JPH03120226A - 腫瘍障害細胞誘導剤および腫瘍障害細胞誘導デバイス - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野］ 本発明は体液中の白血球を刺激して腫瘍障害細胞を誘導
するための腫瘍障害細胞誘導剤、これを用いた腫瘍障害
細胞誘導の方法、および腫瘍障害細胞誘導デバイスに関
する。

［従来の技術］ 白血球分画中には細胞障害性Ｔリンパ球、ナチュラルキ
ラー細胞、単球など腫瘍細胞などを障害、排除する機能
を持つ細胞が存在することが知られている。これらの細
胞群は健常人のみならず担癌患者体内にも存在するにも
かかわらず担癌患者の腫瘍は増殖し、症状が悪化するの
が現状である。その原因としては免疫寛容、免疫抑制細
胞の活性化、液性免疫因子バランスの免疫抑制側へのシ
フトなどの理由による、腫瘍障害細胞数および活性低下
のためと考えられている。

悪性腫瘍の治療法の一つとして、白血球を刺激して腫瘍
障害細胞をうることが考えられるが、生体内で効率的か
つ選択的に白血球を刺激して腫瘍障害細胞誘導をするこ
とはきわめて困難である。したがって、患者体内からリ
ンパ球を取り出し、生体外で人為的に環境を整えて数日
間刺激培養して腫瘍障害細胞誘導をし、これを再び患者
体内に戻すことによって腫瘍を治療する方法が種々試み
られている。これに用いる刺激剤としてはインターロイ
キン２などのリンフ才力イン（ＬＡに療法：イー・ニー
φグリム、ジャーナル　オブ　エクスペリメンタル　メ
ディシン、　１５５巻、１８２３頁（１９８２年）　（
Ｅ、　Ａ、　Ｇｒｉｓｖ。

Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｗｅｄ、、　１５５　、１８２３（１
９８２））など）、ＰＨＡ　、　ＰｗＭなどのレクチン
およびプロティンＡなどが知られている。

癌治療を目的として生体外でリンパ球を刺激培養するこ
とにより腫瘍障害細胞誘導をする試みは現在活発に研究
されているが、■腫瘍障害細胞誘導に用いる刺激剤の毒
性が高く、混入したばあいの危険性が大きい、■数日間
の培養による細胞の形態変化、異形化、■培養に伴う煩
雑な操作、および汚染などの問題がある。

これらの課題のうち■を解決するためには毒性の低い刺
激剤を用いてこれを不溶性担体に固定化し、その混入を
防ぐことが考えられる。毒性の低い刺激剤として白血球
に対する抗体が一部実験室的に検討されている。しかし
ながら−般に毒性の低い物質は腫瘍障害細胞誘導効果が
小さいことが知られており、白血球抗体による腫瘍障害
細胞誘導効果も大きいものではなく抗原特異的な腫瘍障
害細胞を抗原非特異的な腫瘍障害細胞に誘導した報告が
ある（ジェー・エフ・エム　リューベンベルク、ジャー
ナル　オブイムノロジー、１３４巻（８号）　、　３７
７０頁（１９８５年）（Ｊ、　　Ｐ、　　Ｍ、　　Ｌｅ
ｏｕｖｅｍｂｅｒｇ、　　Ｊ、　　ｌｍ５ｕｎｏ１．．
１３４（６）　、３７７０（１９８５））のみである。

さらに刺激剤を固定することによりその誘導活性が低下
することが多く、白血球抗体を固定しても大きな腫瘍障
害細胞誘導効果は期待できなかった。

また■、■の課題を解決するためには培養期間の短縮あ
るいは培養そのものを省略する必要があるが、いずれに
せよ白血球を強く刺激することが必須となる。強い腫瘍
障害細胞誘導活性を有する刺激剤は前述のごとく一般に
毒性が高く、たとえ不溶性担体に固定して用いたとして
も刺激剤の漏出を完全に防ぐことはきわめて困難であり
、安全性の面から実用化はほぼ不可能である。

以上述べたごとく高い腫瘍障害細胞誘導活性と安全性と
を兼ね備えた腫瘍障害細胞誘導剤を開発することは、２
つの矛盾する特性を同時に満たす必要があり、きわめて
むずかしく、事実これまでそのような誘導剤は実現して
いない。

［発明が解決しようとする課８］ そこで、本発明者らは癌治療を目的として安全かつ効果
の高い腫瘍障害細胞誘導剤をうるため、鋭意研究を重ね
た結果、抗白血球抗体またはその一部を固相に固定化す
ることによって未固定の抗体からは予想できない高い活
性の腫瘍障害細胞が誘導されることを見いだし、従来知
られている腫瘍障害細胞をうるためのいかなる刺激剤よ
りも安全で、かつ強いキラー活性を持つ腫瘍障害細胞を
うろことができる腫瘍障害細胞誘導剤を完成するにいた
った。

［Ｒ題を解決するための手段］ すなわち、本発明は■抗白血球抗体またはその一部分を
水不溶性担体に固定化してなる腫瘍障害細胞誘導剤、■
抗白血球抗体またはその一部分が水不溶性担体に固定化
されたＩＩ瘍障害細胞誘導剤を白血球を含む体液と接触
させることを特徴とする腫瘍障害細胞誘導方法、■液の
入口、出口を有し、かつ腫瘍障害細胞誘導剤の容器外へ
の流出防止手段を備えた容器内に、杭内血球抗体または
その一部分が水不溶性担体に固定化されてなる腫瘍障害
細胞誘導剤を充填してなる腫瘍障害細胞誘導デバイスに
関する。

［作用および実施例］ （体　液） 本発明において体液とは血液、血漿、血清、腹水、リン
パ液、関節内液およびこれらからえられた分画成分、な
らびにその他の生体由来の液性成分をいう。

（杭内血球抗体） 本発明において杭内血球抗体とは白血球を抗原として作
成した抗体を意味する。白血球にはリンパ球、単球、好
中球、好塩基球、好酸球などが含まれるが、杭内血球抗
体の中でも抗リンパ球抗体が望ましい。リンパ球表面に
は多数の表面抗原が存在している。それらの表面抗原は
国際ワークショップでＣＤココ−ド（クラスターディフ
ァレンシエーション）゛で呼ぶことに決定したがそれら
表面抗原の中でＣＤ２　、ＣＤ３　、ＣＤ４、ＣＤ８　
、ＣＤ１Ｂに対する抗体がとくに望ましい。それら杭内
血球抗体から固定化する抗体を選択する際、単一種類の
抗体を選ぶばあいと複数種類の抗体を選ぶばあいが考え
られるがいずれでもよい。単一種類の抗体を選択するば
あい、ＣＤ２、ＣＤ３　、ＣＤ１Ｂがとくに好ましいが
これに限定されるものではない。また、複数種類の抗体
を選択するばあい、多数の組合せが考えられるが、それ
らの中でもＣＤ２、ＣＤ３　、ＣＤ１Ｂを含む組合せの
ものがとくに好ましい。

抗体の種類にはＩｇＧ　ＳＩｇＭ　、ＩｇＡ　、、Ｉｇ
Ｄ　。

ＩｇＥがあるがいずれでもよい。また、抗体の由来には
マウス、ラット、ラビット、ヤギなど各種動物のものと
ヒト由来のものがあるが抗原性をはじめとする安全性の
面から考えてヒト由来のものが好ましいがとくに限定さ
れるものではない。抗体の一部分とは抗体の断片または
その断片同志を共有結合で結合し抗体より低分子量化し
たものを意味し、酵素または化学試薬によって切断して
うる方法、遺伝子工学的にうる方法などがある。

（水不溶性担体） 本発明における水不溶性担体とは常温常圧で固体であり
水不溶性であることを意味する。該水不溶性担体は杭内
血球抗体またはその一部と結合するため、に該担体表面
に少なくとも１種類以上の官能基を有することが望まし
い。具体例としてはたとえば、ガラスピーズ、シリカゲ
ルなどの無機担体、架橋ポリビニルアルコール、架橋ポ
リアクリレート、架橋ポリアクリルアミド、架橋ポリス
チレンなどの合成高分子や結晶性セルロース、架橋セル
ロース、架橋アガロース、架橋デキストリンなどの多糖
類からなる有機担体、さらにはこれらの組合せによって
えられる有機−有機、有機−無機などの複合担体などが
あげられる。また、担体表面に有する官能基の具体例と
しては水酸基、アミノ基、アルデヒド基、カルボキシル
基、チオール基、シラノール基、アミド基、エポキシ基
、ハロゲン基、サクシニルイミド基、酸無水物基などが
あげられるがこれらに限定されるものではない。また、
水不溶性担体は、非特異的な疎水性相互作用で、腫瘍障
害細胞誘導剤表面に細胞が付着することによる腫瘍障害
細胞の劣化を防ぐために親水性であることが好ましい。

（固定方法） 本発明の腫瘍障害細胞誘導剤は、杭内血球抗体またはそ
の一部分を水不溶性担体に固定化したことを特徴とする
ものをいう。そのような腫瘍障害細胞誘導剤をうるため
の固定化方法は共有結合、疎水結合、イオン結合など様
々な方法があるがいかなる方法でもよい。それらの中で
も滅菌時あるいは治療時の安全性を考えると共有結合で
固定化されていることがとくに望ましい。

抗体を水不溶性担体に共有結合で固定化する方法は種々
あるがいずれの共有結合でもよい。

抗体分子のもつ官能基をそのまま利用するばあいはエス
テル（チオエステルを含む）結合、アミド（スルホン酸
アミドを含む）結合、二一テル（チオエーテルを含む）
結合、アミノ結合、イミド結合などで結合することがで
きるがこれらに限定されるものではない。また、抗体分
子の官能基に、より反応性の高い官能基を導入してから
水不溶性担体と結合する方法もある。反応性の高い官能
基は様々あるがＤＳＣ、ｗｓｃなどはとくに有効な官能
基導入試薬である。

（抗白血球抗体の固定Ｉｋ） 本発明における腫瘍障害細胞誘導剤は抗白血球抗体を適
量有していることが望ましい。少なすぎると抗白血球抗
体の効果がなく、多すぎると非特異吸着、細胞障害がお
こる。すなわち抗白血球抗体を腫瘍障害細胞誘導剤表面
に１×ｔｏ−９ｕ　ｍｏｌｌｃ−以上Ｉ　Ｘ　１Ｏ−２
１ｔ　ｍｏｌｌｃ−以下固定化されていることが好まし
く、とりわけ腫瘍障害細胞誘導剤表面に５Ｘ１０４μ自
ｏｆ／ｃ−以上５×ｌＯ゛４μ＋ｉｏｌ／ｃ−以下固定
化されていることがより好ましい。

（ａ癌細胞誘導剤） 本発明における腫瘍障害細胞誘導剤は前記抗白血球抗体
またはその一部分を、前記水不溶性担体に固定化したも
のであって、その形状には粒状、板状、膜状、繊維状な
どがあるが形状は問わない。腫瘍障害細胞誘導剤をカラ
ムに充填して使用するばあいは、体液に含まれる細胞が
十分に通過しうる間隙をつくれるものが好ましい。たと
えば腫瘍障害細胞誘導剤が粒状であるばあい、微粉末の
ようなものは好ましくなく２Ｏ０Ａｌ１１１以上の粒径
のものが好ましい。さらに詳しくは粒子の大きさが小さ
すぎるものと大きすぎるものが除去された状態での使用
が好ましく、粒径の平均が２Ｏ０燗以上１０００ＪＪ１
１以下でかつ粒径分布が狭い方がより好ましい。また、
腫瘍障害細胞誘導剤が繊維状でかつ中空であるばあい、
内径が５廓以上が好ましく、中空ではない繊維状である
ばあいは外径が１β以上であることが好ましい。腫瘍障
害細胞誘導剤の表面は滑らかな方がよく、表面が粗であ
ると非特異吸着が増加し選択的活性化が低下するため好
ましくない。

このように抗白血球抗体またはその一部分を固体に固定
化することによってえられた腫瘍障害細胞誘導剤は可溶
性の抗体からは予想できない白血球活性化の効果が引き
出された。

（Ｉｌｉ瘍障害細胞の誘導） 本発明において腫瘍障害細胞とは白血球から誘導された
、腫瘍細胞に対して障害機能をもつ細胞を意味する。

一般に細胞を刺激し、ある機能を誘導するばあい細胞の
活性化という言葉が用いられるが、活性化には多くの種
類がある。代表的な活性化（およびその測定法）を以下
に例示する。■通常より増殖が促進する（　３Ｈ−Ｔｄ
Ｒ取り込み量、ＭＴＴ法、グルコース消費Ｑ）■ＩＬ−
２産生量が増加する（ＩＬ−２依存性細胞による測定法
）■ＩＬ−２レセプターの発現量（抗ＩＬ−２レセプタ
ー抗体による標識抗体法）■キラー活性（他の細胞に対
する細胞障害能力を測定）。

本発明における腫瘍障害細胞誘導とは前記分類の■キラ
ー活性に関する活性化を意味するものである。

（Ｍｌ瘍障害細胞誘導方法） 本発明による腫瘍障害細胞誘導剤を用いて体液中の白血
球を腫瘍障害細胞に誘導する方法には種々の方法がある
。代表的な方法としては、体液を取り出してバッグなど
に貯留し、これに腫瘍障害細胞誘導剤を混合して腫瘍障
害細胞誘導をしたのち、腫瘍障害細胞誘導剤を濾別して
腫瘍障害細胞を含む体液をえる方法、体液の入口と出口
を有し、出口に体液は通過するが腫瘍障害細胞誘導剤は
通過しないフィルターを装着した容器に腫瘍障害細胞誘
導剤を充填し、これに体液を流す方法（カラム法）など
がある。いずれの方法を用いてもよいが後者の方法は操
作も簡単であり、また体外循環回路に組み込むことによ
り患者の体液、とくに血液中の白血球から腫瘍障害細胞
をうろことが可能である。本発明の腫瘍障害細胞誘導剤
はこの方法に適している。

腫瘍障害細胞誘導剤をカラムに充填し、体外循環回路に
組み込みオンラインで腫瘍障害細胞誘導を行なうという
方法は、多量の体液を短時間に処理することができると
いう点で好ましい。

つぎに、前記腫瘍障害細胞誘導剤を用いた本発明の腫瘍
障害細胞誘導デバイスを、その一実施例の概略断面図で
ある第１図に基づき、説明する。

第１図中、（１）は体液の流入口、（′２Ｊは体液の流
出口、（３）は本発明の腫瘍障害細胞誘導剤、［４）お
よび（５）は体液および体液に含まれる成分は通過でき
るが前記腫瘍障害細胞誘導剤は通過できないフィルター
、（６）はカラム、（力は容器である。

前記容器の形状、材質にとくに限定はないが、好ましい
具体例としては、たとえば容ｆｆｉ　１５０〜４００　
ｍｌ程度、直径４〜１０ｃｍ程度の筒状容器があげられ
る。

以下実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本
発明は以下の実施例のみに限定されるものではない。

実施例１では水不溶性担体に白血球抗体を固定化した腫
瘍障害細胞誘導剤に白血球浮遊液をカラム法にて接触さ
せて腫瘍障害細胞がどの程度誘導できたかをキラー活性
の測定によって評価した。キラー活性の測定結果に示し
たように腫瘍障害細胞の誘導操作を行なわなかった白血
球（コントロール）に比べて高いキラー活性カ誘導され
た。

また、杭内血球抗体が固定化されたことによる効果を明
らかにするため、可溶性の状態（未固定の抗体）で培地
に投与し２４時間刺激したばあい（比較例１）、同一の
培養容器（９６穴マイクロプレート）に同一の抗体を固
定化し２０時間刺激（さらに４時間培養）したばあい（
実施例２）、抗体を培養容器に固定化し刺激時間を大幅
に短縮（１０分間刺激し、さらに２４時間培養）したば
あい（実施例３）についての実験結果をそれぞれ示した
。これらのキラー活性の測定結果かられかるように未固
定の抗体ではキラー活性の誘導はわずかであるが固定化
することにより刺激時間を充分短くしてもキラー活性は
高く、すなわち腫瘍障害細胞誘導をする効果が高がった
。このことは生体外で長時間刺激培養することによる細
胞の形態変化、異形化を防げることを示唆するものであ
る。

さらに他の刺激剤としてレクチン（ＰＷＭ）を固定化し
て上記同様に腫瘍障害細胞誘導を試みたところ、２０時
間刺激（参考例１）に比べ１０分間刺激の腫瘍障害細胞
誘導効果（参考例２）はかなり減少した。一方、前述の
ように杭内血球抗体を固定化したばあいは刺激時間を短
縮してもその効果（キラー活性）はかなり保持された（
実施例３）。

実施例１ （腫瘍障害細胞誘導剤の作成） ＣＮＢｒ活性化セファローズ６　ＭＢ　（ファルマシア
（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）社製）４ｇを１　ｍＭ　ｔｌｃ
Ｉｌ水溶液少量で１５分間膨潤させ、１　ｍＭ　ＨＣ＃
水溶液（８００ｍｌ）で洗浄し、さらにカップリングバ
ッファー（０，５ＭＮａ（Ｊ、　　Ｏ，１Ｍ　ＮａＨＣ
Ｏ３、ｐＨ８，３，２０ｍ１）で洗浄した。

カップリングバッファーに抗体（ＯＫＴ３：オーソダイ
グノステイクシステム（Ｏｒｔｈｏ　Ｄ１ａｇｎｏｓｔ
ｉｃＳｙｓｌｅ＋１）社製’）　２５ｔｔｇ／ｒｎｌを
溶解した溶液に洗浄したゲルをサックドライで添加し、
４℃で終夜反応させた。

カップリングバッファーで洗浄後、ブロックバフ　７７
　　（０，２Ｍグリシン、　０．５Ｍ　ＮａＣｌ　、　
　０．ＩＭ　ＮａＨＣＯ３、（ｐＨ８，３）、１６ｍ１
）を添加し室温で２時間反応させた。

２種の後処理バッフｙ　−（０，５Ｍ　ＮａＣ１！、Ｏ
，１ＭＡｃＮａ　ｐＨ４，ｏ、０．５Ｍ　ＮａＣｌ、　
　０．１Ｍ　Ｔｒｉｓ、　ｐＨ８，０）で交互に３回づ
つ洗浄し杭内血球抗体７ＸＩＯ−８μｓａｒ／ｃ−を担
体にもつ腫瘍障害細胞誘導剤をえた。

（白血球浮遊液の調製） Ｆｌｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ　（フィコール−バク　−フ
ァルマシア社製）の上層にヘパリン化末梢血を重層し、
比重遠心法により白血球を分離し、等張液で充分に洗浄
した白血球分画を４　ｘ　１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃
度にｐＨ１７，２０等張液で調製した。

（誘導操作） 腫瘍障害細胞誘導剤０　、６　ｍｌを塩化ビニールチュ
ーブ（φ３１ＤＸ　８５關）に生理食塩液（日本薬局方
、大塚製薬株式会社製）で充填し、両端はメッシユ（血
小板粘着能測定管、医学書院器械株式会社製）で押えた
。白血球浮遊液を通液する前に白血球浮遊液と同じ緩衝
液を用いてリンスを行なった。

白血球浮遊液の通液は流速０．１ｍｌ／ｓｉｎ　ｓ　２
５℃で行なった。

（誘導効果測定方法） （１）グルコース消費量の測定 刺激後、白血球浮遊液の濃度を４Ｘ１０６ｃａｌｌｓ／
ｍｌに調製したサンプルおよび未刺激の白血球浮遊液を
同濃度に調製したコントロールに関して（炭酸ガス培養
器にてＰＯ２１０％ＲＰ旧１６４０培地にて２４時間）
培養前後の培地中のグルコース濃度を測定（グルコース
Ｂテストワコー：和光純薬工業■製）しグルコース消費
量を算出した。

（２）キラー活性の測定 刺激後、白血球浮遊液の濃度を４　Ｘ　１０６ｃｅｌｌ
ｓ／ｍｌに調製したサンプルおよび未刺激の白血球浮遊
液を同濃度に調製したコントロールに関して（炭酸ガス
培養機にてＲＰＭｌ　１６４０培地にて２４時間）培養
後のＩＩｅＬａＳ　３細胞に関するキラー活性を５１Ｃ
ｒリリース法により測定した。

（測定結果） グルコース消費量　　　　　　１０．２±　２．４％（
コントロール）５．７±　３．８％ キラー活性（対ＨｅＬａ５３）　　　　４８．７±２．
８％（コントロール）８．７±　４．０％ 実施例２ （腫瘍障害細胞誘導剤の作成） ９Ｂ穴平底マイクロプレートに抗体溶液（０ＫＴ３．２
５ｕｇ１ｍ１．２０ｕｌ　）を分注し、４℃で２４時間
静置し、無血清培地（ＲＰＭｌ　１８４０）で洗浄（２
００ｕｇで２回）することによって抗体を固定化した。

固定化量をＥＬＩＳＡ法で測定したところ０．３８　ｕ
　ｇ／ｗｅｌｌ　（（ｉ、３Ｘ　ｔｏ−８ｕ　ｍｏｌ／
ｃｊ）であった。

（白血球浮遊液の調製） 実施例１と同様に調製した。

（誘導操作） 腫瘍障害細胞誘導剤に白血球浮遊液を２００ｕ　Ｉ　／
ｗｅｌｌ（１１Ｘ　１０’　ｃｅｌｌｓ／ｍｌ　）分注
し、２０時間刺激培養後、抗体未固定のマイクロプレー
トに移してさらに４時間培養した。

（誘導効果ｎ１定方法） （１）グルコース消費量の測定 実施例１に同じ。

（２）キラー活性の測定 実施例１に同じ。

（測定結果） グルコース消費量　　　　　　２２．５±４．５％（コ
ントロール）７．９±　６．２％ キラー活性（対ＨｅＬａ５３）　　　　６１．６±３．
５％（コントロール）　２０．５±　０．３％実施例３ ＣＷｉ瘍障害細胞誘導剤の作成） 実施例２と同様に調製した。

（白血球浮遊液の調製） 実施例１と同様に調製した。

（誘導操作） 腫瘍障害細胞誘導剤に白血球浮遊液を２００μｆｌ　／
ｗｅｌｌ（８Ｘ　１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）分注し、１
０分間刺激後、抗体未固定のマイクロプレートに移して
２４時間培養した。

（誘導効果測定方法） （１）グルコース消費量の測定 実施例１に同じ。

（２）キラー活性の測定 実施例１に同じ。

（測定結果） グルコース消費量　　　　　　　３．２±　２．１％（
コントロール）７．９±　６６２％ キラー活性（対ＨｅＬａ５３）　　　　５１．２±２．
２％（コントロール）　２０．５±　０．３％実施例４ （Ｐ（ａｂ’）２（抗体の一部分）の調製）常法にした
がって抗体（ＩｇＧ）をＦ（ａｂｏ）ｚに切断した。す
なわち、抗体（ＯＫＴ３：オーソダイグノスティクシス
テム（Ｏｒｔｈｏ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ　５ｙｓｔｅ
ｔｘｓＩｎｃ、）社製）２５μｇ／ｍｌ、２ｍｌを０，
１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐｉｔ　４．５）に透析し
、１．０ｇｇのペプシン（東洋紡社製）を加えて８時間
３７℃に保温しＩＮ水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ８，
０に調整した。反応溶液を０．１Ｍホウ酸ナナトリウム
緩衝液ｐＨｇ、ｏ）を展開溶液として用いてセファデッ
クスＧ１５０　（ファルマシア社製）カラム（０，５Ｘ
　１５μｍ　）にかけてＰ（ａｂ’）ｚ画分を分取し、
０，１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８，０）に対し
て透析した。

（腫瘍障害細胞誘導剤の作成） ＣＮＢｒ活性化セファロース６　ＭＢ　（ファルマシア
社製）４ｇを１　ｍＭＨＣＩ！水溶液少量で１５分間膨
潤サセ、１　ｍＭ　ＨＣＩ水溶液（ＨＯｍｌ）　テ洗浄
し、さらにカップリングバッフｙ　−（０，５Ｍ　Ｎａ
Ｃｌ！　Ｏ，ＬＭＮａｌｌＣＯｓ　ｐＨ８，３，２０ｍ
１　）で洗浄した。

カップリングバッファーにさきに調製したＦ（ａｂｏ）
２を溶解した溶液に洗浄したゲルをサックドライで添加
し、４℃で終夜反応させた。

カップリングバッファーで洗浄後、ブロックバッフｙ−
（０，２Ｍグリシン０．５Ｍ　ＮａＣＩ）　Ｏ，１ＭＮ
ａＨＣＯ３（ｐＨ８，３）、１６ｍ１）を添加し室温で
２時間反応させた。

２８の後処理バッファ　−（０，５Ｍ　ＮａＣｌ　０．
１ＭＡｃＮａ　ｐＨ４，０，０，５Ｍ　Ｎａ（Ｊ　Ｏ，
ＩＭ　Ｔｒｌｓ　ｐＨ８，０）で交互に３回づつ洗浄し
た。抗白血球抗体の一部分であるＰ（ａｂ’）ｚ　５　
ｘ　１０−’　ｔｔ　ｍｏｌ／ｃ−を担体にもつ腫瘍障
害細胞誘導剤をえた。

（白血球浮遊液の調製） 実施例１と同様に調製した。

（誘導操作） 腫瘍障害細胞誘導剤に白血球浮遊液を２００ｕ　１　／
ｗｅｌｌ（８Ｘ　ｔｏ５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ　）分注し、
１ｏ分間刺激後、抗体未固定のマイクロプレートに移し
て２４時間培養した。

（誘導効果測定方法） （１）グルコース消費量の測定 実施例１に同じ。

（２）キラー活性の測定 実施例１に同じ。

（測定結果） グルコース消費量　　　　　　　５．５±　１．７％（
コントロール）７．９±　８．２％ キラー活性（対ＨｅＬａ５３）　　　　５９．２±４．
５％（コントロール）　２０．５±　０．３％実施例５ （腫瘍障害細胞誘導剤の作成） ＣＮＢｒ活性化セファローズ６　ＭＢ　（ファルマシア
社製）４ｇを１　ａ＋Ｍ　ＨＣＩ！水溶液少量で１５分
間膨潤させ、１　ｍＭ　ＨＣＩ水溶液（ＨＯｍｌ）で洗
浄し、さらにカップリングバッフｙ　−（０，５Ｍ　Ｎ
ａＣｌ１　、　０．ＩＭＮ　ａ　ＩＩ　Ｃ０３、ｐｏｇ
、ａ、２０ｍ１）で洗浄した。

カップリングバッファーにＯＫＴ　３を２５μｇ／ｍｌ
、ＯＸＴ　４を１５μｇ／ｍｌを溶解した溶液に洗浄し
たゲルをサックドライで添加し、４℃で終夜反応させた
。

カップリングバッファーで洗浄後、ブロックバッフｙ−
（０，２Ｍグリシン、　０．５Ｍ　ＮａＣｌ！。

０、ＩＭ　ＮａＨＣＯＪ、　（ｐＪＩ　８．３＞、ＩＢ
ｍｌ）を添加し室温で２時間反応させた。

２種の後処理バッフｙ　−（０，５Ｍ　ＮａＣｌ　、　
　Ｑ、ＩＭＡｃＮａ　ｐＨ４，０、Ｑ、５Ｍ　ＮａＣｌ
、　　０．ＩＭ　Ｔｒｉｓ　ｐＨ８，０）で交互に３回
づつ洗浄した。

かくして抗白血球抗体１２Ｘ１０’μ謹ｏｆ／ｃシをも
つ腫瘍障害細胞誘導剤をえた。

（白血球浮遊液の調製） Ｆｉｅｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ　（ファルマシア社製）の上
層にヘパリン化末梢血を重層し、比重遠心法により白血
球を分離し、等張液で十分に洗浄した白血球分画を４　
Ｘ　１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度にｐＨ７，２０等張
液で調製した。

（誘導操作） 腫瘍障害細胞誘導剤０．６ｍｌを塩化ビニールチューブ
（φ３１１１ｘ　８５ｍｍ）に生理食塩液（日本薬局方
、大塚製薬株式会社製）で充填し、両端はメツシュ（血
小板粘着能測定管、医学書院器械株式会社製）で押えた
。白血球浮遊液を通液する前に白血球浮遊液と同じ緩衝
液を用いてリンスを行なった。

白血球浮遊液の通液は流速０．１ｍｌ／ｗｉｎ　ｓ　２
５℃で行なった。

（誘導効果測定方法） （１）グルコース消費量の測定 刺激後、白血球浮遊液の濃度を４Ｘ１０８ｃｅｌｌｓ／
ｍｌに調製したサンプルおよび未刺激の白血球浮遊液を
同濃度に調製したコントロールに関して（炭酸ガス培養
機にてｐｃｓ　ｔｏ％ＲＰ旧ｌＢ４Ｏ培地にて２４時間
）培養前後の培地中のグルコース濃度を測定（グルコー
スＢテストワコー二和光純薬）しグルコース消費量を算
出した。

（２キラー活性の測定 刺激後、白血球浮遊液の濃度を４Ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／
ｍｌに調製したサンプルおよび未刺激の白血球浮遊液を
同濃度に調製したコントロールに関して（炭酸ガス培養
機にてＲＰＭＩ　１８４０培地にて２４時間）培養後の
ＩＩｅＬａＳ　３細胞に関するキラー活性を５１Ｃｒリ
リース法により測定した。

（測定結果） グルコース消費量　　　　　　　６．２±　３．２％（
コントロール）５．７±　３．８％ キラー活性（対１１ｅＬａＳ３）　　　　５８．７±４
．２％（コントロール）３．７±　４．０％ 固定化されていない抗体と固定化された抗体による白血
球のキラー活性の違いを示すために固定化されていない
抗体とともに培養したばあいの白血球のキラー活性の実
験結果を以下に示した。

比較例１ （抗体溶液の調整） 抗体溶液（ＯＫＴ　３．２５μｇ／ｍｌ）を調製した。

（白血球浮遊液の調製） 実施例１と同様に調製した。

（誘導操作） ９６穴平底マイクロプレートに調製した抗体溶液２Ｄｔ
ｌｌ　　（抗体総量　Ｏ，５μｇ／ｗｅｌｌ）および白
血球浮遊液を２００μｊ！　／ｗｅｌｌ（８Ｘ　１０５
ｃｅｌｌｓ／ｍｌ　）分注し、２４時間培養した。

（誘導効果測定方法） （１）グルコース消費量の測定 実施例１に同じ。

（２）キラー活性の測定 実施例１に同じ。

（測定結果） グルコース消費量　　　　　　２０．２±２．５％（コ
ントロール）７．９±　８．２％ キラー活性（対ＨｅＬａ５３）　　　　２３．６±４．
１％（コントロール）　１０．７±　３．３％参考例１ （Ｈ瘍障害細胞誘導剤の作成） ９Ｂ穴平底マイクロプレートにレクチン溶液（ＰＷＭ　
、　２５μｇ／ｍｌ、２０μ、Ｑ）を分注し、４℃で２
４時間静置し、無血清培地（ＲＰＭｌ　１８４０）で洗
浄（２００ｕｇで２回）した。

（白血球浮遊液の調製） 実施例１と同様に調製した。

（誘導操作） 腫瘍障害細胞誘導剤に白血球浮遊液を２００ｕ　ｆｌ　
／ｗｅｌｌ（８Ｘ　１０’　ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）分注し
、２０時間刺激後、抗体未固定のマイクロプレートに移
して２４時間培養した。

（誘導効果測定方法） （１）グルコース消費量の測定 実施例１に同じ。

（２）キラー活性の測定 実施例１に同じ。

（ｉＪＩ定結果） グルコース消費量　　　　　　　９．８±０．６％（コ
ントロール）７．９±　８．２％ キラー活性（対ＨｅＬａ５（）　　　　５５．１±５．
８％（コントロール）　２０．５±　０，３％参考例２ （腫瘍障害細胞誘導剤の作成） 参考例１と同様に調製した。

（白血球浮遊液の調製） 実施例１と同様に調製した。

（誘導操作） 腫瘍障害細胞誘導剤に白血球浮遊液を２００μｆｌ　／
ｗｅｌｌ（８Ｘ　１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ　）分注し、
ｌＯ分間刺激後、抗体未固定のマイクロプレートに移し
て２４時間培養した。

（誘導効果測定方法） （１）グルコース消費量の測定 実施例１に同じ。

（２）キラー活性の測定 実施例１に同じ。

（測定結果） グルコース消費量　　　　　　　５．４±　１．０％（
コントロール）７．９±　６．２％ キラー活性（対ＨｅＬａ５３）　　　　３２．６±１．
８％（コントロール）　２０．５±　０．３％［発明の
効果コ 以上の結果（実施例および比較例）から明らかなように
抗白血球抗体を単に培地に加えただけではキラー活性の
誘導効果は僅かであるが、固定化することによってより
少ない抗体量でキラー活性誘導は予想できないくらい強
くなった。

さらに固定化した抗白血球抗体により腫瘍障害細胞誘導
をするばあい、きわめて短時間の刺激時間でも誘導を可
能にするものであった。また、すでに腫瘍障害細胞誘導
剤として知られているレクチン（ＰＷＭ）を抗白血球抗
体のばあいと同様に固定化して腫瘍障害細胞誘導を試み
参考例で示したが、抗白血球抗体を固定化して腫瘍障害
細胞誘導をしたばあいにくらべて誘導に要する刺激時間
、誘導されたキラー活性ともに劣っていた。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の腫瘍障害細胞誘導デバイスの一実施例
の概略断面図である。 （図面の主要符号） （１）二体液の流入口 （２）：体液の流出口 （３）：腫瘍障害細胞誘導剤 （４）、（５）二体液および体液に含まれる成分は通過
できるが前記腫瘍障害細胞誘 導剤は通過できないフィルター （６）二カラム （７）：容　器 牙１　図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　抗白血球抗体、またはその一部分を水不溶性担体に
   固定化してなる腫瘍障害細胞誘導剤。 ２　２種以上の抗白血球抗体、またはその一部分が水不
   溶性担体に固定されたことを特徴とする請求項１記載の
   腫瘍障害細胞誘導剤。 ３　１×１０＾−＾９μｍｏｌ／ｃｍ＾２以上、１×１
   ０＾−＾２μｍｏｌ／ｃｍ＾２以下の抗白血球抗体、ま
   たはその一部分が表面に固定化されたことを特徴とする
   請求項１記載の腫瘍障害細胞誘導剤。 ４　水不溶性担体が親水性であることを特徴とする請求
   項１記載の腫瘍障害細胞誘導剤。５　抗白血球抗体、ま
   たはその一部分が水不溶性担体に固定化されてなる腫瘍
   障害細胞誘導剤を、白血球を含む体液と接触させること
   を特徴とする腫瘍障害細胞誘導の方法。 ６　液の入口、出口を有し、かつ腫瘍障害細胞誘導剤の
   容器外への流出防止手段を備えた容器内に、抗白血球抗
   体、またはその一部分が水不溶性担体に固定化されてな
   る腫瘍障害細胞誘導剤を充填してなる腫瘍障害細胞誘導
   デバイス。