JPH03164177A - バイオセンサ用酵素固定化担体 - Google Patents
バイオセンサ用酵素固定化担体Info
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- JPH03164177A JPH03164177A JP1083262A JP8326289A JPH03164177A JP H03164177 A JPH03164177 A JP H03164177A JP 1083262 A JP1083262 A JP 1083262A JP 8326289 A JP8326289 A JP 8326289A JP H03164177 A JPH03164177 A JP H03164177A
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Landscapes
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は酵素等の蛋白質の固定化担体に関す２ものであ
る。その担体は優れた蛋白質固定化性項持ち，高ａ度の
酵素を固定化して電極型バイオ→ンサやイオン＠脂性電
界効果トランジスター（ＩＰＥＴ）型バイオセンサ等の
用途に適している。ｊた，アブィニテイクロマトグラフ
等々の用途にも適している。
る。その担体は優れた蛋白質固定化性項持ち，高ａ度の
酵素を固定化して電極型バイオ→ンサやイオン＠脂性電
界効果トランジスター（ＩＰＥＴ）型バイオセンサ等の
用途に適している。ｊた，アブィニテイクロマトグラフ
等々の用途にも適している。
（従来の技術）
バイオセンサ用の酵素膜は繰返し使用する間に酵素が溶
出してはいけない。酵素固定化法については．すでに．
包括法，共有結合法．架橋法，イオン結合法，吸着法等
などいろいろの方法が知られている。バイオ七ンサ用と
してよく使われている代表的な酵素固定化担体として．
例えば， アルブミンーグルタールアルデヒド系担体で
あるとか，水溶性のポリビニルアルコールＣ ＰＶＡ）
系スチルバゾール感光性樹脂（ ＩＩｏＳｂＱ）
担体，ポリビニルビロリドン（ ＰＶＩ’） 一ジ
アジド化合物系担体，ポリアクリルアミドー九重合用ビ
ニルモノマーｗｔ担体などが知られている。他に．酵素
を単に吸着させただけのメンプランフィルター担体があ
るし．加水分解ナイロンーグルタールアルデヒド系担体
等がある。
出してはいけない。酵素固定化法については．すでに．
包括法，共有結合法．架橋法，イオン結合法，吸着法等
などいろいろの方法が知られている。バイオ七ンサ用と
してよく使われている代表的な酵素固定化担体として．
例えば， アルブミンーグルタールアルデヒド系担体で
あるとか，水溶性のポリビニルアルコールＣ ＰＶＡ）
系スチルバゾール感光性樹脂（ ＩＩｏＳｂＱ）
担体，ポリビニルビロリドン（ ＰＶＩ’） 一ジ
アジド化合物系担体，ポリアクリルアミドー九重合用ビ
ニルモノマーｗｔ担体などが知られている。他に．酵素
を単に吸着させただけのメンプランフィルター担体があ
るし．加水分解ナイロンーグルタールアルデヒド系担体
等がある。
（発明が解決しようとする課題）
従来の固定化担体は，酵素を高濃度に固定出来なかった
り，固定化されている酵素が溶出し易かったり，脆くて
物性的に劣っていたりする。
り，固定化されている酵素が溶出し易かったり，脆くて
物性的に劣っていたりする。
例えば， ｌＩｏｓｂＱ感光性樹脂でも酵素をｌＯ％
以上加えれば．溶出すると言われている。アルプミンー
グルタールアルデヒドでも酵素を約４０％も入れると溶
出を起こす。その他，生体ポリマーのアルブミンやゼラ
チンは，生成フィルムが脆かったり，品質にばらつきが
あったりすると言われてい る。
以上加えれば．溶出すると言われている。アルプミンー
グルタールアルデヒドでも酵素を約４０％も入れると溶
出を起こす。その他，生体ポリマーのアルブミンやゼラ
チンは，生成フィルムが脆かったり，品質にばらつきが
あったりすると言われてい る。
また，感光性樹脂を使う場合には，光硬化性を与えるた
め特殊な官能基を持つ化合物や特殊な官能基を持つポリ
マーが必要である。
め特殊な官能基を持つ化合物や特殊な官能基を持つポリ
マーが必要である。
（課題を解決する手段〉
本発明では，ＰＡＡｗｌＯＯ％単独で用いてもよいが，
ごく普通に用いられる安価で安定した品質と優れた性
能とを持つ水溶性合成ポリマー 例えば，ポリビニルビ
ロリドン（ＰＶＰ）． ポリビニルアルコール（ＰＶ
＾） 等をベースポリマーとしてＰＡＡｍに混合して用
いた方が好ましい。その混合割合は，ベースボリマ−１
００部に対してＦＡＡ■を２０部用いたが特に限定しな
い。
ごく普通に用いられる安価で安定した品質と優れた性
能とを持つ水溶性合成ポリマー 例えば，ポリビニルビ
ロリドン（ＰＶＰ）． ポリビニルアルコール（ＰＶ
＾） 等をベースポリマーとしてＰＡＡｍに混合して用
いた方が好ましい。その混合割合は，ベースボリマ−１
００部に対してＦＡＡ■を２０部用いたが特に限定しな
い。
酵素の固定化方法は，水溶性ポリマー， ＰＡＡｍ，
酵素をグルタールアルデヒドによって固定することであ
り，代表的な方法について実施例で詳細に述べる。
酵素をグルタールアルデヒドによって固定することであ
り，代表的な方法について実施例で詳細に述べる。
酵素膜はスクリーン印刷用の紗，および， それに類す
る物の上に塗布したフィルム状として得ることが出来る
。それを酸素電極等に取付ければバイオセンサとなる。
る物の上に塗布したフィルム状として得ることが出来る
。それを酸素電極等に取付ければバイオセンサとなる。
同様に行えば． ＩｓＦＥＴ基板の上にもフィルム状
の酵素膜を得ることが出来る。
の酵素膜を得ることが出来る。
〈作用〉
本発明の担体に用いるＰＡＡｍは，一級アミンを側鎖に
持つポリマーであり，市販品としても得られる。このポ
リマーの一級アミンと酵素蛋白質を構成するアミノ酸の
一級アミンとはグルタールアルデヒドとシップ塩基を作
って結合する。
持つポリマーであり，市販品としても得られる。このポ
リマーの一級アミンと酵素蛋白質を構成するアミノ酸の
一級アミンとはグルタールアルデヒドとシップ塩基を作
って結合する。
従って， ＰＡＡｓはグルタールアルデヒドとの組合
わせで担体の架橋剤にもなるし，酵素の固定化剤にもな
る。
わせで担体の架橋剤にもなるし，酵素の固定化剤にもな
る。
（効果）
本発明の担体は，ベースポリマーにＰ＾＾■を２０％添
加した場合でもアルブミン等の生体ポリマーと比べて一
級アミンの濃度は十分高い。そのため．酵素濃度が高く
ても酵素をＰ＾＾自側鎖アミンに結合させることが可能
であり，酵素膜から酵素が溶出し難くなる。
加した場合でもアルブミン等の生体ポリマーと比べて一
級アミンの濃度は十分高い。そのため．酵素濃度が高く
ても酵素をＰ＾＾自側鎖アミンに結合させることが可能
であり，酵素膜から酵素が溶出し難くなる。
また，Ｐ＾＾■はグルタールアルデヒドと組合わせるこ
とにより担体の架橋剤にもなり，普通の水溶性合成ポリ
マーをベースポリマーに用いることが可能になる。従っ
て，特殊な感光基をポリマー側鎖に導入する必要が無い
し．アジド化合物やビニルモノマー オリゴマーのよう
な特殊な感光性化合物を添加する必要もない。
とにより担体の架橋剤にもなり，普通の水溶性合成ポリ
マーをベースポリマーに用いることが可能になる。従っ
て，特殊な感光基をポリマー側鎖に導入する必要が無い
し．アジド化合物やビニルモノマー オリゴマーのよう
な特殊な感光性化合物を添加する必要もない。
（実施例）
以下に実施例を示す。ここで使用したＰＡＡｍは市販品
（ｆリアリルアミン塩酸塩 Ｈ： 日東紡績■）を用い
たが，一旦，力性ソーダで中和し，透析した後，水溶液
の状態で用いた。また，酵素の代表としてＣＯＤ （
２３．８００ Ｕｎｉｔｅ／ｇｍ ｓｏｌｉｄ）を用い
た。
（ｆリアリルアミン塩酸塩 Ｈ： 日東紡績■）を用い
たが，一旦，力性ソーダで中和し，透析した後，水溶液
の状態で用いた。また，酵素の代表としてＣＯＤ （
２３．８００ Ｕｎｉｔｅ／ｇｍ ｓｏｌｉｄ）を用い
た。
ＣＯＤ酵素膜の組或と製法の一覧表を表１に示す。
Ｎα 酵素固定材 製 法ア
ＰＶＰ（１００部）＋ｐ＾Ａｍ（２０部）同上
表１．
固定材の組成と酵素膜の製法
ＣＯＤは固定材固形分に対して４０％添加酵素膜の製法
を実施例−１〜４と比較例１〜３に示す。
を実施例−１〜４と比較例１〜３に示す。
実施例−１．
下記の割合いで樹脂や酵素等を混合した均一な溶液を作
る。
る。
緩衝液 （Ｐｌｌ ７．０）
ＰＡＡｍｌ Ｏ％水溶液
ＰＶＰ
ＣＯＤ
ｌ 威
１００ｍｇ
１００ｍｇ
５０＋ｌｇ
この溶演をテフロンシ一ト上のスクリーン印刷用の厚さ
８５μ嘗の紗の上に塗布し，風乾してフィルムを形成さ
せた後， ３％のグルタールアルデヒド溶液に室温で５
分間処理することによってフィルム状の酵素膜（表１．
８α５〉が得られた。
８５μ嘗の紗の上に塗布し，風乾してフィルムを形成さ
せた後， ３％のグルタールアルデヒド溶液に室温で５
分間処理することによってフィルム状の酵素膜（表１．
８α５〉が得られた。
実施例−２．
実施例−ｌのＰＶＰをＰｖＡに代えれば同様な酵素膜（
表１．Ｎｎ４）が得られた。
表１．Ｎｎ４）が得られた。
実施例−３．
下記の割合いで均一な溶液を作る。
緩衝液 （ＰＨ ７．０）
ｌ 威
ＰＡＡｍｌ Ｏ％水溶戒
１００ｍｇ
ＰＶＰ
１０（ｌｏｇ
上記の溶液を実施例−１と同様に紗の上に塗布，風乾し
てフィルム形成させた後， ５％グルタールアルデヒド
で１分間浸漬し，引き続いて， ４０一ｇ／２威のＣ
ＯＤ溶液に浸漬することによって酵素後付与の酵素膜（
表１．ＮＱ７）が得られた。
てフィルム形成させた後， ５％グルタールアルデヒド
で１分間浸漬し，引き続いて， ４０一ｇ／２威のＣ
ＯＤ溶液に浸漬することによって酵素後付与の酵素膜（
表１．ＮＱ７）が得られた。
実施例−４
下記の割合いで均一な溶液を作る。
緩衝液 （Ｐｌｌ ７．０）
水溶性感光性樹脂（ ＢｏＳｂＱ，固形分１３％）ＧＯ
Ｄ ５ＰＡＡ會ｌＯ％
水溶液 ２５ｌ 一 Ｉｇ Ｏｍｇ Ｏ ■ 上記の溶液を実施例−１と同様に紗の上に塗布，風乾し
てフィルムを形成させた後， ＵＶランプ（１００Ｗ
超高圧水銀ランプ）で５分間１０ｃｓの距離でＵｖを
照射し，引き続いて， ３％グルタールアルデヒド溶液
に室温で５分間処理することによって酵素膜（表ｔ．Ｎ
ａ３）が得られた。
Ｄ ５ＰＡＡ會ｌＯ％
水溶液 ２５ｌ 一 Ｉｇ Ｏｍｇ Ｏ ■ 上記の溶液を実施例−１と同様に紗の上に塗布，風乾し
てフィルムを形成させた後， ＵＶランプ（１００Ｗ
超高圧水銀ランプ）で５分間１０ｃｓの距離でＵｖを
照射し，引き続いて， ３％グルタールアルデヒド溶液
に室温で５分間処理することによって酵素膜（表ｔ．Ｎ
ａ３）が得られた。
比較例−１．
下記の割合いで均一な溶岐を作る。
緩衝液 （ＰＨ ７．０１ １威
水溶性感光性樹脂（ ＩＩｏＳｂＱ．固形分１３％＞Ｌ
ｇＧＯＤ
５ ０ Ｎ上記溶液を実施
例−１と同様に紗の上に塗布，風乾後，実施例−４と同
様にしてυＶランブにようてｕｖを照射することによっ
て酵素膜（表１．Ｎ（１１）が得られた。
水溶性感光性樹脂（ ＩＩｏＳｂＱ．固形分１３％＞Ｌ
ｇＧＯＤ
５ ０ Ｎ上記溶液を実施
例−１と同様に紗の上に塗布，風乾後，実施例−４と同
様にしてυＶランブにようてｕｖを照射することによっ
て酵素膜（表１．Ｎ（１１）が得られた。
比較例−２．
下記の割合いで均一な溶液を作る。
緩衝液
アルブミ
ＧＯＤ
（Ｐｌｌ
７．０）
（牛血Ｆ−Ｖ）
１ｍ
１２５ｍｇ
５ ０ ■
上記溶岐を冷蔵庫（約４℃）の中で約３０分間保存して
適当な粘度で実施例−１と同様に紗の上に塗布，風乾す
ることによって酵素膜（表１．Ｎｏ２ ） が得られた〇 比較例−３． 下記の割合いの均一な溶液を作る。
適当な粘度で実施例−１と同様に紗の上に塗布，風乾す
ることによって酵素膜（表１．Ｎｏ２ ） が得られた〇 比較例−３． 下記の割合いの均一な溶液を作る。
緩衝液 （Ｐｌｌ
７．０）
ｌ Ｏ 威
ゼラチン
！
ｇ
上記溶液を紗の上に塗布，風乾後，実施例−３と同様に
グルタールアルデヒド，酵素液で処理することによって
酵素後付与の酵素膜（表１．Ｎａ６）が得られた。
グルタールアルデヒド，酵素液で処理することによって
酵素後付与の酵素膜（表１．Ｎａ６）が得られた。
各実施例．比較例で得られた酵素膜を用いて，センサと
して酸素電極（ ＤＣ−５０ ； エイプル社）ヲ用
いれば容易に酵素膜の活性，あるいは，酵素固定量が比
較出来るし．酵素膜の活性変化．および，酵素の溶出を
調べることが出来る。
して酸素電極（ ＤＣ−５０ ； エイプル社）ヲ用
いれば容易に酵素膜の活性，あるいは，酵素固定量が比
較出来るし．酵素膜の活性変化．および，酵素の溶出を
調べることが出来る。
即ち，酸素電極にＣＯＤ酵素膜を取付け，酸素飽和下の
緩衝溶液中においてグルコース溶液を添加してゆくとＣ
ＯＤにより酸素が消費されて． グルコース濃度と酵素
膜中の酸素濃度（電流億．μＡ〉との間で直線関係が得
られる。その勾配（Ｓ； 減少電流／グルコース濃度
）は．酵素膜の見掛け上の活性，あるいは，ｉｌ素固定
量に比例し，高い勾配ほど活性が高く，固定量が多い。
緩衝溶液中においてグルコース溶液を添加してゆくとＣ
ＯＤにより酸素が消費されて． グルコース濃度と酵素
膜中の酸素濃度（電流億．μＡ〉との間で直線関係が得
られる。その勾配（Ｓ； 減少電流／グルコース濃度
）は．酵素膜の見掛け上の活性，あるいは，ｉｌ素固定
量に比例し，高い勾配ほど活性が高く，固定量が多い。
また，測定回数毎のＳの変化から最初の酵素膜活性との
比が求まり（ＲＡ＝３１／Ｓｎ）， 図１にそれを示
す。
比が求まり（ＲＡ＝３１／Ｓｎ）， 図１にそれを示
す。
横軸に酵素膜の測定回数を示し，縦紬に活性変化を示す
。測定回数１回あたりの時間は，同じではないが平均１
時間を要しており，一つの試料について数回測定するに
は２〜３日を要している。
。測定回数１回あたりの時間は，同じではないが平均１
時間を要しており，一つの試料について数回測定するに
は２〜３日を要している。
ｐｖＡ系感光性樹脂担体く比較例−１．表１．Ｎａｌ）
では高ａ度の酵素（約４０％： 酵素／担体〉を含むの
で酵素がかなり溶出している。また，アルブミンーグル
タールアルデヒド担体（比較例−２．表１．Ｎ［１２）
でも酵素を約４０％も添加すれば溶出を起こす。
では高ａ度の酵素（約４０％： 酵素／担体〉を含むの
で酵素がかなり溶出している。また，アルブミンーグル
タールアルデヒド担体（比較例−２．表１．Ｎ［１２）
でも酵素を約４０％も添加すれば溶出を起こす。
実施例−４の酵素膜（表１．８Ｑ３）は，同種類の担体
である比較例−１の酵素ＩＩＩ（表１．ＮＱ１）と比べ
て酵素が溶出し難くなっており， ＦＡＡ一を添加し
た効果が現れている。本発明の担体は，時間的には２〜
３日ではあるがこのように酵素濃度が高くても酵素の溶
出がほとんどない（ＮＯ３， ４．５＋ ７）。
である比較例−１の酵素ＩＩＩ（表１．ＮＱ１）と比べ
て酵素が溶出し難くなっており， ＦＡＡ一を添加し
た効果が現れている。本発明の担体は，時間的には２〜
３日ではあるがこのように酵素濃度が高くても酵素の溶
出がほとんどない（ＮＯ３， ４．５＋ ７）。
ＰＡＡ一単独でも酵素膜が得られるけれどＰＶＰのよう
な水溶性ペースポリマーと混合した担体の方が理由を特
に述べないけれど高活性である。
な水溶性ペースポリマーと混合した担体の方が理由を特
に述べないけれど高活性である。
実施例３で述べた酵素後付与の酵素膜は，反応条件によ
って活性が異なるけれど，条件を遺べば，実施例−１の
酵素１１（Ｎｏ５）と同程度，または，それ以上高活性
になる。比較例−３のゼラチン（表ｌ．Ｎｏ６）は，酵
素が溶出し難いけれど活性がｋ ７の酵素膜の約！／２
以下であり，高活性な酵素膜が得られない。
って活性が異なるけれど，条件を遺べば，実施例−１の
酵素１１（Ｎｏ５）と同程度，または，それ以上高活性
になる。比較例−３のゼラチン（表ｌ．Ｎｏ６）は，酵
素が溶出し難いけれど活性がｋ ７の酵素膜の約！／２
以下であり，高活性な酵素膜が得られない。
Claims (1)
- ポリアリルアミン（ＰＰＡｍ）を必須の構成材料として
用い、好ましくは水溶性ポリマーを加えた担体に酵素を
グルタールアルデヒドで固定化することによって酵素の
溶出が少ないことを特徴とするバイオセンサ用酵素固定
化担体
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1083262A JPH0753109B2 (ja) | 1989-03-31 | 1989-03-31 | バイオセンサ用酵素固定化担体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1083262A JPH0753109B2 (ja) | 1989-03-31 | 1989-03-31 | バイオセンサ用酵素固定化担体 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03164177A true JPH03164177A (ja) | 1991-07-16 |
| JPH0753109B2 JPH0753109B2 (ja) | 1995-06-07 |
Family
ID=13797437
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1083262A Expired - Fee Related JPH0753109B2 (ja) | 1989-03-31 | 1989-03-31 | バイオセンサ用酵素固定化担体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0753109B2 (ja) |
-
1989
- 1989-03-31 JP JP1083262A patent/JPH0753109B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0753109B2 (ja) | 1995-06-07 |
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Legal Events
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