JPH03290498A - 洗浄剤組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はアルカリ又はアルカリ耐性プルラナーゼを含有
する洗浄剤組成物に関する。

〔従来の技術〕

洗浄剤に酵素を配合することは古くから実施されている
。洗浄剤中の酵素は洗浄補助剤として働き、例えば衣料
用洗浄剤においては、衣料に付着した各種の汚垢及びシ
ミを、また食器用洗浄剤においては、食器表面に残留す
る油脂類、蛋白質、澱粉等を分解ないしは変質させて除
去しやすくする機能を果す。

特に澱粉質の汚れを除去するために従来はα−アミラー
ゼが用いられており、α−アミラーゼ含有洗浄液に被洗
物を長時間浸漬しておくことにより、澱粉質汚れに対す
る洗浄力を向上させることができる。

本発明者らは、α−アミラーゼとプルラナーゼを併用す
れば、食器、繊維等に強固に付着した澱粉質汚れに効果
的に作用し、洗浄力を顕著に向上せしめ得ることを見出
し、先に特許出願した（特願昭６３−２８５４２４号）
。

〔発明が解決しようとする課題〕

しかしながら、自然界において従来見出されているプル
ラナーゼのほとんどが、中性ないし酸性領域において最
大かつ安定な酵素活性を示す、いわゆる中性もしくは酸
性プルラナーゼに分類されるものであるため、食器用洗
浄剤又は衣料用洗浄剤組成物に適する、すなわちアルカ
リ領域において最大活性を示すか、あるいはアルカリ耐
性を有するプルラナーゼ、いわゆるアルカリプルラナー
ゼ及びアルカリ耐性プルラナーゼの存在は、極めて少な
いのが実情である。

尚、ここでアルカリプルラナーゼとは、至適ｐＨをアル
カリ領域に有するものを言い、アルカリ耐性プルラナー
ゼとは、至適ｐＨは中性から酸性領域に有するが、アル
カリ領域に於いても至適ｐＨに於ける活性に比較して充
分な活性を有し且つ安定性を保持するものを言う。また
、中性とはｐＨ６〜８の範囲を言い、アルカリ性とはそ
れ以上のｐＨ範囲を言う。

従来、アルカリプルラナーゼとしては特公昭５３−２７
７８６号公報に記載されているもののみが知られている
。しかし、これは、アルカリ領域に至適ｐＨを有する酵
素であり、従来知られているプルラナーゼより基質特異
性が広い等の特徴を有してはいるが、至適ｐＨが８〜９
と弱アルカリ領域にあるため、洗浄剤成分として使用す
るには適さないという問題があった。また、酵素が不安
定であると同時に酵素の生産性が悪いという欠点も有し
ており、工業的発酵生産に適うものではなかった。

〔課題を解決するための手段〕

このような実情において、本発明者らは洗浄剤成分とし
てより好適なプルラナーゼについて鋭意研究を行った結
果、α−アミラーゼ活性を有するアルカリ又はアルカリ
耐性プルラナーゼが、α−アミラーゼを併用しない場合
でも食器、繊維等に強固に付着した澱粉質汚れに効果的
に作用し、洗浄力を顕著に向上せしめ、しかも安定で生
産性も良好であることを見出し、本発明を完成した。

すなわち本発明は、α−アミラーゼ活性を有するアルカ
リ又はアルカリ耐性プルラナーゼを含有することを特徴
とする洗浄剤組成物を提供するものである。

本発明に用い得るアルカリ又はアルカリ耐性プルラナー
ゼの例としては、例えば次に示す好アルカリ微生物の一
種であるバチルス　エスピー＜Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ
、）ＫＳＭ−ＡＰＬ３７ｇ（ＦＢＲＭ　Ｐ−１０８８６
）が産生ずるアルカリプルラナーゼが挙げられる。

この微生物は、次のような菌学的性質を示す。

尚、以下において菌株の分類に用いた培地は次の培地１
〜２１の２１種類であり、これらは何れも別滅菌した炭
酸ナトリウム（Ｎａ２ＣＤ−）を０．５重量％（以下、
単に％という）含有する。

使用した培地の組成（表示は％）： 培地１．ニュートリエンドブロス、０．８；　寒天末（
和光紬薬製）、１．５ 培ｊｔ２．　　ニコートリエントブロス、０．８培地３
．ニュートリエンドブロス、０．８：　　ゼラチン、２
０．０；寒天末（和光紬薬製）、１．５培地４．バタト
リトマスミルク、　１０．５培地５．　ニュートリエン
ドブロス、　０．８　：　ＫＮＯ３，０，１培地６．バ
タトペブトン、０．７　；　　ＮａＣ１，０，５；　　
ブドウ糖、０．５ 培地７．　３１Ｍ寒天培地（巣作化学製〉、指示量培地
８．　　ＴＳＩ寒天培地（巣作化学製）、指示量培地９
．酵母エキス、０．５；　　バクトペプトン、１，５；
に２）ＩＰ［１４，０，１；　Ｍｇ５Ｄ４−７Ｈ２０，
０，０２；　可溶性澱粉、２．０；　　寒天末（和光紬
薬製）、１．５培地１０．コーサー培地（巣作化学製）
、指示量培地１１．クリステンセン培地（巣作化学製）
、指示量 培地１２．■酵母エキス、０．０５　；　　ＮａｚＳＯ
４，０，１；ＫＨ，ＰＯ，、０゜１；　ブドウ糖、１．
０■酵母エキス、　０．０５　；　　ＮａａＳＯ−、０
，１；Ｋｔ１２Ｐ［１，、０，１；　　ブドウ糖、１．
０；　　ＣａＣ１，−２Ｈ２０，０，０５；　　Ｍｎ５
Ｏａ”４〜６ＦＩＪ、０．０１；Ｆｅ５Ｏａ’７Ｈ２［
１，０，００１；　　Ｍｇ５０４４ＨＪ、０．０２窒素
源としては、硝酸ナトリウム、亜硝酸ナトリウム、塩化
アンモニウム及びリン酸アンモニウムをそれぞれ０．２
５％、０、２０２５％、０．１５８％及び０．１９５％
となるように上記■及び■の培地に加えて用いた。

培地１３．キングＡ培地“巣作”　（巣作化学製）。

指示量 培地１４．キングＢ培地“巣作”　（巣作化学製）。

指示量 培地１５．尿素培地“巣作゛　（巣作化学製）、指示量
培地１６．チトクローム・オキシダーゼ試験用濾紙（日
本製薬製） 培地１７．３％過酸化水素水 培地１８．バタトペブトン、０．５；　　酵母エキス、
０．５゜Ｋ、ＨＰＯ，、０，１；　　ブドウ糖、　１．
０　；　　Ｍｇ５Ｏ＋・７Ｈ２０，０，０２ 培ｊｌ！！１９．バタトペブトン、２．７；　　Ｎａｉ
、５，５；に、ＨＰＤ、、　０．３；　ブドウ糖、０．
５；　　ブロモチモールブルー、０．０６　、　　寒天
末〈和光紬薬製）、１．５ 培地２０．　（ＮＨ＝）ＪＰＤｉ、０．１；　　ＫＣｊ
！、０．０２；　　Ｍｇ５Ｏｖ７Ｈ２０，０，０２；　
　酵母エキス、０．０５；糖、１゜０培地２１．カゼイ
ン、０．５；　　酵母エキス、０，５；　　ブドウ糖、
１．０；　　Ｋ２ＨＰＯ４，０，１；　　Ｍｇ５Ｏａ・
７Ｈ２Ｄ、０．０２　；　　寒天末（和光紬薬製）、　
１．５〔菌学的性質〕 （ａ）　　顕微鏡的観察結果 菌体の大キサハ、０．８〜２．４ｕｍＸ１．８〜４．０
μｍの桿菌であり、菌体の一端に楕円形の内生胞子（１
，０〜１．２μｍＸ　１．２〜１．４μｍ＞を作る。ま
た、周鞭毛を有し運動性がある。ダラム染色は不定。

抗酸性はない。

６）各種培地に於ける生育状態 ■　肉汁寒天平板培養（培地１．） 生育状態は良い。集落の形状は円形であり、表面は円滑
、周縁は円滑である。又集落の色調は黄色半透明で光沢
がある。

■　肉汁寒天斜面培養（培地１．） 生育する。その状態は拡布状で光沢が有り、黄色半透明
である。

■　肉汁液体培養（培地２．） 生育する。

■　肉汁ゼラチン穿刺培養（培地３．）生育状態は良い
。ゼラチンの液化が認められる。

■　リドマスミルク培地（培地４．） ミルクの凝固、ペプトン化は認められない。

リドマスの変色は培地がアルカリのため判定できない。

（Ｃ）　　生理学的性質 ■　硝酸塩の還元及び脱窒反応（培地５．）硝酸塩の還
元は陽性。脱窒反応は陰性。

■　ＭＲテスト（培地６．） 培地がアルカリ性のため、陰性、陽性は判定できない。

■　ｖｐテスト（培地６．） 陰性。

■　インドールの生ｔＬ＜培地７．） 陰性。

■　硫化水素の生成（培地８．） 陰性。

■　澱粉の加水分解（培地９．） 陽性。

■　クエン酸の利用 コーサー培地（培地１０．）で陰性。クリステンセン培
地（培地１１．）では陽性か陰性か判定できない。

■　無機窒素源の利用（培地１２．） 硝酸塩、アンモニウム塩、亜硝酸塩ともに利用する。

■　色素の生ｔＬ（培地１３．．１４、）陰性。

［相］　ウレアーゼ（培地１５．） 陰性。

０　オキシダーゼ（培地１６．） 陰性。

■　カタラーゼ（培地１７．〉 陽性。

０　生育の範囲（培地１８．） 生育の温度範囲は２０〜４０℃、生育最適温度範囲は３
０〜３５℃である。

生育のｐＨ範囲はｐＨ７〜１０．５、生育最適ｐＨはｐ
Ｈ１Ｏである。

■　酸素に対する態度 好気的。

■　０−Ｆテスト（培地１９．） アルカリ性のため、変色は判定できない。

好気状態でのみ生育する。

［相］　糖の利用性（培地２０．〉 Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース、Ｄ−グルコース、
Ｄ−マンノース、Ｄ−７ラクトース、Ｄ−ガラクトース
、麦芽糖、ショ糖、乳糖、トレハロース、Ｄ−ソルビッ
ト、Ｄ−マンニット、イノジット、グリセリン、デンプ
ン、ラフィノース、サリシン、Ｄ−リボース及びデキス
トリンを利用する。

■　食塩含有培地に於ける生育（培地１．を改変）食塩
濃度７％では生育するが、１０％では生育できない。

［相］　カゼインの分解（培地２１．）陽性。

以上の菌学的性質に関する検討に基づき、バーシーズ・
マニュアル・才ブ・デイタミネイティブ・バクテリオロ
ジ−（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｎｕａｌ　ｏｆＤｅｔ
ｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）第
８版及びザ・ジーナス・バチルス（”’Ｔｈｅ　Ｇｅｎ
ｕｓ　Ｂａｃｉｌｌｕｓ”Ｒｕｔｈ。

Ｂ、　　Ｇｏｒｄｏｎ、　　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ　
Ｈａｎｄｂｏｏｋ　　Ｎ（Ｌ　　４２７゜Ａｇｒｉｃｕ
ｌｔｕｒａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　５ｅｒｖｉｃｅ、　
　Ｕ、　　Ｓ。

口ｅｐａｒｔｍｅｎｔ　　ｏｆ　　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕ
ｒｅ　　Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ　　Ｄ、　Ｃ，。

（１９７３））を参照し、比較検索した結果、本菌株は
有胞子桿菌であるバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属の一
種であると認められる。しかし、本菌株は中性領域では
生育できず、専ら高アルカリ領域で良好な生育を示すこ
とから、最近、ＨｏｒｉｋｏｓｈｉとＡｋｉｂａ〔Ａｌ
ｋａｌｏ、Ｐｂｉｌｉｃ　Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ
　　、　ＪａｐａｎＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　５ｏｃｉｅ
ｔｙ　Ｐｒｅｓｓ　（Ｔｏｋｙｏ）、　　１９８２年刊
〕の主張している、所謂好アルカリ性 （Ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｉｃ）微生物として暫定的に、
従来の中性で生育するバチルス属細菌とは区別される。

更に、本菌株の菌学的性質は公知の好アルカリ性バチル
スのいずれとも一致しないので、これを新規菌株と判断
してバチルス　エスピーＫＳＭ−ＡＰ１３７８と命名し
、微工研菌寄第１０８８６号として工業技術院微生物工
業技術研究所に寄託した。

上記の菌株を用いて本発明に用いられるα−アミラーゼ
活性を有するアルカリプルラナーゼを得るには、培地に
菌株を接種し、常法に従って培養すればよい。培養に用
いる培地中には、資化し得る炭素源及び窒素源を適当量
含有せしめておくことが好ましい。この炭素源及び窒素
源は特に制限されないが、その例としては、窒素源とし
てコーングルテンミール、大豆粉、コーンスチープリカ
ー、カザミノ酸、酵母エキス、ファーマメディア、肉エ
キス、トリプトン、ソイトン、バイブロ、アジパワー、
綿実油粕、カルチベーター、アジプロン、ゼスト等の有
機窒素源及び硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、リ
ン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、硝酸ナトリウム
、酢酸アンモニウム等の無機窒素源が挙げられる。また
炭素源としては、可溶性澱粉、不溶性澱粉、アミロペク
チン、グリコーゲン、プルラン及びこれらの部分分解に
より生じた分岐オリゴ糖に加え、資化し得る炭素源、例
えばグルコース、マルトース、アラビノース、キシロー
ス、リボース、マンノース、フラグドース、ガラクトー
ス、麦芽糖、ショ糖、乳糖、トレハロース、マンニット
、ソルビット、グリセリンや資化し得る有機酸、例えば
クエン酸、酢酸等が挙げられる。またその他、リン酸塩
、マグネシウム塩、カルシウム塩、マンガン塩、亜鉛塩
、コバルト塩、ナトリウム塩、カリウム塩等の無機塩や
、必要であれば、無機、有機微量栄養源を培地中に適宜
添加することもできる。

また、培養における温度は２０〜４０℃、特に３０〜３
５℃が好ましく、ｐＨは８〜１０１５、特にｌＯが好ま
しく、この条件下において通常２〜３日間で培養は完了
する。

斯くして得られた培養物中からの目的物質である、α−
アミラーゼ活性を有するアルカリプルラナーゼの採取及
び精製は、一般の酵素の採取及び精製の手段に準じて行
うことができる。即ち、培養後、遠心分離又は濾過等の
通常の固液分離手段により菌体を培養物から除去して粗
酵素液を得ることができる。この粗酵素液は、そのまま
使用することもできるが、必要に応じて、塩析法、沈澱
法、限外濾過法等の分離手段により粗酵素を得、更に公
知の方法により精製結晶化し、精製酵素として使用する
ことも可能である。

以下に、上記アルカリプルラナーゼの好ましい製造法の
一例を説明する。アルカリ性細菌バチルス属に属する例
えばＫＳＭ−ＡＰＩ３７８株を１％プルラン、１％ポリ
ペプトン、０．５％酵母エキス、０．１％に１１２ＰＯ
，，０，２５％Ｎａ＊ＨＰＯ４・１２Ｈ２０，０，０２
％Ｍｇ５Ｏ＜・７Ｈ１０，０，５％炭酸ナトリウムを含
む培地で３０℃にて３日間好気的に振盪培養して得られ
る培養液から菌体を除き、上澄液を得る。次いで、■Ｄ
ＲＡＢセルロース吸着、■α−シクロデキストリン　ア
フィニティ　クロマトグラフィー、■ＤＲＡＢ　）ヨパ
ール（東洋曹達社製）クロマトグラフィー、■セファク
リル（ファルマシア社製）クロマトグラフィーを行うこ
とによって精製される。斯くして得られる精製酵素は、
ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度１５％）及
びソディウムドデシルサルフェー）　（ＳＯＳ）電気泳
動で単一のバンドを与え、またプルラナーゼの活性収率
は約２％であった。

斯くして得られる、アルカリプルラナーゼは、本発明洗
浄剤組成物の成分として好適に使用し得る。このアルカ
リプルラナーゼの酵素化学的性質について、以下に説明
する。

尚、酵素活性の測定は次の緩衝液（各々５０ｍＭ宛）を
用い、以下の方法に従って行った。

ｐＨ４〜６　　酢酸緩衝液 ｐＨ６〜８　　リン酸緩衝液（プルラナーゼ活性測定に
使用） ｐＨ（６〜８　　トリスマレイド緩衝液（α−アミラー
ゼ活性測定に使用） ｐＨ８〜１１　　　グリシン−食塩−水酸化ナトリウム
緩衝液 ｐＨ１１〜１２　　　塩化カリウム−水酸化ナトリウム
緩衝液 酵素活性測定法： ■　プルラナーゼ活性 各種緩衝液中にプルラン（反応系に於ける最終濃度は、
０．２５％）を溶解させた基質溶液０．９−に、酵素液
０．１−を加え、４０℃で、３００分間反応せた。反応
後、３．５−ジニトロサリチル酸（３゜５−ｄｉｎｉｔ
ｒｏｓａｌｉｃｙｌｉｃ　ａｃｉｄ　（ＤＮＳ）　’）
法にて、還元糖の定量を行った。即ち、反応液１．０−
に口ＮＳ試薬１．０−を加え、５分間、１００℃で加熱
発色させ、冷却後、４．０７！の脱イオン水を加えて希
釈し、波長５３５ｎｍで比色定置した。酵素の力価は、
Ｉ分間に１μｍｏ１のグルコースに相当する還元糖を生
成する酵素量を１単位（ＩＵ）とした。

■　α−アミラーゼ活性 各種ＭＩｒ液中に可溶性澱粉（反応系に於ける最終濃度
は、０．２５％）を溶解させた基質溶液０．９−に、酵
素液０．１−を加え、５Ｄ’Ｃで、１５分間反応させた
。

反応後、（［１ＮＳ）法にて、還元糖の定量を行った。

即ち、反応液１．０ｗｌ！に口ＮＳ試薬１．０ｒｒ１１
を加え、５分間、１００℃で加熱発色させ、冷却後、４
．０ｍｌ！の脱イオン水を加えて希釈し、波長５３５ｎ
ｍで比色定置した。酵素の力価は、１分間に１μｌｌ１
０Ｊｉ！のグルコースに相当する還元糖を生成する酵素
量を１単位（１Ｕ）とした。

〔酵素化学的性質〕

■　作用 プルラン及び可溶性澱粉に作用し、前者からは主として
マルトトリオースを、後者からは主としてマルトテトラ
オース及びマルトペンタオースを生成する。また、グリ
コーゲンにも作用しマルトテトラオース及びマルトペン
タオースを生成する（第１図）。

■　基質特異性 プルラン、可溶性澱粉及びグリコーゲンに作用する（第
１表）。

以下余白 第１表 ■　作用ｐＨ及び最適作用ｐｉ（ 本酵素のプルランに対する作用ｐＨは５〜１２の範囲に
あり、最適作用ｐ＋は８．５〜１０の範囲に認められる
。

尚、各ｐＨにおけるプルラナーゼ活性を０．２５％プル
ラン、１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐｔ１４〜５）、リン酸緩
衝液（ｐＨ６〜８）、グリシン−食塩−水酸化ナトリウ
ム緩衝液（ｐＨ９〜１０．５）及び塩化カリウム−水酸
化ナトリウム緩衝液（ｐｔ（１１−１２）の反応系を用
い、４０℃、３００分間反応せて測定した結果を第２図
（ａ）に示す。

また、可溶性澱粉に対する作用ｐＨは４〜１２の範囲に
あり、最適作用ｐａｌはｐＨ７〜９．５の範囲に認めら
れる。

尚、各ｐＨにおけるα−アミラーゼ活性を０，２５％可
溶性澱粉、１０ｍＭ酢酸Ｍ衝液（ｐ）１４〜５〉、トリ
スマレイド緩衝液（ｐＨ６〜８）、グリシン−食塩−水
酸化す）ＩＪウム緩衝液（ｐＨ９〜１０．５）及び炭酸
緩衝液（ｐｆｌｌｌ〜１２）の反応系を用い、５０℃、
１５分間反応させて測定した結果を第２図（ロ）に示す
。

■　ｐ）Ｉ安定性 本酵素のプルランに対するｐＨ安定性は、ｐＨ６〜１０
．５の範囲に認められる。

尚、各ｐＨ（におけるプルラナーゼ活性を０．２５％プ
ルラン、１〇−酢酸緩衝液（ｐＨ４〜５）、リン酸緩衝
液（ｐＨ６〜８）、グリシン−食塩−水酸化ナトリウム
緩衝液（ｐＨ９〜１０．５）及び塩化カリウム−水酸化
ナトリウム緩衝液（ｐＨ１ｌ〜１２）の反応系を用い、
４５℃、１０分間反応させて測定した結果を第３図（ａ
）に示す。

また、可溶性澱粉に対するｐ）Ｉ安定性は、ｐＨ４〜１
２の範囲に認められる。

尚、各ｐＨにおけるα−アミラーゼ活性を０．２５％プ
ルラン、１０ｄ酢酸緩衝液（ｐＨ４〜５）、トリスマレ
イド緩衝液（ｐＨ６〜８）、グリシン−食塩−水酸化ナ
トリウム緩衝液（ｐＨ１１〜１２．５）及び炭酸緩衝液
（ｐＨ１１〜１２）の反応系を用い、５０℃、１５分間
反応させて測定した結果を第３図（ロ）に示す。

■　作用温度範囲及び最適作用温度 本酵素のプルラン及び可溶性澱粉に対する活性は、１０
〜６５℃の範囲で認められ、最適作用温度は約５０℃に
認められる（第４図（ａ）及び（ロ））。

■　温度安定性 本酵素についてｐｆ（９，５の条件で温度を変化させ、
各温度で３０分間処理することにより失活の条件を調べ
たところ、４５℃までは極めて安定である（第５図（ａ
）及び（ロ））。

■　分子量 ＳＯ３電気泳動法（ゲル濃度７．５％〉による分子量は
約２００．０００±５．０００である。

■　金属イオンの影響 プルラナーゼ活性はＨｇ２＋、　Ｍｎ２＋、　Ｐｂ２＋
で阻害される。また、α−アミラーゼ活性はＨｇ”、　
Ｍｎ２＋Ｐｂ”、　Ｃｄ”、　Ｚｎ’＋で阻害される（
第２表）。

下記第２表より明らかな如く、本酵素のプルラナーゼ活
性とα−アミラーゼ活性とでは、阻害を受ける金属イオ
ンの種類が異なっている。

■　界面活性剤の影響 直鎮アルキルベンゼンスルフオン酸ナトリウム、ポリオ
キシエチレンアルキル硫酸エステルナトリウム塩、α−
オレフィンスルフオン酸ナトリウム、α−スルフォン化
脂肪酸エステルナトリウム、アルキルスルフオン酸ナト
リウム、ＳＯ３，石Ｍ、ソフタノール（登録商標）等の
各種界面活性剤の０．０５％溶液で４０℃にて１５分間
処理しても殆ど活性阻害を受けない。

■　キレート剤の影響 キレート剤であるＥＤＴＡ　（１０ｃｎＭ）及びＥＧＴ
Ａ（１０ｍＭ＞でプルラナーゼ活性は殆ど阻害を受けな
いが、α−アミラーゼ活性は著しい阻害を受ける。また
、キレート剤により阻害を受けたα−アミラーゼ活性は
再びＣａ２＋を加えると復活する（第２表）。

■　プロテアーゼ耐性 マクサターゼＣＩＢＩＳ社製〉及びサビナーゼ（ノボ社
製）等のアルカリプロテアーゼを活性測定時に共存（０
，２ＡＵ／Ｉ１）させても、いずれのプロテア−ゼに対
しても強い耐性を有する。

以上の酵素化学的性質から明らかなように、本酵素は、
従来のα−アミラーゼ活性を有するプルラナーゼとは理
化学的性質の異なる新規な酵素である。

更に、ここで、本酵素の新規な点を更に明らかにするた
めに、従来報告されているα−アミラーゼ活性を有する
プルラナーゼとの理化学的性質を比較した結果を下記第
３表に示す。

以下余白 第３表から明らかな如く、本アルカリプルラナーゼは、
バチルス　ズブチリス　ＴＯ由来のプルラナーゼ−アミ
ラーゼ複合酵素及びバチルス　サーキュランス　Ｆ−２
由来のプルラナーゼ活性を有するアミラーゼとは、その
理化学的性質が明らかに異なるものである。

上記α−アミラーゼ活性を有するアルカリ又はアルカリ
耐性プルラナーゼは、本発明洗浄剤組成物中に通常０．
１〜１０重量％配合される。尚、アルカリ又はアルカリ
耐性プルラナーゼは、精製酵素を用いてもよいし、培養
液をそのまま粗製酵素として用いてもよい。

本発明の洗浄組成物に配合される、その他の洗剤常用成
分は、特に限定は付されず、用途、目的に合わせて任意
に配合されてよい。以下、それらの配合成分について述
べる。

（１〕　　界面活性剤の配合量は特に限定されないが好
ましくは０．５〜６０重量％配合される。本発明の洗浄
剤組成物に用いることができる界面活性剤としては、陰
イオン性界面活性剤としては、アルキルベンゼンスルフ
ォン酸塩、アルキル又はアルケニルエーテル硫酸塩、ア
ルキル又はアルケニル硫酸塩、オレフィンスルフォン酸
塩、アルカンスルフォン酸塩、飽和又は不飽和脂肪酸塩
、アルキル又はアルケニルエーテルカルボン酸塩、α−
スルホ脂肪酸塩又はエステル、アミノ酸型界面活性剤、
Ｎ−アシルアミノ酸型界面活性剤、アルキル又はアルケ
ニル酸性燐酸エステル、アルキル又はアルケニル燐酸エ
ステル又はその塩などが、両性界面活性剤としては、カ
ルボキシ又はスルホベタイン型界面活性剤などが、非イ
オン界面活性剤としては、ポリオキシアルキレンアルキ
ル又はアルケニルエーテル、ポリオキシエチレンアルキ
ルフェニルエーテル、高級脂肪酸アルカノールアミド又
はそのアルキレンオキサイド付加物、ショ糖脂肪酸エス
テル、脂肪酸グリセリンモノエステル、アルキルアミン
オキサイド、アルキルグリコシドなどが、カチオン性界
面活性剤としては、第四級アンモニウム塩などが例示さ
れる。

本発明の洗浄剤組成物を自動食器洗浄機用洗剤として用
いる場合の界面活性剤としては、低泡性乃至無泡性の非
イオン性界面活性剤が好ましい。

この種の界面活性剤の例としてはアルコキシ化非イオン
性界面活性剤（このアルコキシ部はエチレンオキサイド
、プロピレンオキシド及びその混合物からからなる群か
ら選ばれたものである）が挙げられる。このような界面
活性剤の具体例としては、ＢＡＳＦジャパン社の“Ｐｌ
ｕｒａｆａｃ　（登録商標）ＬＦ４０３”、Ｐｌｕｒａ
ｆａｃ　ＬＦ１３００″及び日本触媒化学工業■の“ソ
フタノールＢＰ７０４５”　（登録商標）等が挙げられ
る。本発明の洗浄剤組成物を自動食器洗浄機用洗剤とし
て用いる場合、界面活性剤は組成物中に０．５〜３０重
量％配合されることが好ましい。

（２）炭酸塩、重炭酸塩、珪酸塩、ホウ酸塩、アルカノ
ールアミンなどのアルカリ剤あるいは硫酸塩などの無機
電解質は、普通０〜９０重量％配合され百〇 （３）トリポリリン酸塩、ピロリン酸塩、オルトリン酸
塩等のリン酸塩、エタン−１，１−ジホスホン酸塩等の
ホスホン酸の塩、２−ホスホノブタン−１，２−ジカル
ボン酸等のホスホノカルボン酸の塩、アスパラギン酸、
グルタミン酸等のアミノ酸の塩、ニトリロ三酢酸塩、エ
チレンジアミン四酢酸塩等のアミノポリ酢酸塩、ポリア
クリル酸、ポリアコニット酸等の高分子キレート剤、シ
ュウ酸、クエン酸等の有機酸の塩、アルミノ珪酸塩なと
の二価金属イオン捕捉剤は、組成物中に普通Ｏ〜５０重
量％配合される。

（４）過炭酸ソーダ、過炭酸ソーダ、次亜塩素酸ソーダ
、ジクロルイソシアル酸などの漂白剤は０〜８５重量％
配合される。

（５）その他の少量成分として、ポリエチレングリコー
ル、カルボキシメチルセルロース等の再汚染防止剤、プ
ロテアーゼ、リパーゼ、α−アミラーゼ、セルラーゼ等
の酵素、亜硫酸塩等の酵素失活防止剤、螢光染料、青味
付剤、色素、ケーキング防止剤、可溶化剤、酵素あるい
は漂白剤の活性化剤、金属腐食防止剤などを必要に応じ
て配合することができる。

本発明に使用し得るプロテアーゼの例としては、バチル
ス・ズブチリスやバチルス・リケニフォルミス等、特定
の菌株から得られるズブチリシンが挙げられる。これら
の例としてはギスト社から販売されている“マクサター
ゼ（登録商標〉、ノボ・インダストリー社の“アルカラ
ーゼ（登録商標）、“エスペラーゼ”　（登録商標）及
び“サビナーゼ（登録商標）などが挙げられる。

また、本発明に使用し得るα−アミラーゼの例としては
、バチルス・リケニフォルミス、バチルス・ズブチリス
等から得られたものが挙げられ、市販品の例としてノボ
・インダストリー社の“ターマミル′″　（登録商標）
、ギスト社の“マキサミル”　（登録商ａ）等が挙げら
れる。

本発明の洗浄剤組成物を自動食器洗浄機用洗剤として用
いる場合、前記各成分以外のバランス成分としては、粉
末又は顆粒組成物の場合、無機アルカリ剤を用いるのが
好ましい。無機アルカリ剤としては、例えばピロリン酸
ナトリウム、オルトリン酸ナトリウム、トリポリリン酸
ナトリウム、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、セス
キ炭酸ナトリウム、ホウ砂、珪酸ナトリウムなとが挙げ
られる。特に、珪酸す）　ＩＪウムは金属腐食防止作用
を有するので、これを他のアルカリ剤と併用するのが望
ましい。この場合、他のアルカリ剤３５〜８５重量％及
び珪酸ナトリウム（ＳｘＯａ／　Ｎａ１Ｏ比が１／１〜
４／１、好ましくは２７１〜２．５／　１　）２〜１５
重量％を併用するのが最も好ましい。無機アルカリ剤は
、０．０５〜１重量％濃度の洗剤溶液がｐＨ９，０〜１
１．０になるように配合量を調整する。

液体の場合は、バランス成分は水である。

また、自動食器洗浄機用洗剤には、銅腐食防止剤として
炭化水素鎖長が８〜１８程度である脂肪酸や、ベンゾト
リアゾール等を添ｉすることも効果的である。

また、多くの洗浄剤について無リン洗剤が主流である現
在、環境問題の点からリン酸塩含有洗剤は社会的な問題
になりかねない。そこで、各種汚れに対する洗浄力を低
下することなく無リン化することも重要である。

無リン化する際には、二価金属イオン捕捉剤として、次
の一毅式（Ｉ）で表わされるヒドロキシ多価カルボン酸
又はその水溶性塩を使用するのが好ましい。

（式中、Ｘ１ｔ−Ｈ、−ＣＨａ　、−ＣＨ，Ｃ００）Ｉ
又は−Ｃ）ｌ　（ＤＩ（）　Ｃ００ＩＩを、Ｙは−Ｈ又
は−叶を表す）この中でも、クエン酸、リンゴ酸、酒石
酸又はそれらの水溶性塩が好ましい。かかる塩としては
、ナトリウム塩、カリウム塩、モノエタノールアミン塩
、ジェタノールアミン塩、トリエタノールアミン塩等が
例示される。

このような成分は、本発明洗浄剤組成物中に０．５〜３
０重量％配合するのが好ましい。

また、更に二価金属イオン捕捉剤として高分子キレート
剤１〜１０重量％を併用するのが好ましい。高分子キレ
ート剤としては、特開昭５７−１４５１９９号公報に記
載されているような二価金属イオン捕捉高分子電解質が
例示できるが、アクリル酸又はメタクリル酸の重合体、
アクリル酸メタクリル酸共重合体、それらの水溶性塩基
等が挙げられ、平均分子量は１．５００〜１００．００
０、特に３．０００〜２０．０００のものが好ましい。

本発明の洗浄剤組成物は、上記成分を常法に従って混合
し、粉末状、顆粒状又は液状の衣料用、食器用、住居用
等の洗浄剤として使用することができる。

〔実施例〕

以下、実施例を挙げて更に詳細に説明するが、本発明は
これらに限定されるものではない。

製造例１ （１）栃木県栃木市の土壌を薬匙−杯（約０．５ｇ）、
滅菌生理食塩水に懸濁し、８０℃で１５分間熱処理した
。この熱処理液の上清を適当に希釈して、分離用寒天培
地（培地Ａ）に塗布した。次いで、これを３０℃にて３
日間培養し、集落を形成させた。集落の周囲に着色プル
ラン及び着色澱粉の溶解に基づく透明帯を形成するもの
を選出し、α−アミラーゼ活性を有するプルラナーゼ生
産菌を取得した。更に、取得菌を培地Ｂの液体培地に接
種し、３０℃で３日間振盪培養した。培養後、遠心分離
した上滑液についてプルラナーゼ活性及びアミラーゼ活
性を、ｐＨ１０にて測定し、α−アミラーゼ活性を有す
るアルカリプルラナーゼ生産菌をスクリーニングした。

上述の方法により、α−アミラーゼ活性を有するアルカ
リプルラナーゼ生産菌であるバチルスエスピー　ＫＳＭ
−八Ｐ１３７８（ＦＯＲＭ　Ｐ−１０８８６）を取得す
ることが出来た。

培地Ａ、プルラン　　　　　　　　　０．５％可溶性澱
粉　　　　　　　　０．５％ 着色プルラン　　　　　　　０．２％ 着色澱粉　　　　　　　　　０．２％ ポリペプチド　　　　　　　　０．２％酵母エキス　　
　　　　　　０．１％ ＫＨ２ＰＯ４０，０３％ （Ｎｔ１４）　２ＳＯ，０，１％ １１ｇ５Ｏａ”７ＨＪ ＣａＣｊ！　＊”２Ｌ［１ ＦｅＳＯａ・７ｔ（Ｊ ＭｎＣｊ！　ａ”４）１ｉ０ 寒天 ｐＨ 培地Ｂ、プルラン 可溶性澱粉 トリプトン 酵母エキス ＨａＰＯｉ （Ｎ）Ｉｓ）ｓｓＯａ ＭｇＳＬ・７Ｈ２０ ＣａＣ１１２Ｌ。

Ｆｅ５０．’？）１．０ ＭｎＣＪ　１４Ｈｚ０ ０、０２％ ０．０２％ ０．００１％ ０、０００１％ １．５％ １０．０ ０．５％ ０．５％ ０．２％ ０．１％ ０．０３％ ０．１％ ０．０２％ ０．０２％ ０．００１％ ０．０００１％ ｐＨ１０，０ （２）　　α−アミラーゼ活性を有するアルカリプルラ
ナーゼ生産菌であるバチルス　エスピー　ＫＳＭ−＾Ｐ
１３７８株を実施例１の液体培地Ｂに接種し、３０℃で
３日間振盪培養した。培養後、菌体を遠心分離して除き
、粗酵素液とした。更に、通常の方法に従って、１００
％エタノールを添加してエタノール乾燥粉末とし、以下
の第４表に示すα−アミラーゼ活性を有するアルカリプ
ルラナーゼ酵素標品を得ることができた（酵素活性はｐ
Ｈ９に於ける測定値である）。

（３）（２）で得られた粗酵素液について、以下の手順
に従って精製を行い、α−アミラーゼ活性を有するアル
カリプルラナーゼを得た。すなわち、粗酵素液の上澄液
にＤＢＡＢセルロース粉末を加え、上澄液中のプルラナ
ーゼを完全にＤＲＡＢセルロースに吸着させた。次いで
、１０ｒｎＭ）！Ｊスス−酸緩衝液（ｐ）（８）で樹脂
を洗浄した後、０．６Ｍの食塩を含む同緩衝液で酵素を
溶出した。次に、１０ｍＭ）！Ｊスス−酸緩衝液（ｐＨ
８）で透析後、同緩衝液で平衡化したα−シクロデキス
トリン　アフィニティー　カラムに吸着させ、β−シク
ロデキストリンを含有する同緩衝液により溶出し、その
活性画分を集めた。集められた活性画分は、透析後、１
１０ｆｆ１トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８＞で平衡化した
ＤＥＡＢトヨパール６５０Ｓに吸着させた。吸着したＷ
Ｉ素を同緩衝液中、０．１からＩＭの食塩の濃度勾配に
より溶出し、その活性画分を集めた。集められた活性画
分は、透析後、次いで０．１Ｍ食塩を含む同緩衝液で平
衡化したセファクリルＳ−２００カラムに充填し、０．
１Ｍ食塩を含む同ｔｌＮｆｒ液で溶出し、その活性画分
を集めた。集められた活性画分は、限外濾過膜を用いて
濃縮した後、１００１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８）
を用いて一夜透析した。得られたα−アミラーゼ活性を
有するアルカリプルラナーゼについてデービスＣＤａｖ
ｉｓ　Ｄ、Ｊ、、＾ｎｎ、　Ｎ、　Ｙ。

＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、、　１２１．４０４　（１９６４
）　）の方法に従って電気泳動を行った後、コマシー・
ブリリアント・ブルーで染色して単一のバンドを与える
ことを確認した（第６図）。

（５）（４）で得られたα−アミラーゼ活性を有するア
ルカリプルラナーゼについて、常法に従い、ソディウム
・ドデシル・硫酸（ＳＤＳ）電気泳動を行った。

この結果を第７図に示す。この結果から、本酵素は分子
量２００．０００±５．０００であった。

実施例１　（自動食器洗浄機用洗浄剤）本実施例で採用
した洗浄条件、洗浄力試験及びその結果は次の通りであ
る。

（１）洗浄条件 使用洗浄機；松下電器■製全自動食器洗い機（機種ＮＰ
−６００） 洗浄剤水溶液が回転ノズルから 噴射され、その噴射軌道上面に 設置された食器類を洗浄する形 式のもの。

洗浄温度；５℃から５５℃まで徐々に昇温する。

洗浄用水；硬度３．５°ＤＨの水 洗浄濃度；０．２％ 洗浄時間；洗浄２０分、すすぎ２０分 洗浄時の循環水量；２゜５１ （２）洗浄力の評価 澱粉汚れの汚染皿及び評価方法 （汚染皿） 軟質の炊き上がり米飯を３０分間室温にて放置し、３ｇ
を磁性の皿（直径２５ｃｍ）に引き伸ばし塗布し、室温
で一昼夜風乾したものを各６枚洗浄に供した。

（澱粉汚れ洗浄力評価方法） 澱粉の残存を、ヨウ素の呈色反応によって生じる青色部
分面積（Ｐ、）を写真判定によって測り、以下初期の汚
染面積（Ｓｏ）から洗浄率を下の式によって求めた。

洗浄率＝　Ｃ（Ｓｏ　　Ｐ　＋）／Ｓ０〕Ｘ　１００（
３）洗浄組成 クエン酸ナトリウム　　　　　　　　２０１号珪酸ナト
リウム　　　　　　　　５酵　素　　　　　　　　　第
５表又は第６表炭酸ナトリウム　　　　　　　　バラン
ス（注）数字は重量％を示す。

ただし酵素は洗剤中の活性で示す。

（４）洗浄力試験効果 試験結果を第５表及び第６表に示す。

第５表 トワコー（ＣＭ−アミロース・ＤＢＸ法〉法により測定
した。尚ＩＵは、酵素１００−が３７℃、３０分でデン
プン１０■を過不足なく分解する酵素単位とする。

第５表中の酵素活性は、アミラーゼ、Ｂ−テスゼ 第６表中の酵素活性は、以下の方法で測定した。

１０ｍＭグリシン−食塩−水酸化す）　ＩＪウム緩衝液
（ｐＨ９、０）中にプルラン（反応系における最終濃度
は０．２５％）を溶解させた基質溶液０．９ｍｌに、酵
素液０．１１ｎ１を加え４０℃で３０分間反応させる。

反応後、３．５−ジニトロサリチル酸（３，５−ｄｉｎ
ｉｔｒｏｓａｌｉｃｙｌｉｃ　ａｃｉｄ　（ＤＮＳ））
法にて、還元糖の定量を行った。即ち、反応液１．０−
にＤＮＳ試薬１．０−を加え、５分間、１００℃で加熱
発色させ、冷却後、４．０Ｔｎｌの脱イオン水を加えて
希釈し、波長５３５ｎｍで比色定量した。酵素の力価は
、１分間に１μｌｌ１０１のグルコースに相当する還元
糖を生成する酵素量を１単位（ＩＵ）とした。

実施例２（衣料用洗浄剤） 本実施例で採用した洗浄条件、洗浄力試験及びその結果
は次の通りである。

（１）人工汚染布 白玉と米飯を９：１で混合し、水道水で２倍に希釈しミ
キサーにかける。この液を木綿布１０ｃｍＸ１０ｃｍの
試験片に布の重量の２．５〜５％になるように塗布する
。２０℃、２４時間乾燥し、実験に供した。

（２）洗浄条件及び方法 ４°ＤＨ硬水に洗剤を溶解し、０．６６５％洗剤水溶液
１１（水溶液中の酵素活性１．９８Ｘ　１０　”Ｕ、＃
　）　ヲ調製する。木綿人工汚染布５枚を洗剤水溶液に
添加し、４０℃で１時間静置後、洗剤溶液と人工汚染布
をそのままターボトメ−ター用ステンレスビーカーに移
し、ターボトメ−ターにて１１００ｒｐ、　２０℃、１
０分間撹拌洗浄する。流水下ですすいだ後、２０℃、２
４時間乾燥し、重量測定に供した。

（３）洗浄力の評価 洗浄前の原布及び洗浄前後の汚染布の重量を測定し、次
式によって洗浄率（％）を算出した。

洗浄率（％）＝ 第２表中の各洗浄率の値は５枚の平均値で示した。

（４）洗剤組成 ４Ａ型ゼオライト ケイ酸ソーダ 炭酸ソーダ ポリアクリル酸ソーダ（ＭＷ＝８０００）ポリエチレン
グリコール（ＭＷ＝６０００）螢光染料 芒硝 水 ０．５ 残量 第７表中の酵素活性は、第５表における酵素活性測定法
により測定した。

第８表 （５）洗浄力試験結果 試験結果を第７表及び第８表に示す。

第７表 （注〉アルカリプルラナーゼは製造例１で得ら第８表中
の酵素活性は、第６表における酵素活性測定法により測
定した。

〔発明の効果〕

以上のように、本発明の洗浄剤組成物は、通常の洗浄時
間内において、澱粉質汚れに対する優れた洗浄力を有す
るものである。

【図面の簡単な説明】

第１図は、α−アミラーゼ活性を有するアルカリプルラ
ナーゼを用いてプルラン、アミロペクチン、アミロース
、グリコーゲンを基質として酵素反応を行ったときの、
マルトオリゴ糖の生成を示すペーパークロマトグラフィ
ーである。 第２図（ａ）及び（ロ）は、α−アミラーゼ活性を有す
るアルカリプルラナーゼの反応ｐＨと相対活性との関係
を示す図面である。 第３図（ａ）及び（ロ）は、α−アミラーゼ活性を有す
るアルカリプルラナーゼの処理ｐＨと残存活性との関係
を示す図面である。 第４図（ａ）及び（ロ）は、α−アミラーゼ活性を有す
るアルカリプルラナーゼの反応温度（ｐＨ９，５）と相
対活性との関係を示す図面である。 第５図（ａ）及び（ロ）は、α−アミラーゼ活性を有す
るアルカリプルラナーゼの処理温度（ｐＨ９，５）と残
存活性との関係を示す図面である。 第６図は、α−アミラーゼ活性を有するアルカリプルラ
ナーゼをデービスの方法に従って電気泳動を行った結果
を示す図面である。 第７図は、α−アミラーゼ活性を有するアルカリプルラ
ナーゼのＳＯ３電気泳動の結果を示す図面である。 以上

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）α−アミラーゼ活性を有するアルカリ又はアルカ
   リ耐性プルラナーゼを含有することを特徴とする洗浄剤
   組成物。
2. （２）アルカリプルラナーゼが、プルランに対する最適
   作用ｐＨが８．５〜１０の範囲であり、可溶性澱粉に対
   する最適作用ｐＨが７〜９．５の範囲であるものである
   請求項１記載の洗浄剤組成物。
3. （３）アルカリプルラナーゼが、次の酵素学的性質を有
   するものである請求項２記載の洗浄剤組成物。 １）作用 プルラン及び可溶性澱粉に作用し、プルランからは主と
   してマルトトリオース、可溶性澱粉からは主としてマル
   トテトラオース及びマルトペンタオースを生成する。ま
   た、グリコーゲンにも作用し、マルトテトラオース及び
   マルトペンタオースを生成する。 ２）基質特異性 プルラン、可溶性澱粉及びグリコーゲンに作用する。 ３）作用ｐＨ及び最適作用ｐＨ プルランに対する作用ｐＨは５〜１２の範囲であり、最
   適作用ｐＨは８．５〜１０の範囲である。 また、可溶性澱粉に対する作用ｐＨは４〜１２の範囲で
   あり、最適作用ｐＨは７〜９．５の範囲である。 ４）ｐＨ安定性 プルランに対してはｐＨ６〜１０．５の範囲で安定であ
   り、可溶性澱粉に対してはｐＨ４〜１２の範囲で安定で
   ある（４５℃、１０分間処理による）。 ５）作用温度範囲及び最適作用温度 プルラン及び可溶性澱粉に対して１０〜６５℃の範囲で
   作用し、その最適作用温度は約５０℃である。 ６）温度安定性 ４５℃までは極めて安定である。（ｐＨ９．５の１０ｍ
   Ｍグリシン−食塩−水酸化ナトリウム緩衝液中、３０分
   間処理による）。 ７）分子量 ソディウムドデシル硫酸（ＳＤＳ）電気泳動法による分
   子量は２００，０００±５，０００である。 ８）金属イオンの影響 プルラナーゼ活性はＨｇ＾２＾＋、Ｍｎ＾２＾＋、Ｐｂ
   ＾２＾＋で阻害される。また、α−アミラーゼ活性はＨ
   ｇ＾２＾＋、Ｍｎ＾２＾＋、Ｐｂ＾２＾＋、Ｚｎ＾２＾
   ＋、Ｃｄ＾２＾＋で阻害される。
4. （４）アルカリ又はアルカリ耐性プルラナーゼが、バチ
   ルス属に属する微生物の培養物より分離取得されたもの
   である請求項１〜３のいずれかに記載の洗浄剤組成物。
5. （５）微生物が、バチルスエスピー（￥Ｂａｃｉｌｌｕ
   ｓ￥ｓｐ．）ＫＳＭ−ＡＰ１３７８と命名され、微工研
   菌寄第１０８８６号として寄託されたものである請求項
   ４記載の洗浄剤組成物。