JP3858065B2 - 新規ｎ−アセチルキトオリゴ糖デアセチラーゼ及びその製造法 - Google Patents

Description

【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、ビブリオ属に属する微生物によって生産される新規デアセチラーゼＤＡ１及びデアセチラーゼＤＡ２に関するものである。本発明の酵素は、医薬品等の合成中間体として有用なＮ−アセチルキトビオース及びＮ−アセチルキトトリオースの脱アセチル化物の製造に重要である。
【０００２】
【従来の技術】
Ｎ−アセチルグルコサミンあるいはそのオリゴマーを脱アセチル化する酵素に関しては従来ほとんど研究されていなかったが、最近藤島ら（Biosci. Biotech. Biochem., Vol 58 193-195 1994）（特開平4-349884) によって報告されている。
【０００３】
しかしながら、上記酵素は菌体内酵素であり、精製酵素タンパク質１mg当たりの活性が0.11ユニットと非常に弱く、基質特異性において、Ｎ−アセチルグルコサミンのみに選択的に作用するものであった。すなわち、菌体外に生産され、活性が精製酵素タンパク質１mg当たり10ユニット以上の高い活性を有し、しかも、Ｎ−アセチルキトビオースあるいはＮ−アセチルキトトリオースに選択的に作用する酵素は知られていない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、Ｎ−アセチルグルコサミンのオリゴマーであるＮ−アセチルキトビオースあるいはＮ−アセチルキトトリオースに選択的に作用し、従来のデアセチラーゼよりも高い活性を有する新規なデアセチラーゼを提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、上記課題を解決すべく、海洋性細菌由来のデアセチラーゼの探索を行った結果、ビブリオ属に属するＨ−８株が、高いデアセチラーゼ活性を有し、かつＮ−アセチルキトビオースあるいはアセチルキトトリオースに選択的に作用するデアセチラーゼを産生することを見出し、本発明を完成した。
【０００６】
即ち、本発明は、下記の酵素化学的性質を有するデアセチラーゼＤＡ１又はデアセチラーゼＤＡ２である。
Ａ．デアセチラーゼＤＡ１
（１）Ｎ−アセチルキトビオースあるいはＮ−アセチルキトトリオースに作用して、脱アセチル化する。
（２）至適 pH ：37℃で8.５−9.０
（３）至適温度：pH8.５で45℃
（４）pH安定性：37℃で6.０−11.0で安定
（５）熱安定性：pH8.５で50℃で１時間の処理に安定
（６）分子量：20,000−60,000（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法）
（７）等電点：3.３
Ｂ．デアセチラーゼＤＡ２
（１）Ｎ−アセチルキトビオースあるいはＮ−アセチルキトトリオースに作用して、脱アセチル化する。
（２）至適 pH ：37℃で8.０−8.５
（３）至適温度：pH8.５で40℃
（４）pH安定性：37℃で7.０−11.0で安定
（５）熱安定性：pH8.５で50℃で１時間の処理に安定
（６）分子量：20,000−60,000（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法）
（７）等電点：3.５
また、本発明は、ビブリオ属に属し、デアセチラーゼＤＡ１またはデアセチラーゼＤＡ２産生能を有する微生物を培養し、その培養物からデアセチラーデＤＡ１またはデアセチラーゼＤＡ２を採取することを特徴とするデアセチラーゼＤＡ１またはデアセチラーゼＤＡ２の製造法である。
【０００７】
以下、本発明を詳細に説明する。
Ｈ−８株は、静岡県浜名湖にて採取した底泥より分離された。
Ｈ−８株の菌学的性質は下記に示すが、培地は、マリンアガー（Bacto Marine Agar 2216)(Difco 社製）あるいはマリンブロス（Bacto Marine Broth 2216)(Difco社製）を用いた。これらの培地に本菌株を植菌し30℃で24から48時間培養し、光学顕微鏡及び透過型電子顕微鏡を用いて形態観察を行った。また、本菌株は、塩化ナトリウムを要求することから、生化学的性状の試験は75％人工海水を用いて培地を作成するか、あるいは培地中に３％塩化ナトリウムを添加することによって行った。
（１）形態（好気的条件下）
細胞の形及び大きさ：曲がりのない桿菌、0.７〜1.１×1.３〜1.８μｍ
細胞の多形成の有無：無し
運 動 性 ：あり
鞭毛の着生状態 ：極毛性、固体培地で培養した場合菌体周辺に周鞭毛が観察される。
【０００８】
スウォーミング ：あり
胞子の有無 ：無し
グラム染色性 ：陰性
（２）各培地における生育状態
マリンアガー平板培養：良好に生育、コロニーは、凸円状に生育し、全縁湿光、不透明乳白色であり、表面は平滑である。
【０００９】
マリンアガー斜面培養：良好に生育、糸状、乳白色
マリンブロス培養 ：良好に生育、培養液は均一に濁る。
マリンブロスゼラチン穿刺培養：液化する（１週間後）。
リトマスミルク ：消化する
（３）生理学的性質
硝酸塩の還元 ：還元する
インドールの生成：生成する。
【００１０】
硫化水素の生成 ：ＴＳＩ培地では、生成しない。
でんぷんの分解 ：加水分解する。
クエン酸の利用 ：Simons培地 利用する。
：Cristensen培地 利用する。
無機窒素源の利用：利用する。
【００１１】

【００１２】

以上の菌学的性質からバージーズ・マニュアル・オブ・デターミネイティブ・バクテリオロジー第８版の分類基準に従って公知の菌株と比較した結果、グラム陰性桿菌で、極毛性の鞭毛を有し、通性嫌気性、またＯＦテストで発酵性であり、好塩性で発光性をもたず、オキシダーゼ陽性、ＧＣ含量が４５．８％である等の理由から本菌株は、ビブリオ属に所属すると考えられた。そして、本菌株は、ビブリオｓｐ．Ｈ−８株として工業技術院生命工学技術研究所に寄託番号FERM P-14737として寄託されている（寄託日：平成７年１月19日）。
【００１３】
デアセチラーゼＤＡ１及びデアセチラーゼＤＡ２は、ビブリオ属に属するデアセチラーゼ生産菌を培地で培養し、培養物から得ることができる。デアセチラーゼ生産菌としては、ビブリオ属に属し、デアセチラーゼＤＡ１及びデアセチラーゼＤＡ２を産生するものであれば、いずれの菌株でも用いることができる。また、これら微生物の人工的変異方法、例えば紫外線照射、Ｘ線照射、変異誘起剤処理など、あるいは自然発生による変異株、また遺伝子操作、細胞融合による変異株でもデアセチラーゼＤＡ１またはデアセチラーゼＤＡ２を生産するものであればいずれも本発明に用いることができる。デアセチラーゼ生産能を有する菌株を選定するには、菌株の培養物を取り出し、そのデアセチラーゼ活性を測定することにより行うことができる。デアセチラーゼ生産株のうち、代表的な株としては、ビブリオｓｐ．Ｈ−８株（FERM P-14737) を挙げることができる。
【００１４】
本発明の微生物の培養には微生物の培養に一般的に用いられる培養方法を用いることができる。培地としては資化可能な炭素源、窒素源、無機物および必要な生育、生産促進物質を程よく含有する培地であれば合成培地、天然培地いずれでも使用可能である。本酵素は、誘導酵素のため炭素源として、キチン又はキチンオリゴ糖を用いることが必須である。また、そのほかに炭素源としてグルコース、澱粉、デキストリン、麦芽糖、マンノース、フラクトース、シュークロース、アラビノース、マンニトール、糖蜜などを単独または組み合わせて用いられる。更に、菌の資化能によっては炭化水素、アルコール類、有機酸なども用いられる。窒素源としては塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、尿素、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、乾燥酵母、コーン・スチーブ・リカー、大豆粉、カザミノ酸などが単独または組み合わせて用いられる。そのほか、食塩、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、炭酸カルシウム、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、硫酸第一鉄、塩化カルシウム、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、硫酸銅などの無機塩類や海水を必要に応じて加える。更に使用菌の生育やデアセチラーゼの生産を促進する微量成分を適当に添加することができる。
【００１５】
培養法としては、一般の培養方法が用いられるが、液体培養法、とくに深部攪拌培養法がもっとも適している。培養温度は16〜60℃、特に30〜42℃が適当であり、培養中の培地のpHはアンモニア水や炭酸アンモニウム溶液、塩酸溶液などを添加して、６〜11、特に７〜９に維持することが望ましい。液体培養で通常６〜96時間培養をおこなうと、目的物質のデアセチラーゼＤＡ１及びデアセチラーゼＤＡ２が菌体外に生成される。培養物中の生成量が最大に達したときに培養を停止する。
【００１６】
培養物からデアセチラーゼＤＡ１及びデアセチラーゼＤＡ２の分離、精製は、酵素をその培養物から単離精製するために常用される方法に従っておこなわれる。例えば培養物を濾過により培養濾液と菌体に分け、培養ろ液を硫酸アンモニウム等を用い、塩析によって沈澱物を得る。この沈澱物を溶解、透析、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー等の手順で精製することができる。
【００１７】
以上の手順で生成されたデアセチラーゼＤＡ１は、以下の酵素化学的性質を有している。
（１）Ｎ−アセチルキトビオースあるいはＮ−アセチルキトトリオースに作用して、脱アセチル化する。
（２）至適 pH ：37℃で8.５−9.０
（３）至適温度：pH8.５で45℃
（４）pH安定性：37℃で6.０−11.0で安定
（５）熱安定性：pH8.５で50℃で１時間の処理に安定
（６）分子量：20,000−60,000（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法）
（７）等電点：3.３
デアセチラーゼＤＡ２は、以下の理化学的性質を有している。
（１）Ｎ−アセチルキトビオースあるいはＮ−アセチルキトトリオースに作用して、脱アセチル化する。
（２）至適 pH ：37℃で8.０−8.５
（３）至適温度：pH8.５で40℃
（４）pH安定性：37℃で7.０−11.0で安定
（５）熱安定性：pH8.５で40−55℃℃で１時間の処理に安定
（６）分子量：20,000−60,000（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法）
（７）等電点：3.５
以上の酵素化学的性質及び後述の酵素活性について、本発明のデアセチラーゼと公知のデアセチラーゼとを比較したところ、Ｎ−アセチルグルコサミンのオリゴマーであるＮ−アセチルキトビオース及びＮ−アセチルキトトリオースに選択的に作用する点、及び、酵素活性がタンパク質１mg当たり、10ユニット以上である点で、公知のデアセチラーゼと明らかに相違する。そこで、デアセチラーゼＤＡ１及びデアセチラーゼＤＡ２を新規酵素と認定した。
【００１８】
本発明の酵素は、医薬品等の合成中間体として有用なＮ−アセチルキトビオース及びＮ−アセチルキトトリオースの脱アセチル化物の製造に用いることができる。
【００１９】
【実施例】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
［実施例１］
キチン粉末５g/L 、ペプトン５g/L 、酵母エキス１g/L 、リン酸第二鉄0.01g/L 、天然海水1000mlの組成を有する前培養培地（殺菌前 pH 7.５) 30mlを300ml フラスコに加え、ビブリオｓｐ．Ｈ−８株を種菌として植菌し、37℃、24時間培養した。このようにして得られた前培養液を 100Ｌ容量の発酵槽中の上記組成と同一組成の培地30Ｌに５％v/v の割合で植菌し、30℃で通気攪拌方式（回転数300rpm, 通気量0.7vvm) により18時間培養を行った。この際、pHは7.８になるように調整しながら培養した。
［実施例２］
実施例１で得られた培養液30Ｌを1000rpm で遠心分離し、培養上清を得た。上清を硫酸アンモニウムで塩析し（80％飽和）、沈澱物をろ過後、50mM リン酸ナトリウム緩衝液（pH7.０）２Ｌに懸濁し、そのろ液を粗酵素液とした。次に、50ＦＴ-Ｃ-110透析チューブ（三光純薬製) に上記粗酵素を入れ、50mM リン酸ナトリウム緩衝液40Ｌを透析液として透析を行った。透析した酵素懸濁液をＤＥＡＥセファロースＦＦ（ファルマシアバイオテク社製）カラムを用いて、NaClのグラジェントによりデアセチラーゼ活性画分を溶出した。溶出画分はさらにブチルセファロース４ＦＦ（ファルマシアバイオテク社製) に吸着させ、硫酸アンモニウムのグラジェントにより溶出した。デアセチラーゼ活性画分は２つに分かれた。２つの画分をそれぞれセファクリルＳ-200ＨＲ（ファルマシアバイオテク社製）を用いてゲルろ過クロマトグラフィーを行った。その結果、精製デアセチラーデＤＡ１を25mg及び精製デアセチラーゼＤＡ２を７mg得ることができた。
［実施例３］
デアセチラーゼＤＡ１及びデアセチラーゼＤＡ２の酵素活性の測定には、亜硝酸−インドール反応（Z. Dische, E. Borenferund, J. Biol. Chem., 184, 517 (1950)) を用いた。なお、デアセチラーゼ１ユニットは１分間に１μmol のグルコサミンを遊離する活性を有する量とする。上記の測定法に従ってデアセチラーデＤＡ１及びデアセチラーゼＤＡ２の酵素活性を測定した。その結果、タンパク質１mgあたり、デアセチラーゼＤＡ１の活性は、32.5ユニットまた、デアセチラーゼＤＡ２の活性は、35ユニットであった。
【００２０】
【発明の効果】
本発明は、高活性で、かつ、Ｎ−アセチルグルコサミンのオリゴマーに選択的に作用する新規なデアセチラーゼを提供する。

Claims (3)

1. 下記の酵素化学的性質を有するデアセチラーゼＤＡ１。
   （１）Ｎ−アセチルキトビオースあるいはＮ−アセチルキトトリオースに作用して、脱アセチル化する。
   （２）至適 pH ：37℃で8.5−9.0
   （３）至適温度：pH8.5で45℃
   （４）pH安定性：37℃で6.0−11.0で安定
   （５）熱安定性：pH8.5で50℃で1時間の処理に安定
   （６）分子量：20,000−60,000（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法）
   （７）等電点：3.3
   （８）ビブリオｓｐ．Ｈ−８株（受託番号 FERM P-14737 ）によって生産される。
   （９）ビブリオｓｐ．Ｈ−８株（受託番号 FERM P-14737 ）の培養上清を硫酸アンモニウムで塩析し、得られた沈殿物を溶解し、透析し、 DEAE セファロースカラムクロマトグラフィーにかけて NaCl のグラジェントで溶出してデアセチラーゼ活性画分を取得し、さらにそれをブチルセファロースカラムクロマトグラフィーにかけて硫酸アンモニウムのグラジェントで溶出させた２つのデアセチラーゼ活性画分の一方をゲルろ過クロマトグラフィーにかけて得られる。
2. 下記の酵素化学的性質を有するデアセチラーゼＤＡ２。
   （１）Ｎ−アセチルキトビオースあるいはＮ−アセチルキトトリオースに作用して、脱アセチル化する。
   （２）至適 pH ： 37 ℃で 8.0 − 8.5
   （３）至適温度： pH8.5 で 40 ℃
   （４） pH 安定性： 37 ℃で 7.0 − 11.0 で安定
   （５）熱安定性： pH8.5 で 50 ℃で 1 時間の処理に安定
   （６）分子量： 20,000 − 60,000 （ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法）
   （７）等電点： 3.5
   （８）ビブリオｓｐ．Ｈ−８株（受託番号 FERM P-14737 ）によって生産される。
   （９）ビブリオｓｐ．Ｈ−８株（受託番号 FERM P-14737 ）の培養上清を硫酸アンモニウムで塩析し、得られた沈殿物を溶解し、透析し、 DEAE セファロースカラムクロマトグラフィーにかけて NaCl のグラジェントで溶出してデアセチラーゼ活性画分を取得し、さらにそれをブチルセファロースカラムクロマトグラフィーにかけて硫酸アンモニウムのグラジェントで溶出させた２つのデアセチラーゼ活性画分の一方をゲルろ過クロマトグラフィーにかけて得られる。
3. ビブリオｓｐ．Ｈ−８株（受託番号 FERM P-14737 ）を培養し、その培養物から請求項１に記載のデアセチラーゼＤＡ１または請求項２に記載のデアセチラーゼＤＡ２を採取することを特徴とするデアセチラーゼＤＡ１またはデアセチラーゼＤＡ２の製造法。