JPH029370A - 遺伝子操作によるタンパク質ｐｐ１５の製造 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 免疫抑制的活性を有するタンパク質ＰＰ１５は、ＤＥ−
Ａ第２９５２７９２号（ＵＳ−Ａ第４，３４８，３１６
号）明細書に次のパラメーターとともに記載されている
。

ａ）炭水化物含有ｊｉ：３．３５±０．９％（ヘキソー
ス２．８±０．５％、ヘキソースアミン０．３±０．２
％、フコース０．０５±０．０５％、およびノイラミン
酸０．２０±０．１５％） Ｃ）分子量（超遠心分離によって決定）：３０．７００
±３，２００（ダイマー）ｄ）吸光係数（ｅｘｔｉｎｃ
ｔｉｏｎ　ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ）　：Ｅ　人（２８
０ｎｍ）＝　１４　、２±１．０、およびｅ）電気泳動
移動度：アルブミンの位置、およびｆ〉　等電点：４．
４±０．１ ｇ）アミノ酸組成： （モル％） （％） リジン ヒスチジン アルギニン アスパラギン酸 トレオニン セリン グルタミン酸 ブａリン グリシン ４．７４ ３．８１ １．６２ １３．３９ ３．８５ ６．３８ １３．４３ ４．３５ ６．８７ バリン メチオニン イソロイシン ロイシン チロシン フェニルアラニン トリブトファン ２．２９ ２．８７ ８．３９ ８．１８ ２．０９ ６．２７ ２．５１ １５．６７ １０．８６ ８．１８ ６．７２ ８．４９ ２．２７ ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動による分子量決
定によって、分子量が約１５，０ＯＯｄ（モノマー）で
あることが明らかになった。

このタンパク質の免疫抑制的性質から生じる治療上の関
心および診断的な関心の故に、遺伝子操作による製造が
強く望まれる。したがって、本発明は、ＰＰ１５の遺伝
子操作による製造法、これに必要なｍ　ＲＮ　Ａ、これ
によって得られるｃＤＮＡ、このｃＤＮＡの全部または
部分を含むＤＮＡ構造物（５ｔｒｕｃｔｕｒｅｓ）およ
びベクター、そのようなりＮＡによって形質転換された
細胞、これらの細胞によって発現されたポリペプチド、
およびこれらの医薬物としての使用に間する。本発明は
、さらに、ＰＰ１５のアミノ酸配列およびアミノＭ配列
の部分配列物、これらによって得られる特異抗体、これ
ら抗体から調製される診断補助物（ａｉｄｓ）および抗
体カラム、およびそのようなカラムを用いて得られるポ
リペプチドに関する。

本発明のさらなる態様は、ＰＰ１５をコードするＲＮＡ
またはＤＮＡの全部または一部、またはこれらの相補物
（ｃｏｍｐｌｅｎ＋ｅｎｔａｒｙ）、を含む診断補助物
、およびそのような診断補助物を用いて体液および組織
を調べる診断的方法、に関する０本発明のさらなる様相
は、以下に詳細に説明され、特許請求の範囲に定義され
る通りである。

まず、ＰＰ１５を発現するクローンを、成熟ヒト胎盤か
らのｍ　ＲＮ　Ａからなる市販のｃＤＮＡ発現バンク［
ゲノフィッ）　（Ｇｅｎｏｆｉｔ）社（ハイデルベルグ
）から人手］において検出することを、ＰＰ１５に対す
る特異抗体を用いて試みた。

ＰＰ１６が免疫抑制作用を有することは知られており、
したがって、特異的抗体の調製はできたとしても不十分
であった。これがペプチド断片にたいする特異抗体が調
製されてきた理由である。

この理由のために、タンパク質ＰＰ１５を臭化シアン、
トリプシンまたはブロテイナーゼＶ８によって特異的な
断片に切断した。次いで、これら断片の配列決定を行っ
た。次のような配列物が得られた。

（Ａ）　　Ｍ　Ｖ　Ｖ　Ｇ　Ｑ　Ｌ　Ｋ　Ａ　Ｄ　Ｅ　
Ｄ　Ｐ　工Ｍ　Ｇ　Ｆ　ＨＱ　Ｍ　Ｆ（Ｂ）　　Ｆ　Ｒ
Ｌ　Ａ　Ｌ　ＨＮ　Ｆ　Ｇ（Ｃ）　　Ｖ　Ｓ　Ｖ　Ｙ　
Ａ　Ｅ　Ａ　Ａ　Ｅ　Ｒ（Ｄ）　　Ｌ　Ｓ　Ｓ　Ｌ　Ｐ
　Ｆ　Ｑ　Ｋ　工Ｑ　（）（）（巳）　　　ＦＤＮＤＲ
ＴＱＬＧＡＩＹ　　工　ＤＡＳ−ＬＴ−Ｅ（Ｆ）　　Ｌ
　Ｌ　Ｋ　Ｎ　　Ｉ　Ｎ　Ｄ　Ａ　Ｗ　ＴペプチドＡ、
　　ＢおよびＣを公知の方法にて合成して、特異的抗体
をウサギを用いて通常の方法にて調製した。上記のｃＤ
ＮＡ発現バンクには陽性クローンを見出すことはできな
かった。これは、≧ｌＸｌ０Ｇ制の組換えλｇｔｌｌク
ローンを含んでいた。このように、ペプチドＡおよびペ
プチドＢに対する抗体は対照実験においてＰＰ１５を沈
澱させたが、ペプチドＣに対する抗体は反応しなかった
。ざらに、後で示されるように、ペプチドＣは、ｃＤＮ
Ａ配列から次いで派生するＰＰ１５のタンパク質配列に
存在しない。したがって、これはおそら＜ＰＰ１５に付
随するタンパク質とみなされる。

次いで、Ｒ，Ｌａｔｈｅ　　［Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏ
ｌ、　ＩＪ１２（１９８５）　ｌ−１２１の統計的デー
タに基づいて、ＰＰ１５オリゴペプチドＡをコードする
オリゴヌクレオチドからＰＰ１５オリゴヌクレオチド１
０３５’ＡＴＧＧＴＧＧＴＧＧ　ＧＣＣＡＧＣＴＧＡＡ
　ＧＧＣＴＧＡＴＧＡＧ　ＧＡＣＣＣＣを、および対応
してオリゴペプチドＥからＰＰ１５オリゴヌクレオチド
１４０ ５’ＴＴＴＧＡＣＡＡＴＣｉ　ＡＣＣＧＧＡＣＣＣＡ　
ＧＣＴＧＧＧＣＧＣＣＡＴＣＴＡＣＡＴＴＧ　ＡＴＧＣ
を、オリゴペプチドＦから６４倍変質（６４−ｆｏｌｄ
ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ）　Ｐ　Ｐ　１５オリゴヌクレオ
チド１３９５　’　ＡＡＡＡＡＴＡＴＴＡＡＴＧＡＴＧ
ＣＣＴＧＧＡＣＣＣＣＣ を、選択した。

これらオリゴヌクレオチドプローブを、成熟ヒト胎盤か
らのｍ　ＲＮ　Ａから調製したｃＤＮＡバンクのスクリ
ーニングに用いた。ｍ　ＲＮ　Ａをまず胎盤から分離し
てｃＤＮＡのｖ４製に用いた。後者にＥｃｏＲＩ末端を
付して、ファージベクター人ｇｔｌｏのＥｃ　ｏＲＩ切
断部位に連結した。

ＰＰ１５の完全なｃＤＮＡを含む２個のクローン（ＰＰ
　１５−２４およびＰＰ１５−２８）を検出した。ＤＮ
Ａ配列を既知の方法にて決定した。表１にＰＰ１５ｃＤ
ＮＡ（コード鎖）の完全な配列が示されている。このｃ
ＤＮＡは、８９４塩基対（ｂｐ）の長さで、かつ９９ｂ
ｐの非Ｕ訳（ｕｎｔｒａｎｓ　ｆａｔｅｄ）配列を５′
末端に有し、３８１ｂｐの転写解読枠（ｏｐｅｎ　ｒｅ
ａｄｉｎｇ　ｆｒａａ＋ｅ）を有し、ポリ（Ａ）の８個
の塩基を含む４１４ｂｐの非翻訳配列を３′末端に有す
る。

ヌクレオチドプローブの位置が、表１に下線で示されて
おり、アミノ酸配列がさらに挿入されている。

本発明によれば、適当な発現系を利用してコードｅＤＮ
Ａを用いてＰＰ１５を発現させることが可能である。さ
らに、宿主の選択によってＰＰ１５のＩＩ飾のタイプに
影響を及ぼすことができる。例えば、細菌中ではグリコ
ジル化（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）は起きないが、
一方、酵母細胞で起きるグリコジル化は高等真核細胞に
おけるものとは異なる。

ＰＰ１５のアミノ酸配列が解ると、ポリクローナルまた
はモノクローナル抗体の製造のための抗原として用い得
るアミノ酸部分配列物を従来法または遺伝子操作法によ
って調製することができる。

そのような抗体は、診断的用途だけでなく、抗体カラム
の調製にも用いられる。そのようなカラムによって、Ｐ
Ｐ１５を他のタンパク質とともに含む溶液からＰＰ１５
を分離することが可能である。

また、ＰＰ１５をコードし、真核細胞中での発現を促進
し、ざらには診断的結論をも導くことができるようなゲ
ノムクローンを、ｃＤＮＡまたはその部分を用いてゲノ
ムバンクから簡単な方法で単離することも可能である。

本発明は、さらに、特許請求の範囲に定義され、以下の
諸例に詳細に説明される通りである。

上記で説明したものの他に、次の略語を用いる。

ＥＤＴＡ＝エチレンジアミン四酢酸ナトリウム５ＤＳ＝
ソジウムドデシルサルフエートＤＴＴ＝ジチオスレイト
ール Ｂ　Ｓ　Ａ＝ウシ血清アルブミン 阻止 １．ヒト胎盤からのＲＮＡの単離 ＲＮＡを成熟ヒト胎盤から得た（Ｃｈｉｒ３ｗｉｎらの
方法：　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　Ｌｆｌ（１９７９
）　５２９４−５２９９）。約１０ｇの胎盤組織を乳鉢
で液体窒素中で破砕して、０．１Ｍメルカプトエタノー
ルを含む８０ｍ１の４Ｍグアニジンチオシアネート中に
懸濁させて、次いでホモジナイザー（Ｌｊｌ　ｔｒａｔ
ｕｒｒａｘ）で２０．０００ｒｐｍで９０秒間処理した
。破砕物を７，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離（Ｓｏ
ｒｖａｌｌ　ＧＳＡローター）して、上清を２ｎ＋Ｉの
１Ｍ酢酸および６０１の無水エタノールで一２０℃で一
晩で沈澱させた。核酸を６、ＯＯＯｒｐｍで一１０℃に
て１０分間で沈澱させて、次いで４０ｍ１の７．５Ｍグ
アニジン塩酸（ｐＨ７，０）に完全に溶解して、１ｍｌ
の１Ｍ酢酸と２０ｍ１の無水エタノールとの混合液で沈
澱させた。

ＤＮＡを除去するために、各容量を半分にして沈澱処理
をもう一度繰り返した。ＲＮＡを１２＋ａｌのＨ２Ｏに
溶解して、１．２１の４Ｍ酢酸カリウムと２４ｍ１の無
水エタノールとの混合液で沈澱させて、最後にこの沈澱
を再び１０ｍ１のＨ２Ｏに入れた（Ｍｉ繊織１重量当り
１１）。

２、ポリ（Ａ）を含む胎盤ｍ　ＲＮ　Ａの調製ポリ（Ａ
）を含むｍ　ＲＮ　Ａを得るために、胎盤ＲＮＡを２ｍ
ｌのパスツールピペット中のオリゴ（ｄＴ）−セルロー
スクロマトグラフィー［ＡｖｉｖおよびＬｅｄｅｒ：　
Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳ
Ａ　ｆｌｆＪ（１９７３）　１４０８−１４１２３でＬ
ｉＣ１にて分画した。緩衝液１　［５００ａＭ　Ｌ　ｉ
ｃ　１．２０ｍＭ）リス（ｐＦ（７，５）、１ｍＭＥＤ
ＴＡ、０．１％ＳＯＳ］に溶解した約５ｍｇの胎盤ＲＮ
Ａをカラムにかけた。ポリ（Ａ）＋ＲＮＡはオリゴ（ｄ
　Ｔ）−セルロースと結合したが、ポリ（Ａ）−ＲＮＡ
を再び溶出することができた。緩衝液２［１００ｎ＋Ｍ
ＬｊＣ１，２９ｍＭ）リス（ｐＨ７，５）、１ｍＭＥＤ
ＴＡ、０．１％ＳＤＳ］で洗浄処理した後に、ポリ（Ａ
）　十ＲＮＡ　（胎盤ｍＲＮＡ）を緩衝液３［５ｍＭ　
）リス（ｐＨ７，５）、１ｍＭＥＤＴＡ、０．０５％Ｓ
ＤＳ］にてカラムから溶出させた。

さらに精製するために、ポリ（Ａ）”ＲＮＡを緩衝液１
に調整して、再びオリゴ（ｄＴ）−セルロースクロマト
グラフに供した。この第二精製工程の後の胎盤ポリ（Ａ
）十ＲＮＡの収率は、用いたＲＮＡの約４％だった。

３、ヒト胎盤からのｃＤＮＡ（胎盤ｃＤＮＡ）および二
本鎖ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ　（ｄｓＤ　ＮＡ）の合成ｃＤＮＡ
合成の前に、ポリ（Ａ）を含む胎盤ｍ　ＲＮ　Ａの全体
を１．５％アガロースゲルで調べた。

次いで、４１１８の胎盤ｍ　ＲＮ　Ａを６５．５μ＋の
Ｈ２Ｏに溶解して、７０℃にて１０分間変性させて、水
中で冷却した。

これに、２０　Ｉｔ　ＩのＲＴ　＋ｕ（ｌ液［２５０ｍ
Ｍ　トリス（ｐＨ８，２，４２℃）、２５０非ＫＣｌ。

３０ｍＭＭｇＣ１２コ　、　２．５ｕｌの２０ｍＭｄＮ
ＴＰ（全４種類のデオキシヌクレオシド三燐酸）、１μ
ｍの１ｎｇ／ｎ＋ｌのオリゴ（ｄＴ）、１１１１のＩＭ
ＤＴＴ、２μｍのＲＮ　Ａｓ１ｎ　（ベーリンガー・マ
ンハイム社製）および８１１１の逆転写酵素（２４Ｕ／
μｍ、ベーリンガー・マンハイム社！りを加えてから１
００μＩの混合液にして、４２℃で９０分間でｃＤＮＡ
を合成した。二本鎖ｃＤＮＡ （ｄｓＤＮＡ）をＧｕｂｌｅｒおよびｌ（ｏｆｆｍａｎ
ｎの方法（Ｇｅｎｅ　２，２　（１９８３）　２６３−
２６９）にて合成した。合成は、ｃＤＮＡ合成の直後に
、３０５．５７１１のＨ２Ｏ，８０μｍのＲＴ２緩衝液
［１００ｍＭ）リス（ｐＨ７，５）、２５ｍＭＭｇＣＩ
２．５００＋ｎＭＫＣ１，５０ｍＭＤＴＴ、２５０μｇ
／＋ａｌＢＳＡ］、２μｍのＲＮａｓｅＨ（２Ｕ／Ｅｌ
）、２．５μ＋の大腸菌ＤＮＡリガーゼ（５ｕｌμｍ）
、５μｍの１５ｍＭβ−ＮＡＤ、および５μｍのＤＮＡ
ポリメラーゼ■（５ｕｌμｍ）を添加して、１５℃で５
時間インキュベートして行った。反応を加熱不活化（７
０℃、３０分間）によって終結させた。

５５μｍの２５０μＭ　ｄＮＴＰ、５５１１１の１０ｍ
Ｍ）リス（ｐＨ７，５）、１０ｍＭＭｇＣＩ２．１０μ
ｇ／ｍ１ＢｓＡ、３μｍのＴ４ＤＮＡポリメラーゼＩ（
ＩＵ／μｌ）、２μｍのＲＮａｓｅＨ（２ｕｌμｍ）お
よび２μｍのＲＮａ５ｅＡ　（２ｕｇ／ｍｌ）を反応混
合液に添加した後、３７℃でさらに１３分間インキュベ
ートして二本目のＤＮＡＮ玉鎖上ける合成が完全である
ようにした（ｒｌｌ！復反応」）。

４．１ＪｓＤＮＡへのＥｃｏＲＩリンカ−の連結、およ
びリンカ−の開裂 胎ｉ　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａバンクを作出するために、ｄｓＤ
ＮＡにＥｃｏＲｉ末端を付して、ファージベクター人ｇ
ｔｌｏのＥｃｏＲＩ切断部位にこれを連結できるように
した［：Ｔ、　Ｍａｎｉａｔｉｓら：（１９８２）、Ｍ
ｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ％Ａ　Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙＭａｎｕａ　ｌ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈ
ａｒｂｏｒ］。この目的のために、ｄｓＤ　Ｎ　Ａを、 ａ）ｄｓＤ　Ｎ　Ａの内部ＥｃｏＲＩ切断部位を保護す
るためにＥｃｏＲＩメチラーゼで処理し、１））ＥＣＯ
ＲＩＣＯＲ−を１寸して、０）次いで、これらリンカ−
をＥｃｏＲＩで開裂した。

ａ）に関して： ｄｓＤＮＡのメチラーゼ反応を、修復反応に続いて直ち
に、２５　／１＋の５００ｍＭ　ＥＤＴＡ　（ｐＨ８，
０）、６０μｍのメチラーゼ緩衝液（１００Ｉｌ１ＭＮ
ａＯＡｃ　（ｐＨ５，２）、２＋ｏ３のＳ−アデノシル
−Ｌ−メチオニン）および２μｍのＥｃｏＲＩメチラー
ゼ（２０Ｕ／μｍ）を加えた後、３７°Ｃで３０分間イ
ンキュベートして行った。

反応混合物をフェノールで抽出して、ｄｓＤＮＡを６０
μｍの４ＭＮａ０Ａｃおよび１３００μ＋のエタノール
で沈澱させた。ｄｓＤＮＡを７０％エタノールで２回洗
浄して、エーテルと１回振盪して抽出して、乾燥させた
。

ｂ）に関して： ＥｃｏＲＩメチル化ｄｓＤＮＡを、８８μｍのＨ２Ｃに
溶解して、１０μｍのリガーゼ緩衝液［５００１１Ｍト
リス（ｐＨ７，４）、１００ａ＋ＭＭｇＣ１２、ｌｏｏ
ｍＭＤＴＴ、１００１Ｍスペルミジン、１０ｍＭ　ＡＴ
　Ｐ、　　１　ｍｇ／ｍｌ　Ｂ　ＳＡ］および１１１１
のＴ４ＤＮＡリガーゼ（ｌ　ＯＵ／μｍ）を加えた後に
、１μｍのＥｃｏＲＩリンカ−（０，５μｇ／μＩ）（
ｐＧＧ−ＡＡＴＴＣＣおよびｐＡＧＡＡＴＴＣＴ）と１
５℃にて一晩で連結させた。

Ｃ）に関して： リガーゼ混合物の容量を、６μｍのＨ２Ｃ，１２μ＋の
１０ＸＥｃｏＲＩ緩衝液および２　Ｂ　ＩのＥｃｏＲ［
（１２０Ｕ／μｍ）で１２０μ＋にした。

ＥｃｏＲＩ消化を３７℃にて２時間で行った。

５、酢酸カリウム勾配による非結合リンカ−の除去、お
よびｄｓＤＮＡの大きさによる選択ＥｃｏＲＩ反応混合
物を＃故カリウム勾配（５〜２０％ＫＯＡｃ、１ｍＭＥ
ＤＴＡ、１μｍ７ｍ１臭化エチジウム）に供して、５０
，０００ｒｐｍで２０″℃ここで３時間遠心分Ｍ（ベッ
クマン５Ｗ６５０−ター）することによって、すべての
非結合Ｅ　Ｃｏ　Ｒｒリンカ−をｄｓＤＮＡから除去し
た。

勾装置αを、最初の５画分を５００μｍずつ、後はすべ
て１００μｍずつを計１して下から分画した。

両分を０．Ｏ１容漬のアクリルアミド（２ｍｇ／ｍｌ）
および２．５容１のエタノールで沈澱させて、７０％強
度のエタノールで１回洗浄・乾燥して、それぞれを５μ
ｍのＨ２Ｃに入れた。

ｄｓ　Ｄ　Ｎ　ｋの大きさを決めるために、各両分の１
Ｉｌｌを１．５％のアガロースゲル中で分析した。

さらに、ｄｓＤＮＡの量を各両分の１μｍを用いて決定
した。

５００ｂｐ以上のｄｓＤＮＡを含む両分を合わせて、そ
の試料を最終濃度が２７１ｔｇ／ｉ＋ｌになるまで濃縮
した。

６．７フ一ジベクターλｇｔ１０へのｄｓＤＮＡの挿入
、およびインビトロパッケージング（ｐａｃｋａｇ　ｉ
　ｎｇ）反応 ｄｓＤＮＡを４μｍのリガーゼ混合物中でファージベク
ター人ｇ　ｔ　１０　（Ｖｅｃｔｏｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ
　Ｓｙｓｔｅｍｓ社、Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、　ＣＡ）の
ＥｃｏＲＩ切断部位に挿入した。

リガーゼ混合物は２μｍのｄｓＤＮＡ、、１μｍの入ｇ
ｔｌＯＸＥｃｏＲＩ　（１μｇ／ｌ）、０．４　μ＋（
７）リガーゼ緩衝液、０．５　μＩのＨ２Ｃ，０，１μ
ｍのＴ　４　Ｄ　Ｎ　Ａリガーゼからなる。混合物を１
５℃で・１時間インキュベートした。

ファージベクター人ｇｔ　１０中に胎盤ｃＤＮＡバンク
を確立するために、次いでリガーゼ混合物をλ１原性細
胞抽出物（大腸菌Ｎ５４２８およびＮ５４３３）とのイ
ンビトロパッケージング反応に室温で２時間供した（Ｖ
ｅｃｔｏｒ　ＣｌｏｎｉｎｇＳｙｓｔｅｍｓ、　Ｓａｎ
　Ｏｉｅｇｏ、　ＣＡ、　Ｅｎｑｕｉｓｔおよびｓｔｅ
ｒｎｂｅｒｇ：　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏ
ｌｏｇｙ　ｕ　（１９７９）２８１−２９８）。反応を
５００μｍの懸濁培地［ＳＭ：０、ＩＭＮａＣＩ、　８
ｉ＋ＭＭｇＳＯ４、５０ｍＭ）　リス（ｐＨ７，５）、
０．０１％ゼラチンコおよび２８Ｎのクロロホルムで終
結させた。

７、胎Ｍ　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａバンクの力価決定および分析
大腸菌Ｋ　ｌ　２Ｃ６００ＨＦＬ株のコンピテントにし
た細胞を用いて決定した胎盤ｃＤＮＡバンクのプラーク
形成ユニッ）　（ＰＦｔｌ）の数は、Ｉ　Ｘ　１０６Ｐ
ＦＩＪＱあった。

８、胎盤ｃＤＮＡバンクのスクリーニングのためのオリ
ゴヌクレオチド１０−ブ 胎！ｃＤＮＡバンクの分析のためにオリゴヌクレオチド
プローブ（ＰＰ１５オリゴヌクレオチド１０３及び１４
０）およびオリゴヌクレオチドのプール（ＰＰ１５オリ
ゴヌクレオチドブール１３９）を合成した。それらの配
列を、ＰＰ１５の三つの臭化シアン断片のアミノ酸配列
から得た。

構築の方法およびプローブの使用は主にＲ８Ｌａｔｈｅ
　（前出）の方法に従った。

オリゴヌクレオチド配列物の５′末端をＴ４ポリヌクレ
オチドキナーゼを用いて（γ−３２Ｐ）ＡＴＰ　（６０
μＣｉ／４０μｍの反応混合物を用いて）の存在下でラ
ベルした。プローブの比放射能（５ｐｅｃｉｆｉｃ　ａ
ｃｔｉｖｉｔｙ）は、Ｉ　Ｘ　１０８Ｂｑ／　μｌすな
わち１　、５　Ｘ　ｌ　Ｏ’Ｂｑ／　ｐｍｏｌであった
。

９、ＰＰ１５−特異性オリゴヌクレオチドによる胎盤ｃ
ＤＮＡのスクリーニング Ｉ　Ｘ　１０’ＰＦＵの胎盤ｃＤＮＡを、ＰＰ１５オリ
ゴヌクレオチドプローブ１０３．１４０および】３９を
合わせて調べた。この目的のために、３　Ｘ　１０’Ｐ
ＦＵを、軟寒天中の大腸菌に１２Ｃ６００ＨＦＬ株の細
胞とともに１３．５ｃｍのペトリ皿上にプレートして、
３７℃で６時間インキュベートした。この時、溶面ばま
だ不完全だった。

プレートを一晩冷蔵庫にてインキュベートして、ファー
ジをニトロセルロースフィルター（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅ
ｒ　＆　５ｃｈｕｌｌ、ＢＡ　８５、Ｒｅｆ、　Ｎｏ、
４０１１２４）に移した（デユープリケード）。ニトロ
セルロースフィルターおよびペトリ皿には、注射針を用
いて後の陽性プラークの照合のために印を付した。

ニトロセルロースフィルターの処理の閏、ペトリ皿を冷
蔵庫に保存した。ニトロセルロースフィルター上のＤＮ
Ａを１．５ＭＮａＣ１および０．５ＭＮａＯＨに浸した
濾紙（ファツトマンＭ３）上にフィルターを５分間置く
ことによ°って変性させた。

次いでフィルターを同様にして１．５ＭＮａＣ１，０，
５Ｍ）リス（ｐＨ８，０）を用いてもとに戻して、２Ｘ
ＳＳＰＥ　（０，３６Ｍ　ＮａＣ１％　１６ｍＭＮ　ａ
　ＯＨ１２０ｍＭ　ＮａＨ，、ＰＯ，，２ｍＭＥＤＴＡ
）で洗浄した。次いでフィルターを８０℃にて２時間真
空中で乾燥した。フィルターを３ＸＳＳＣ１０，１％Ｓ
ＤＳ　（２０ＸＳＳＣ＝３Ｍ　ＮａＣ１，０，３Ｍクエ
ン酸ナトリウム）中で６５℃にて４時間洗浄して、６５
℃にて４時間ブレハイブリダイゼーションさせた［ブレ
ハイブリダイゼーション溶液：　０．６Ｍ　ＮａＣｌ、
０．０６Ｍ）リス（ｐＨ８，３）、６ｍＭ　ＥＤＴＡ、
０．２％非イオン性合成シヱークロースボリマ−（ＲＦ
ｉｃｏｌｌ）、０．２％ポリビニルピロリドン４０．０
．２％ＢＳＡ、０．１％ＳＤＳ、５０μ８／１変性ニシ
ン精子ＤＮＡ］。

フィルターに、１１のハイブリダイゼーション溶液にシ
ン精子ＤＮＡを含まないブレハイブリダイゼーション溶
液）当り１００，０００〜２００．０Ｏ０８ｑのラベル
したオリゴヌクレオチドを加えて、これをビーカーまた
は封をしたポリエチレンフィルム中で静かに振盪しなが
ら一晩インキユベートした。ハイブリダイゼーションの
温度はオリゴヌクレオチドブロー１１３９の場合で４６
℃、その他のプローブの場合で５２℃であった。ニトロ
セルロースフィルターを６ＸＳＳＣ１０，０５Ｍピロ燐
酸ナトリウムで室温で１時間、それぞれのハイブリダイ
ゼーション温度でざらに１時間洗浄した。フィルターを
乾燥させて、−晩オートラジオグラフに供した。Ｘ線フ
ィルムの両デユープリケードに現れたシグナルをペトリ
皿に照合して、対応領域（約５０プラーク）をパスツー
ルとベットの広い先端で切り出して、ファージをｌｉｔ
の５Ｍ緩衝液に再懸濁させた。陽性のファージを３回の
サイクルで単離して、単一のクローンを得た。

各々三つの試料のＩ　Ｘ　１０６ＰＦＵの胎盤ｃＤＮＡ
バンクを調べた。３回目のスクリーニングではじめて、
二つのシグナルがデユープリケードフィルター上で同定
された。二つのクローン、ＰＰ１５−２４およびＰＰ　
１５−２８はＰＰ１５の完全なｃＤＮＡを含む。

表２に、すりゴヌクレオチド配列１０３．１３９および
１４０と見出されたＰＰ１５配列とが比較して示されて
いる。

３０１　＾ＴＣＡＣＣＣＣＧＣＡＧＧＡＣＣＡＴＣＡＧ
ＣＣＣＡＣＴＣＣＡＧＡＴＡＧＣＴＧＣＡＴＣＡＴＣＡ
ＧＣＡＴ　３５０１　・・・・・・・・・・・・・・・
・・・・・・・・・、、・・・・・・・・・・・・・・
・・・・・・・・＾Ｔ２３　ＧＧＴＧＧＴＧＧＧＣＣＡ
ＯＣＴＧＡＡＧ（ｉｃＴＧＡＴＧＡＧＯＡｃｃ：ＣＣ，
、、、、−・・・・、・・・・・３６ＰＰ１５配列対Ｐ
Ｐ１５オリゴヌクレオチド１１０１　ＡＧＡＴＧＴＴＣ
ＣＴＡＴＴＡＡＡＧＡＡＣＡＴＣＡＡＣＧＡＴＧＣＴＴ
ＧＧＧｍＧＣＡＣＣＡＡＴＧＡＣ’１５０１・、・、、
、、、、、、、、、ＡＡＧＡＡＣＡＴＣＡＡＣＧＡＴＧ
ＣＣＴＣｉＧＡＣ，、、、、、、、、、、、、２３ＰＰ
１５配列対ＰＰ１５オリゴヌクレオチド、、、、、、、
、、、、、ＴＴＴＧＡＣＡＡＴＯＡＣＣＧＧＡＣＣＣＡ
ＧＣＴＧＧＧＣＯＣＣＡＴＣＴＡＣＡＴ　３８表２ ＰＰ１５配列対ＰＰ１５オリゴヌクレオチド１０、ＤＮ
Ａ配列分析 ）７−ジクローンＰＰ１５−２４およびＰＰｌ５−２８
を増やして、それぞれのＤＮＡを抽出した。

各場合に、ＥｃｏＲＩ断片を単離して、Ｂｌｕｅｓｃｒ
ｉｐｔ　Ｍ　Ｉ　３ベクター（Ｓ　ｔｒａ　Ｌａｇｅｎ
ｅ社、Ｓａｎ　Ｄｉｅ３ｏ、　Ｃ＾、ＵＳＡ）のＥＣｏ
Ｒｌ部位に連結して、Ｓａｎｇｅｒの酵素的ジデオキシ
法を用いて制限酵素分析および配列分析を行フた。配列
は、転写解読枠および最大１２７個のアミノ酸を有する
タンパク質のコードを示す。ＰＰｌ５は、計算上の分子
這１４４７８ｄ　（メチオニンを含む）を有し、これは
導入部で記述した特許出願第ＤＥ−Ａ第２．９５２，７
９２号明細書中からの数値とよく合致している。

１１、免疫抑制性タンパク質ＰＰ１５の発現ベクターｐ
　Ｔ　ｒ　ｃ　９９Ａ　［Ｅ、　Ａａ＋ａｎｎら：　Ｇ
ｅｎｅｕ　（１９８８）　３０１−３１５１を用イテ非
融合成熟ＰＰ１５タンパク質を大腸面内で発現させた。

ＰＰ１５ｃＤＮＡの開始コードンのＤＮＡ配列は以下に
示す通りである。

Ｍｅｔ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ ５’　　　、、、ＣＧＣＴＣＣＡＧＡ　　ＡＴＧ　ＧＧ
Ａ　ＧＡＣ、、，３’ＡＴＣの位置にＮ　ｃ　ｏ　Ｉ　
８８位がないことから、このＤＮＡを直接にｐＴｒｃ９
９Ａ発現ベクターにクローニングすることは不可能であ
る。　しかし、ＰＰ１５ｃＤＮＡ配列中の２個の塩基を
交換する突然変異によってＮｃｏＩ部位を作出すること
ができる（５’ＣＡＡ　Ｔ　Ｇ　０３’→ｓ’ｃｃＡＴ
ｃＧ３’）。

ＰＰ１５構造配列の二番目のコードンがｒＧＪで始まる
ために、二番目のアミノ酸（Ｇ　Ｉ　ｙ）はこの操作に
よって影響されない、突然変異を行うために、ＰＰ１５
ｃＤＮＡクローンＰＰ１５−２８から９０２ｂｐのＥｃ
　ｏＲＩ断片を単離して、同様にＥｃｏＲＩで切断して
脱燐酸化しておいた突然変異用（ｍｕｔａ８ｅｎｅｓｉ
ｓ）ベクターｐＭａ５−８（第１図）に連結させた０次
いで、得られたプラスミドｐＭａ５−８−ＰＰ　１５　
（Ｆ　１−ｏ　ｒ　ｉに対して正しい位置方向でＰＰ１
５ＥｃｏＲＩ挿入物を含む）を、次のオリゴデオキシヌ
クレオチドを用いてｇａｐｐｅｄ　ｄｕｐｌｅｘ　ａ＋
ｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　ｐｒｏｔｏｃｏｌ　［Ｋｒａｌ
ｌＩＩｅｒら：　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　
Ｌ２　（１９８４）　９４４１−９４５６］に供した。

５　’　　ＧＧＣＴＴＧＴＣＴＣＣＣＡＴＧＧＴＧＧＡ
ＧＣＧＴＣＡＣ３’目的の突然変異を有する１個のクロ
ーンを制限酵素分析で同定して、ｐＭｃ５−８− ＰＰ１５−ＮｃｏＩと命名した。このプラスミドから７
９８ｂｐのＮｃ　ｏ　Ｉ−Ｅｃ　ｏＲＩ断片を単離して
、対応するように切断しておいたｐＴｒｃ９９Ａベクタ
ーに連結させた。得られたプラスミドｐＴｒｃ９９Ａ−
ＰＰ１５は４９］８ｂｐからなり、ｔｒｃプロモーター
の誘導の後、約１５ｋＯの非融合ＰＰ１５タンパク質を
発現する。

【図面の簡単な説明】

第１図は、プラスミドｐＭａ　Ｃ５−８（＝ｐＭａ５−
８および１）へ４ｅ５−８）の地図を示す、説明図であ
る。 Ｆｌ−ＯＲＩ：ファージｆ１の複製開始点ＯＲＩ：Ｃｏ
１ＥＩタイプの複製開始点ＣＡＴ　：クロラムフエニコ
ールアセチルトランスフエラーゼのコード領域 Ａ　ｈ′ｔ　Ｐ　：　β−ラクタマーゼのコード領域ｐ
Ｍａ５−８はＣＡＴ　（塩基位置３４０９のＡ）にアン
バー突然変異を有し、ｐＭｃ！５−８はＡＭＰ（塩基位
置２２３８のＣ）にアンバー突然変異を有する。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、表１に示されたアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配
   列物（ｓｅｑｕｅｎｃｅ）、またはその部分。 ２、請求項１に記載のＤＮＡと緊縮条件 （ｓｔｒｉｎｇｅｎｔｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）下でハイ
   ブリダイズする、ＤＮＡまたはＲＮＡ、またはその部分
   。 ３、タンパク質ＰＰ１５をコードし、表１に示されたコ
   ード鎖を含む、請求項１に記載のＤＮＡ配列物、または
   その部分。 ４、請求項１〜３のいずれか１項に記載のＤＮＡを含む
   、遺伝子構造物（ｇｅｎｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ）また
   はベクター。 ５、請求項１〜４のいずれか１項に記載のＤＮＡを含む
   、形質転換細胞。 ６、遺伝子操作によって得られ、かつ表１に示されたア
   ミノ酸配列を有する、ＰＰ１５。７、請求項１に記載の
   ＤＮＡ配列物を大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌ
   ｉ）内で発現させることからなる、遺伝子操作によって
   得られるＰＰ１５。 ８、請求項１に記載のＤＮＡ配列物を酵母内で発現させ
   ることからなる、遺伝子操作によって得られるＰＰ１５
   。 ９、請求項１または３に記載のｃＤＮＡの発現系への挿
   入およびそこでの発現、から成る、ＰＰ１５の製造法。 １０、ＰＰ１５に特異的であって、かつ請求項６〜８の
   いずれか１項に記載の遺伝子操作によって製造されたＰ
   Ｐ１５、または抗原活性を有するその部分、から得た、
   ポリクローナルまたはモノクローナル抗体。 １１、請求項１〜４のいずれか１項に記載のＤＮＡの全
   部または部分を含む、診断補助物。 １２、請求項１０に記載の抗体を含む、診断補助物。 １３、請求項６に記載のＰＰ１５またはその部分を含む
   、診断補助物。 １４、体液、組織またはそれらから分離した核酸を請求
   項１１〜１３のいずれか１項に記載の診断補助物と接触
   させることからなる、診断法。 １５、請求項６に記載のＰＰ１５を含む、医薬物。