JPH0286741A - 変性タンパク質を基材とするカプセル - Google Patents

変性タンパク質を基材とするカプセル

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JPH0286741A
JPH0286741A JP63236999A JP23699988A JPH0286741A JP H0286741 A JPH0286741 A JP H0286741A JP 63236999 A JP63236999 A JP 63236999A JP 23699988 A JP23699988 A JP 23699988A JP H0286741 A JPH0286741 A JP H0286741A
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雅彦 野中
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添田 孝彦
Seiichirou Toiguchi
渡井口 清一郎
Masao Motoki
本木 正雄
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  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • General Preparation And Processing Of Foods (AREA)

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 (産業上の利用分野) 本発明は、トランスグルタミナーゼ変性タンパク質を基
材とするカプセルに関する。
(従来技術とその問題点) タンパク質を基材としたカプセル化tよ知られているが
、この場合、従来はタンパク質としてゼラチン位しか用
いられず、広範囲の利用目的には必ずしも適合するもの
ではなかった。又、ゼラチンを基材とする場合でも耐熱
、耐水、耐油、耐凍結性を付与するためには化学架橋材
や紫外線などを用いるため、食品及び医薬品用途として
は安全性の面からも好まれず、更に製造温度も約30℃
以下の如く限られている。
囚みに、タンパク質を基材とするカプセルであって、特
にタンパク質としてトランスグルタミナーゼ(以下、T
Gaseと略記することがある。)で変性したタンパク
質を使用した例は児ない。
(問題点を解決するための手段とその作用効果)本発明
者は、上記問題点を解決すべく鋭意研究の結果、トラン
スグルタミナーゼの架橋高分子化能、ゲル化能を活用し
て各種タンパク質を変性させると上記問題点の解決され
ることを見出して本発明を完成した。
本発明によれば、従来ピラチンのみであっ基材蛋白がげ
ラチン以外の各種蛋白質を容易にカプセル化できるよう
に拡張され、又製造温度も従来より広い範囲にすなわち
約5〜90℃に拡大できる。更に、化学架橋剤を使用せ
ずとも調製できるので、安全性の面からも食品及び医薬
品として利用できる。本発明のカプセルmは、従来化成
品等に広範囲に使用できる。
以下、本発明のカブビルとそのWIJ造法について詳述
する。
本発明のカプセルは、単カブヒル、二重カプセル等とす
ることができる。そのザイズは食品、医薬品、化成品等
の用途により賃なる。また、食品においてもその種類に
よって異なる。(近藤隆[新しいソフトカプセル食品の
開発とその応用1食品と開発Vo I 、 23. N
13  (昭和63年))。例えば、食品への利用を考
えた時には、魚卵様カプセル用の場合は1〜10sであ
り、ビタミン含有カプセル用の場合は5〜30mである
使用する蛋白質としては、大豆、小麦、綿実、トウモロ
コシ等の植物性のもの及び、魚肉、畜肉、オキアミ、乳
等の動物性のものなどタンパク含有物であれば何でもよ
く広範囲に利用できる。これらのタンパク質をトランス
グルタミナービを作用させて変性させて用いるのである
トランスグルタミノー−ぜは、特に起源を問わず、例え
ばモルモットの肝臓から分離したしの(以上、MTG 
a s eと略記することがある)、微生物が産生ずる
もの(以下、B T G a s cと略記することが
ある)を挙げることができる。前晋のMTGaseは、
例えば、特開昭!18−14964号に記載の方法で調
製することができる。後者のB T G a s eは
、新規酵素であって、本発明者の一部が発明者として関
与した発明(特願昭62−165067)に係わるもの
で、その酵素特性、製造法等については別項に記Uする
上記蛋白質にTGaseを作用させ、優者の架FJl!
1i分子化能、ゲル化能を話用して従来のカブ廿ル化技
術だけではカプセルにできないタンパク質をも変性して
カブビルの基材とするには、例えば、次のようにする。
まず、タンパク質の水溶液もしくは乳化液を調製する。
その濃度は、1〜30%と1にとができる。
次いで、この水溶液もしくは乳化液にTGaSeを濃度
1〜1,000 u/gタンパク、好ましくは10〜1
00u/びタンパクとなるように添加して撹拌する。こ
れより低IS1度では、無添加の場合と差別化ができず
、高濃度だと、ゲル化が進み過ぎて良い物性のものが1
qられす、時にはカプセルの製造機械中で詰ったりする
。反応I Iffは、5〜90℃、好ましくは20〜6
0℃であり、反応時間は、1秒乃至24時間で、好まし
くは5秒乃至30分である。
このようにして1!7られたTGase添加タン添加タ
ンパ液質水溶液乳化液は、ついで生成した変性タンパク
がカブビルの基材どなるように処理するが、これは従来
周知の技術によってよいことはもらろんである。
TGase添加タンパク貿水溶液もしくは乳化液には、
必要に応じて適当な添加物、例えば、砂糖、塩、エキス
、スパイス、フレーバー等の調味F+、多糖類、油脂、
乳化剤、可塑剤、グリセリン、ビタミン、ミネラルなど
を可溶性、不溶性の状態で例えば酵素反応を阻害しない
程度で加えることも可能である。
このようにして調製した添加物を加えた又は加えない7
[ase添加添加タンパ水質水溶液くは乳化液を用いC
カブビルを製造するには、カブビルが単カプセルの場合
は、上記水溶液を粒滴として油層中に射出するが、油層
中では適当な撹拌操作を加えて粒滴状を保つなどの方法
が用いられる。
油層としては例えばコーン油、大豆油等各種の植物油を
使用することができる。その他の粒滴製造条件は、前記
水溶液もしくは乳化液の種類、タンパク質濃度、Vf素
濃度等に応じて当業者であれば容易に設定できるが、粒
滴のサイズは、充分l、:凝固反応が起ぎる程度の大き
さにすべきで、例えば0、01〜30111111とす
ることができる。必要に応じてインキュベーションを行
なうが、これは例えば5〜60℃で30秒〜24時間行
なう。インキュベーションは、各種特性、例えば保形性
、耐熱性等+1与の観点から好ましい。
二重カプセルの場合、例えば油yjを芯液とし変性タン
パク質を皮膜基材とするカプセルの場合は、いわゆる滴
下法によるとよい。即ち、二重ノズルの内側のノズルか
ら芯液が、外側のノズルからカプセル皮膜液である前記
水溶液もしくは乳化液が一定速度で流出するようにし、
この2層の液流を一定間隔で切断し、液滴として油層中
1.:射出する。
皮膜の性質は、ノズルの形とサイズ、射出mとスピード
、タンパク質水溶液もしくは乳化液の組成、TGase
11度、油層の種類と状態、インキュベーションの条件
等に依存するが、これらの因子を考慮して適当な性質の
皮膜を得ることは当業者であれば容易に行なうことがで
きる。
油層中に生成したカブヒルは、そのまま例えば90℃に
加熱して10分間保持した後に油層から分離回収するか
、逆に油層から分離回収した後に加熱するとよい。
その侵の乾燥などの処理は、当業者に周知の方法で必要
に応じて適宜行なうとよい。
(新規トランスグルタミナーゼBTGase)(1)ト
ランスグルタミナーゼとその由来トランスグルタミナー
ゼ(以下、TGaseと略称することがある。)は、ペ
プチド鎖内にあるグルタミン酸J3のγ−カルボ4−ジ
アミド基のアシル転移反応を触媒する酵素である。この
−rGaseは、アシル受容体としてタンパク質中のリ
ジン残塁のε−アミノ基が作用すると、分子内及び分子
間にε−(γ−Glu) −’cys架橋結合が形成さ
れる。また水がアシル受容体として機能するどきは、グ
ルタミン残拮が税アミド化されグルタミン酸残塁になる
反応を進行させる酵素である。
TGaseのこのような性質ににす、TGasCを用い
てタンパク含有溶液又はスラリーをゲル化させることが
できる。
TGaseは、これまでモルモット肝由来のもの(MT
Gase)などの動物由来のものが知られているが、動
物由来のものは、安価にまた人聞に入手するのが困難で
あり、タンパク質をゲル化するときは酵′s′a度およ
び基質濃度を共に高くする必要があり、またCa2+依
存性であるので用途がυ1限される。
本発明で使用できる新規1〜ランスグルタミナーぜ(B
TGase)は、微生物、例えば、ストシブ1−ベルブ
シリウム属の菌により産生されるものであるが、微生物
由来のTGascについての報告は現時点ではない。
本発明で使用できる微生物由来のBTGaseは安価に
供給され、かつ生成も容易であるので実用性が大である
。また、BTG−aseを用いることにJ:す、カルシ
ウム非存在下で又カルシウム存在下rb酵’?+ (B
TGasc)iIIn度及び基質濃度が非常に低いとこ
ろけで品質の優れたゲル化物をtJ Iaできるという
利点がある。
■BTGaseの製造 BTGaseを産生する微生物は、例えば、ストレプト
ベルチシリウム・グリセオカルネウム(S trept
overticillium  griseocarn
eum)  I  F Q1277G、ストレプトベル
チシリウム・シナモネウム・サブ・エスピー・シナ七ネ
ウム (3treptoverticillium cinn
amoneuI!1sub sp 。
cinnamoneum) I F O12852、ス
トレプトベルチシリウムΦモバラエンス(S trep
toverticilliummobaraense)
 I F 013819等があげられる。
これら微生物を培養し、トランスグルタミナーゼを取得
するための培養法及び精製法等は次の通りである。
培養形態としては、液体培養、固体培養いずれも可能で
あるが、工業的には深部通気撹拌培養を行うのが有利で
ある。又、使用する培養源としては、一般に微生物培養
に用いられる炭素線、窒素源、無11j!及びその他の
微量栄養源の伯、ストレプトベルチシリウム属に属する
微生物の利用出来る栄養源であれば全て使用出来る。培
地のv!糸源としでは、ブドウ糖、ショ糖、ラスターゲ
ン、グリセリン、デキストリン、澱粉等の他、脂肪酸、
油脂、Th1fi酸などが単独で又は組合せて用いられ
る。窒素源としては、無機窒素源、有機窒素源のいずれ
も使用可能であり、無機窒素源としては硝酸アンモニウ
ム、硫酸アンモニウム、尿素、硝酸ソーダ、塩化アンモ
ニウム等が挙げられる。又、6機窒素源としては大豆、
米、トウモ[lコシ、小麦などの粉、糠、脱脂粕をはじ
めコーンステイープリカー、ペプトン、肉エキス、カゼ
イン、アミノ酸、酵母エキス等が挙げられる。無様地及
び微量栄養素としては、リン酸、マグネシウム、カリウ
ム、鉄、カルシウム、亜鉛等の塩類の他ビタミン、非イ
オン界面活性剤、消泡剤等の菌の生育や[3TQase
の産生を促進するものであれば必要に応じて使用出来る
培養は好気的条件で、培養温度は菌が発育しBTGas
eが産生ずる範囲であれば良く、好ましくは25〜35
℃である。培養時開は、条件により異なるが、BTGa
seが最も産生される時間まで培養すれば良く、通常2
〜4日程度である。
BTGaseは液体培養では培養液中に溶解されており
、培養終了後培養液より固形分を除いた培養ろ液より採
取される。
培養ろ液よりBTGaseを精製するには、通常酵素精
製に用いられるあらゆる方法が使用出来る。
例えば、エタノール、アセトン、イソプロピルアル」−
ル等の有機溶媒による処理、硫安、食塩等により塩析、
透析、限外ろ適法、イオン゛交換り[1マドグラフイー
、吸着クロマトグラフィー、ゲルろ過、吸着剤、等電点
分画等の方法が使用出来る。又、これらの方法を適当に
組合せる事によりBTGaSeのF5製度が上る揚台は
適宜組合せて行う串が出来る。これらの方法によって得
られる酵素は、安定化剤として各種の塩チ°j、糖類、
蛋白質、脂質、界面活性剤等を加え或いは加えることな
く、限外ろ・過濃縮、逆浸透濃縮、減圧乾燥、凍結乾燥
、噴霧乾燥の方法により液状又は固形の[3TGaSC
を得ることが出来る。
[3TGascの活性測定はベンジルオキシカルボニル
−し−グルタミニルグリシンとヒト上1ギシルアミンを
V質としてCa2+非存在下で反応を行い、1成したヒ
トDキ4Jム酸をトリクロ1コ[存在ドで鉄錯体を形成
させ525nmの吸収を測定し、ヒドロキサム酸の吊を
検量線より求め活性を口出する。
RTGase活性は、特に記載しないかぎり以下に記載
する方法により測定した。
く活性測定法〉 試薬A  0.2Mトリス塩酸緩衝液(1)86.0)
0.1Mヒドロキシルアミン 0.01 M還元型グルタブーオン 003Mベンジルオキシカlレボニル−し−グルタミニ
ルグリシン 試薬8 3N−塩酸 12%−トリク[コ[1酢酸 5%F ccj!3GH20(0,INl」C!に溶y
> 上記溶液の1:1:1の混合液を試薬Bとする。
酵素液の0.05mに試薬へ〇、5dを加えて混合し3
7℃で10分間反応キリ、試QBを加えて反応停止とF
e錯体の形成を行った後525nmの吸光度を測定する
。対照としてあらかじめ熱失活させた酵素液を用いて同
様に反応さけたものの吸光度を測定し、酵素液との吸光
度差を求める。別に酵素液のかわりにL−グルタミン酸
γ−モノヒドロキサム酸を用いて検量線を作成し、前記
吸光度差より生成されたヒト1]キザム酸の量を求め、
1分間に1μモルのヒドロキサム酸を生成する酵素活性
を1単位とした。
(3) B T G a s e (7)酵素特性上の
ようにして得られる精製BTGasa、即らストレブト
ベヂシリウム・tバランスIF013819のトランス
グルタミノ−−ゼ(BTG−1と命名)、ストレプトベ
ルブシリウム・グリレオカルネラムI F O1277
0のトランスグルタミナーロ(BTG−2と命名)、ス
トレプトベルブシリウム・シナモネウム・サブ・エスピ
ー・シナモネウムIF○ 12852のトランスグルタ
ミナーピ(BTG−3と命名)についての酵素化学的性
質は次の通り。
a)至適pH: HHとしてベンジルオキシカルボニル−し−グルタミニ
ルグリシンどヒドロキシルアミンを使用した場合、37
℃、10分反応ぐ、13TG−1の至適pHは6〜7に
あり、BTG−2の至適118は6〜7付近にあり、B
 T G−3の至適pHは6〜7付近にある。
b)至適温度: 阜買としてベンジルオキシカルボニル−し−グルタミニ
ルグリシンとヒドロキシルアミンを使用した場合、pi
−16,10分反応で、BTG−1の至適温度は55℃
付近であり、B T G −2の至適温度は45℃付近
であり、BTG−3の至適温度は45mイ」近にある。
C)  flH安定性: 37℃、10分間処理で、BTG−1はp1]5〜9で
安定であり、BTQ−2はpl−15〜9で安定であり
、BTG−3はp116〜9で安定である。
d)温度安定性: tlH7テIO分1i’j 処理F ハ、[3TG−1
は+o℃で【1883話性が残存し、50℃では14%
活性が残存し、B T G〜2は40℃では86%活性
が残存し、50℃でハ!i G % ’61性が残存し
、BTG−3は40”Cで80%活性が残存し、50℃
では53%活性が残存する。
e)基質特異性: 各13TGascを用い、各種合成基質とヒドロキシル
アミンとの反応を調べた。いずれのBTGaseも合成
W Y(がベンジルオキシカルボニルアスパラ−1!ニ
ルグリシン、ベンジルオキシカルボニルグルタミン 場合反応しない。しかし合成基¥′【がベンジルオキシ
力ルポニルグルタミニルグリシンの場合の反応性は最も
高い。この時の各種合成拮質濶度は5 mMとした。結
果は表−1に示される。
イ【お、表−1中のCBZはペンジルオキシヵルボニル
基の略であり、Qlnはグルタミルはの略で表−2 あり、Glyはグリシル基の略であり、ASI)はアス
パラギニル填の略である。
f)金属イオンの影響: 活性測定系に1mM濃度になるように各種金属イオンを
加えて影響を調べた(結果は表−2に示される)。イず
れのBTGaseもCu2+z n24により活性が阻
害される。
g)阻害剤の影響: 各阻害剤を1 mMになるように加え、25℃、30分
放置侵、活性を測定した(結果は表−3に示される)。
いずれの[3TQaseもバラクL]ロマーキュリー安
息fI酸(PCMBと略する)、N−エチルマレイミド
(NEMと略する)、モノヨードM酸により活性が阻害
される。
表−3 表−3中PMSFはフェニルメチルスルホニルフルAラ
イトの略である。
h)等電点: アンホライン等電点電気泳動により求めたところ、BT
G−1の等電点plf49付近であり、BTO−2の等
電点plは97付近であり、BTG3の等電点ptは9
8付近である。
i)分子量: SDSディスク電気泳動法より求めたところ、BTGl
の分子量は約38,000であり、13 T G2の分
子量は約41 、000であり、BTG−3の分子1蟲
1は約41,000である。
j)MTGaseとの比較: 次にBTGaSCとモルモット肝由来のトランスグルタ
ミナーゼ(MTGase)との性質を比較する。尚、M
 T G a s e +よ、特開昭58−14904
5号に記載された方法で調製した。
表−4には各酵素化学的性すIの比較を、表−5にはC
a2+の活性に及ぼす影響を示す。表−4および表−5
より明らかのJ、うに従来主どして研究されているMT
GaSeと放線菌由来のBTGaseとには酵系化学的
+!1質において種々の差が見られ、特に温度安定性、
分子jd、等電点、基質特異性に差が見られる。また、
Ca24の存在下及びノ[存在下においてもBTGas
eは作用する点等でも明らかな差がみられる。従つで、
新規酵素[3TGaseに屈する各Vf素はMTGaS
eとはその性質を責にするものと考えられる。
表−4 表−5 (4) B T G a S e ノ%J 3i)例a
)BTG−1の製造 ストレプトベルチシリウム・モバラエンスIF0138
19を培地組成ボリベブ]・ン02%、グリコース0.
5%、リン酸二カリウム02%、硫酸マグネシウム0.
1%からなる培地(13)17) 200rnIlに接
神し、30℃、48時間培養し、得られた種培養液をポ
リペプトン2.0%、ラスターゲン2.0%、リン酸二
カリウム0.2%、硫酸マグネシウム0,1%、ffH
n工Vス0,2%、消泡剤としてアデカノール(商品名
、旭電化社製品)O,OS%からなる培地2ON(1’
1l−17)に加え30℃で3日間培養後ろ過し、培溶
液18.5j!49だ。このものの活性は、0.351
1膜ml!である。
培養液を塩酸でpH6,5に調整し、予め0.05Mリ
ン酸緩衝液(rlH6,5)で平衡化しておいたCG−
50(商品名、オルガノ社製品)のカラムに通した。
この操作でトランスグルクミナーゼは吸着された。
さらに同緩衝液で不純蛋白質を洗い流した後、さらに0
.05〜0.5Mの同緩衝液の濃度匂配をつくり、通液
して溶出液を分画回収し、比活性の高い分画を集めた。
電導度をIoms以Fになるように希釈後ブルーセファ
ロースのカラムに通した。この操作でトランスグルタミ
ナーぜは吸着された。更に0.05Mリンlli!緩衝
液(pH7)で不純蛋白質を洗い流した後、0〜1Mの
食塩濃度匂配をつくり通液して溶出液を回収し比活性の
高い両分を集めた。UF 6000膜を使い濃縮し、0
.5Mの食塩を含む0.05Mリン酸緩衝液(pH7)
で緩衝液を用いて平衡化させた。
1【lられた瀾縮液を同FIim液で予め平衡化してお
いたけファデックスG−75(ファルマシアファインケ
ミカルネ[製)を含むカラムに通し、同緩衝液を流して
溶出液を分画した。この結果縮性画分は甲−のピークと
して溶出された。このものの比活性は、培湿る液に対し
625倍であり、回収率は41%であった。
b)  +3Tc+、−2の製造 BTG−1の場合と同様にして、ストレブトベルヂシリ
ウム・グリセオカルネウム[FO12776を30℃で
3日間培養後ろ過し、培養液19!を(qた。
このものの活性は0.28u/m−(’あった。
BTG−1の場合と同様な方法で酵素を精製して、SO
Sディスク電気泳動で単一の酵素をえた。
C)  B T G −3の製造 BTG−1の場合と同様にして、ストレプトベルブ−シ
リウム・シナモネウム・ザブ・エスピー・シナEネウム
I F 012852を30℃で3日培養後ろ過し、I
8養液18.5βを1!7た。このものの酵素活性は0
.5u/dであった。
BTGlの場合と同様な方法で酵素を精製して、SDS
ディスク電気泳動で単一の酵素を得た。
以下、本発明の変性タンパク7′[を具材とする力ブレ
ルの製造例を実施例として掲げて本発明を更に説明する
実施例1 15−L’ インMナトリウム(1’J OW  Zc
aland[) airy  3 oard製、アラネ
ート180)409をビーカーにとり、水2809を加
え、55℃の凛浴中で完全に溶解させた。その侵、大豆
油(味の素■!I)を32ff加え、ホモゲナイザ−(
KIN[HATICA GmbllLITTAII製P
OIVTrtON■、シャフトφ20m)ヲ用イテ乳化
した(12.OOOrpm X 3分)。
この乳化物にBTG−1(比活性2.Ou #9 )4
00IQを水5dに溶解させて添加し、均一になるよう
に上記のホ七グナイザーを用いて廓拌した(12.OO
Orpm x10秒)。ツいで55℃の温浴中に10分
間保持した。
その後、口径1mmのノズルを通して、上記乳化物を1
分間に5mlの割合で、大豆油からなる油層(55℃)
へ滴下した。油層にはマグネチツクスターラーを用いで
、撹拌子がおよそ1分間に180回転となるような撹拌
を加えた。滴下lG30分間放置してから、カブレル状
に擬固したカビイン乳化物のみを取り上げ、90℃の湯
中で10分間加熱した。
このようにして得た生成物は、白色の球状(球径1〜2
m)で、柔かくなめらかな舌触りのタラコ様の食感をイ
」していた。
実施例2 分離大豆タンパク質(味の素側製、アジブロン182)
509をビーカーにとり、水400 rJと大豆油(味
の素■’!I)50gを加え、実施例1に記したlのと
JulUR器、条件で乳化しIC0この乳化物50gに
対し、BTG−1(比活性2、Ou / rng) 2
5qを水 1dに溶解させて添加し均一になるよう混合
した。
次いで、直径2Mのノズル4通して、上記乳化物を1分
間に12mf!の割合で、マグネチックスターラを用い
て[1マ(1分間に240回転)している油層(55℃
)へ注入した。ざらに撹拌を継続しながら10分間放置
した後i1+層の温度を90℃まで1ユ背させ10分間
保った。
これにより白色球状(球(そ1〜3M>のカプセルを(
9だ。

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. (1)トランスグルタミナーゼ変性タンパク質を基材と
    するカプセル。
JP63236999A 1988-09-21 1988-09-21 変性タンパク質を基材とするカプセル Expired - Fee Related JP2580732B2 (ja)

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JPH10249184A (ja) * 1997-01-31 1998-09-22 Givaudan Roure Internatl Sa タンパク質カプセル化油粒子
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