JPH03178996A - 成長因子 - Google Patents
成長因子Info
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- JPH03178996A JPH03178996A JP1318569A JP31856989A JPH03178996A JP H03178996 A JPH03178996 A JP H03178996A JP 1318569 A JP1318569 A JP 1318569A JP 31856989 A JP31856989 A JP 31856989A JP H03178996 A JPH03178996 A JP H03178996A
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- growth factor
- fibroblast
- cultured
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- Peptides Or Proteins (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〈産業上の利用分野〉
本発明は成長因子に関する。より詳細には、血管内皮細
胞に対して著しい増殖促進作用を有し、医薬、臨床検査
試薬等として有用な成長因子に関する。
胞に対して著しい増殖促進作用を有し、医薬、臨床検査
試薬等として有用な成長因子に関する。
〈従来の技術及び発明が解決しようとする課題〉生体組
織、臓器、体液等には種々の成長因子が含まれているこ
とが知られ、数多くの成長因子が単離されている。その
ような例としては、例えば、線維芽細胞成長因子（Ｆｉ
ｂｒｏｂｌａｓｔ Ｇｒｏｗｔｌ＋ Ｆａｃｔｏｒ 。
織、臓器、体液等には種々の成長因子が含まれているこ
とが知られ、数多くの成長因子が単離されている。その
ような例としては、例えば、線維芽細胞成長因子（Ｆｉ
ｂｒｏｂｌａｓｔ Ｇｒｏｗｔｌ＋ Ｆａｃｔｏｒ 。
以下、ＦＧＦという）、トランスフォーミング成長因子
（Ｔｒａｎｓｆ’ｏｒｍｉｎｇ Ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃ
ｔｏｒ）Ｓ血小板由来成長因子（Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄ
ｅｒｉｖｅｄ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ）、上皮成
長因子（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔ
ｏｒ）等が挙げられる（例えば、書籍「細胞成長因子Ｊ
（１９８４年）及び同書ＰａｒｔＩ［（１９８７年〉
、何れも日本組織培養学会綿、朝食書店発行参照）。
（Ｔｒａｎｓｆ’ｏｒｍｉｎｇ Ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃ
ｔｏｒ）Ｓ血小板由来成長因子（Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄ
ｅｒｉｖｅｄ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ）、上皮成
長因子（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔ
ｏｒ）等が挙げられる（例えば、書籍「細胞成長因子Ｊ
（１９８４年）及び同書ＰａｒｔＩ［（１９８７年〉
、何れも日本組織培養学会綿、朝食書店発行参照）。
上記成長因子は、その生理活性に基づいて、細胞の増殖
、肥大及び伸長、分化機能の発現の調節等の種々の作用
を示す。これらの成長因子の中には血管内皮細胞増殖促
進活性を有する成長因子も知られ、それらは内皮細胞成
長因子（Ｅｎｄｏｔｈｅ！ ｉ ａｌｃｅｌｌ ｇｒｏ
ｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）という概念で総括されている。
、肥大及び伸長、分化機能の発現の調節等の種々の作用
を示す。これらの成長因子の中には血管内皮細胞増殖促
進活性を有する成長因子も知られ、それらは内皮細胞成
長因子（Ｅｎｄｏｔｈｅ！ ｉ ａｌｃｅｌｌ ｇｒｏ
ｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）という概念で総括されている。
内皮細胞成長因子は、固型腫瘍の成長、胚形成、黄体形
成、創傷の治癒過程、免疫応答等における毛細血管網の
構築過程に関与していることが明らかにされており、ま
た慢性リウマチ（以下、ＲＡという）の病体解析におい
て、炎症時の血管増殖のメカニズムを研究する際の重要
な因子であると考えられている。従って、内皮細胞成長
因子は、創傷治癒、固型腫瘍の成長、慢性炎症、関節炎
等の生理的及び病理的過程と密接な関係を有し、医薬等
としての利用が期待されている。
成、創傷の治癒過程、免疫応答等における毛細血管網の
構築過程に関与していることが明らかにされており、ま
た慢性リウマチ（以下、ＲＡという）の病体解析におい
て、炎症時の血管増殖のメカニズムを研究する際の重要
な因子であると考えられている。従って、内皮細胞成長
因子は、創傷治癒、固型腫瘍の成長、慢性炎症、関節炎
等の生理的及び病理的過程と密接な関係を有し、医薬等
としての利用が期待されている。
線維芽細胞由来の内皮細胞成長因子としては、前記のＦ
ＧＦが知られている。ＦＧＦには、脳下垂体、脳、黄体
、副腎、胎盤等に存在し、１４６個のアミノ酸からなり
、ｐＩが９．６である塩基性ＦＧＦと、脳、網膜等に存
在し、１４０個のアミノ酸からなり、ｐＩが５〜７の酸
性ＦＧＦが知られているが、これらは何れもヘパリンに
対して親和性を有する。
ＧＦが知られている。ＦＧＦには、脳下垂体、脳、黄体
、副腎、胎盤等に存在し、１４６個のアミノ酸からなり
、ｐＩが９．６である塩基性ＦＧＦと、脳、網膜等に存
在し、１４０個のアミノ酸からなり、ｐＩが５〜７の酸
性ＦＧＦが知られているが、これらは何れもヘパリンに
対して親和性を有する。
また、ヘパリンに対する親和性を持たない内皮細胞成長
因子としては、分子量的４５，０００である血小板由来
内皮細胞成長因子が報告されている（Ｐ、 ｌｓｈｉｋ
ａｗａ ｅｔ ａｌ、 Ｎａｔｕｒｅ、 ３３３： ５
５７−５６２゜１、９８９ ）。
因子としては、分子量的４５，０００である血小板由来
内皮細胞成長因子が報告されている（Ｐ、 ｌｓｈｉｋ
ａｗａ ｅｔ ａｌ、 Ｎａｔｕｒｅ、 ３３３： ５
５７−５６２゜１、９８９ ）。
本発明者らはＲＡの滑脱細胞を鋭意研究した結果、滑脱
細胞からクローン化された線維芽細胞様細胞の培養上清
中に、血管内皮細胞に対して強い増殖促進作用を有する
と共にヘパリンに対して親和性を持たない成長因子が存
在することを見出し、当該成長因子を単離、精製して本
発明を完成した。
細胞からクローン化された線維芽細胞様細胞の培養上清
中に、血管内皮細胞に対して強い増殖促進作用を有する
と共にヘパリンに対して親和性を持たない成長因子が存
在することを見出し、当該成長因子を単離、精製して本
発明を完成した。
即ち、本発明は、血管内皮細胞増殖促進活性を有すると
共にヘパリンに対して親和性を持たない新規な線維芽細
胞様細胞由来戊長因子を提供するものである。
共にヘパリンに対して親和性を持たない新規な線維芽細
胞様細胞由来戊長因子を提供するものである。
く課題を解決するための手段〉
上記の課題を解決すべくなされた本発明の成長因子は、
下記の性質を有するものである。
下記の性質を有するものである。
（１）分子量＋５０，０００〜７０，０００（２）ヘパ
リンに対して親和性を持たない。
リンに対して親和性を持たない。
（３） ５６℃、３０分間の熱処理に安定である。
（４）血管内皮細胞の増殖を促進する。
本発明の成長因子は次のような方法で得ることができる
が、この方法によって得られたものに限定されるもので
はない。即ち、本発明の成長因子は、ＲＡ滑脱膜細胞由
来線維芽細胞様細胞の培養上清中に含まれ、それを単離
することにより得ることができる。
が、この方法によって得られたものに限定されるもので
はない。即ち、本発明の成長因子は、ＲＡ滑脱膜細胞由
来線維芽細胞様細胞の培養上清中に含まれ、それを単離
することにより得ることができる。
上記の方法で使用されるＲＡ滑脱膜細胞ＲＡ患者の膝関
節から得ることができ、採取された滑脱細胞は後藤らの
方法（Ｍ、 Ｇｏｔｏ ｅｔ ａｔ、 Ｊ、 Ｃｌ１ｎ
。
節から得ることができ、採取された滑脱細胞は後藤らの
方法（Ｍ、 Ｇｏｔｏ ｅｔ ａｔ、 Ｊ、 Ｃｌ１ｎ
。
Ｉｎｖｅｓｔ、 ８０： ７ｇＢ−７９６，１９８７）
に従って、培養し、クローン化することができる。クロ
ーン化された滑脱細胞は、形態的に主として３種の細胞
、即ち、線維芽細胞様細胞、マクロファージ様細胞及び
樹状細胞様細胞に分類され、本発明の成長因子は、線維
芽細胞様細胞の培養上滑中に含まれる。Ｓ維芽細胞様細
胞の培養は、慣用の培地（例えば、ＨＡＭ Ｆ１２、
ＲＰＭ１１６４０等）で行うことができるが、通常、血
清成分（例えば、ウシ胎児血清等）を３〜１５％程度、
好ましくは１０％程度含有し、さらに必要に応じてペニ
シリン１００Ｕ ／ ｘＩ程度、ストレプトマイシン１
００μｇ ／ １１程度を含有する培地中で行われる。
に従って、培養し、クローン化することができる。クロ
ーン化された滑脱細胞は、形態的に主として３種の細胞
、即ち、線維芽細胞様細胞、マクロファージ様細胞及び
樹状細胞様細胞に分類され、本発明の成長因子は、線維
芽細胞様細胞の培養上滑中に含まれる。Ｓ維芽細胞様細
胞の培養は、慣用の培地（例えば、ＨＡＭ Ｆ１２、
ＲＰＭ１１６４０等）で行うことができるが、通常、血
清成分（例えば、ウシ胎児血清等）を３〜１５％程度、
好ましくは１０％程度含有し、さらに必要に応じてペニ
シリン１００Ｕ ／ ｘＩ程度、ストレプトマイシン１
００μｇ ／ １１程度を含有する培地中で行われる。
培養条件としでは、加湿下、温度３７℃程度、炭酸ガス
濃度５郊程度の条件を採用するのが好ましい。
濃度５郊程度の条件を採用するのが好ましい。
本発明の成長因子は、上記の線維芽細胞様細胞の培養上
滑中に含まれており、当該培養上清を、必要に応じて限
外濾過、硫安塩析等の手段により濃縮した後、ゲル濾過
、アフィニティクロマトグラフィー、イオン交換クロマ
トグラフィー等の慣用の分離・精製手段に付すことによ
り、本発明の成長因子を得ることができる。斯くして分
離・精製された本発明の成長因子は、下記の性質を有し
ている。
滑中に含まれており、当該培養上清を、必要に応じて限
外濾過、硫安塩析等の手段により濃縮した後、ゲル濾過
、アフィニティクロマトグラフィー、イオン交換クロマ
トグラフィー等の慣用の分離・精製手段に付すことによ
り、本発明の成長因子を得ることができる。斯くして分
離・精製された本発明の成長因子は、下記の性質を有し
ている。
（１）分子ｉ：５０，０００〜７０，０００（２）ヘパ
リンに対して親和性を持たない。
リンに対して親和性を持たない。
（３） ５６℃、３０分間の熱処理に安定である。
（４）血管内皮細胞の増殖を促進する。
本発明の成長因子は種々の生理活性を有するが、特に血
管内皮細胞に対して強い増殖促進活性を示す。本発明の
成長因子の血管内皮細胞増殖促進活性（以下、ＥＣＧＦ
活性という）は、公知の活性測定法により測定すること
ができ、例えば、ニワトリの有精卵の漿尿膜の血管の間
に試料を置き、試料を中心として車軸状に誘導される毛
細血管を測定する方法（ＣＡＭ法）；ウサギの角膜に試
料を含ませた高分子ペレットを埋め込んで、毛細血管の
新生を測定する方法；マウスの皮下に空気袋をつくり、
そこに試料を投与して毛細血管の新生を剖検する方法等
が挙げられる（ Ｓ、 Ｔａｙｌｏｒ ａｔａｌ、 Ｎ
ａｔｕｒｅ、 ２９７： ３０７．１９８２、Ｊ、 Ｆ
ｏｌｋｍａｎ ｅｔ ａｔＳｃｉｅｎｃｅ、 ２２１：
７１９．１９８３ 、Ｍ、 Ａ、 Ｇｉｍｂｒｏｎｅ
ｅｔ ａｔ、 Ｊ、 Ｎａ１１． Ｃａｎｃｅｒ １ｎ
ｓｔ、、 ５２： ４１３．１９７４、Ｇ、 Ａ、 Ｐ
ｏｕｒｎｉｅｒ Ｃｔ ａｌ、 Ｉｎｖｅｓｔ、 Ｏｐ
ｈｔｈａｌｍｏｌ。
管内皮細胞に対して強い増殖促進活性を示す。本発明の
成長因子の血管内皮細胞増殖促進活性（以下、ＥＣＧＦ
活性という）は、公知の活性測定法により測定すること
ができ、例えば、ニワトリの有精卵の漿尿膜の血管の間
に試料を置き、試料を中心として車軸状に誘導される毛
細血管を測定する方法（ＣＡＭ法）；ウサギの角膜に試
料を含ませた高分子ペレットを埋め込んで、毛細血管の
新生を測定する方法；マウスの皮下に空気袋をつくり、
そこに試料を投与して毛細血管の新生を剖検する方法等
が挙げられる（ Ｓ、 Ｔａｙｌｏｒ ａｔａｌ、 Ｎ
ａｔｕｒｅ、 ２９７： ３０７．１９８２、Ｊ、 Ｆ
ｏｌｋｍａｎ ｅｔ ａｔＳｃｉｅｎｃｅ、 ２２１：
７１９．１９８３ 、Ｍ、 Ａ、 Ｇｉｍｂｒｏｎｅ
ｅｔ ａｔ、 Ｊ、 Ｎａ１１． Ｃａｎｃｅｒ １ｎ
ｓｔ、、 ５２： ４１３．１９７４、Ｇ、 Ａ、 Ｐ
ｏｕｒｎｉｅｒ Ｃｔ ａｌ、 Ｉｎｖｅｓｔ、 Ｏｐ
ｈｔｈａｌｍｏｌ。
Ｖｉｓｕａｌ Ｓｅｔ、、 ２１： ３５１．１９８１
、Ｒ，Ｒａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ。
、Ｒ，Ｒａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ。
Ｎａｔｕｒｅ、 ２Ｈ： ７９７．１９７Ｅｉ、Ｊ、
Ｂ、 Ｈｕｒｒａｙ ｅｔ ａ、ｌ。
Ｂ、 Ｈｕｒｒａｙ ｅｔ ａ、ｌ。
Ｉｎ ＶＨｒｏ １９： ７４Ｂ、 １９８３、三井ら
１日本臨床、４４：Ｌ［ｉ９．１９８８等参照）。より
好ましくは、ヒト屑帯静脈血管内皮細胞（ＨＵ Ｖ −
Ｅ Ｃ）を用い、ＨＵＶ−ＥＣの増殖を３Ｈ−チミジン
の取込み量を指標として測定する方法が挙げられる（Ｍ
、 Ｋａｎ ｅｔａｔ、 Ｊ、 Ｃｅ１１． Ｐｈｙｓ
ｉｏｌ、、 １１１： １５５．１９８２ ）。
１日本臨床、４４：Ｌ［ｉ９．１９８８等参照）。より
好ましくは、ヒト屑帯静脈血管内皮細胞（ＨＵ Ｖ −
Ｅ Ｃ）を用い、ＨＵＶ−ＥＣの増殖を３Ｈ−チミジン
の取込み量を指標として測定する方法が挙げられる（Ｍ
、 Ｋａｎ ｅｔａｔ、 Ｊ、 Ｃｅ１１． Ｐｈｙｓ
ｉｏｌ、、 １１１： １５５．１９８２ ）。
〈発明の効果〉
本発明の成長因子は血管内皮細胞に対する強い増殖促進
活性を有するので、火傷や創傷などの治療促進剤及び血
管障害等の疾病の治療剤として有用である。また、本発
明の成長因子及びその抑制因子又は抗体は、ＲＡ、固型
腫瘍等の治療薬及び診断薬の開発への応用が期待できる
。さらに本発明の成長因子の生体外での応用としては、
管状の高分子素材の内面に血管内皮細胞を付着、増殖さ
せて得られる非血栓性人工血管の製造において細胞の成
長促進剤として利用できる。
活性を有するので、火傷や創傷などの治療促進剤及び血
管障害等の疾病の治療剤として有用である。また、本発
明の成長因子及びその抑制因子又は抗体は、ＲＡ、固型
腫瘍等の治療薬及び診断薬の開発への応用が期待できる
。さらに本発明の成長因子の生体外での応用としては、
管状の高分子素材の内面に血管内皮細胞を付着、増殖さ
せて得られる非血栓性人工血管の製造において細胞の成
長促進剤として利用できる。
〈実施例〉
以下、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが
、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１
ヒト滑脱細胞の調製
滑脱細胞は、関節鏡を用いて５人のＲＡ患者の膝関節か
ら得たものを使用した。この５人の患者は、非ステロイ
ド系抗炎症剤を投与されており、さらに何人かは少量の
コルチコステロイドを投与されていた。滑脱細胞は、脂
肪組織を除いた後、細切し、滅菌プラスチックチューブ
に移し、ＰＢＳ （ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒ
ｄ ５ａｌｉｎｅ）で３回洗浄した。
ら得たものを使用した。この５人の患者は、非ステロイ
ド系抗炎症剤を投与されており、さらに何人かは少量の
コルチコステロイドを投与されていた。滑脱細胞は、脂
肪組織を除いた後、細切し、滅菌プラスチックチューブ
に移し、ＰＢＳ （ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒ
ｄ ５ａｌｉｎｅ）で３回洗浄した。
細切した滑脱細胞を、Ｐ Ｂ Ｓ ＋ ０．２５％トリ
プシン溶液で、３７℃、４０分間処理し、上澄中の細胞
を集めた。細胞はＰＢＳで３回洗浄し、ＲＡＭＦ−１２
培地（Ｇｉｂｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に分散
させた。このＨＡＭ Ｆ−１２培地は、１０％ウシ胎
児血清（ＦＢＳ） 、５Ｘ１０−５Ｍ ２−メルカプ
トエタノール、１０００／１１ｆペニシリン及び１００
μｇ／′１１ストレプトマイシンを含んでいる。
プシン溶液で、３７℃、４０分間処理し、上澄中の細胞
を集めた。細胞はＰＢＳで３回洗浄し、ＲＡＭＦ−１２
培地（Ｇｉｂｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に分散
させた。このＨＡＭ Ｆ−１２培地は、１０％ウシ胎
児血清（ＦＢＳ） 、５Ｘ１０−５Ｍ ２−メルカプ
トエタノール、１０００／１１ｆペニシリン及び１００
μｇ／′１１ストレプトマイシンを含んでいる。
実施例２
ヒト滑脱細胞のクローニング
ヒト滑脱細胞のクローニングは、限界希釈法により行っ
た。細胞は前記した培地に、２個／１１１の割合で分散
させた。↓５０μρのサンプルを９６穴マイクロプレー
トに分け（０，６個／穴）、炭酸ガス濃度５％、湿度１
００％、３７℃で培養した。各式に細胞が１個しかない
ことを顕微鏡で確認し、複数の細胞が存在している場合
にはポリクローンとして除去した。３０日間の初代培養
の後、各々のクローン化された細胞を、ざらに０，３個
／穴の割合で再クローン化した。以後、細胞は２〜４週
間に一度、室温下、０．０５％トリプシンで５分間処理
し、洗浄後、５個／穴の割合に分けて継代を繰り返し、
安定な増殖能を示す細胞株を得た。
た。細胞は前記した培地に、２個／１１１の割合で分散
させた。↓５０μρのサンプルを９６穴マイクロプレー
トに分け（０，６個／穴）、炭酸ガス濃度５％、湿度１
００％、３７℃で培養した。各式に細胞が１個しかない
ことを顕微鏡で確認し、複数の細胞が存在している場合
にはポリクローンとして除去した。３０日間の初代培養
の後、各々のクローン化された細胞を、ざらに０，３個
／穴の割合で再クローン化した。以後、細胞は２〜４週
間に一度、室温下、０．０５％トリプシンで５分間処理
し、洗浄後、５個／穴の割合に分けて継代を繰り返し、
安定な増殖能を示す細胞株を得た。
クローン化された細胞は形態的に、マクロファージ様の
細胞、樹状細胞様の細胞及び線維芽細胞様の細胞に分類
でき、このうち、線維芽細胞様の細胞をＲＡＦと命名し
た。
細胞、樹状細胞様の細胞及び線維芽細胞様の細胞に分類
でき、このうち、線維芽細胞様の細胞をＲＡＦと命名し
た。
実施例３
ＲＡＦ培養上清の調製
９６六マイクロプレート（ＦＡＬＣＯＮ社製）を用い、
ＲＡＦ （約２Ｘ１０Ｇ個／穴）に培養液（ＲＰＭ１１
６４０）を２００μ夏／穴加え、炭酸ガスインキュベー
ター中、３７℃で１８時間培養した。
ＲＡＦ （約２Ｘ１０Ｇ個／穴）に培養液（ＲＰＭ１１
６４０）を２００μ夏／穴加え、炭酸ガスインキュベー
ター中、３７℃で１８時間培養した。
次いで、培養上清を分離し、−２０℃で保存した。
実施例４
ＨＵＶ−ＥＣの調製
Ｊａｆ’ｆｅらの方法（Ｅ、 Ａ、 Ｊａｆｆ’ｅ ｅ
ｔ ａｌ、 Ｊ、 Ｃｌ１ｎ。
ｔ ａｌ、 Ｊ、 Ｃｌ１ｎ。
Ｉｎｖｅｓｔ、 ５２： ２７４５−２７５８．１９７
３）に準じて、ヒト新鮮請帯静脈より０．２％コラゲナ
ーゼ処理により内皮細胞を分離し、２５ｃｍフラスコ内
で２５％Ｆ０ ＢＳ加ＲＰＭ１１６４０液中で培養した。
３）に準じて、ヒト新鮮請帯静脈より０．２％コラゲナ
ーゼ処理により内皮細胞を分離し、２５ｃｍフラスコ内
で２５％Ｆ０ ＢＳ加ＲＰＭ１１６４０液中で培養した。
実施例５
ＥＣＧＦ活性の測定
前記実施例３で得られたＲＡＦ培養上清のＥＣＧＦ活性
を、Ｋａｎらの方法に準じ、ＨＵＶ−ＥＣに対する増殖
促進活性を３Ｈ−チミジンの取込み量で測定する方法で
試験した（Ｍ、 Ｋａｎ ｅｔ ａｌ、ｊ。
を、Ｋａｎらの方法に準じ、ＨＵＶ−ＥＣに対する増殖
促進活性を３Ｈ−チミジンの取込み量で測定する方法で
試験した（Ｍ、 Ｋａｎ ｅｔ ａｌ、ｊ。
Ｃｅ１１． Ｐｈｙｓｉｏｌ、 １１１： １５５．１
９８２）。
９８２）。
即ち、はぼコンフルエントな状態のＨＵＶ−ＥＣを、０
．０５％トリプシンを含む０．０１％ＥＤＴＡで処理し
て浮遊細胞とし、２Ｘ１０３個／穴の割合で９６穴マイ
クロプレー） （ＰＡＬＣＯＮ社製）に分注した。１８
時間後、上清を、実施例３で得られたＲＡＦ培養上清を
５０％含むＲＰＭ１１６４０液（以下、試験培地という
）で置換した。３７℃で４８時間培養後、３Ｈ−チミジ
ンを加え、さらに２４時間培養し、３Ｈ−チミジンの取
込み量をシンチレーションカウンターで計測した（第１
図参照）。なお、コントロールとして、上記試験培地の
代りに、ＲＡＦ培養上清を含有しないＲＰＭ１１ １６４０液を用いて同様な試験を行った。また、比較試
験（ポジティブコントロール）として、内皮細胞成長因
子である酸性ＦＧＦ （商品名：ＥＣＧ５．販売元：
Ｃ０ＩｌａｂＯｒａｔｉＶｅ Ｒｅ５ｅａｒｃｈｓウシ
脳由来）を用い同様な試験を行った。代表的な試験結果
を第１表に示す。
．０５％トリプシンを含む０．０１％ＥＤＴＡで処理し
て浮遊細胞とし、２Ｘ１０３個／穴の割合で９６穴マイ
クロプレー） （ＰＡＬＣＯＮ社製）に分注した。１８
時間後、上清を、実施例３で得られたＲＡＦ培養上清を
５０％含むＲＰＭ１１６４０液（以下、試験培地という
）で置換した。３７℃で４８時間培養後、３Ｈ−チミジ
ンを加え、さらに２４時間培養し、３Ｈ−チミジンの取
込み量をシンチレーションカウンターで計測した（第１
図参照）。なお、コントロールとして、上記試験培地の
代りに、ＲＡＦ培養上清を含有しないＲＰＭ１１ １６４０液を用いて同様な試験を行った。また、比較試
験（ポジティブコントロール）として、内皮細胞成長因
子である酸性ＦＧＦ （商品名：ＥＣＧ５．販売元：
Ｃ０ＩｌａｂＯｒａｔｉＶｅ Ｒｅ５ｅａｒｃｈｓウシ
脳由来）を用い同様な試験を行った。代表的な試験結果
を第１表に示す。
第１表
第１表に示されるように、ＲＡＦ培養上清を含む培養液
を用いた系は、コントロールに対して３Ｈ−チミジンの
取込み量が大きく増加しており、血管内皮細胞の増殖が
著しく促進されていることが明らかとなった。なお、３
Ｈ−チミジンの取込み量の増加は酸性ＦＧＦにおいても
認められ、上記試験法の正当性が確認された。
を用いた系は、コントロールに対して３Ｈ−チミジンの
取込み量が大きく増加しており、血管内皮細胞の増殖が
著しく促進されていることが明らかとなった。なお、３
Ｈ−チミジンの取込み量の増加は酸性ＦＧＦにおいても
認められ、上記試験法の正当性が確認された。
また、上記試験において、試験培地中のＲＡＦ２
培養上清の濃度を２５％及び１２．５％として同様な試
験を行った。ＲＡＦ培養上清の濃度に対する３Ｈ−チミ
ジンの取込み量をプロットした図を第２図に示す。
験を行った。ＲＡＦ培養上清の濃度に対する３Ｈ−チミ
ジンの取込み量をプロットした図を第２図に示す。
第２図から明らかなように、ＲＡＦ培養上清濃度が低下
すると３Ｈ−チミジンの取込み量が減少し、濃度依存性
が認められた。
すると３Ｈ−チミジンの取込み量が減少し、濃度依存性
が認められた。
実施例６
ＲＡＦ培養上清の精製
実施例３で得られたＲＡＦ培養上清を、アミコン膜ＰＭ
５０を用いて、分離・濃縮したところ、非透析画分（即
ち、分子量５０，０００以上）にＥＣＧＦ活性が認めら
れた。
５０を用いて、分離・濃縮したところ、非透析画分（即
ち、分子量５０，０００以上）にＥＣＧＦ活性が認めら
れた。
また、アミコン濃縮された画分を、スーパーローズ１２
（Ｓｕｐｅｒｒｏｓｅ １２）を用いたＨＰＬＣに付
し、分子量とＥＣＧＦ活性の関係を調べた。その結果を
第３図に示す。第３図から明らかなように、分子量が５
０，０００から７０，０００の間にＥＣＧＦ活性のピー
クが認められた。
（Ｓｕｐｅｒｒｏｓｅ １２）を用いたＨＰＬＣに付
し、分子量とＥＣＧＦ活性の関係を調べた。その結果を
第３図に示す。第３図から明らかなように、分子量が５
０，０００から７０，０００の間にＥＣＧＦ活性のピー
クが認められた。
さらに、ＨＰＬＣで分離した分子量が５０．０００か３
ら７０，０００の画分をヘパリン・セファロースを用い
たアフィニテイクロマトグラフイーに付したところ、非
吸着画分にＥＣＧＦ活性が認められ、本発明の成長因子
はヘパリンに対して親和性を持たないことが示された。
たアフィニテイクロマトグラフイーに付したところ、非
吸着画分にＥＣＧＦ活性が認められ、本発明の成長因子
はヘパリンに対して親和性を持たないことが示された。
また、ヘパリン・セファロースカラム非吸着画分を、５
６℃、３０分間の加熱処理に付したが、ＥＣＧＦ活性は
損なわれず、本発明の成長因子は耐熱性であることを示
した。
６℃、３０分間の加熱処理に付したが、ＥＣＧＦ活性は
損なわれず、本発明の成長因子は耐熱性であることを示
した。
第１図は、内皮細胞のクローニング法及びＥＣＧＦ活性
測定操作を図解した説明図である。 第２図は、ＲＡＦ培養上清のＥＣＧＦ活性における濃度
依存性を示すグラフである。 第３図は、ＲＡＦ培養上清をスーパーローズ１２を充填
したＨＰＬＣカラムに付した際のタンパクの溶出ｆｆ１
（−）及びそのＥＣＧＦ活性（−〇−〇−）を示すグラ
フである。
測定操作を図解した説明図である。 第２図は、ＲＡＦ培養上清のＥＣＧＦ活性における濃度
依存性を示すグラフである。 第３図は、ＲＡＦ培養上清をスーパーローズ１２を充填
したＨＰＬＣカラムに付した際のタンパクの溶出ｆｆ１
（−）及びそのＥＣＧＦ活性（−〇−〇−）を示すグラ
フである。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、慢性関節リウマチ滑膜細胞由来線維芽細胞様細胞の
培養上清中に含まれており、下記の性質を有する成長因
子。 （１）分子量：５０，０００〜７０，０００（２）ヘパ
リンに対して親和性を持たない。 （３）５６℃、３０分間の熱処理に安定である。 （４）血管内皮細胞の増殖を促進する。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1318569A JPH03178996A (ja) | 1989-12-06 | 1989-12-06 | 成長因子 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1318569A JPH03178996A (ja) | 1989-12-06 | 1989-12-06 | 成長因子 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03178996A true JPH03178996A (ja) | 1991-08-02 |
Family
ID=18100601
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1318569A Pending JPH03178996A (ja) | 1989-12-06 | 1989-12-06 | 成長因子 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH03178996A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6518255B2 (en) | 1997-01-29 | 2003-02-11 | Cornell Research Foundation, Inc. | Multiple site delivery of adenoviral vector directly into muscle for the induction of angiogenesis |
-
1989
- 1989-12-06 JP JP1318569A patent/JPH03178996A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6518255B2 (en) | 1997-01-29 | 2003-02-11 | Cornell Research Foundation, Inc. | Multiple site delivery of adenoviral vector directly into muscle for the induction of angiogenesis |
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