JPH03130075A - 細菌によるキチナーゼの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （１）産業上の利用分野 本発明は、キチナーゼの新規な製造法に関する。

（２）従来の技術 キチンは、セルロースに次ぐ豊富なバイオマス資源とし
て、その有効利用がはかられている。

例えば、その部分加水分解物であるキトオリゴ糖は、食
品分野においては、低う触性ないし非消化性甘味料、或
いはテクスチャー改良剤としての利用が考えられており
、医薬品分野では、細胞免疫強化作用や、ビフィダス因
子としての利用に期待が持たれている。

キトオリゴ糖は、通常キチンを濃塩酸で長時間処理する
ことにより、部分加水分解して製造されるが、反応後の
中和及び脱塩の、煩雑な工程が不可欠である。このため
、温和な条件で加水分解でき、工程が単純なキチナーゼ
の利用が古くから望られるが、細菌によるものとしては
、アエロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）属（Ｊ、　Ｇｅ
ｎ、　Ａｐｐｌ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　ｖｏｌ。

３２、　　Ｐ、２５（１９８６））や、セラチア（Ｓｅ
ｒｒａｔｉａ）属（Ｃａｎ。

Ｊ、　　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　　ｖｏｌ、１５．　　
Ｐ、６８９（１９６９））等の方法が知られているが、
次項に述べる欠点を有している。

また、クルチア属の生産するキチナーゼについては、ま
だ報告がない。

（３）発明が解決しようとする問題点 従来の方法によりキチナーゼ生産菌を利用して、効率よ
く生産しようとすると、酵素の生産能も不十分なうえに
、生産培地に誘導基質としてコロイダルキチン等の、前
処理を施したキチンを添加する必要があり、この調製に
多大の労力を要するため、キチナーゼ工業生産の一つの
隘路となっていた。

本発明者らは、広く自然界からキチナーゼ生産能を有す
る微生物を求めて検索した結果、クルチア（Ｋｕｒｔｈ
ｉａ）属の新規な一菌株が、誘導基質としてコロイダル
キチン等の、前処理したキチンを必要とせず、脱灰した
だけのキチン質により、菌体外に著量のキチナーゼを生
産することを見出し、本発明を完成するに至った。

ルチア属に属すキチナーゼ生産能の優れた菌株を使用す
るものであり、またその培地には誘導基質として、脱灰
しただけで、コロイド化してないキチン質を用いること
ができ、培地中に生産された当該キチナーゼを採取する
ことを特徴としている。

本発明に使用可能な微生物は、クルチア属に属しキチナ
ーゼ生産能を有する株であればよいが、好適な一例とし
て、本発明者らによって、鳥取県人形峠の土壌より分離
されたＫｕｒｔｈｉａ　ｓｐ、　　ＴＫ−２１８株があ
げられる。

Ｋｕｒｔｈｉａ　ｓｐ、　　ＴＫ−２１８株の、菌学的
性状は、次のとおりである。

■、形態学的性質 肉汁寒天上で生育した本菌株は、０．５〜０．７×２．
０〜３．０　　μの桿菌である。鞭毛により運動し、ダ
ラム染色は陽性である。胞子は形成しない。

■、培養的性質 本菌株は、通常の細菌用培地に２５〜４５℃、１〜コロ
ニーの色は白色で、コロニー表面は円滑である。水溶性
あるいは非水溶性色素は生産しない。

２〉コロイダルキチン寒天培地 ２〜３日のうちにコロイダルキチンを責化し。

コロニー周囲が透明となる。コロニー表面は円滑で、隆
起はほとんど認められない、コロニーの色は白色である
。

３）ニュートリアントゼラチン斜面培地羽毛状の生育を
示す。

■、生理学的性質 １）硝酸塩の還元　　　：陰　性 ２）硫化水素の生成　　：陰　性 ３）インドールの生成　：陰　性 ４）　Ｖ　−Ｐテスト　　　：陰　性 ５）　Ｏ−Ｆテスト　　　二酸化的 ６）メチルレッドテスト：陰　性 ７）カタラーゼ　　　　：陽　性 ８）フォスファターゼ　：陽　性 ９）デンプンの加水分解：陽　性 １０）糖の利用性 ■　次の糖から酸の生成は認められるが、ガスの発生は
しない。

グルコース、セロビオース、ラクトース。

ラフィノース、シュクロース。

サ　リ　シ　ン。

以上の性質から、本菌株はクルチア属の菌と考えられる
が、キチンの加水分解および澱粉の加水分解については
、ｒバーシーズ・マニュアル・オブ・システマティック
・バクテリオロン−１２巻（Ｂｅｒｇｙ’ｓ　Ｍａｎｕ
ａｌ　ｏｆ　Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　Ｂａｃｔｅｒｉ−
ｏｌｏｇｙ　ｖｏｌ、２　　（１９８６））　　に記載
された馬肉のどの種とも一致しないので、クルチア（Ｋ
ｕｒｔｈｉａ）　　ｓｐ。

ＴＫ−２１８と命名した（以下単にＴＫ−２１８株と略
す）。

なお本菌株は工業技術院微生物工業技術研究クルチア属
細菌は、他の細菌と同様、天然ないし人工の突然変異を
生じ易く、従って変異株であっても、ＴＫ−２１８株と
同様のキチナーゼを生産するクルチア属菌株は、すべて
本発明の方法に使用することができる。

■、培養 本発明に使用する菌株の培養には、通常の細菌の培養に
用いられる方法が可能であるが、炭素源としては、キチ
ン分解活性を誘導させるため、脱灰したカニ殻等のキチ
ン質を主体とし、これに必要に応じて他の炭素源を組み
合わせて使用するのが望ましい、また、窒素源としては
、アンモニウム塩、硝酸塩、酵母エキス、ペプトン等が
単独または組み合わせて用いられる。さらに、ナトリウ
ム、カリウム、マグネシウム、℃が適当であり、初発ｐ
旧よ、通常６．５〜７．５、好ましくは　７．０程度で
ある。また、培養時間は通常２４〜９６時間であるが、
４８〜９６時間が好ましい。

通気撹拌培養等による培養で、培地中にキチナーゼが生
成蓄積される。

培養時間と、培地中に生成したキチナーゼ活性およびｐ
ｉ（の変化の一例を、第１図に示す。

■、酵素の精製 培地中のキチナーゼを分離精製するには、酵素精製の一
般的手法が用いられる０例えばイオン交換クロマトグラ
フィー、疎水クロマトグラフィー　ゲル濾過法等の各種
クロマトグラフィー硫安あるいは有機溶媒等による分画
沈澱法等があげられる。これ等の方法を適宜組み合わせ
ることにより、純化されたキチナーゼを得ることができ
る。

■、酵素活性 酵素活性の測定は、次のように行う。

キチン（和光純薬工業製）をボールミルで細かく粉砕し
、濃塩酸に溶解させる。これを大量の水に注いで再沈澱
させた後、ホモジナイザーで細かく分散させコロイダル
キチンを調製する。

０、３３Ｘコロイダルキチンを含む０．０５Ｍ酢酸緩衝
液（ｐＨ５，０）　　３ｍｌに酵素液　１ｍｌを加えて
、３７℃で１０分間反応させる。その後０．５Ｍ−Ｎａ
ｚＣＯｉ　１ｍｌを添加して酵素反応を停止させ、反応
液中に生成した還元糖の量を定量する。

この条件下で１分間に１μｍｏｌの　Ｎ−アセチル−β
−Ｄ−グルコサミンを遊離するのに必要な酵素量をキチ
ナーゼ活性の１単位（Ｕｎｉｔ）とする。

■、酵素の性質 得られたキチナーゼは、以下に示す理化学的性質を有し
ていた。

１〉作用 脱灰キチン、コロイダルキチン、Ｎ−アセチルキトオリ
ゴ糖、キトサン等に作用して、β−グルコシド結合を加
水分解する。

２）至適ｐｉ（および安定ｐＨ範囲 コロイダルキチンを基質として、３７℃で反応を行った
場合、本酵素の至適ｐ■は、５．０付近であった（第２
図〉、また本酵素は、３７℃、１時間の処理において、
ｐＨ４，０〜９．５の範囲において、９０に以上の残存
活性を示したく第３図〉。

３）至適温度および燕麦定性 コロイダルキチンを基質とした場合、ｐＨ５，０の条件
下では、本酵素の至適温度は、約６５℃であった（第４
図〉、また本酵素は、ｐＨ５，０，６０分間の処理に対
して、４５℃以下で安定であった（第５図）。

４）分子量 本酵素の分子量は、セファクリルＳ−２００を用いるゲ
ル濾過法により、５６．０００±２，０００と測定され
た。

（４〉実施例 以下、本発明の詳細を、実施例により説明する。

〈実施例−１〉 脱灰キチン０．５５ｆ：（午ミツ十ヂンＣ；　君津化学
製）、ペプトン０．１５Ｇ、　　酵母エキス０．１％、
リン酸１カリウム０．１％の組成の液体培地１００ｍ１
（ｐＨ７，０＞を、常法により滅菌し、ＴＫ−２１８株
を接種し、３０℃で４８時間通気撹拌培養した。培養液
を遠心分離して菌体を除き、キチナーゼ含有上澄液９０
ｍ１を得た。上澄液のキチナーゼ活性は、１００Ｕ／ｍ
ｌ　であった。

〈実施例−２〉 ペプトン０．５５：、　　酵母エキス０．５５Ｇ、　　
リン酸１カリウム０．０６１を含む前培養培地（ｐ［（
７，０）　５０ｍ１を、５００ｍ１容三角フラスコに入
れ、ＴＫ−２１８株を接種し、３０°Ｃで１日間振盪培
養して前培養液とした０次いで、脱灰キチン０．５Ｘ（
キミツキチンＣ；　君津化学製）、ペプトン０．１５Ｆ
、　　酵母エキス０．　ｌ、　　リン酸１カリウム０．
２な。

消泡剤０．０１％の組成の液体培地２５００Ｉ１１１　
（ＰＨ７，０）を、５Ｌ−ジャーファーメンタ−に入れ
、殺菌後前記前培養液を接種した。３０℃１回転数２５
０ｒｐｍ、　　通気量１　ｖｖｍの条件で、６８時間培
養した。この時、培養液中のキチナーゼ活性は、１７０
Ｕ／ｍｌであった。

培養期間中のキチナーゼ活性とｐＨの変化は、第１図の
とおりであった。

この培養液を、１０，０００Ｘｇ、　　２０分の遠心分
離により菌体を除去し、上澄液に８０５（飽和となるよ
うに硫酸アンモニウムを添加して塩析した。

次いで、再度１０．０００　Ｘ　ｇ、　　２０分間遠心
分離して沈澱画分を回収し、２５ｍＭリン酸緩衝液＜ｐ
Ｈ７，０）に溶解し、同緩衝液に対して透析した。その
透析内液を、２５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で平
衡化したＤＥＡＥ　）ヨバール力ラムに通液し、非吸着
画分を回収して酵素液とした。キチナーゼの回収率は８
０りであった。

（５）発明の効果 本発明により、クルチア属細菌による新規なキチナーゼ
製造方法が提供され、調製の煩雑なコロイダルキチンを
誘導基質に用いることなく、簡便にキチナーゼの生産が
可能となった。

【図面の簡単な説明】

第１図は、培養時間とキチナーゼ活性およびｐＨ変化の
関係の一例を示す。 第２図は１本発明によるキチナーゼの活性とｐ［（の関
係を示す。 第３図は、本発明によるキチナーゼのｐｕ安定性を示す
。 第４図は、本発明によるキチナーゼの活性と温度の関係
を示す。 第５図は、本発明によるキチナーゼの熱安定性を示す。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）クルチア（Ｋｕｒｔｈｉａ）属に属し、キチナー
   ゼ生産能を有する細菌を培地に培養し、培地中にキチナ
   ーゼを生産せしめ、培地よりキチナーゼを採取すること
   を特徴とするキチナーゼの製造法。