-03-25 | Procede de separation et de recuperation de la coproporphyrine et de l'uroporphyrine d'un bouillon de culture |
| US06/247,501 US4347184A (en) | 1980-03-25 | 1981-03-25 | Process for separating and recovering coproporphyrin and uroporphyrin from a culture broth containing them |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3688280A JPS56134994A (en) | 1980-03-25 | 1980-03-25 | Separating and recovering method of porphyrin |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS56134994A JPS56134994A (en) | 1981-10-22 |
| JPS6255837B2 true JPS6255837B2 (ja) | 1987-11-21 |
Family
ID=12482138
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3688280A Granted JPS56134994A (en) | 1980-03-25 | 1980-03-25 | Separating and recovering method of porphyrin |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
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| JP (1) | JPS56134994A (ja) |
| DE (1) | DE3111607A1 (ja) |
| FR (1) | FR2479260A1 (ja) |
| GB (1) | GB2072670B (ja) |
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| DE69333065T2 (de) * | 1992-12-22 | 2004-04-01 | Novozymes A/S | Alkalische lipase |
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Family Cites Families (2)
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1981
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- 1981-03-24 DE DE19813111607 patent/DE3111607A1/de not_active Withdrawn
- 1981-03-25 FR FR8105965A patent/FR2479260A1/fr active Granted
- 1981-03-25 US US06/247,501 patent/US4347184A/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
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| FR2479260A1 (fr) | 1981-10-02 |
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