JPH09131188A - 遺伝子操作によるタンパク質ｐｐ１５の製造 - Google Patents
遺伝子操作によるタンパク質ｐｐ１５の製造Info
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- JPH09131188A JPH09131188A JP8161789A JP16178996A JPH09131188A JP H09131188 A JPH09131188 A JP H09131188A JP 8161789 A JP8161789 A JP 8161789A JP 16178996 A JP16178996 A JP 16178996A JP H09131188 A JPH09131188 A JP H09131188A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 遺伝子操作によるタンパク質ＰＰ１５および
その用途を提供する。 【解決手段】 遺伝子操作によって得られ、特定のアミ
ノ酸配列を有する実質的に純粋なタンパク質ＰＰ１５。
特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列物を大腸菌
内で発現させることからなる、遺伝子操作によって得ら
れる実質的に純粋なタンパク質ＰＰ１５。特定のアミノ
酸配列をコードするＤＮＡ配列物を酵母内で発現させる
ことからなる、遺伝子操作によって得られる実質的に純
粋なタンパク質ＰＰ１５。タンパク質ＰＰ１５に特異的
であって、かつ上記の遺伝子操作によって製造されたＰ
Ｐ１５、または抗原活性を有するその部分、から得た、
ポリクローナルまたはモノクローナル抗体。 【効果】 上記のタンパク質ＰＰ１５は実質的に純粋で
あって免疫抑制活性が高く、また上記の抗体はタンパク
質ＰＰ１５に対して特異性が高い。
その用途を提供する。 【解決手段】 遺伝子操作によって得られ、特定のアミ
ノ酸配列を有する実質的に純粋なタンパク質ＰＰ１５。
特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列物を大腸菌
内で発現させることからなる、遺伝子操作によって得ら
れる実質的に純粋なタンパク質ＰＰ１５。特定のアミノ
酸配列をコードするＤＮＡ配列物を酵母内で発現させる
ことからなる、遺伝子操作によって得られる実質的に純
粋なタンパク質ＰＰ１５。タンパク質ＰＰ１５に特異的
であって、かつ上記の遺伝子操作によって製造されたＰ
Ｐ１５、または抗原活性を有するその部分、から得た、
ポリクローナルまたはモノクローナル抗体。 【効果】 上記のタンパク質ＰＰ１５は実質的に純粋で
あって免疫抑制活性が高く、また上記の抗体はタンパク
質ＰＰ１５に対して特異性が高い。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、遺伝子操作による
タンパク質ＰＰ１５の製造に関するものである。
タンパク質ＰＰ１５の製造に関するものである。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】免疫
抑制的活性を有するタンパク質ＰＰ１５は、ＤＥ−Ａ第
２９５２７９２号（ＵＳ−Ａ第４，３４８，３１６号）
明細書に次のパラメーターとともに記載されている。 ａ） 炭水化物含有量：３．３５±０．９％（ヘキソース２．８±０．５％）、 ヘキソースアミン０．３±０．２％、フコース０．０５±０．０５％、およびノ イラミン酸０．２０±０．１５％） 0 ｂ） 沈降係数：Ｓ20,w＝２．９±０．２Ｓ ｃ） 分子量（超遠心分離によって決定）：３０，７００±３，２００（ダイマ ー） ｄ） 吸光係数（extinction coefficient）： １％ Ｅ１cm（２８０nm）＝１４．２±１．０、および ｅ） 電気泳動移動度：アルブミンの位置、および ｆ） 等電点：４．４±０．１ ｇ） アミノ酸組成： アミノ酸 １００残基当りの残基数 変動係数 （モル％） （％） リジン ４．７４ ３．３０ ヒスチジン ３．８１ ５．４３ アルギニン １．６２ ３．４３ アスパラギン酸 １３．３９ ５．０８ トレオニン ３．８５ ５．３５ セリン ６．３８ ２．８１ グルタミン酸 １３．４３ ５．３２ プロリン ４．３５ １４．２５ グリシン ６．８７ ２．１３ アラニン ６．５１ ８．２６ シスチン １／２ ２．４８ ４．５５ バリン ２．２９ １５．６７ メチオニン ２．８７ １０．８６ イソロイシン ８．３９ ８．１８ ロイシン ８．１８ ６．７２ チロシン ２．０９ ８．４９ フェニルアラニン ６．２７ ２．２７ トリプトファン ２．５１ ６．８１ ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動による分子量決
定によって、分子量が約１５，０００ｄ（モノマー）で
あることが明らかになった。
抑制的活性を有するタンパク質ＰＰ１５は、ＤＥ−Ａ第
２９５２７９２号（ＵＳ−Ａ第４，３４８，３１６号）
明細書に次のパラメーターとともに記載されている。 ａ） 炭水化物含有量：３．３５±０．９％（ヘキソース２．８±０．５％）、 ヘキソースアミン０．３±０．２％、フコース０．０５±０．０５％、およびノ イラミン酸０．２０±０．１５％） 0 ｂ） 沈降係数：Ｓ20,w＝２．９±０．２Ｓ ｃ） 分子量（超遠心分離によって決定）：３０，７００±３，２００（ダイマ ー） ｄ） 吸光係数（extinction coefficient）： １％ Ｅ１cm（２８０nm）＝１４．２±１．０、および ｅ） 電気泳動移動度：アルブミンの位置、および ｆ） 等電点：４．４±０．１ ｇ） アミノ酸組成： アミノ酸 １００残基当りの残基数 変動係数 （モル％） （％） リジン ４．７４ ３．３０ ヒスチジン ３．８１ ５．４３ アルギニン １．６２ ３．４３ アスパラギン酸 １３．３９ ５．０８ トレオニン ３．８５ ５．３５ セリン ６．３８ ２．８１ グルタミン酸 １３．４３ ５．３２ プロリン ４．３５ １４．２５ グリシン ６．８７ ２．１３ アラニン ６．５１ ８．２６ シスチン １／２ ２．４８ ４．５５ バリン ２．２９ １５．６７ メチオニン ２．８７ １０．８６ イソロイシン ８．３９ ８．１８ ロイシン ８．１８ ６．７２ チロシン ２．０９ ８．４９ フェニルアラニン ６．２７ ２．２７ トリプトファン ２．５１ ６．８１ ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動による分子量決
定によって、分子量が約１５，０００ｄ（モノマー）で
あることが明らかになった。
【０００３】このタンパク質の免疫抑制的性質から生じ
る治療上の関心および診断的な関心の故に、遺伝子操作
による製造が強く望まれる。
る治療上の関心および診断的な関心の故に、遺伝子操作
による製造が強く望まれる。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明は、後記の表１に
示された特定のアミノ酸配列を有するＰＰ１５を見出
し、これを遺伝子操作によって得て、この知見をもとに
完成されるに至った。
示された特定のアミノ酸配列を有するＰＰ１５を見出
し、これを遺伝子操作によって得て、この知見をもとに
完成されるに至った。
【０００５】
【発明の実施の形態】本発明は、ＰＰ１５の遺伝子操作
による製造に関する。これに必要なｍＲＮＡ、これによ
って得られるｃＤＮＡ、このｃＤＮＡの全部または部分
を含むＤＮＡ構造物（structures）およびベクター、そ
のようなＤＮＡによって形質転換された細胞が本発明に
関連する。本発明は、これらの細胞によって発現された
ポリペプチド、およびこれらの医薬物としての使用に関
する。本発明は、さらに、ＰＰ１５のアミノ酸配列およ
びアミノ酸配列の部分配列物、これらによって得られる
特異抗体、これら抗体から調製される診断補助物（aid
s）および抗体カラム、およびそのようなカラムを用い
て得られるポリペプチドに関する。ＰＰ１５をコードす
るＲＮＡまたはＤＮＡの全部または一部、またはこれら
の相補物（complementary ）、を含む診断補助物が本発
明に関連する。本発明はさらに、上記のような診断補助
物を用いて体液および組織を調べる診断的方法、に関す
る。本発明のさらなる様相は、以下に詳細に説明され、
特許請求の範囲に定義される通りである。
による製造に関する。これに必要なｍＲＮＡ、これによ
って得られるｃＤＮＡ、このｃＤＮＡの全部または部分
を含むＤＮＡ構造物（structures）およびベクター、そ
のようなＤＮＡによって形質転換された細胞が本発明に
関連する。本発明は、これらの細胞によって発現された
ポリペプチド、およびこれらの医薬物としての使用に関
する。本発明は、さらに、ＰＰ１５のアミノ酸配列およ
びアミノ酸配列の部分配列物、これらによって得られる
特異抗体、これら抗体から調製される診断補助物（aid
s）および抗体カラム、およびそのようなカラムを用い
て得られるポリペプチドに関する。ＰＰ１５をコードす
るＲＮＡまたはＤＮＡの全部または一部、またはこれら
の相補物（complementary ）、を含む診断補助物が本発
明に関連する。本発明はさらに、上記のような診断補助
物を用いて体液および組織を調べる診断的方法、に関す
る。本発明のさらなる様相は、以下に詳細に説明され、
特許請求の範囲に定義される通りである。
【０００６】まず、ＰＰ１５を発現するクローンを、成
熟ヒト胎盤からのｍＲＮＡからなる市販のｃＤＮＡ発現
バンク［ゲノフィット（Genofit ）社（ハイデルベル
グ）から入手］において検出することを、ＰＰ１５に対
する特異抗体を用いて試みた。ＰＰ１５が免疫抑制作用
を有することは知られており、したがって、特異的抗体
の調製はできたとしても不十分であった。これがペプチ
ド断片にたいする特異抗体が調製されてきた理由であ
る。
熟ヒト胎盤からのｍＲＮＡからなる市販のｃＤＮＡ発現
バンク［ゲノフィット（Genofit ）社（ハイデルベル
グ）から入手］において検出することを、ＰＰ１５に対
する特異抗体を用いて試みた。ＰＰ１５が免疫抑制作用
を有することは知られており、したがって、特異的抗体
の調製はできたとしても不十分であった。これがペプチ
ド断片にたいする特異抗体が調製されてきた理由であ
る。
【０００７】この理由のために、タンパク質ＰＰ１５を
臭化シアン、トリプシンまたはプロテイナーゼＶ８によ
って特異的な断片に切断した。次いで、これら断片の配
列決定を行った。次のような配列物が得られた。
臭化シアン、トリプシンまたはプロテイナーゼＶ８によ
って特異的な断片に切断した。次いで、これら断片の配
列決定を行った。次のような配列物が得られた。
【０００８】
【化１】 ペプチドＡ、ＢおよびＣを公知の方法にて合成して、特
異的抗体をウサギを用いて通常の方法にて調製した。上
記のｃＤＮＡ発現バンクには陽性クローンを見出すこと
はできなかった。これは、＞１×１０6 個の組換えλｇ
ｔ１１クローンを含んでいた。このように、ペプチドＡ
およびペプチドＢに対する抗体は対照実験においてＰＰ
１５を沈澱させたが、ペプチドＣに対する抗体は反応し
なかった。さらに、後で示されるように、ペプチドＣ
は、ｃＤＮＡ配列から次いで派生するＰＰ１５のタンパ
ク質配列に存在しない。したがって、これはおそらくＰ
Ｐ１５に付随するタンパク質とみなされる。
異的抗体をウサギを用いて通常の方法にて調製した。上
記のｃＤＮＡ発現バンクには陽性クローンを見出すこと
はできなかった。これは、＞１×１０6 個の組換えλｇ
ｔ１１クローンを含んでいた。このように、ペプチドＡ
およびペプチドＢに対する抗体は対照実験においてＰＰ
１５を沈澱させたが、ペプチドＣに対する抗体は反応し
なかった。さらに、後で示されるように、ペプチドＣ
は、ｃＤＮＡ配列から次いで派生するＰＰ１５のタンパ
ク質配列に存在しない。したがって、これはおそらくＰ
Ｐ１５に付随するタンパク質とみなされる。
【０００９】次いで、R.Lathe[J.Mol.Biol. 183 (1985)
1-12] の統計的データに基づいて、ＰＰ１５オリゴペプ
チドＡをコードするオリゴヌクレオチドからＰＰ１５オ
リゴヌクレオチド１０３
1-12] の統計的データに基づいて、ＰＰ１５オリゴペプ
チドＡをコードするオリゴヌクレオチドからＰＰ１５オ
リゴヌクレオチド１０３
【００１０】
【化２】 を、および対応してオリゴペプチドＥからＰＰ１５オリ
ゴヌクレオチド１４０
ゴヌクレオチド１４０
【００１１】
【化３】 を、オリゴペプチドＦから６４倍変質（64-fold degene
rate）ＰＰ１５オリゴヌクレオチド１３９
rate）ＰＰ１５オリゴヌクレオチド１３９
【００１２】
【化４】 を、選択した。
【００１３】これらオリゴヌクレオチドプローブを、成
熟ヒト胎盤からのｍＲＮＡから調製したｃＤＮＡバンク
のスクリーニングに用いた。ｍＲＮＡをまず胎盤から分
離してｃＤＮＡの調製に用いた。後者にＥｃｏＲＩ末端
を付して、ファージベクターλｇｔ１０のＥｃｏＲＩ切
断部位に連結した。ＰＰ１５の完全なｃＤＮＡを含む２
個のクローン（ＰＰ１５−２４およびＰＰ１５−２８）
を検出した。ＤＮＡ配列を既知の方法にて決定した。表
１にＰＰ１５ｃＤＮＡ（コード鎖）の完全な配列が示さ
れている。このｃＤＮＡは、８９４塩基対（bp) の長さ
で、かつ９９bpの非翻訳（untranslated）配列を５´末
端に有し、３８１bpの転写解読枠（openreading fram
e）を有し、ポリ（Ａ）の８個の塩基を含む４１４bpの
非翻訳配列を３´末端に有する。
熟ヒト胎盤からのｍＲＮＡから調製したｃＤＮＡバンク
のスクリーニングに用いた。ｍＲＮＡをまず胎盤から分
離してｃＤＮＡの調製に用いた。後者にＥｃｏＲＩ末端
を付して、ファージベクターλｇｔ１０のＥｃｏＲＩ切
断部位に連結した。ＰＰ１５の完全なｃＤＮＡを含む２
個のクローン（ＰＰ１５−２４およびＰＰ１５−２８）
を検出した。ＤＮＡ配列を既知の方法にて決定した。表
１にＰＰ１５ｃＤＮＡ（コード鎖）の完全な配列が示さ
れている。このｃＤＮＡは、８９４塩基対（bp) の長さ
で、かつ９９bpの非翻訳（untranslated）配列を５´末
端に有し、３８１bpの転写解読枠（openreading fram
e）を有し、ポリ（Ａ）の８個の塩基を含む４１４bpの
非翻訳配列を３´末端に有する。
【００１４】ヌクレオチドプローブの位置が、表１に下
線で示されており、アミノ酸配列がさらに挿入されてい
る。
線で示されており、アミノ酸配列がさらに挿入されてい
る。
【００１５】本発明によれば、適当な発現系を利用して
コードｃＤＮＡを用いてＰＰ１５を発現させることが可
能である。さらに、宿主の選択によってＰＰ１５の修飾
のタイプに影響を及ぼすことができる。例えば、細菌中
ではグリコシル化（glycosylation ）は起きないが、一
方、酵母細胞で起きるグリコシル化は高等真核細胞にお
けるものとは異なる。
コードｃＤＮＡを用いてＰＰ１５を発現させることが可
能である。さらに、宿主の選択によってＰＰ１５の修飾
のタイプに影響を及ぼすことができる。例えば、細菌中
ではグリコシル化（glycosylation ）は起きないが、一
方、酵母細胞で起きるグリコシル化は高等真核細胞にお
けるものとは異なる。
【００１６】ＰＰ１５のアミノ酸配列が解ると、ポリク
ローナルまたはモノクローナル抗体の製造のための抗原
として用い得るアミノ酸部分配列物を従来法または遺伝
子操作法によって調製することができる。そのような抗
体は、診断的用途だけでなく、抗体カラムの調製にも用
いられる。そのようなカラムによって、ＰＰ１５を他の
タンパク質とともに含む溶液からＰＰ１５を分離するこ
とが可能である。
ローナルまたはモノクローナル抗体の製造のための抗原
として用い得るアミノ酸部分配列物を従来法または遺伝
子操作法によって調製することができる。そのような抗
体は、診断的用途だけでなく、抗体カラムの調製にも用
いられる。そのようなカラムによって、ＰＰ１５を他の
タンパク質とともに含む溶液からＰＰ１５を分離するこ
とが可能である。
【００１７】また、ＰＰ１５をコードし、真核細胞中で
の発現を促進し、さらには診断的結論をも導くことがで
きるようなゲノムクローンを、ｃＤＮＡまたはその部分
を用いてゲノムバンクから簡単な方法で単離することも
可能である。
の発現を促進し、さらには診断的結論をも導くことがで
きるようなゲノムクローンを、ｃＤＮＡまたはその部分
を用いてゲノムバンクから簡単な方法で単離することも
可能である。
【００１８】本発明は、さらに、特許請求の範囲に定義
され、以下の諸例に詳細に説明される通りである。
され、以下の諸例に詳細に説明される通りである。
【００１９】上記で説明したものの他に、次の略語を用
いる。 ＥＤＴＡ＝エチレンジアミン四酢酸ナトリウム ＳＤＳ＝ソジウムドデシルサルフェート ＤＴＴ＝ジチオスレイトール ＢＳＡ＝ウシ血清アルブミン例： １．ヒト胎盤からのＲＮＡの単離 ＲＮＡを成熟ヒト胎盤から得た（Chirgwinらの方法：Bi
ochemistry 18 (1979)5294-5299）。約１０ｇの胎盤組
織を乳鉢で液体窒素中で破砕して、０．１Ｍメルカプト
エタノールを含む８０mlの４Ｍグアニジンチオシアネー
ト中に懸濁させて、次いでホモジナイザー（Ultraturra
x ）で２０，０００rpm で９０秒間処理した。破砕物を
７，０００rpm で１５分間遠心分離（Sorvall GSA ロー
ター）して、上清を２mlの１Ｍ酢酸および６０mlの無水
エタノールで−２０℃で一晩で沈澱させた。核酸を６，
０００rpm で−１０℃にて１０分間で沈澱させて、次い
で４０mlの７．５Ｍグアニジン塩酸（ｐＨ７．０）に完
全に溶解して、１mlの１Ｍ酢酸と２０mlの無水エタノー
ルとの混合液で沈澱させた。ＤＮＡを除去するために、
各容量を半分にして沈澱処理をもう一度繰り返した。Ｒ
ＮＡを１２mlのＨ2Ｏに溶解して、１．２mlの４Ｍ酢酸
カリウムと２４mlの無水エタノールとの混合液で沈澱さ
せて、最後にこの沈澱を再び１０mlのＨ2 Ｏに入れた
（組織１ｇ重量当り１ml）。
いる。 ＥＤＴＡ＝エチレンジアミン四酢酸ナトリウム ＳＤＳ＝ソジウムドデシルサルフェート ＤＴＴ＝ジチオスレイトール ＢＳＡ＝ウシ血清アルブミン例： １．ヒト胎盤からのＲＮＡの単離 ＲＮＡを成熟ヒト胎盤から得た（Chirgwinらの方法：Bi
ochemistry 18 (1979)5294-5299）。約１０ｇの胎盤組
織を乳鉢で液体窒素中で破砕して、０．１Ｍメルカプト
エタノールを含む８０mlの４Ｍグアニジンチオシアネー
ト中に懸濁させて、次いでホモジナイザー（Ultraturra
x ）で２０，０００rpm で９０秒間処理した。破砕物を
７，０００rpm で１５分間遠心分離（Sorvall GSA ロー
ター）して、上清を２mlの１Ｍ酢酸および６０mlの無水
エタノールで−２０℃で一晩で沈澱させた。核酸を６，
０００rpm で−１０℃にて１０分間で沈澱させて、次い
で４０mlの７．５Ｍグアニジン塩酸（ｐＨ７．０）に完
全に溶解して、１mlの１Ｍ酢酸と２０mlの無水エタノー
ルとの混合液で沈澱させた。ＤＮＡを除去するために、
各容量を半分にして沈澱処理をもう一度繰り返した。Ｒ
ＮＡを１２mlのＨ2Ｏに溶解して、１．２mlの４Ｍ酢酸
カリウムと２４mlの無水エタノールとの混合液で沈澱さ
せて、最後にこの沈澱を再び１０mlのＨ2 Ｏに入れた
（組織１ｇ重量当り１ml）。
【００２０】２． ポリ（Ａ）を含む胎盤ｍＲＮＡの調
製 ポリ（Ａ）を含むｍＲＮＡを得るために、胎盤ＲＮＡを
２mlのパスツールピペット中のオリゴ（ｄＴ）−セルロ
ースクロマトグラフィー［AvivおよびLeder:Proc.Natl.
Acad.Sci.USA 69 (1973) 1408-1412] でＬｉＣｌにて分
画した。緩衝液１［５００mM ＬｉＣｌ、２０mMトリス
（ｐＨ７．５）、１mM ＥＤＴＡ、０．１％ＳＤＳ］に
溶解した約５mgの胎盤ＲＮＡをカラムにかけた。ポリ
（Ａ）＋ＲＮＡはオリゴ（ｄＴ）−セルロースと結合し
たが、ポリ（Ａ）−ＲＮＡを再び溶出することができ
た。緩衝液２［１００mM ＬｉＣｌ、２９mMトリス（ｐ
Ｈ７．５）、１mM ＥＤＴＡ、０．１％ＳＤＳ］で洗浄
処理した後に、ポリ（Ａ）＋ＲＮＡ（胎盤ｍＲＮＡ）を
緩衝液３［５mMトリス（ｐＨ７．５）、１mM ＥＤＴ
Ａ、０．０５％ＳＤＳ］にてカラムから溶出させた。
製 ポリ（Ａ）を含むｍＲＮＡを得るために、胎盤ＲＮＡを
２mlのパスツールピペット中のオリゴ（ｄＴ）−セルロ
ースクロマトグラフィー［AvivおよびLeder:Proc.Natl.
Acad.Sci.USA 69 (1973) 1408-1412] でＬｉＣｌにて分
画した。緩衝液１［５００mM ＬｉＣｌ、２０mMトリス
（ｐＨ７．５）、１mM ＥＤＴＡ、０．１％ＳＤＳ］に
溶解した約５mgの胎盤ＲＮＡをカラムにかけた。ポリ
（Ａ）＋ＲＮＡはオリゴ（ｄＴ）−セルロースと結合し
たが、ポリ（Ａ）−ＲＮＡを再び溶出することができ
た。緩衝液２［１００mM ＬｉＣｌ、２９mMトリス（ｐ
Ｈ７．５）、１mM ＥＤＴＡ、０．１％ＳＤＳ］で洗浄
処理した後に、ポリ（Ａ）＋ＲＮＡ（胎盤ｍＲＮＡ）を
緩衝液３［５mMトリス（ｐＨ７．５）、１mM ＥＤＴ
Ａ、０．０５％ＳＤＳ］にてカラムから溶出させた。
【００２１】さらに精製するために、ポリ（Ａ）＋ＲＮ
Ａを緩衝液１に調整して、再びオリゴ（ｄＴ）−セルロ
ースクロマトグラフに供した。この第二精製工程の後の
胎盤ポリ（Ａ）＋ＲＮＡの収率は、用いたＲＮＡの約４
％だった。
Ａを緩衝液１に調整して、再びオリゴ（ｄＴ）−セルロ
ースクロマトグラフに供した。この第二精製工程の後の
胎盤ポリ（Ａ）＋ＲＮＡの収率は、用いたＲＮＡの約４
％だった。
【００２２】３． ヒト胎盤からのｃＤＮＡ（胎盤ｃＤ
ＮＡ）および二本鎖ｃＤＮＡ（dsＤＮＡ）の合成 ｃＤＮＡ合成の前に、ポリ（Ａ）を含む胎盤ｍＲＮＡの
全体を１．５％アガロースゲルで調べた。
ＮＡ）および二本鎖ｃＤＮＡ（dsＤＮＡ）の合成 ｃＤＮＡ合成の前に、ポリ（Ａ）を含む胎盤ｍＲＮＡの
全体を１．５％アガロースゲルで調べた。
【００２３】次いで、４μｇの胎盤ｍＲＮＡを６５．５
μｌの氷中で冷却した。
μｌの氷中で冷却した。
【００２４】これに、２０μｌのＲＴ1 緩衝液［２５０
mMトリス（ｐＨ８．２、４２℃）、２５０mM ＫＣｌ、
３０mM ＭｇＣｌ2 ］、２．５μｌの２０mM ｄＮＴＰ
（全４種類のデオキシヌクレオシド三燐酸）、１μｌの
１μｇ／mlのオリゴ（ｄＴ）、１μｌの１M ＤＴＴ、２
μｌのＲＮＡsin(ベーリンガー・マンハイム社製）およ
び８μｌの逆転写酵素（２４Ｕ／μｌ、ベーリンガー・
マンハイム社製）を加えてから１００μｌの混合液にし
て、４２℃で９０分間でｃＤＮＡを合成した。二本鎖ｃ
ＤＮＡ（dsＤＮＡ）をGublerおよびHoffmannの方法（Ge
ne 25 (1983)263-269 ）にて合成した。合成は、ｃＤＮ
Ａ合成の直後に、３０５．５μｌのＨ2Ｏ、８０μｌの
ＲＴ2 緩衝液［１００mMトリス（ｐＨ７．５）、２５mM
ＭｇＣｌ2 、５００mM ＫＣｌ、５０mM ＤＴＴ、２
５０μｇ／mlＢＳＡ］、２μｌのＲＮase Ｈ（２Ｕ／μ
ｌ）、２．５μｌの大腸菌ＤＮＡリガーゼ（５Ｕ／μ
ｌ）、５μｌの１５mM β−ＮＡＤ、および５μｌのＤ
ＮＡポリメラーゼＩ（５Ｕ／μｌ）を添加して、１５℃
で５時間インキュベートして行った。反応を加熱不活化
（７０℃、３０分間）によって終結させた。
mMトリス（ｐＨ８．２、４２℃）、２５０mM ＫＣｌ、
３０mM ＭｇＣｌ2 ］、２．５μｌの２０mM ｄＮＴＰ
（全４種類のデオキシヌクレオシド三燐酸）、１μｌの
１μｇ／mlのオリゴ（ｄＴ）、１μｌの１M ＤＴＴ、２
μｌのＲＮＡsin(ベーリンガー・マンハイム社製）およ
び８μｌの逆転写酵素（２４Ｕ／μｌ、ベーリンガー・
マンハイム社製）を加えてから１００μｌの混合液にし
て、４２℃で９０分間でｃＤＮＡを合成した。二本鎖ｃ
ＤＮＡ（dsＤＮＡ）をGublerおよびHoffmannの方法（Ge
ne 25 (1983)263-269 ）にて合成した。合成は、ｃＤＮ
Ａ合成の直後に、３０５．５μｌのＨ2Ｏ、８０μｌの
ＲＴ2 緩衝液［１００mMトリス（ｐＨ７．５）、２５mM
ＭｇＣｌ2 、５００mM ＫＣｌ、５０mM ＤＴＴ、２
５０μｇ／mlＢＳＡ］、２μｌのＲＮase Ｈ（２Ｕ／μ
ｌ）、２．５μｌの大腸菌ＤＮＡリガーゼ（５Ｕ／μ
ｌ）、５μｌの１５mM β−ＮＡＤ、および５μｌのＤ
ＮＡポリメラーゼＩ（５Ｕ／μｌ）を添加して、１５℃
で５時間インキュベートして行った。反応を加熱不活化
（７０℃、３０分間）によって終結させた。
【００２５】５５μｌの２５０μM ｄＮＴＰ、５５μｌ
の１０mMトリス（ｐＨ７．５）、１０mM ＭｇＣｌ2 、
１０μｇ／mlＢＳＡ、３μｌのＴ４ＤＮＡポリメラーゼ
Ｉ（１Ｕ／μｌ）、２μｌのＲＮase Ｈ（２Ｕ／μｌ）
および２μｌのＲＮase Ａ（２μｇ／ml）を反応混合液
に添加した後、３７℃でさらに１３分間インキュベート
して二本目のＤＮＡ鎖上における合成が完全であるよう
にした。（「修復反応」）。
の１０mMトリス（ｐＨ７．５）、１０mM ＭｇＣｌ2 、
１０μｇ／mlＢＳＡ、３μｌのＴ４ＤＮＡポリメラーゼ
Ｉ（１Ｕ／μｌ）、２μｌのＲＮase Ｈ（２Ｕ／μｌ）
および２μｌのＲＮase Ａ（２μｇ／ml）を反応混合液
に添加した後、３７℃でさらに１３分間インキュベート
して二本目のＤＮＡ鎖上における合成が完全であるよう
にした。（「修復反応」）。
【００２６】４． dsＤＮＡへのＥｃｏＲＩリンカーの
連結、およびリンカーの開裂 胎盤ｃＤＮＡバンクを作出するために、dsＤＮＡにＥｃ
ｏＲＩ末端を付して、ファージベクターλｇｔ１０のＥ
ｃｏＲＩ切断部位にこれを連結できるようにした［T.Ma
niatisら：（1982) 、Molecular Cloning 、A Laborato
ry Manual 、Cold Spring Harbor］。この目的のため
に、dsＤＮＡを、 ａ） dsＤＮＡの内部ＥｃｏＲＩ切断部位を保護するた
めにＥｃｏＲＩメチラーゼで処理し、 ｂ） ＥｃｏＲＩリンカーを付して、 ｃ） 次いで、これらリンカーをＥｃｏＲＩで開裂し
た。
連結、およびリンカーの開裂 胎盤ｃＤＮＡバンクを作出するために、dsＤＮＡにＥｃ
ｏＲＩ末端を付して、ファージベクターλｇｔ１０のＥ
ｃｏＲＩ切断部位にこれを連結できるようにした［T.Ma
niatisら：（1982) 、Molecular Cloning 、A Laborato
ry Manual 、Cold Spring Harbor］。この目的のため
に、dsＤＮＡを、 ａ） dsＤＮＡの内部ＥｃｏＲＩ切断部位を保護するた
めにＥｃｏＲＩメチラーゼで処理し、 ｂ） ＥｃｏＲＩリンカーを付して、 ｃ） 次いで、これらリンカーをＥｃｏＲＩで開裂し
た。
【００２７】ａ）に関して：dsＤＮＡのメチラーゼ反応
を、修復反応に続いて直ちに、２５μｌの５００mMＥＤ
ＴＡ（ｐＨ８．０）、６０μｌのメチラーゼ緩衝液（１
００mM ＮａＯＡｃ（ｐＨ５．２）、２mgのＳ−アデノ
シル−Ｌ−メチオニン）および２μｌのＥｃｏＲＩメチ
ラーゼ（２０Ｕ／μｌ）を加えた後、３７℃で３０分間
インキュベートして行った。
を、修復反応に続いて直ちに、２５μｌの５００mMＥＤ
ＴＡ（ｐＨ８．０）、６０μｌのメチラーゼ緩衝液（１
００mM ＮａＯＡｃ（ｐＨ５．２）、２mgのＳ−アデノ
シル−Ｌ−メチオニン）および２μｌのＥｃｏＲＩメチ
ラーゼ（２０Ｕ／μｌ）を加えた後、３７℃で３０分間
インキュベートして行った。
【００２８】反応混合物をフェノールで抽出して、dsＤ
ＮＡを６０μｌの４Ｍ ＮａＯＡｃおよび１３００μｌ
のエタノールで沈澱させた。dsＤＮＡを７０％エタノー
ルで２回洗浄して、エーテルと１回振盪して抽出して、
乾燥させた。
ＮＡを６０μｌの４Ｍ ＮａＯＡｃおよび１３００μｌ
のエタノールで沈澱させた。dsＤＮＡを７０％エタノー
ルで２回洗浄して、エーテルと１回振盪して抽出して、
乾燥させた。
【００２９】ｂ）に関して：ＥｃｏＲＩメチル化ｄｓＤ
ＮＡを、８８μｌのＨ2 Ｏに溶解して、１０μｌのリガ
ーゼ緩衝液［５００mMトリス（ｐＨ７．４）、１００mM
ＭｇＣｌ2 、１００mM ＤＴＴ、１００mMスペルミジ
ン、１０mM ＡＴＰ、１mg／ml ＢＳＡ］および１μｌ
のＴ４ＤＮＡリガーゼ（１０Ｕ／μｌ）を加えた後に、
１μｌのＥｃｏＲＩリンカー（０．５μｇ／μｌ）（ｐ
ＧＧ−ＡＡＴＴＣＣおよびｐＡＧＡＡＴＴＣＴ）と１５
℃にて一晩で連結させた。
ＮＡを、８８μｌのＨ2 Ｏに溶解して、１０μｌのリガ
ーゼ緩衝液［５００mMトリス（ｐＨ７．４）、１００mM
ＭｇＣｌ2 、１００mM ＤＴＴ、１００mMスペルミジ
ン、１０mM ＡＴＰ、１mg／ml ＢＳＡ］および１μｌ
のＴ４ＤＮＡリガーゼ（１０Ｕ／μｌ）を加えた後に、
１μｌのＥｃｏＲＩリンカー（０．５μｇ／μｌ）（ｐ
ＧＧ−ＡＡＴＴＣＣおよびｐＡＧＡＡＴＴＣＴ）と１５
℃にて一晩で連結させた。
【００３０】ｃ）に関して：リガーゼ混合物の容量を、
６μｌのＨ2 Ｏ、１２μｌの１０×ＥｃｏＲＩ緩衝液お
よび２μｌのＥｃｏＲＩ（１２０Ｕ／μｌ）で１２０μ
ｌにした。ＥｃｏＲＩ消化を３７℃にて２時間で行っ
た。
６μｌのＨ2 Ｏ、１２μｌの１０×ＥｃｏＲＩ緩衝液お
よび２μｌのＥｃｏＲＩ（１２０Ｕ／μｌ）で１２０μ
ｌにした。ＥｃｏＲＩ消化を３７℃にて２時間で行っ
た。
【００３１】５． 酢酸カリウム勾配による非結合リン
カーの除去、およびdsＤＮＡの大きさによる選択 ＥｃｏＲＩ反応混合物を酢酸カリウム勾配（５〜２０％
ＫＯＡｃ、１mM ＥＤＴＡ、１μｌ／ml臭化エチジウ
ム）に供して、５０，０００rpm で２０℃にて３時間遠
心分離（ベックマンＳＷ６５ローター）することによっ
て、すべての非結合ＥｃｏＲＩリンカーをdsＤＮＡから
除去した。
カーの除去、およびdsＤＮＡの大きさによる選択 ＥｃｏＲＩ反応混合物を酢酸カリウム勾配（５〜２０％
ＫＯＡｃ、１mM ＥＤＴＡ、１μｌ／ml臭化エチジウ
ム）に供して、５０，０００rpm で２０℃にて３時間遠
心分離（ベックマンＳＷ６５ローター）することによっ
て、すべての非結合ＥｃｏＲＩリンカーをdsＤＮＡから
除去した。
【００３２】勾配液を、最初の５画分を５００μｌず
つ、後はすべて１００μｌずつを計量して下から分画し
た。画分を０．０１容量のアクリルアミド（２mg／ml）
および２．５容量のエタノールで沈澱させて、７０％強
度のエタノールで１回洗浄・乾燥して、それぞれを５μ
ｌのＨ2 Ｏに入れた。
つ、後はすべて１００μｌずつを計量して下から分画し
た。画分を０．０１容量のアクリルアミド（２mg／ml）
および２．５容量のエタノールで沈澱させて、７０％強
度のエタノールで１回洗浄・乾燥して、それぞれを５μ
ｌのＨ2 Ｏに入れた。
【００３３】dsＤＮＡの大きさを決めるために、各画分
の１μｌを１．５％のアガロースゲル中で分析した。さ
らに、dsＤＮＡの量を各画分の１μｌを用いて決定し
た。
の１μｌを１．５％のアガロースゲル中で分析した。さ
らに、dsＤＮＡの量を各画分の１μｌを用いて決定し
た。
【００３４】５００bp以上のdsＤＮＡを含む画分を合わ
せて、その試料を最終濃度が２７μｇ／mlになるまで濃
縮した。
せて、その試料を最終濃度が２７μｇ／mlになるまで濃
縮した。
【００３５】６． ファージベクターλｇｔ１０へのds
ＤＮＡの挿入、およびインビトロパッケージング（pack
aging ）反応 dsＤＮＡを４μｌのリガーゼ混合物中でファージベクタ
ーλｇｔ１０（VectorCloning Systems社、San Diego
、ＣＡ）のＥｃｏＲＩ切断部位に挿入した。リガーゼ
混合物は２μｌのdsＤＮＡ、１μｌのλｇｔ１０×Ｅｃ
ｏＲＩ（１μｇ／ml）、０．４μｌのリガーゼ緩衝液、
０．５μｌのＨ2 Ｏ、０．１μｌのＴ４ＤＮＡリガーゼ
からなる。混合物を１５℃で４時間インキュベートし
た。
ＤＮＡの挿入、およびインビトロパッケージング（pack
aging ）反応 dsＤＮＡを４μｌのリガーゼ混合物中でファージベクタ
ーλｇｔ１０（VectorCloning Systems社、San Diego
、ＣＡ）のＥｃｏＲＩ切断部位に挿入した。リガーゼ
混合物は２μｌのdsＤＮＡ、１μｌのλｇｔ１０×Ｅｃ
ｏＲＩ（１μｇ／ml）、０．４μｌのリガーゼ緩衝液、
０．５μｌのＨ2 Ｏ、０．１μｌのＴ４ＤＮＡリガーゼ
からなる。混合物を１５℃で４時間インキュベートし
た。
【００３６】ファージベクターλｇｔ１０中に胎盤ｃＤ
ＮＡバンクを確立するために、次いでリガーゼ混合物を
λ溶原性細胞抽出物（大腸菌ＮＳ４２８およびＮＳ４３
３）とのインビトロパッケージング反応に室温で２時間
供した（Vector Cloning Systems、San Diego 、CA、En
quist およびsternberg:Methods in Enzymology 68 (19
79)281-298）。反応を５００μｌの懸濁培地［ＳＭ：
０．１Ｍ ＮａＣｌ、８mM ＭｇＳＯ4 、５０mMトリス
（ｐＨ７．５）、０．０１％ゼラチン］および２滴のク
ロロホルムで終結させた。
ＮＡバンクを確立するために、次いでリガーゼ混合物を
λ溶原性細胞抽出物（大腸菌ＮＳ４２８およびＮＳ４３
３）とのインビトロパッケージング反応に室温で２時間
供した（Vector Cloning Systems、San Diego 、CA、En
quist およびsternberg:Methods in Enzymology 68 (19
79)281-298）。反応を５００μｌの懸濁培地［ＳＭ：
０．１Ｍ ＮａＣｌ、８mM ＭｇＳＯ4 、５０mMトリス
（ｐＨ７．５）、０．０１％ゼラチン］および２滴のク
ロロホルムで終結させた。
【００３７】７． 胎盤ｃＤＮＡバンクの力価決定およ
び分析 大腸菌Ｋ１２Ｃ６００ＨＦＬ株のコンピテントにした細
胞を用いて決定した胎盤ｃＤＮＡバンクのプラーク形成
ユニット（ＰＦＵ）の数は、１×１０6 ＰＦＵであっ
た。
び分析 大腸菌Ｋ１２Ｃ６００ＨＦＬ株のコンピテントにした細
胞を用いて決定した胎盤ｃＤＮＡバンクのプラーク形成
ユニット（ＰＦＵ）の数は、１×１０6 ＰＦＵであっ
た。
【００３８】８． 胎盤ｃＤＮＡバンクのスクリーニン
グのためのオリゴヌクレオチドプローブ 胎盤ｃＤＮＡバンクの分析のためにオリゴヌクレオチド
プローブ（ＰＰ１５オリゴヌクレオチド１０３及び１４
０）およびオリゴヌクレオチドのプール（ＰＰ１５オリ
ゴヌクレオチドプール１３９）を合成した。それらの配
列を、ＰＰ１５の三つの臭化シアン断片のアミノ酸配列
から得た。
グのためのオリゴヌクレオチドプローブ 胎盤ｃＤＮＡバンクの分析のためにオリゴヌクレオチド
プローブ（ＰＰ１５オリゴヌクレオチド１０３及び１４
０）およびオリゴヌクレオチドのプール（ＰＰ１５オリ
ゴヌクレオチドプール１３９）を合成した。それらの配
列を、ＰＰ１５の三つの臭化シアン断片のアミノ酸配列
から得た。
【００３９】構築の方法およびプローブの使用は主にR.
Lathe （前出）の方法に従った。
Lathe （前出）の方法に従った。
【００４０】オリゴヌクレオチド配列物の５´末端をＴ
４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて（γ−32Ｐ）ＡＴ
Ｐ（６０μＣｉ／４０μｌの反応混合物を用いて）の存
在下でラベルした。プローブの比放射能（specific act
ivity ）は、１×１０8 Ｂｑ／μｌすなわち１．５×１
０6 Ｂｑ／ｐｍｏｌであった。
４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて（γ−32Ｐ）ＡＴ
Ｐ（６０μＣｉ／４０μｌの反応混合物を用いて）の存
在下でラベルした。プローブの比放射能（specific act
ivity ）は、１×１０8 Ｂｑ／μｌすなわち１．５×１
０6 Ｂｑ／ｐｍｏｌであった。
【００４１】９． ＰＰ１５−特異性オリゴヌクレオチ
ドによる胎盤ｃＤＮＡのスクリーニング １×１０6 ＰＦＵの胎盤ｃＤＮＡを、ＰＰ１５オリゴヌ
クレオチドプローブ１０３、１４０および１３９を合わ
せて調べた。この目的のために、３×１０4 ＰＦＵを、
軟寒天中の大腸菌Ｋ１２ Ｃ６００ＨＦＬ株の細胞とと
もに１３．５cmのペトリ皿上にプレートして、３７℃で
６時間インキュベートした。この時、溶菌はまだ不完全
だった。プレートを一晩冷蔵庫にてインキュベートし
て、ファージをニトロセルロースフィルター（Schleich
er & Schull 、BA 85 、Ref.No.401124 ）に移した（デ
ュプリケート）。ニトロセルロースフィルターおよびペ
トリ皿には、注射針を用いて後の陽性プラークの照合の
ために印を付した。ニトロセルロースフィルターの処理
の間、ペトリ皿を冷蔵庫に保存した。ニトロセルロース
フィルター上のＤＮＡを１．５Ｍ ＮａＣｌおよび０．
５Ｍ ＮａＯＨに浸した濾紙（ファットマンＭ３）上に
フィルターを５分間置くことによって変性させた。次い
でフィルターを同様にして１．５Ｍ ＮａＣｌ、０．５
Ｍトリス（ｐＨ８．０）を用いてもとに戻して、２×Ｓ
ＳＰＥ（０．３６Ｍ ＮａＣｌ、１６mMＮａＯＨ、２０
ｍM ＮａＨ2 ＰＯ4 、２mM ＥＤＴＡ）で洗浄した。次
いでフィルターを８０℃にて２時間真空中で乾燥した。
フィルターを３×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ（２０×ＳＳ
Ｃ＝３Ｍ ＮａＣｌ、０．３Ｍクエン酸ナトリウム）中
で６５℃にて４時間洗浄して、６５℃にて４時間プレハ
イブリダイゼーションさせた［プレハイブリダイゼーシ
ョン溶液：０．６Ｍ ＮａＣｌ、０．０６Ｍトリス（ｐ
Ｈ８．３）、６mM ＥＤＴＡ、０．２％非イオン性合成
シュークロースポリマー（R Ｆｉｃｏｌｌ）、０．２％
ポリビニルピロリドン４０、０．２％ＢＳＡ、０．１％
ＳＤＳ、５０μｇ／ml変性ニシン精子ＤＮＡ］。フィル
ターに、１mlのハイブリダイゼーション溶液（ニシン精
子ＤＮＡを含まないプレハイブリダイゼーション溶液）
当り１００，０００〜２００，０００Ｂｑのラベルした
オリゴヌクレオチドを加えて、これをビーカーまたは封
をしたポリエチレンフィルム中で静かに振盪しながら一
晩インキュベートした。ハイブリダイゼーションの温度
はオリゴヌクレオチドプローブ１３９の場合で４６℃、
その他のプローブの場合で５２℃であった。ニトロセル
ロースフィルターを６×ＳＳＣ、０．０５Ｍピロ燐酸ナ
トリウムで室温で１時間、それぞれのハイブリダイゼー
ション温度でさらに１時間洗浄した。フィルターを乾燥
させて、一晩オートラジオグラフに供した。Ｘ線フィル
ムの両デュプリケートに現れたシグナルをペトリ皿に照
合して、対応領域（約５０プラーク）をパスツールピペ
ットの広い先端で切り出して、ファージを１mlのＳＭ緩
衝液に再懸濁させた。陽性のファージを３回のサイクル
で単離して、単一のクローンを得た。
ドによる胎盤ｃＤＮＡのスクリーニング １×１０6 ＰＦＵの胎盤ｃＤＮＡを、ＰＰ１５オリゴヌ
クレオチドプローブ１０３、１４０および１３９を合わ
せて調べた。この目的のために、３×１０4 ＰＦＵを、
軟寒天中の大腸菌Ｋ１２ Ｃ６００ＨＦＬ株の細胞とと
もに１３．５cmのペトリ皿上にプレートして、３７℃で
６時間インキュベートした。この時、溶菌はまだ不完全
だった。プレートを一晩冷蔵庫にてインキュベートし
て、ファージをニトロセルロースフィルター（Schleich
er & Schull 、BA 85 、Ref.No.401124 ）に移した（デ
ュプリケート）。ニトロセルロースフィルターおよびペ
トリ皿には、注射針を用いて後の陽性プラークの照合の
ために印を付した。ニトロセルロースフィルターの処理
の間、ペトリ皿を冷蔵庫に保存した。ニトロセルロース
フィルター上のＤＮＡを１．５Ｍ ＮａＣｌおよび０．
５Ｍ ＮａＯＨに浸した濾紙（ファットマンＭ３）上に
フィルターを５分間置くことによって変性させた。次い
でフィルターを同様にして１．５Ｍ ＮａＣｌ、０．５
Ｍトリス（ｐＨ８．０）を用いてもとに戻して、２×Ｓ
ＳＰＥ（０．３６Ｍ ＮａＣｌ、１６mMＮａＯＨ、２０
ｍM ＮａＨ2 ＰＯ4 、２mM ＥＤＴＡ）で洗浄した。次
いでフィルターを８０℃にて２時間真空中で乾燥した。
フィルターを３×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ（２０×ＳＳ
Ｃ＝３Ｍ ＮａＣｌ、０．３Ｍクエン酸ナトリウム）中
で６５℃にて４時間洗浄して、６５℃にて４時間プレハ
イブリダイゼーションさせた［プレハイブリダイゼーシ
ョン溶液：０．６Ｍ ＮａＣｌ、０．０６Ｍトリス（ｐ
Ｈ８．３）、６mM ＥＤＴＡ、０．２％非イオン性合成
シュークロースポリマー（R Ｆｉｃｏｌｌ）、０．２％
ポリビニルピロリドン４０、０．２％ＢＳＡ、０．１％
ＳＤＳ、５０μｇ／ml変性ニシン精子ＤＮＡ］。フィル
ターに、１mlのハイブリダイゼーション溶液（ニシン精
子ＤＮＡを含まないプレハイブリダイゼーション溶液）
当り１００，０００〜２００，０００Ｂｑのラベルした
オリゴヌクレオチドを加えて、これをビーカーまたは封
をしたポリエチレンフィルム中で静かに振盪しながら一
晩インキュベートした。ハイブリダイゼーションの温度
はオリゴヌクレオチドプローブ１３９の場合で４６℃、
その他のプローブの場合で５２℃であった。ニトロセル
ロースフィルターを６×ＳＳＣ、０．０５Ｍピロ燐酸ナ
トリウムで室温で１時間、それぞれのハイブリダイゼー
ション温度でさらに１時間洗浄した。フィルターを乾燥
させて、一晩オートラジオグラフに供した。Ｘ線フィル
ムの両デュプリケートに現れたシグナルをペトリ皿に照
合して、対応領域（約５０プラーク）をパスツールピペ
ットの広い先端で切り出して、ファージを１mlのＳＭ緩
衝液に再懸濁させた。陽性のファージを３回のサイクル
で単離して、単一のクローンを得た。
【００４２】各々三つの試料の１×１０6 ＰＦＵの胎盤
ｃＤＮＡバンクを調べた。３回目のスクリーニングでは
じめて、二つのシグナルがデュプリケートフィルター上
で同定された。二つのクローン、ＰＰ１５−２４および
ＰＰ１５−２８はＰＰ１５の完全なｃＤＮＡを含む。
ｃＤＮＡバンクを調べた。３回目のスクリーニングでは
じめて、二つのシグナルがデュプリケートフィルター上
で同定された。二つのクローン、ＰＰ１５−２４および
ＰＰ１５−２８はＰＰ１５の完全なｃＤＮＡを含む。
【００４３】表２に、オリゴヌクレオチド配列１０３、
１３９および１４０と見出されたＰＰ１５配列とが比較
して示されている。 表２ ＰＰ１５配列対ＰＰ１５オリゴヌクレオチド１０３
１３９および１４０と見出されたＰＰ１５配列とが比較
して示されている。 表２ ＰＰ１５配列対ＰＰ１５オリゴヌクレオチド１０３
【００４４】
【化５】 ＰＰ１５配列対ＰＰ１５オリゴヌクレオチド１３９
【００４５】
【化６】 ＰＰ１５配列対ＰＰ１５オリゴヌクレオチド１４０
【００４６】
【化７】 １０．ＤＮＡ配列分析 ファージクローンＰＰ１５−２４およびＰＰ１５−２８
を増やして、それぞれのＤＮＡを抽出した。各場合に、
ＥｃｏＲＩ断片を単離して、Bluescript Ｍ１３ベクタ
ー（Stratagene社、San Diego 、CA、USA ）のＥｃｏＲ
Ｉ部位に連結して、Sangerの酵素的ジデオキシ法を用い
て制限酵素分析および配列分析を行った。配列は、転写
解読枠および最大１２７個のアミノ酸を有するタンパク
質のコードを示す。ＰＰ１５は、計算上の分子量１４４
７８ｄ（メチオニンを含む）を有し、これは導入部で記
述した特許出願第ＤＥ−Ａ第２，９５２，７９２号明細
書中からの数値とよく合致している。
を増やして、それぞれのＤＮＡを抽出した。各場合に、
ＥｃｏＲＩ断片を単離して、Bluescript Ｍ１３ベクタ
ー（Stratagene社、San Diego 、CA、USA ）のＥｃｏＲ
Ｉ部位に連結して、Sangerの酵素的ジデオキシ法を用い
て制限酵素分析および配列分析を行った。配列は、転写
解読枠および最大１２７個のアミノ酸を有するタンパク
質のコードを示す。ＰＰ１５は、計算上の分子量１４４
７８ｄ（メチオニンを含む）を有し、これは導入部で記
述した特許出願第ＤＥ−Ａ第２，９５２，７９２号明細
書中からの数値とよく合致している。
【００４７】
【表１】 １１． 免疫抑制性タンパク質ＰＰ１５の発現 ベクターｐＴｒｃ９９Ａ［E.Amann ら： Gene 69 (198
8)301-315] を用いて非融合成熟ＰＰ１５タンパク質を
大腸菌内で発現させた。ＰＰ１５ｃＤＮＡの開始コード
ンのＤＮＡ配列は以下に示す通りである。
8)301-315] を用いて非融合成熟ＰＰ１５タンパク質を
大腸菌内で発現させた。ＰＰ１５ｃＤＮＡの開始コード
ンのＤＮＡ配列は以下に示す通りである。
【００４８】
【化８】 ＡＴＧの位置にＮｃｏＩ部位がないことから、このＤＮ
Ａを直接にｐＴｒｃ９９Ａ発現ベクターにクローニング
することは不可能である。しかし、ＰＰ１５ｃＤＮＡ配
列中の２個の塩基を交換する突然変異によってＮｃｏＩ
部位を作出することができる（５´ＧＡＡＴＧＧ３´→
５´ＣＣＡＴＧＧ３´）。ＰＰ１５構造配列の二番目の
コードンが「Ｇ」で始まるために、二番目のアミノ酸
（Ｇｌｙ）はこの操作によって影響されない。突然変異
を行うために、ＰＰ１５ｃＤＮＡクローンＰＰ１５−２
８から９０２bpのＥｃｏＲＩ断片を単離して、同様にＥ
ｃｏＲＩで切断して脱燐酸化しておいた突然変異用（mu
tagenesis ）ベクターｐＭａ５−８（第１図）に連結さ
せた。次いで、得られたプラスミドｐＭａ５−８−ＰＰ
１５（Ｆ１−ｏｒｉに対して正しい位置方向でＰＰ１５
ＥｃｏＲＩ挿入物を含む）を、次のオリゴデオキシヌク
レオチドを用いてgapped duplex mutagenesisprotocol
[Kramerら： Nucl.Acids Res.12(1984) 9441-9456] に
供した。
Ａを直接にｐＴｒｃ９９Ａ発現ベクターにクローニング
することは不可能である。しかし、ＰＰ１５ｃＤＮＡ配
列中の２個の塩基を交換する突然変異によってＮｃｏＩ
部位を作出することができる（５´ＧＡＡＴＧＧ３´→
５´ＣＣＡＴＧＧ３´）。ＰＰ１５構造配列の二番目の
コードンが「Ｇ」で始まるために、二番目のアミノ酸
（Ｇｌｙ）はこの操作によって影響されない。突然変異
を行うために、ＰＰ１５ｃＤＮＡクローンＰＰ１５−２
８から９０２bpのＥｃｏＲＩ断片を単離して、同様にＥ
ｃｏＲＩで切断して脱燐酸化しておいた突然変異用（mu
tagenesis ）ベクターｐＭａ５−８（第１図）に連結さ
せた。次いで、得られたプラスミドｐＭａ５−８−ＰＰ
１５（Ｆ１−ｏｒｉに対して正しい位置方向でＰＰ１５
ＥｃｏＲＩ挿入物を含む）を、次のオリゴデオキシヌク
レオチドを用いてgapped duplex mutagenesisprotocol
[Kramerら： Nucl.Acids Res.12(1984) 9441-9456] に
供した。
【００４９】
【化９】 目的の突然変異を有する１個のクローンを制限酵素分析
で同定して、ｐＭｃ５−８−ＰＰ１５−ＮｃｏＩと命名
した。このプラスミドから７９８bpのＮｃｏＩ−Ｅｃｏ
ＲＩ断片を単離して、対応するように切断しておいたｐ
Ｔｒｃ９９Ａベクターに連結させた。得られたプラスミ
ドｐＴｒｃ９９Ａ−ＰＰ１５は４９１８bpからなり、ｔ
ｒｃプロモーターの誘導の後、約１５kDの非融合ＰＰ１
５タンパク質を発現する。
で同定して、ｐＭｃ５−８−ＰＰ１５−ＮｃｏＩと命名
した。このプラスミドから７９８bpのＮｃｏＩ−Ｅｃｏ
ＲＩ断片を単離して、対応するように切断しておいたｐ
Ｔｒｃ９９Ａベクターに連結させた。得られたプラスミ
ドｐＴｒｃ９９Ａ−ＰＰ１５は４９１８bpからなり、ｔ
ｒｃプロモーターの誘導の後、約１５kDの非融合ＰＰ１
５タンパク質を発現する。
【００５０】
【発明の効果】本発明によりアミノ酸配列が特定化され
たタンパク質ＰＰ１５が遺伝子操作によって得られ、本
発明ＰＰ１５は実質的に純粋であって免疫抑制活性が高
く、また本発明による抗体はＰＰ１５に対して特異性が
高い。
たタンパク質ＰＰ１５が遺伝子操作によって得られ、本
発明ＰＰ１５は実質的に純粋であって免疫抑制活性が高
く、また本発明による抗体はＰＰ１５に対して特異性が
高い。
【図１】プラスミドｐＭａｃ５−８（＝ｐＭａ５−８お
よびｐＭｃ５−８）の地図を示す、説明図である。 Ｆ１−ＯＲＩ：ファージｆ１の複製開始点 ＯＲＩ：ＣｏｌＥ１タイプの複製開始点 ＣＡＴ：クロラムフェニコールアセチルトランスフェラ
ーゼのコード領域 ＡＭＰ：β−ラクタマーゼのコード領域 ｐＭａ５−８はＣＡＴ（塩基位置３４０９のＡ）にアン
バー突然変異を有し、ｐＭｃ５−８はＡＭＰ（塩基位置
２２３８のＣ）にアンバー突然変異を有する。
よびｐＭｃ５−８）の地図を示す、説明図である。 Ｆ１−ＯＲＩ：ファージｆ１の複製開始点 ＯＲＩ：ＣｏｌＥ１タイプの複製開始点 ＣＡＴ：クロラムフェニコールアセチルトランスフェラ
ーゼのコード領域 ＡＭＰ：β−ラクタマーゼのコード領域 ｐＭａ５−８はＣＡＴ（塩基位置３４０９のＡ）にアン
バー突然変異を有し、ｐＭｃ５−８はＡＭＰ（塩基位置
２２３８のＣ）にアンバー突然変異を有する。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｐ 21/02 21/08 21/08 Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｔ Ｇ０１Ｎ 33/50 33/53 Ｄ 33/53 33/577 Ｂ 33/577 Ａ６１Ｋ 39/395 Ｄ // Ａ６１Ｋ 39/395 Ｎ 37/02 ＡＢＣ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:645） (72)発明者 オイゲン、アマン ドイツ連邦共和国マールブルク、ザクセン リング、８
Claims (8)
- 【請求項１】遺伝子操作によって得られ、かつ表１に示
されたアミノ酸配列を有する、実質的に純粋なタンパク
質ＰＰ１５。 - 【請求項２】表１に示されたアミノ酸配列をコードする
ＤＮＡ配列物を大腸菌内で発現させることからなる、遺
伝子操作によって得られる実質的に純粋なタンパク質Ｐ
Ｐ１５。 - 【請求項３】表１に示されたアミノ酸配列をコードする
ＤＮＡ配列物を酵母内で発現させることからなる、遺伝
子操作によって得られる実質的に純粋なタンパク質ＰＰ
１５。 - 【請求項４】タンパク質ＰＰ１５に特異的であって、か
つ請求項１〜３のいずれか１項に記載の遺伝子操作によ
って製造されたＰＰ１５、または抗原活性を有するその
部分、から得た、ポリクローナルまたはモノクローナル
抗体。 - 【請求項５】請求項４に記載の抗体を含む、診断補助
物。 - 【請求項６】請求項１に記載のＰＰ１５またはその部分
を含む、診断補助物。 - 【請求項７】体液、組織またはそれらから分離した核酸
を請求項５または６に記載の診断補助物と接触させるこ
とからなる、診断法。 - 【請求項８】請求項１に記載のＰＰ１５を含む、医薬
物。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3809119A DE3809119A1 (de) | 1988-03-18 | 1988-03-18 | Gentechnisch hergestelltes protein pp 15 |
| DE3809119.4 | 1988-03-18 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1067402A Division JPH029370A (ja) | 1988-03-18 | 1989-03-18 | 遺伝子操作によるタンパク質ｐｐ１５の製造 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09131188A true JPH09131188A (ja) | 1997-05-20 |
Family
ID=6350091
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1067402A Pending JPH029370A (ja) | 1988-03-18 | 1989-03-18 | 遺伝子操作によるタンパク質ｐｐ１５の製造 |
| JP8161789A Pending JPH09131188A (ja) | 1988-03-18 | 1996-06-21 | 遺伝子操作によるタンパク質ｐｐ１５の製造 |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1067402A Pending JPH029370A (ja) | 1988-03-18 | 1989-03-18 | 遺伝子操作によるタンパク質ｐｐ１５の製造 |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0333134B1 (ja) |
| JP (2) | JPH029370A (ja) |
| KR (1) | KR890014739A (ja) |
| AT (1) | ATE141104T1 (ja) |
| AU (1) | AU616248B2 (ja) |
| DE (2) | DE3809119A1 (ja) |
| DK (1) | DK131989A (ja) |
| ES (1) | ES2090019T3 (ja) |
| FI (1) | FI95146C (ja) |
| GR (1) | GR3020755T3 (ja) |
| PT (1) | PT90031B (ja) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS56100797A (en) * | 1979-12-31 | 1981-08-12 | Behringwerke Ag | Novel protein and its manufacture |
-
1988
- 1988-03-18 DE DE3809119A patent/DE3809119A1/de not_active Withdrawn
-
1989
- 1989-03-14 ES ES89104516T patent/ES2090019T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1989-03-14 EP EP89104516A patent/EP0333134B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1989-03-14 AT AT89104516T patent/ATE141104T1/de not_active IP Right Cessation
- 1989-03-14 DE DE58909708T patent/DE58909708D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1989-03-16 FI FI891249A patent/FI95146C/fi not_active IP Right Cessation
- 1989-03-17 AU AU31431/89A patent/AU616248B2/en not_active Ceased
- 1989-03-17 DK DK131989A patent/DK131989A/da not_active Application Discontinuation
- 1989-03-17 PT PT90031A patent/PT90031B/pt not_active IP Right Cessation
- 1989-03-18 JP JP1067402A patent/JPH029370A/ja active Pending
- 1989-03-18 KR KR1019890003375A patent/KR890014739A/ko not_active Ceased
-
1996
- 1996-06-21 JP JP8161789A patent/JPH09131188A/ja active Pending
- 1996-08-08 GR GR960401980T patent/GR3020755T3/el unknown
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS56100797A (en) * | 1979-12-31 | 1981-08-12 | Behringwerke Ag | Novel protein and its manufacture |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ATE141104T1 (de) | 1996-08-15 |
| KR890014739A (ko) | 1989-10-25 |
| FI891249L (fi) | 1989-09-19 |
| DE58909708D1 (de) | 1996-09-12 |
| FI891249A0 (fi) | 1989-03-16 |
| JPH029370A (ja) | 1990-01-12 |
| AU616248B2 (en) | 1991-10-24 |
| DK131989D0 (da) | 1989-03-17 |
| EP0333134A3 (en) | 1990-06-06 |
| DE3809119A1 (de) | 1989-10-05 |
| AU3143189A (en) | 1989-09-21 |
| PT90031B (pt) | 1994-05-31 |
| PT90031A (pt) | 1989-11-10 |
| FI95146C (fi) | 1995-12-27 |
| EP0333134A2 (de) | 1989-09-20 |
| GR3020755T3 (en) | 1996-11-30 |
| DK131989A (da) | 1989-09-19 |
| FI95146B (fi) | 1995-09-15 |
| EP0333134B1 (de) | 1996-08-07 |
| ES2090019T3 (es) | 1996-10-16 |
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